CN105062905B - 一株用于固体发酵的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株用于固体发酵的酿酒酵母，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03，已于2015年04月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2015209。本发明还公开该酿酒酵母的固体发酵培养方法及其固体发酵培养物的应用。该酿酒酵母菌株具有高生物量，传代稳定等优点；在固体发酵中，其氨基酸、有机酸等代谢产物产量较其他酵母菌固体发酵物高。将酿酒酵母BLNJ03固体发酵培养物应用于草鱼，可显著提高生长指标、消化指标及免疫指标；应用于奶牛可增加产奶量；应用于肉牛、肉羊可显著提高其生产性能。

Description

一株用于固体发酵的酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明涉及一株用于固体发酵的酿酒酵母及其应用。

背景技术

酵母培养物是指酵母菌在特定的培养基上经过充分的发酵后形成的微生态产品，它主要由酵母细胞外代谢产物、经过发酵后变异的培养基和少量的酵母细胞所构成。代谢产物是对细胞外各类代谢物的总称，包括肽、有机酸、寡糖、氨基酸、增味物质和芳香物质等，还包括其他对促进动物生长有益的“未知生长因子”等物质。酵母培养物的功能可概括为：通过向寄宿在动物胃肠道内的微生物提供额外的营养底物来刺激它们代谢活性和维护内生态环境的相对稳定。以往的科学研究和生产应用实践证明，酵母培养物中所含有的细胞外代谢产物可明显提高动物的生产性能、优化饲料的营养价值、改善动物的健康状态。酵母培养物作为饲料添加剂可以改善动物的肠道菌群，抑制致病菌的繁殖，提高动物的免疫力，增强对疾病的抵抗能力，同时可以改善动物的血液生化指标，促进动物生长。因此，酵母培养物对于改善动物生产性能和降低养殖成本有着十分积极的意义。

但目前的酵母培养物产品存在质量参差不齐，使用效果也不稳定等问题，亟需开发质优价廉的品牌性产品。通过加强对酵母培养物作用机理的深入研究,充分利用丰富的酵母菌资源，开发得到生物量高、代谢产物丰富的新菌株，并进一步通过优化发酵工艺，包括液体和固体发酵工艺，研究发酵培养基的成分，高目的产物的表达，对于研发新型酵母培养物产品具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株用于固体发酵的酿酒酵母及其应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一株用于固体发酵的酿酒酵母，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLNJ03，已于2015年04月08日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2015209。

本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的菌学特征如下：所述酿酒酵母细胞呈圆形或椭圆形，大小为(3.5μm～4.5μm)×(7.0μm～13.0μm)，以多边出芽方式进行无性繁殖，形成假菌丝；菌落呈乳白色，表面光滑湿润，有光泽或无光泽，边缘整齐或菌丝状；化能异养型，能发酵葡萄糖、果糖和甘露糖，不发酵半乳糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖；能同化尿素、铵盐和硝酸盐，不分解蛋白质和脂肪；兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵；最适生长温度30℃，最适生长pH为7.0。

本发明还提供了该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的固体发酵培养方法，步骤为：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液体种子按4％-6％(体积分数)的接种量接种于固体发酵培养基中，发酵温度为28-30℃，有氧发酵时间为36-60h，厌氧发酵时间为72-96h。本发明对发酵工艺进行了优化改进，采用两步两态法——液体深层发酵与固体发酵结合；有氧发酵与厌氧发酵相继进行，使其固体培养物中代谢产物含量更加丰富。

所述固体发酵培养基是由基质和水按1g:(0.5-0.7)mL组成；其中，基质的组成为：按质量百分比计，麸皮90％、玉米面3％、豆粕7％。本发明对固体发酵培养基中基质和水的比例(即料水比)进行了优化，结果表明，过高和过低的料水比均不利于酵母菌的生长，本发明将料水比控制在1:0.5—1:0.7范围内，在该范围内培养得到的培养物中活菌数较高。

所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液体种子的制备方法，具体步骤如下：

(1)向三角瓶中装入1/4-1/5体积的酵母菌液体培养基，灭菌，冷却后用接种环接种两环固体斜面酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03，30℃摇床200rpm培养20h，得到一级种子酿酒酵母菌液；

(2)向种子罐中加入2/5-3/5体积的酵母菌液体培养基，实消温度为121℃，时间为30min；待培养基温度降为30℃时，按1.5％(体积分数)接种一级种子酿酒酵母菌液，培养温度28-30℃，罐压0.05MPa，搅拌转速70-90rpm，培养14-20h；

步骤(1)和步骤(2)中，所述酵母菌液体培养基的组成为：葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、泡敌0.05％，所述百分含量均为质量百分含量，纯净水配制，pH值7.0。

步骤(1)中，灭菌的条件为：121℃灭菌30min。

本发明还进一步提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的发酵培养物在水产动物和/或反刍动物养殖中的应用。

本发明还提供了一种饲料添加剂，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的发酵培养物为有效成分。

具体的，该饲料添加剂是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的发酵培养物中添加4‰(质量分数)的高活性产朊假丝干酵母混合而成，复配后混合物中酵母菌活菌数不低于5×10⁸cfu/g。

本发明的有益效果：

本发明筛选出了一株用于固体发酵的酿酒酵母BLNJ03，该菌株具有高生物量、传代稳定等优点；在固体发酵中，其氨基酸、有机酸等代谢产物产量较其他酵母菌固体发酵物高。将酿酒酵母BLNJ03固体发酵培养物应用于草鱼，可显著提高生长指标、消化指标及免疫指标；应用于奶牛可增加产奶量；应用于肉牛、肉羊可显著提高其生产性能。

附图说明

图1：BLNJ03酿酒酵母chromosome XII sequence电泳图；

图2：酿酒酵母BLNJ03在发酵罐中培养的生长曲线；

图3：培养基初始pH对固体发酵活菌数的影响。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的分离筛选

1材料与方法

1.1材料

1.1.1采样地点及样品类型

分别从平度大泽山向阳山坡的两处葡萄架下采集了土壤样品。

1.1.2主要仪器设备

1.1.3培养基

1.1.3.1分离培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：蔗糖20g，马铃薯200g，链霉素20mg，琼脂粉15g，水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。

1.1.3.2纯化培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖固体培养基(YPD培养基)：葡萄糖4g，蛋白胨4g，酵母膏2g，琼脂粉15g，蒸馏水100mL，pH4.5，115℃灭菌20min。

1.1.3.3液体发酵培养基

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g，水1000mL，pH值7.0，121℃灭菌20min。

1.2试验方法

1.2.1酵母菌的分离及纯化

采用富集培养法进行酵母菌的分离。将样品在超净工作台中打开，用灭菌的药匙获取样品l0g左右，加入到一个盛有40mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，30℃振摇30min，将样品充分打散、混匀。然后吸取1mL的液体加入到含链霉素的PDA液体培养基中，30℃摇床培养1天，吸取1mL的培养液接种到一新的含链霉素的PDA液体培养基中，30℃摇床培养1-2天。用接种针蘸取培养液在含链霉素的固体PDA培养基上进行4区划线。30℃培养箱中倒置培养2-3天，挑取形态不同的酵母菌菌落在YPD培养基上进行划线纯化，将纯化好的的菌株接入斜面备用。

1.2.2酵母菌生物量的测定

将分离到的酵母菌分别接入液体发酵培养基中，30℃摇床培养20h，取发酵液3500g离心10min，收集菌体，蒸馏水洗涤3次，收集菌体，冷冻干燥后称重即得(g/100mL)。

1.2.3菌株筛选

挑选出15株菌落生长迅速、革兰氏染色镜检符合酵母菌特征的单菌株，经测定生物量试验后，筛选出3株生物量较高者，在PDA斜面培养基传5代后(观察其稳定性)，并与初始菌株分别在三角瓶中发酵，以生物量为指标进行复筛，筛选出1株生物量高且稳定的菌株。

1.2.4菌株鉴定

鉴定方法：菌种鉴定采用chromosome XII sequence的PCR鉴定法，具体方法如下：酵母菌chromosome XII sequence基因片段扩增的引物序列为：CXS1：5’-CACAGAAATCTCTCACCG-3’(如序列表中SEQ ID NO.1所示)，CXS2：5’-TTATGATATGCTTAAGTTC-3’(如序列表中SEQ ID NO.2所示)，序列由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为：dNTP Mixture 4μL，5×Prime STAR Buffer 10μL，上下游引物各0.6μL，基因组模板0.8μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.6μL，用无菌去离子水补充至50μL。PCR循环参数为：95℃5min；94℃1min，52℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min。将BLNJ03菌株的chromosome XII sequence基因目的片段切胶回收(TAKARA胶回收试剂盒)，送TAKARA测序，测序结果登陆Genbank blast在线对比。

2试验结果

2.1菌株筛选

菌株的筛选结果见表1。

表1高生物量酵母菌株筛选结果

由表1可见，在这15株菌株中生物量较高的为2、3、10号菌株，分别命名为BLNJ02、BLNJ03、BLNJ10。

2.2稳定性试验

将上述试验筛选到的三株菌株进行液体发酵培养，并经连续5代培养，测定其生物量，结果证明这三株菌稳定性能均较好，这表明筛选到的3株酵母菌均具有良好的遗传稳定性，且BLNJ03菌株的生物量最高，故我们选择BLNJ03菌株进行分子生物学鉴定，并作为后续的试验菌株。其结果见表2。

表2酵母菌菌株遗传稳定性试验结果

2.3分子生物学鉴定

酿酒酵母菌的分子生物学检测：取BLNJ03发酵液1mL，提取总DNA，PCR扩增chromosome XII sequence基因序列，PCR产物电泳结果如图1所示，结果显示，在分子量大小为1000bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致。

将BLNJ03菌株的chromosome XII sequence基因目的片段切胶回收(TAKARA胶回收试剂盒)，送TAKARA测序，将序列测定结果登陆Genbank blast在线对比，结果表明BLNJ03与编号为CP006468.1、CP006465.1、CP006464.1菌株同源性为99％。

chromosome XII sequence基因测序结果如序列表中SEQ ID NO.3所示。

经筛选得到的菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03，已于2015年04月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2015209。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的菌学特征如下：

所述酿酒酵母细胞呈圆形或椭圆形，大小为(3.5μm～4.5μm)×(7.0μm～13.0μm)，以多边出芽方式进行无性繁殖，形成假菌丝；菌落呈乳白色，表面光滑湿润，有光泽或无光泽，边缘整齐或菌丝状；化能异养型，能发酵葡萄糖、果糖和甘露糖，不发酵半乳糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖；能同化尿素、铵盐和硝酸盐，不分解蛋白质和脂肪；兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵；最适生长温度30℃，最适生长pH为7.0。

实施例2：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03发酵条件的优化

1酵母菌的液体深层发酵

1.1仪器设备：

电热恒温摇床、50升种子罐、500升发酵罐、恒温电热培养箱等。

1.2试验材料：

培养基：葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％，泡敌0.05％，pH值7.0。(所述百分含量均为质量分数)

1.3试验方法

1.3.1一级种子菌液制备

采用5000mL三角瓶，装量1000mL/5000mL三角瓶，121℃灭菌30min，冷却后接种酿酒酵母BLNJ03，在30℃摇床200rpm培养20h即为一级种子菌液。

1.3.2种子罐发酵

50L种子罐培养基装量为30L；实消温度121℃，时间30min；待培养基温度降为30℃时接种酿酒酵母BLNJ03一级种子菌液，培养温度28-30℃，罐压0.05MPa，搅拌转速80rpm，培养16h，得液体种子，即可转入发酵罐培养。

1.3.3 500升发酵罐发酵

500升发酵罐培养基装量为350L；实消温度121℃，时间30min；待培养基温度降为30℃时接种，培养温度28-30℃，罐压0.05MPa。

发酵期间两小时取样一次，镜检并计酵母活菌数，20h放罐，作为液体种子用于下一步的固体发酵。

酿酒酵母BLNJ03在发酵罐中培养的生长曲线如图2所示。

2酿酒酵母固体发酵生产工艺研究

2.1液体种子接种量对固体发酵活菌数的影响

培养基：麸皮90％、玉米面3％、豆粕7％(均为质量分数)，料水比1g:0.7mL，pH值7.0，接种量分别为2％、4％、6％、8％、10％(体积分数)，30℃培养48h，室温下晾干，测定活菌数及含水量。结果见表3。

表3接种量对固体发酵活菌数的影响

试验结果表明，在试验设计范围内，接种量对活菌数的影响不大，综合考虑成本等因素，建议接种量以4％～6％为宜。

2.2发酵初始pH对固体发酵活菌数的影响

试验将酵母菌固体发酵培养基的初始pH分别调为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，121℃灭菌30min，接种后30℃培养48h，计活菌数，培养基初始pH对固体发酵的影响结果见图3。试验结果证实，培养基初始pH值以7.0最好。

2.3培养基配方对固体发酵活菌数的影响

2.3.1豆粕含量对酵母培养物粗蛋白含量的影响

豆粕在酵母的固体发酵中作为重要的氮源而存在，此外，其含量的高低与酵母培养物的粗蛋白含量密切相关。试验分别将培养基中豆粕的含量设置为5％、7％、15％、20％、25％、30％、35％(均为质量分数)，培养基其他原料种类及比例相同，30℃有氧发酵48h，测定培养物中的酵母活菌数及粗蛋白含量。试验结果见表4。

表4豆粕含量对活菌数及粗蛋白含量的影响

由表4可知，酵母培养物的粗蛋白含量随豆粕含量的提高而上升，但是，活菌数在豆粕含量达20％之前变化不大，当培养基豆粕含量达到并超过25％，活菌数迅速下降。分析其原因为随豆粕含量提高，培养基粘度增大，通气量下降，导致酵母菌生长缓慢。综合考虑实际生产成本等因素，选择7％以内为最佳豆粕添加量。

2.3.2正交试验筛选复合固体发酵培养基

采用三因素三水平正交试验进行。500mL三角瓶装量20g，料水比1:0.5，pH值7.0，接种量6％，做两平行。正交试验设计表见表5，正交试验结果见表6。

表5正交试验设计

表6正交试验结果

试验结果证明，培养基成分影响因素玉米面＞麸皮＞豆粕，最佳配方为A2B2C3，即麸皮90％、玉米面3％、豆粕7％。

2.3.3料水比对固体发酵活菌数的影响

将发酵培养基料水比分别调为1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1(g:mL)，500mL三角瓶装量20g，接种量为6％(v/m)，30℃培养48h，晾干，计数，测含水量。结果见表7。

表7料水比对发酵活菌数的影响

试验结果表明，过高和过低的料水比均不利于酵母菌的生长，料水比在1:0.5—1:0.7范围内活菌数较高，建议生产中将料水比定为1:0.7。

2.4需氧发酵周期对活菌数的影响

将酿酒酵母种子液接种于固体发酵培养基中，堆积进行好氧发酵，接种后12h开始取样，每12h取样1次，计酵母活菌数。结果见表8。

表8需氧发酵周期对活菌数的影响

由表8可知，随时间延长，培养基中酵母活菌数逐渐增加，到48h活菌数达到最高，为3.9×10⁸cfu/g。之后，随时间延长，培养基中酵母活菌数呈持平趋势，因此确定最佳需氧发酵时间为48h。

2.5厌氧发酵周期对营养成分及消化率的影响

将酿酒酵母BLNJ03种子液接种于酵母固体发酵培养基中，有氧发酵48h后压实密封进行厌氧发酵，厌氧发酵24h开始取样，每24h取样1次，测定酵母培养物中氨基酸、核苷酸含量及消化率指标。结果见表9。

表9厌氧发酵周期对氨基酸、核苷酸含量及消化率的影响

由表9可知，随厌氧发酵时间延长，酵母培养物中氨基酸及核苷酸含量增加，消化率提高，到96h均达到较高值11.33％、28.31mg/g和89.05％，综合考虑生产成本及发酵时间继续延长易污染霉菌等因素，确定最佳厌氧发酵时间为96h。

综上，酿酒酵母BLNJ03固体发酵工艺的优化条件为：固体发酵培养基为麸皮90％、玉米面3％、豆粕7％，初始pH值7.0、料水比1:0.7、接种量4％～6％，有氧发酵48h后厌氧发酵96h。

3酵母培养物的营养成分检测

将酿酒酵母BLNJ03、产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM(产朊假丝酵母CUM已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010090；记载在申请人的另一项专利“一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌及其应用”(CN101864369 B)中)，分别按相同培养基配方及发酵工艺进行固体发酵，结束后分别将酵母培养物低温烘干，并粉碎。购买市场同类酿酒酵母固体培养物产品测定活菌数、营养成分含量及消化率。结果见表10。

表10酵母固体培养物活菌数、营养成分含量及消化率比较

由表10可知，酿酒酵母BLNJ03固体培养物与市售酿酒酵母培养物、产朊假丝酵母培养物相比，粗纤维、粗脂肪等基本应用成分与培养基配方相关，相差不大；蛋白质含量略有升高，此现象与菌体蛋白有关；氨基酸的含量比市售酿酒酵母培养物、产朊假丝酵母培养物高30％左右，有机酸含量是市售酿酒酵母培养物、产朊假丝酵母培养物的1.5-2倍，说明酿酒酵母BLNJ03菌种更加优良，在固体发酵中代谢产物方面具有优势；同时，本发明的发酵工艺更加先进，两步两态法——液体深层发酵与固体发酵结合；有氧发酵与厌氧发酵相继进行，使其固体培养物中代谢产物含量更加丰富。

实施例3：酵母培养物对草鱼生长、消化及免疫性能的影响

1材料与方法

1.1试验用鱼：43±5g草鱼200尾；

1.2试验分组：

共分四组，每组试验用鱼50尾。对照组，饲喂基础日粮；试验I组，BLNJ03酵母培养物复配4‰(质量分数)的产朊假丝酵母干粉，复配混合物酵母菌活菌数达5×10⁸cfu/g，按质量分数3‰比例添加至基础日粮；试验II组，在饲喂的基础日粮中添加BLNJ03酵母培养物，添加比例为3‰(质量分数)；竞品组，在饲喂的基础日粮中添加市场上购买的竞品酵母培养物，添加比例为3‰(质量分数)。

1.3试验动物饲养

1.3.1预饲期

按鱼体重的3％投喂，早、中、晚定时定点投喂，观察采食情况及残饵率，根据实际情况进行适当调整确定投喂量。

1.3.2正饲期

根据预饲期得到的投喂量进行饲喂管理，为期10周。每2周采样一次。

1.4样品采集测定

饲养试验结束后，停食24h。测定每组草鱼的体重、净重。每组随机抽取9尾草鱼臀鳍静脉采血，血液首先在室温下静置1h待其凝固，置4℃冰箱保持4h后，于4℃条件下以4000r/min离心10min，收集上层血清。采血后的草鱼于冰上操作采集肠道、肝、中肾称重，并加入缓冲液于冰上进行研磨后取上清液。计算饲料系数、增重率、特定生长率。测定肠道蛋白酶及淀粉酶指标。

计算公式：

增重率(％)＝100×(末均重－初均重)/初均重

特定生长率(％)＝100×(Ln末均重-Ln初均重)/饲养天数

饲料系数＝每组投喂饲料总量/每组鱼体总增重量

消化指标：

蛋白酶活性测定方法：福林酚法。

淀粉酶活力测定方法：碘-淀粉比色法。

组织蛋白采用南京建成总蛋白检测试剂盒测定。

免疫指标：

溶菌酶活性测定方法：溶壁微球菌法。

2结果

2.1生长指标

2.1.1饲料系数

酵母培养物对草鱼饲料系数的影响如表11所述。

表11酵母培养物对草鱼饲料系数的影响

由上表可知，正饲10周，对照组鱼体增重708.2g，复配产朊假丝酵母培养物的试验I组鱼体增重806g，较对照组重97.8g；BLNJ03酵母培养物组(试验II组)鱼体增重799g，较对照组重90.8g；竞品组鱼体增重753g，较对照组增重44.8g。对照组、试验I组、试验II组、竞品组四组饲料系数分别为1.93、1.69、1.70、1.81。可知，饲料中添加本发明的酵母培养物明显降低饲料系数，提高饲料利用效率，提高草鱼生长速度。

2.1.2增重率

酵母培养物对草鱼增重率的影响如表12所示。

表12酵母培养物对草鱼增重率的影响

由表12可知，正饲10周，复配产朊假丝酵母组及BLNJ03酵母培养物组的增重率呈稳步上升趋势，较对照组及竞品组有明显提高。

2.1.3特定生长率

酵母培养物对草鱼特定生长率的影响如表13所示。

表13酵母培养物对草鱼特定生长率的影响

由表13可知，正饲10周，复配产朊假丝酵母组及BLNJ03酵母培养物组的特定生长率呈上升趋势。由于采样的随机性，对照组与竞品组呈交替趋势，总体趋势复配产朊假丝酵母组及BLNJ03酵母培养物组优于其它两组。本发明的酵母培养物在提高草鱼增长率及特定生长率上均效果显著，对草鱼的促生长作用效果明显。

2.2消化指标测定

蛋白酶消化活力测定(福林法)，结果如表14所述。

表14酵母培养物对草鱼肠道蛋白酶活的影响

由表14可知，正饲10周采样测定结果显示，前、中肠蛋白酶活性，复配产朊假丝酵母培养物组、BLNJ03酵母培养物组及竞品组均显著高于对照组(P＜0.05)，且复配产朊假丝酵母培养物组、BLNJ03酵母培养物组显著高于竞品组(P＜0.05)。酵母培养物可促进胃肠道功能，提高肠道蛋白酶活性，促进消化吸收，提高饲料中营养物质消化率，且本发明的酵母培养物效果优于竞品。

2.3免疫指标测定

2.3.1酵母培养物对草鱼溶菌酶活性的影响

溶壁微球菌法测定试验草鱼血液溶菌酶活性，结果见表15。

表15酵母培养物对草鱼溶菌酶活性的影响

由表15可知，第8周溶菌酶活性，复配产朊假丝酵母培养物组、BLNJ03酵母培养物组显著高于对照组(P＜0.05)，竞品组高于对照组，但差异不显著；第10周溶菌酶活性，复配产朊假丝酵母培养物组、BLNJ03酵母培养物组及竞品组均显著高于对照组(P＜0.05)。由此推断，酵母及其培养物可提高血液溶菌酶活性，抑制有害菌的繁殖生长，且复配产朊假丝酵母培养物组、BLNJ03酵母培养物组的效果更为明显。

2.3.2酵母培养物对草鱼免疫器官的影响

脾脏指数、肾脏指数测定结果见表16。

表16酵母培养物对草鱼免疫器官的影响

由表16可知，饲喂10周复配产朊假丝酵母培养物组及BLNJ03酵母培养物组脾脏指数、肾脏指数显著高于对照组和竞品组(P＜0.05)。由此可见，本发明的酵母培养物可促进免疫器官发育，提高免疫指数以达到增强免疫力的功效。

2.4酿酒酵母BLNJ03培养物对草鱼的保护性验证----嗜水气单胞菌感染试验

正饲10周试验结束后，取饲喂基础日粮的对照组与在饲喂基础日粮的基础上添加3‰BLNJ03酵母培养物的试验组15尾草鱼，分别用3种浓度嗜水气单胞菌腹腔注射进行攻毒试验。结果见表17。

表17急性攻毒试验结果

由表17可知，嗜水气单胞菌在1×10⁹cfu/mL浓度下，对照组于第1天全部死亡，BLNJ03酵母培养物组第1天死亡3尾，第2天死亡1尾；嗜水气单胞菌在1×10⁸cfu/mL浓度下，对照组第2天死亡2尾，第3天死亡1尾，BLNJ03酵母培养物组第3天死亡1尾，第4天死亡1尾；嗜水气单胞菌在1×10⁷cfu/mL浓度下，对照组第4天死亡1尾，BLNJ03酵母培养物组无死亡。这说明，在急性感染条件下，酿酒酵母BLNJ03培养物能延缓发病，明显提高草鱼的抗疾病能力。

3结论

本发明的酵母培养物能显著提高草鱼消化道蛋白酶活性；提高草鱼特异生长率及增重率，提高饲料利用率，降低饲料系数；提高血液溶菌酶活性、免疫器官指数及抗病力。

实施例4：酵母培养物在反刍动物上的应用

1酵母培养物对奶牛生产性能的影响

1.1材料与方法

1.1.1试验动物

40头泌乳中期的荷斯坦奶牛，要求年龄、日产奶量、泌乳天数、胎次相近。

1.1.2试验分组及饲养管理

40头泌乳中期奶牛随机分为4组，每组10头。分别设为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、竞品组。对照组，饲喂基础日粮；试验I组，在饲喂基础日粮的基础上添加BLNJ03酵母培养物，添加比例为5‰(质量分数)；试验II组，BLNJ03酵母培养物复配4‰(质量分数)产朊假丝酵母干粉，复配混合物中酵母菌活菌数达5×10⁸cfu/g，按质量分数为5‰的比例添加至基础日粮；竞品组，添加市场上购买的竞品酵母培养物，添加比例为5‰。

试验日粮由牧场自行配制，采用TMR喂养技术，精饲料由山东宝来利来巴夫饲料有限公司提供，粗料为干草和青贮，精粗比约为40：60，试验为期30d。

1.1.3测定指标及方法

产奶量：试验期间每天凌晨和傍晚记录每组每头奶牛的产奶量，计算试验组和对照组平均每天每头奶牛的产奶量。

乳品质测定：试验结束时采样检测各组牛奶品质，包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、非脂固形物等指标的检测。所用仪器为优创乳成分分析仪。

1.2结果与分析

由表18可知，试验Ⅰ组(BLNJ03酵母培养物组)和试验Ⅱ组(复配产朊假丝酵母组)的产奶量显著高于竞品组和对照组(P＜0.05)；从乳成分指标来看，BLNJ03酵母培养物组和复配产朊假丝酵母组的乳脂、乳蛋白、乳糖也显著(P＜0.05)高于对照组和竞品组，说明本发明的酵母培养物具有显著提高奶牛产奶量的功效，复配产朊假丝酵母组的效果略优于BLNJ03酵母培养物组；同时，BLNJ03酵母培养物和复配产朊假丝酵母均具有改善乳脂、乳蛋白、乳糖的功效，与竞品组的效果均呈显著性差异(P＜0.05)。

表18酵母培养物对奶牛生产性能及乳成分的影响

注：同列数据肩标有相同小写字母者表示二者之间差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母者表示二者之间差异显著(P＜0.05)，下同。

1.3结论

本发明的酵母培养物在提高奶牛产奶量及改善乳品质方面具有较好的使用效果。

2酵母培养物对肉牛生产性能的影响

2.1.材料与方法

2.1.1试验动物

40头5月龄西门塔尔肉牛，要求体重相近。

2.1.2试验分组及饲养管理

将肉牛随机分为4组，每组10头，分别为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、竞品组。对照组：饲喂基础日粮；试验I组：在饲喂基础日粮的基础上添加BLNJ03酵母培养物，添加比例为5‰；试验II组：BLNJ03酵母培养物复配4‰(质量分数)产朊假丝酵母干粉，复配混合物中酵母菌活菌数达5×10⁸cfu/g，按5‰比例添加至基础日粮；竞品组：添加市场上购买的竞品酵母培养物，添加比例为5‰。

试验日粮由牧场自行配制，采用TMR喂养技术，精饲料由山东宝来利来巴夫饲料有限公司提供，粗料为干草和青贮，精粗比约为40：60。预试期5d，记录牛的健康状况，预试期结束后开始正式试验，试验为期55d

2.1.3测定指标及方法

生产性能指标：试验开始和结束当天清晨各试验组和对照组分别空腹称量一次体重，计算肉牛的总增重和平均日增重。

血清抗氧化指标：试验期的第30天，于晨饲前2h颈静脉采血10mL，3500r/min离心15min，取血清保存于-20℃冰箱，测定抗氧化指标丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)含量，总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活力。

2.2试验结果与分析

2.2.1对肉牛生产性能的影响

由表19知，试验Ⅰ组(BLNJ03酵母培养物组)和试验Ⅱ组(复配产朊假丝酵母组)和竞品组的总增重和平均日增重均显著高于对照组(P＜0.05)，试验Ⅰ组(BLNJ03酵母培养物组)和试验Ⅱ组(复配产朊假丝酵母组)的总增重和平均日增重均高于竞品组，其中试验Ⅰ组与竞品组相比，总增重提高10.31％、平均日增重提高11.11％，试验Ⅱ组与竞品组相比，总增重提高9.03％、平均日增重提高10.10％，说明本发明的酵母培养物具有提高肉牛增重的功效。

表19酵母培养物对肉牛生产性能的影响

2.2.2对肉牛血清抗氧化指标的影响

由表20可知，BLNJ03酵母培养物组、复配产朊假丝酵母组和竞品组的血清MDA含量均显著低于对照组(P＜0.05)，BLNJ03酵母培养物组的MDA也低于竞品组，但差异不显著(P＞0.05)；试验I组、试验II组的血清SOD、GSH、T-AOC均显著(P＜0.05)高于竞品组及对照组，竞品组的血清SOD、GSH、T-AOC也显著高于对照组(P＜0.05)。说明本发明的酵母培养物具有明显的提高机体抗氧化酶活性的作用，能够有效清除自由基，减少活性氧对机体造成的损伤，从而缓解冷、热等各种应激，提高机体抵抗力。

表20酵母培养物对肉牛抗氧化功能的影响

2.3结论：

2.3.1本发明的酵母培养物在提高肉牛增重方面具有较好的使用效果。

2.3.2本发明的酵母培养物在缓解肉牛应激、增强机体免疫力方面具有较好的使用效果。

3酵母培养物对肉羊生产性能的影响

3.1材料与方法

3.1.1试验动物

200头体重相近(15±3)kg的小尾寒羊。

3.1.2试验动物的选择、分组及饲养管理

将小尾寒羊随机分为4组，每组50头，分别为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、竞品组。对照组：饲喂基础日粮；试验I组：在饲喂基础日粮的基础上添加BLNJ03酵母培养物，添加比例为5‰；试验II组：BLNJ03酵母培养物复配4‰(质量分数)产朊假丝酵母干粉，复配混合物中酵母菌活菌数达5×10⁸cfu/g，按5‰比例添加至基础日粮；竞品组：添加市场上购买的竞品酵母培养物，添加比例为5‰。

试验日粮由牧场自行配制，采用TMR喂养技术，精饲料由山东宝来利来巴夫饲料有限公司提供，粗料为干草和青贮，精粗比约为40：60，试验设预试期7d，正试期30d。

3.1.3测定指标及方法

生产性能指标的检测：试验开始和结束的当天各试验组清晨空腹称量一次体重，计算肉羊的总增重、日增重。

血清生化指标的检测：于试验结束前一天清晨空腹采集血样，用真空抗凝采血管经颈静脉采血约10mL，3500r/min离心15min，分离出血浆，-20℃保存，用于血浆葡萄糖、白蛋白、尿素氮、总蛋白的测定，所用仪器为上海科华全自动生化分析仪。

3.2.试验结果与分析

3.2.1酵母培养物对肉羊生产性能的影响

由表21可知BLNJ03酵母培养物组和复配产朊假丝酵母组羊只的总增重、平均日增重均高于竞品组，试验I组、试验II组羊只的总增重、平均日增重均显著高于对照组(P＜0.05)。说明酵母培养物具有提高肉羊增重的功效，且本发明的酵母培养物的效果优于竞品。

表21酵母培养物对肉羊生产性能的影响

3.2.2酵母培养物对肉羊血清生化指标的影响

由表22可知，BLNJ03酵母培养物组、复配产朊假丝酵母组和竞品组羊只的的血清尿素氮显著低于对照组(P＜0.05)，BLNJ03酵母培养物组、复配产朊假丝酵母组显著低于竞品组(P＜0.05)；BLNJ03酵母培养物组、复配产朊假丝酵母组的血清白蛋白、IgG、IgA均显著高于竞品组及对照组(P＜0.05)，竞品组也显著高于对照组(P＜0.05)。说明酵母培养物能通过增加瘤胃微生物的数量，进而增加对日粮中含氮物质降解产生的氨的利用，导致减少经尿素循环进入血液中的氨含量，并可以改善肉羊蛋白质的合成及抗体水平。

表22酵母培养物对肉羊血液指标的影响

3.3结论：

3.3.1本发明酵母培养物在提高肉羊增重方面具有较好的使用效果。

3.3.2本发明酵母培养物可以降低血清尿素氮的含量，同时提高血清白蛋白及抗体含量，且在此方面的作用效果优于竞品。

Claims (6)

1.一株用于固体发酵的酿酒酵母，其特征在于，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03，已于2015年04月08日保藏在位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2015209。

2.权利要求1所述的酿酒酵母的固体发酵培养方法，其特征在于，步骤为：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液体种子按4-6％的接种量接种于固体发酵培养基中，发酵温度为28-30℃，有氧发酵时间为36-60h，厌氧发酵时间为72-96h；

所述固体发酵培养基是由基质和水按1g:(0.5-0.7)mL组成；其中，基质的组成为：按质量百分比计，麸皮90％、玉米面3％、豆粕7％；所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液体种子的制备方法，步骤如下：

(1)向灭菌、冷却后的酵母菌液体培养基中接种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLNJ03，摇床培养，得到一级种子酿酒酵母菌液；

(2)将一级种子酿酒酵母菌液接种于种子罐内的酵母菌液体培养基中，培养温度28-30℃，搅拌速度为70-90rpm，培养14-20h，即得酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLNJ03的液体种子；

步骤(1)和步骤(2)中，所述酵母菌液体培养基的组成为：葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％，泡敌0.05％，所述百分含量均为质量百分含量，pH值7.0。

3.权利要求2所述的培养方法制备得到的酿酒酵母发酵培养物。

4.权利要求3所述的酿酒酵母发酵培养物在水产动物和/或反刍动物养殖中的应用。

5.一种饲料添加剂，其特征在于，以权利要求3所述的酿酒酵母发酵培养物为有效成分，该饲料添加剂是由权利要求3所述的酿酒酵母发酵培养物复配产朊假丝酵母干粉而成，复配后混合物中酵母菌活菌数大于或等于5×10⁸cfu/g；

产朊假丝酵母于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2010090。

6.如权利要求5所述的饲料添加剂，其特征在于，该饲料添加剂是由权利要求3所述的酿酒酵母发酵培养物复配4‰的产朊假丝酵母干粉而成。