CN116850267B - 一种酵母细胞壁-抗菌肽a3复合制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种酵母细胞壁-抗菌肽a3复合制剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酵母细胞壁‑抗菌肽A3复合制剂及其制备方法与应用，属于酵母高值化利用技术领域。本发明的酵母细胞壁‑抗菌肽A3复合制剂由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比(8‑10)：1复配而成；所述酵母细胞壁由如下方法制备而成：将酿酒酵母发酵液固液分离，收集菌体沉淀；将菌体沉淀稀释得到菌液，调节菌液的pH至6.0‑7.0，加入木瓜蛋白酶，控制温度50‑60℃，处理12‑36h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙，混匀，干燥，制备得到酵母细胞壁。本发明的酵母细胞壁‑抗菌肽A3复合制剂能够提高抗菌肽A3在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的抗菌活性；并且，在提高动物机体生长性能、抗氧化能力及免疫指标等方面具有协同增效作用。
Description
技术领域
本发明涉及酵母高值化利用技术领域，具体涉及一种酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，随着养殖业向集约化、规模化、高密度转型，饲养畜禽容易遭受多种应激影响，主要表现为免疫力降低、易发病、死亡率高，畜产品质量受影响，可明显降低养殖效益。通过饲料添加剂手段解决以上问题，成为一种常规途径。
酵母细胞壁是一种全新的天然绿色添加剂，酵母细胞壁主要包含β-葡聚糖和甘露聚糖。β-葡聚糖具有免疫调节功能，是非特异性免疫刺激多糖，能与机体的免疫细胞受体特异性结合，刺激B细胞、T细胞、自然杀伤细胞产生大量巨噬细胞，进而调控机体免疫。甘露聚糖能增加动物体液免疫和细胞免疫能力，调节肠道菌群平衡，结合吸附外源性病原菌，并具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤等活性功能。
由于酵母细胞的营养物质都被厚厚的细胞壁所包围，为充分利用酵母细胞内丰富的营养资源，研究高效破壁手段显得尤为重要。酵母破壁就是对酵母细胞壁进行破碎，释放出里面的营养物质。常见的酵母破壁方法有酶法、超声波法、高压均质法以及自溶法等，但现有的酵母破壁方法仍存在破壁时间长、破壁率低、酵母多糖溶出率低等问题。
抗菌肽作为大多数生物对入侵病原体的自然防御***的重要组成部分，其具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌且不易引发细菌的耐药性。抗菌肽主要通过影响细胞质膜来发挥作用，因此细菌必须要改变它们膜的组成和结构来对抗菌肽产生抗药性，但这对菌体本身也会造成严重的伤害。细菌细胞膜外层富含阴离子磷脂，哺乳动物细胞膜的两性离子脂质比较丰富，这正是抗菌肽可以抗菌而对哺乳类细胞不造成损坏的主要原因。所以抗菌肽是一类极具发展潜力的生物药物。申请人在前期研究中筛选到一株产抗菌肽的多粘芽孢杆菌(CN 110484467B)，其能够自然高产小分子量(不大于5KDa)的抗菌肽，其中，分子量不大于5KDa的多肽占所述多粘芽孢杆菌蛋白上清液体积的65％以上，5KDa-3KDa的多肽占量接近20％，超滤浓缩后得到的5KDa-3KDa的多肽产量(蛋白浓度)高达2.73mg/mL，且其多肽纯化倍数达2.12，活性回收率达19.65％。但是，所产生的抗菌肽经胃蛋白酶作用后抑菌活性降低20％，胰蛋白酶作用后抑菌活性降低18％，因此，其口服应用效果仍有待进一步完善。
对于酵母细胞壁和抗菌肽的组合使用，专利CN 104782909A公开了一种饲料用抗菌肽脱霉剂，其采用构建酵母工程菌进行发酵生产，发酵培养过程中大量表达抗菌肽，在最终的发酵培养产物中同时具有酵母菌的细胞体和抗菌肽的表达产物，将细胞体自溶破壁后，分离纯化收集酵母细胞壁和抗菌肽，获得脱霉剂产品。但是，该专利仍是利用酵母细胞壁的吸附性能和抗菌肽的杀菌功能，未产生协同作用；而且该专利仅是提出了一个设计构想，并未对其效果进行验证。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂及其制备方法与应用。本发明采用自溶与酶解结合的破壁方法，制备得到酵母细胞壁；然后将制备的酵母细胞壁与保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌生产的抗菌肽A3复配，能够提高抗菌肽A3在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的抗菌活性；并且，在提高动物机体生长性能、抗氧化能力及免疫指标等方面具有协同增效作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂，由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比(8-10):1复配而成；
所述酵母细胞壁由如下方法制备而成：
将保藏编号CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种于酵母液体培养基中，30℃震荡培养24h，得到酵母发酵液，固液分离，将菌体沉淀稀释得到菌液，调节菌液的pH至6.0-7.0，加入木瓜蛋白酶，控制温度50-60℃，处理12-36h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙，混匀，干燥，制备得到酵母细胞壁。
其中，保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母记载在申请人的另一专利CN105062905B中。
作为优选，将菌体沉淀用水稀释至质量浓度为25-35％。本发明的菌体沉淀的稀释浓度是经过摸索验证的，稀释浓度过高，菌液过于粘稠，不易搅拌混匀，影响破壁率；稀释浓度过低，水分含量高，菌含量低，使得木瓜蛋白酶体积添加量高，增加破壁成本。将菌体沉淀稀释至质量浓度为25-35％，能够综合平衡破壁效果和破壁成本。
作为优选，所述木瓜蛋白酶的加入量为菌液体积的0.5‰-2‰。
作为优选，所述轻质碳酸钙的加入量为菌液体积的5％。通过加入轻质碳酸钙能够防止酵母细胞壁因糖含量高导致的喷雾干燥过程糊塔。
作为优选，所述酵母液体培养基的组成为：葡萄糖2wt％、酵母膏0.5wt％、蛋白胨1wt％、磷酸二氢钾0.2wt％，余量为水。
作为优选，所述抗菌肽A3由如下方法制备而成：
将保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体培养基中，37℃静置培养20h，得到多粘芽孢杆菌发酵液；将多粘芽孢杆菌发酵液离心，收集上清液，分别选用分子截留量为5KDa、3KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量为5KDa-3KDa的组分，冷冻干燥，得到抗菌肽A3。
更优选的，所述芽孢杆菌液体培养基的组成为：玉米浆0.5wt％、蛋白胨5wt％、葡萄糖3wt％、氯化钙0.25wt％，余量为水。
其中，保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌记载在申请人的另一专利CN 110484467B中。
作为优选，所述酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂，是由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比9:1复配而成。
本发明的第二方面，提供上述酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
将上述方法制备的酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比混合均匀，即得。
本发明的第三方面，提供上述酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)提高抗菌肽A3经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的活性保持率；
(2)制备提高动物机体生长性能、抗氧化性能和免疫能力的产品。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用自溶和酶解同时处理的破壁方法，利用活酵母本身含有的内源酶，水解菌体内部的高分子物质；同时添加外源蛋白酶，酶解酵母细胞壁的蛋白质层，促使甘露聚糖和葡聚糖大量释放，还创造了适宜的激发酶活性的条件，增强酵母细胞壁破壁效果，使酵母多糖得到充分利用。与现有的酵母破壁方法相比，本发明提高了酵母细胞壁的破壁率和酵母多糖的溶出率；而且，采用本发明方法制备的酵母细胞壁与其他破壁方法制备的酵母细胞壁相比，其对动物机体生长免疫有明显的提升效果。
(2)保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌生产的抗菌肽经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后，其抑菌活性下降，影响了其作为口服产品的应用。本发明将酵母细胞壁和抗菌肽A3复配后意外的发现，其能提高抗菌肽A3经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的活性保持率。
(3)本发明将酵母细胞壁和抗菌肽A3复配使用，与单独使用酵母细胞壁和抗菌肽A3相比，在促进机体生长、抗氧化、提高免疫能力、抑制病原菌等方面均有提升，具有协同增效作用。
附图说明
图1：不同温度的酵母自溶实验破壁的镜检图；图中A-D分别为30℃、40℃、50℃、60℃条件下自溶处理的镜检图。
图2：不同时间酵母自溶实验破壁的镜检图；图中A-G分别为0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h条件下自溶处理的镜检图。
图3：不同pH值酵母自溶实验破壁的镜检图；图中A-F分别为pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下自溶处理的镜检图。
图4：不同添加量诱导剂NaCl酵母自溶实验破壁的镜检图；图中A-E分别为NaCl添加量是菌液重量的0％、1％、2％、3％、4％条件下自溶处理的镜检图。
图5：不同酶制剂对酵母破壁的镜检图；图中：A为高温灭活处理的镜检图；B-F分别为加入高温灭活菌液体积1‰中性蛋白酶、1‰碱性蛋白酶、1‰木瓜蛋白酶、1‰β-葡聚糖酶、1‰甘露聚糖酶条件下酶解处理的镜检图。
图6：自溶+单一破壁酶考察实验的破壁镜检图；图中A-E分别为自溶+1‰中性蛋白酶、自溶+1‰碱性蛋白酶、自溶+1‰木瓜蛋白酶、自溶+1‰β-葡聚糖酶、自溶+1‰甘露聚糖酶条件下自溶+酶解处理的镜检图。
图7：自溶+复合破壁酶考察实验的破壁镜检图；图中A-G分别为自溶+1‰木瓜蛋白酶，自溶+1‰β-葡聚糖酶；自溶+1‰甘露聚糖酶；自溶+0.5‰木瓜蛋白酶+0.5‰β-葡聚糖酶；自溶+0.5‰木瓜蛋白酶+0.5‰甘露聚糖酶；自溶+0.5‰β-葡聚糖酶+0.5‰甘露聚糖酶；自溶+0.4‰木瓜蛋白酶+0.3‰β-葡聚糖酶+0.3‰甘露聚糖酶条件下自溶+酶解处理的镜检图。
图8：不同温度对酵母自溶酶解破壁的镜检图；图中A-E分别为25℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下自溶+1‰木瓜蛋白酶处理的镜检图。
图9：不同pH值对酵母自溶酶解破壁的镜检图；图中A-F分别为pH原始、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5条件下自溶+1‰木瓜蛋白酶处理的镜检图。
图10：不同处理时间对酵母自溶酶解破壁的镜检图；图中A-E分别为0h、12h、24h、36h、48h条件下自溶+1‰木瓜蛋白酶的镜检图。
图11：不同木瓜蛋白酶添加量对酵母自溶酶解破壁的镜检图；图中A-D分别为自溶+0.5‰木瓜蛋白酶、自溶+1‰木瓜蛋白酶、自溶+2‰木瓜蛋白酶、自溶+3‰木瓜蛋白酶的镜检图。
图12：酵母菌5吨发酵罐自溶酶解不同时间破壁的镜检图；图中A-E分别为处理0h、12h、24h、36h、48h的镜检图。
图13：抗菌肽A3经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的活性保持考察结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
酵母液体培养基：葡萄糖2wt％、酵母膏0.5wt％、蛋白胨1wt％、磷酸二氢钾0.2wt％，余量为水。
芽孢杆菌液体培养基：玉米浆0.5wt％、蛋白胨5wt％、葡萄糖3wt％、氯化钙0.25wt％，余量为水。
木瓜蛋白酶(20万U/g)、中性蛋白酶(20万U/g)、碱性蛋白酶(20万U/g)，购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司；β-葡聚糖酶(20万U/g)，购自四川绿骋生物科技有限公司；甘露聚糖酶(20万U/g)，购自河北仟盛生物科技有限公司。
实施例1：酵母破壁方法的优化考察
将保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种于酵母液体培养基中，30℃振荡培养24h，得到菌液。将菌液分别采用自溶破壁、酶解破壁、自溶酶解结合的方法进行破壁处理。采用革兰氏染色法镜检观察酵母破壁效果，按如下方法测定酵母细胞破壁率：收集破壁前后的酵母菌液，稀释适当的倍数，用血球计数板于光学显微镜下分别进行细胞计数。
酵母细胞破壁率(％)＝[(M－N)/M]×100％
式中，M，破壁前完整的酵母细胞个数；N，破壁后完整的酵母细胞个数。
1、自溶破壁
(1)自溶温度考察
将菌液分别在30℃、40℃、50℃、60℃自溶处理24h，检测不同自溶温度下酵母细胞破壁率，结果如表1和图1所示。
表1：不同温度的酵母自溶实验破壁率
由表1可以看出，自溶温度为60℃时，酵母细胞破壁率较高，故选择60℃进行下一步实验。
(2)自溶时间考察
将菌液在60℃条件下分别自溶处理0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h，检测不同自溶时间条件下酵母细胞破壁率，结果如表2和图2所示。
表2：不同时间酵母自溶实验破壁率
由表2可以看出，随着时间的增加，酵母自溶破壁率不断提高，但耗时过长，暂定72h为自溶时间，进行下一步实验。
(3)自溶pH值考察
调节菌液的pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后在60℃条件下自溶处理72h，检测不同自溶pH值条件下酵母细胞破壁率，结果如表3和图3所示。
表3：不同pH值酵母自溶实验破壁率
由表3可以看出，pH值为8.0时，酵母自溶破壁效果最佳，选择pH8.0进行下一步实验。
(4)不同添加量诱导剂考察
调节菌液的pH值为8.0，分别加入不同量的自溶诱导剂NaCl，NaCl的加入量分别为菌液重量的0％、1％、2％、3％、4％，然后在60℃条件下自溶处理72h，检测不同添加量诱导剂自溶条件下酵母细胞破壁率，结果如表4和图4所示。
表4：不同添加量诱导剂NaCl酵母自溶实验破壁率
由表4可以看出，添加诱导剂NaCl对酵母自溶破壁率结果影响不显著，暂不添加。
由上述实验结果可以看出，酵母自溶优化的条件为：60℃，pH8.0，不加诱导剂，自溶72h；酵母细胞破壁率为45％左右，但是自溶时间过长，希望可以通过其它破壁方法缩短时间。
2、酶解破壁
将酵母菌液经121℃高温灭活处理后，分别加入菌液体积的1‰中性蛋白酶、1‰碱性蛋白酶、1‰木瓜蛋白酶、1‰β-葡聚糖酶、1‰甘露聚糖酶，均放入50℃摇床震荡24h，检测酵母细胞破壁率，结果如表5和图5所示。
表5：不同酶制剂对酵母破壁的影响
由表5和图5可以看出，不同蛋白酶对酵母破壁均有很好的效果，以木瓜蛋白酶破壁效果最佳，酵母细胞破壁率为57.69％。但是酵母菌灭活后，无法利用活酵母本身含有的内源酶，所以镜检结果可以看出，酵母菌个体明显变小，但细胞壁无法完全破碎，破壁率无法达到理想效果。因此保持酵母菌活性，以酵母自溶的适宜条件为基本，尝试自溶与酶解相结合的破壁方法，进行下一步实验。
3、自溶酶解结合
(1)自溶+单一破壁酶考察
向酵母菌液中分别加入菌液体积的1‰中性蛋白酶、1‰碱性蛋白酶、1‰木瓜蛋白酶、1‰β-葡聚糖酶、1‰甘露聚糖酶，均放入50℃摇床震荡24h，检测酵母细胞破壁率，结果如表6和图6所示。
表6：自溶+单一破壁酶对酵母破壁的影响
由表6可以看出，不同蛋白酶对酵母破壁均有很好的效果，以木瓜蛋白酶破壁效果最佳，加入菌液体积的1‰木瓜蛋白酶，酵母细胞破壁率最高，为87.69％。
(2)自溶+复合破壁酶考察
向酵母菌液中分别加入菌液体积的1‰木瓜蛋白酶、1‰β-葡聚糖酶、1‰甘露聚糖酶、0.5‰木瓜蛋白酶+0.5‰β-葡聚糖酶、0.5‰木瓜蛋白酶+0.5‰甘露聚糖酶、0.5‰β-葡聚糖酶+0.5‰甘露聚糖酶、0.4‰木瓜蛋白酶+0.3‰β-葡聚糖酶+0.3‰甘露聚糖酶，均放入50℃摇床震荡24h，检测酵母细胞破壁率，结果如表7和图7所示。
表7：自溶+复合破壁酶对酵母破壁的影响
由表7可以看出，单一木瓜蛋白酶的破壁效果优于复合酶破壁，因此选择木瓜蛋白酶进行下一步实验。
(3)不同温度的考察
向酵母菌液中加入菌液体积的1‰木瓜蛋白酶，分别放入25℃、40℃、50℃、60℃、70℃摇床震荡24h，检测酵母细胞破壁率，结果如表8和图8所示。
表8：不同温度对酵母自溶酶解破壁的影响
由表8可以看出，60℃酵母酶解破壁率最高，破壁效果最好，选择60℃进行下一步实验。
(4)不同pH的考察
分别调节酵母菌液的pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，向菌液中加入菌液体积的1‰木瓜蛋白酶，放入60℃摇床震荡24h，检测酵母细胞破壁率，结果如表9和图9所示。
表9：不同pH值对酵母自溶酶解破壁的影响
由表9可以看出，pH值为6.5时酵母细胞破壁率最高，选择pH6.5进行下一步实验。
(5)不同处理时间的考察
调节酵母菌液的pH值为6.5，向菌液中加入菌液体积的1‰木瓜蛋白酶，分别放入60℃摇床震荡0h、12h、24h、36h、48h，检测酵母细胞破壁率，结果如表10和图10所示。
表10：不同处理时间对酵母自溶酶解破壁的影响
由表10可以看出，12h时酵母细胞破壁率可达到77.08％，24h时酵母细胞破壁率可达到95.19％，36h时酵母细胞破壁率可达到96.77％，48h时酵母细胞破壁率可达到98.67％，综合考虑选择自溶酶解破壁时间为24h。
(6)不同木瓜蛋白酶添加量的考察
调节酵母菌液的pH值为6.5，分别向菌液中加入菌液体积的0.5‰、1‰、2‰、3‰的木瓜蛋白酶，分别放入60℃摇床震荡24h，检测酵母细胞破壁率，结果如表11和图11所示。
表11：木瓜蛋白酶对酵母自溶酶解破壁的影响
由表11可以看出，24h，60℃，pH6.5，0.5‰木瓜蛋白酶破壁率可达90.48％，1‰木瓜蛋白酶破壁率可达94.23％。鉴于成本考虑，确定酵母自溶酶解破壁条件为：0.5‰木瓜蛋白酶，24h，60℃，pH6.5，破壁率可达90.48％。
实施例2：酵母菌自溶酶解放大试验
1、试验方法
将保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母活化液按体积比5％接种至装有酵母液体培养基的5吨发酵罐中，30℃发酵培养24h，得到发酵液。将发酵液固液分离，收集菌体沉淀，再将菌体沉淀用灭菌水稀释成质量浓度为30％的菌液，调节菌液的pH值为6.5，向菌液中加入菌液体积0.5‰的木瓜蛋白酶，控制温度60℃，每12h搅拌一次，取样一次，菌液镜检，测定酵母细胞破壁率。用酵母多糖溶出率的测试方法，计算酵母多糖溶出率。
酵母多糖溶出率的测试方法如下：
(1)标准曲线的绘制：精密称取经80℃烘箱干燥至恒重的无水葡萄糖0.01g，用少量蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶中定容。此为葡萄糖标准液，其中葡萄糖含量为0.1mg/mL。依次取葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL分别置于9个具塞试管中，各试管中依次加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4mL的蒸馏水，形成2mL的溶液体系。向各试管内加入6.25％苯酚溶液1.0mL，摇匀后迅速滴加5.0mL浓硫酸，摇匀，室温静置5min，沸水浴25min，取出，冷却至室温。将此混合液置于常量石英比色皿中，用紫外分光光度计于490nm波长处测定吸光度。葡萄糖标准曲线方程为：y＝15.2x+0.077(R2＝0.9901)，式中：y，D490nm值；x，葡萄糖浓度(mg/mL)。
(2)样品测定：将菌液样品于4000r/min离心15min，收集上清液作为酵母多糖溶出液，将酵母多糖溶出液稀释适宜倍数，吸取2.0mL稀释液置于具塞试管中，后续试验方法同标准曲线绘制方法。
酵母多糖溶出率(mg/g)＝多糖浓度(mg/mL)×多糖溶出液体积(mL)/相应的酵母菌泥质量(g)。
2、试验结果
酵母细胞破壁率和酵母多糖溶出率的检测结果如表12所示；镜检图片如图12所示。
表12：5吨发酵罐自溶酶解不同时间酵母细胞破壁率及酵母多糖溶出率
由表12可以看出，自溶与酶解结合破壁12h，酵母多糖溶出率为151.291mg/g，酵母细胞破壁率为73.18％；破壁24h，酵母多糖溶出率为160.852mg/g，酵母细胞破壁率为95.61％；破壁36h，酵母多糖溶出率为179.935mg/g，酵母细胞破壁率为97.68％；破壁48h，酵母多糖溶出率为183.419mg/g，酵母细胞破壁率为98.97％。
实施例3：酵母细胞壁的制备
将保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种至酵母液体培养基中，接种量为酵母液体培养基体积的5％，30℃发酵培养24h，得到发酵液。将发酵液固液分离，收集菌体沉淀，再将菌体沉淀用灭菌水稀释成质量浓度为30％的菌液，调节菌液的pH值为6.5，向菌液中加入菌液体积0.5‰的木瓜蛋白酶，控制温度60℃，处理24h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙(轻钙)，轻质碳酸钙的加入量为菌液体积的5％，混匀，喷雾干燥，制备得到酵母细胞壁。
实施例4：抗菌肽A3的制备
将保藏号CCTCC No:M2019530的多粘芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体培养基中，接种量为芽孢杆菌液体培养基体积的5％，37℃静置培养20h，得到多粘芽孢杆菌发酵液；将多粘芽孢杆菌发酵液离心，收集上清液，分别选用分子截留量为5KDa、3KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量为5KDa-3KDa的组分，冷冻干燥，得到抗菌肽A3。
实施例5：酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂的制备
将实施例3制备的酵母细胞壁和实施例4制备的抗菌肽A3按质量比9:1混合均匀，制备得到酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂。
对比例1：单独酶解制备酵母细胞壁
将保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种至酵母液体培养基中，接种量为酵母培养基体积的5％，30℃发酵培养24h，得到发酵液。将发酵液固液分离，收集菌体沉淀，再将菌体沉淀用灭菌水稀释成质量浓度为30％的菌液，调节菌液的pH值为6.5，将菌液高温灭菌，晾凉后向菌液中加入菌液体积0.5‰的木瓜蛋白酶，控制温度60℃，处理24h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙，轻质碳酸钙的加入量为菌液体积的5％，混匀，喷雾干燥，制备得到酵母细胞壁。
对比例2：单独自溶制备酵母细胞壁
将保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种至酵母液体培养基中，接种量为酵母液体培养基体积的5％，30℃发酵培养24h，得到发酵液。将发酵液固液分离，收集菌体沉淀，再将菌体沉淀用灭菌水稀释成质量浓度为30％的菌液，调节菌液的pH值为6.5，控制温度60℃，处理24h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙，轻质碳酸钙的加入量为菌液体积的5％，混匀，喷雾干燥，制备得到酵母细胞壁。
参照实施例1中的方法对实施例3、对比例1-2制备的酵母细胞壁的破壁率进行测定，结果如表13所示。
表13：不同方法制备的酵母细胞壁的破壁率
由表13的结果可以看出：本发明采用自溶与酶解结合的破壁方法，在提高酵母细胞破壁率方面具有显著的协同增效作用。
试验例1：抗菌肽A3稳定性研究
1、试验方法
参考专利CN 110484467A记载的方法，对抗菌肽A3经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的稳定性进行研究，具体方法如下：
37℃水浴条件下，用反应浓度均为1mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶分别处理实施例4制备的抗菌肽A3和实施例5制备的酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂30min，测定各种酶处理液对大肠杆菌CVCC1556的抑菌活性。以不加酶处理的抗菌肽A3和酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂作为对照，酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂中的抗菌肽A3的含量与单独的抗菌肽A3含量保持一致，其抑菌活力定为100％。
2、试验结果
结果如图13所示，经胃蛋白酶作用后抗菌肽A3活性降低21％，胰蛋白酶作用后抗菌肽A3活性降低19％；经胃蛋白酶作用后酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂活性降低5％，胰蛋白酶作用后酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂活性降低3％。
上述结果表明：将酵母细胞壁和抗菌肽A3复配，能够提高抗菌肽A3经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的活性保持率。
试验例2：小鼠试验
1、材料与方法
1.1实验动物及分组：雄性昆明小鼠126只(24g±2g)，分为7组，每组18只(分3个平行组)。具体实验分组见表14。
表14：酵母破壁粉及抗菌肽A3对小鼠免疫功能影响实验分组
其中：活性酿酒酵母粉采用的是市售澳福酿酒酵母菌粉，200亿/g；自溶破壁酵母粉采用的是对比例2制备的酵母细胞壁；酶解破壁酵母粉采用的是对比例1制备的酵母细胞壁；自溶+酶解破壁酵母粉采用的是实施例3制备的酵母细胞壁；抗菌肽A3采用的是实施例4制备的抗菌肽；自溶酶解酵母细胞壁+抗菌肽A3采用的是实施例5制备的酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂。
试验期间各处理组小鼠均饲喂基础日粮(基础日粮为购自济南朋悦实验动物繁育有限公司的实验鼠饲料)，预饲7d后，按表14中用量每天灌胃1次，连续灌胃21d，试验总计28d。
1.2试验方法
1.2.1动物分组及给药方案：将126只小鼠分配成7组，即CK组(作为空白对照)、活性酿酒酵母组(作为阳性对照)、自溶酵母细胞壁组，酶解酵母细胞壁组、自溶酶解酵母细胞壁组、抗菌肽A3组、自溶酶解酵母细胞壁+抗菌肽A3组；每组有18只小鼠(分3个平行组)。试验期间小鼠均饲喂基础日粮，先预饲养1周，称重然后进行灌胃试验(用量见表14)，时间为3周，每周称重一次。小鼠自由采食、饮水、每三天更换一次垫料。在宰杀小鼠的前24h断粮，在第28天试验结束后对小鼠进行体重称量，利用摘除眼球法采血，之后处死并对其解剖采集胸腺、脾脏和肝脏并称重，取肠道内容物-20℃保存备用。血样于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，3000r/min离心10min，收集血清，-20℃保存。
1.2.2抗氧化指标的测定：采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)的浓度。
1.2.3免疫指标的测定：采用上海酶联生物小鼠ELISA试剂盒检测血清中白细胞介素2(IL-2)、免疫球蛋白G(IgG)的浓度；采用上海酶联生物小鼠ELISA试剂盒检测肠道内容物中分泌型免疫球蛋白(sIgA)的浓度。
1.2.5肠道菌群数量的测定：取肠道内容物各0.1g，于100mL灭菌生理盐水中摇匀，然后取1mL于试管中，加入无菌0.9％生理盐水9mL，振荡混匀，依次按10倍等比稀释。其中乳酸杆菌接种于乳酸菌选择性培养基(LBS)上培养，在37℃生化培养箱中培养48h后进行菌落计数；大肠杆菌则接种于伊红美兰琼脂培养基上培养，在37℃生化培养箱中培养24h后进行菌落计数。菌群数量以每克肠道内容物所含细菌群落总数的对数[(lg cfu/g)]表示。
2、试验结果
2.1酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠体重的影响
表15：酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠体重的影响(g)
注：不同小写字母表示结果差异显著(P＜0.05)，相同字母表示结果差异不显著(P＞0.05)。下表同。
由表15可以看出，试验各组体重从灌胃7d开始产生差异，6组体重显著高于CK组、1组、2组、3组、5组(P﹤0.05)；灌胃14d，4组和6组显著高于CK组、1组、2组、5组(P﹤0.05)；灌胃21d，4组和6组显著高于其它各组，2组、3组显著高于空白组(P﹤0.05)。可见添加酵母细胞壁可显著提高动物体重，单独添加抗菌肽对体重影响较小，添加酵母细胞壁和抗菌肽A3复合制剂组效果最佳。
2.2酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠抗氧化能力的影响
表16：酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠抗氧化能力的影响(U/mL)
由表16可以看出，小鼠灌胃21d后，6组SOD显著高于其他各组(P﹤0.05)；6组T-AOC显著高于其他各组(P﹤0.05)；4组、5组、6组CAT显著高于CK组、1组(P﹤0.05)。可见添加酵母细胞壁可显著提高机体抗氧化能力，抗菌肽对抗氧化指标无显著效果，但优于空白对照组，添加酵母细胞壁和抗菌肽A3复合制剂组效果最佳。
2.3酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠免疫指标的影响
表17：酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠免疫指标的影响
由表17可以看出，小鼠灌胃21d后，5组、6组IL-2含量显著高于其它各组(P﹤0.05)；6组IgG含量、sIgA含量均显著高于其它各组(P﹤0.05)。可见单独添加抗菌肽可显著提升抗炎因子IL-2含量，但添加酵母细胞壁和抗菌肽A3复合制剂组效果最佳。添加酵母细胞壁和抗菌肽A3复合制剂可显著提升免疫指标IgG含量、sIgA含量，优于单独添加酵母细胞壁组和单独添加抗菌肽组，具有显著的协同增效作用。
2.4酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠肠道乳酸杆菌和大肠杆菌数量的影响
表18：酵母细胞壁和抗菌肽A3对小鼠肠道乳酸杆菌和大肠杆菌数量的影响(lgcfu/g)
由表18可以看出，小鼠灌胃21d后，4组、5组、6组乳酸杆菌数量显著高于其它各组(P＜0.05)；5组、6组大肠杆菌数量显著低于其它各组。可见酵母细胞壁对乳酸杆菌增殖起到显著作用，抗菌肽对大肠杆菌起到显著抑制作用，添加酵母细胞壁和抗菌肽A3复合制剂组效果最佳。
通过小鼠试验可以看出，酵母细胞壁可显著提高小鼠体重、抗氧化能力、免疫指标，抗菌肽可显著提高小鼠免疫指标，尤其是抗炎因子IL-2含量，还可显著抑制大肠杆菌。酵母细胞壁和抗菌肽A3两者结合对体重、抗氧化指标、免疫指标均优于单独添加，具有协同增效作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (5)
1.酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂在提高抗菌肽A3经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的活性保持率中的应用；
所述酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比(8-10)：1复配而成；
所述酵母细胞壁由如下方法制备而成：
将保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种于酵母液体培养基中，震荡培养，得到酵母发酵液，固液分离，将菌体沉淀稀释得到菌液，调节菌液的pH至6.0-7.0，加入木瓜蛋白酶，控制温度50-60℃，处理12-36h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙，混匀，干燥，制备得到酵母细胞壁；
所述抗菌肽A3由如下方法制备而成：
将保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体培养基中，37℃静置培养20h，得到多粘芽孢杆菌发酵液；将多粘芽孢杆菌发酵液离心，收集上清液，分别选用分子截留量为5KDa、3KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量为5KDa-3KDa的组分，冷冻干燥，得到抗菌肽A3；
所述芽孢杆菌液体培养基的组成为：玉米浆0.5wt％、蛋白胨5wt％、葡萄糖3wt％、氯化钙0.25wt％，余量为水。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，酵母细胞壁的制备方法中，将菌体沉淀用水稀释至质量浓度为25-35％。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，酵母细胞壁的制备方法中，所述木瓜蛋白酶的加入量为菌液体积的0.5‰-2‰。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，酵母细胞壁的制备方法中，所述轻质碳酸钙的加入量为菌液体积的5％。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂，是由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比9:1复配而成。
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