CN110734867B - 一株深海来源的酵母菌q7-7及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株深海来源的酵母菌Q7‑7及其应用，涉及水产饲料。所述深海来源的酵母菌Q7‑7为近玫色锁掷酵母(Sporidiobolus pararoseus)Q7‑7，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2019662。可在制备新型水产饲料添加剂中的应用。从大洋样品分离出的深海酵母，使用ITS4、ITS5引物扩增得到其ITS序列，培养过程中发现其长势良好并能够产生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，其发酵液混合物可生产为水产饲料添加剂。通过温度、转速、接种量和裝液量四因素三水平的正交试验确定了其最佳发酵条件，通过对虾幼苗育苗实验确定了其应用。

Description

一株深海来源的酵母菌Q7-7及其应用
技术领域
本发明涉及水产饲料，尤其是涉及一株深海来源产淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶的酵母菌Q7-7及其应用。
背景技术
水产饲料是专门为水生动物养殖提供的饵料。按饲喂品种，水产饲料可分为鱼饲料、虾料和蟹料等；按饲料特点，可分为配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料。水产饲料生产的原料主要由鱼粉、谷物原料和油脂构成，鱼粉和谷物原料往往占到饲料成本的50％以上。近年来，随着水产养殖业迅速发展，有较高效益的饲料添加剂相继研制及应用，并取得了很好的效益。使用绿色环保型水产饲料添加剂，正受到人们越来越多的关注。
包含发酵液的酵母培养物是一种复杂的纯天然发酵产品，通常被认为是蛋白质、核酸、维生素和多糖的良好来源，其成分主要包括变性培养基(通常为寡糖等)、酵母细胞(细胞壁主要成分为葡聚糖和甘露聚糖，内容物为蛋白质、氨基酸、维生素、各种酶类等)、酵母细胞外代谢产物(如肽、有机酸、寡糖、氨基酸、营养因子等)。酵母培养物在养殖业中的应用始于20世纪20年代。迄今为止，其在反刍动物、猪等养殖领域已有广泛应用；在水产动物方面的报道见于草鱼、奥尼罗非鱼、凡纳滨对虾等，这些研究表明，酵母培养物具有促进生长、调节微生态环境和增强免疫力等作用。
淀粉酶是水产动物消化吸收淀粉的关键酶，除了动物生产行业，淀粉酶还普遍应用于造纸、纺织、医药、食品加工等行业。在动物生产行业中，主要将淀粉酶添加到动物饲料中以弥补动物体内淀粉酶的不足，从而可以提高饲料的利用率，降低养殖成本，且减少养殖环境的污染。动物可以通过饲料来获取人为添加的外源淀粉酶，其自身消化***也可以分泌出内源消化酶。不论是外源淀粉酶还是内源淀粉酶，其都可以帮助动物消化饲料中的淀粉，增强动物机体的免疫能力，有利于动物的生长([1]张余慧，程晓芳，袁丹丹，王琤(华韦).浅谈淀粉酶在动物生产中的应用研究进展[J].广东饲料，2018，27(03):33-35)。
较畜禽而言，水产动物的消化***更为简单，因此幼年时期的水产动物内源淀粉酶大多分泌不足，影响幼体的发育。外源淀粉酶应用到水产动物饲料中能够刺激幼体分泌内源淀粉酶，有利于其对饲料的消化吸收。同时由于近年来水体污染严重，许多成年水产动物的机体健康受到影响，也需要在其饲料中添加适量淀粉酶来增加其消化道淀粉酶的含量。添加外源淀粉酶还可以增强生产动物机体的抗氧化能力和免疫性能。饲料中单独添加淀粉酶时，其作用效果不明显。因此，淀粉酶常与其他种类的酶一起制成复合酶制剂应用于水产动物饲料当中。
在饲料中增加脂肪的含量，会产生对蛋白质的节约效应，提高蛋白质效率，促进动物生长。就脂肪能量来说，它远远高于碳水化合物所具备的能量，在动物营养物质中占据着极为关键的地位。向动物饲料中添加一定的脂肪粉和油脂来达到满足动物能量需求的目的([2]陈枫，韦仕航.微生物脂肪酶在动物饲料中的应用探讨[J].当代畜牧，2014(17):84-85)。现如今饲料资源的严重缺乏，要想满足所有动物能量的需求，就必须要不断提高饲料的消化利用率。饲粮中添加脂肪酶的价值在于靶向解决动物内源消化酶不足，以提高脂肪消化吸收利用，提高饲料中脂肪能量利用率，促进脂溶性维生素的吸收，发挥动物生产潜力和降低饲料成本。脂肪酶的添加能最大限度地提高脂肪的消化率，脂肪酶在脂质代谢中发挥重要作用，是脂肪消化利用最基本的酶，能将脂肪水解为游离脂肪酸、甘油和甘油单醋供动物吸收利用，最终使养殖动物增重增产。
水产动物对营养物质的消化利用率虽高，由于内源酶并没有完全发挥作用，因此外源酶制剂的添加就显得尤为重要，在水产饲料中添加蛋白酶可以促进对蛋白质的消化吸收，增加机体的生产性能。在水产动物营养中，高效的蛋白质消化率可以更有效、更充分的实现饲料原料的应用价值，保证生产效率，维持肠道健康和减少环境中氨氮的排放。除了对蛋白质营养的贡献外，蛋白酶也可以协助释放其它养分(如淀粉、脂肪和矿物质)、降解蛋白类抗营养因子和抗原(如植物凝集素、伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子)，抑制上述抗原类所诱导的不必要的耗能免疫反应，降低未被动物消化的养分水平。并且，通过增加蛋白质的消化率，蛋白酶还可以降低到达胃肠道后段的蛋白质含量，从而减少有害微生物的发酵底物([3]陈友俭.水产饲料蛋白源的研究现状[J].福建农业科技，2011(03):87-89)。
发明内容
本发明目的在于提供一株可用于制备水产饲料添加剂的深海来源产淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶的酵母菌Q7-7及其应用。
所述深海来源的酵母菌Q7-7为近玫色锁掷酵母(Sporidiobolus pararoseus)Q7-7，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2019662。
所述深海来源的酵母菌Q7-7的微生物学特征为：在YPD平板上18～35℃下培养72h后，菌落正面呈现橘红色，反面呈橘粉色；菌落表面凹凸不平光泽较暗，边缘不规则，菌落中央与边缘的颜色一致。表面粘稠，易挑起，随着培养时间增加，菌落颜色变暗，主菌落周围会分生出各种小菌落，酵母单个或成团分布，单细胞(3～4)×(5～6)μm，呈圆形至椭圆形。
所述深海来源的酵母菌Q7-7的基因组DNA提取方法包括以下步骤：
1)将保种或已纯化的真菌接种到YPD平板上，18～35℃生长2～3天后，挑取菌丝体至EP管，放入液氮中冻30～60min；
2)取出冷冻的菌体，每管加入400μL，65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃；
3)取出冷冻的菌体，每管加入400μL，65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃振荡水浴摇床中保温45～60min；
4)加入等体积的酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，充分混匀，13000r/min离心20～30min，将上层水相移入新管；
5)重复步骤3)；
6)上清加入0.7倍体积的异丙醇，于4℃中静置30min或者过夜；
7)13000r/min离心15min，除去上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，吹干；
8)以20μL DDW溶解沉淀，-20℃保存。
9)取5μL DNA与1μL溴酚蓝；在0.8％的琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度。
所述深海来源的酵母菌Q7-7的ITS序列如下：
Figure BDA0002296245670000031
所述深海来源的酵母菌Q7-7可在制备新型水产饲料添加剂中的应用。
本发明从大洋样品分离出的深海酵母，使用ITS4、ITS5引物扩增得到其ITS序列，经鉴定该株菌为Sporidiobolus pararoseus。培养过程中发现其长势良好并能够产生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，其发酵液混合物可生产为水产饲料添加剂。经过碳氮源和无机盐的单因子筛选以及一系列正交试验确定了深海来源的酵母菌Q7-7的最佳发酵培养基配方，并通过温度、转速、接种量和裝液量四因素三水平的正交试验确定了其最佳发酵条件，通过对虾幼苗育苗实验确定了其应用。
附图说明
图1为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7菌落形态正面图。
图2为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7菌落形态反面图。
图3为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7透射电子显微镜检形态。
图4为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的ITS扩增产物凝胶电泳图。
图5为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的生长曲线图。
图6为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的蛋白酶水解圈正面图。
图7为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的蛋白酶水解圈反面图。
图8为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的脂肪酶水解圈正面图。
图9为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的脂肪酶水解圈反面图。
图10为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的淀粉酶水解圈正面图。
图11为本发明所述深海来源的酵母菌Q7-7的淀粉酶水解圈反面图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
1、菌株的分离鉴定
从大洋沉积物样品中分离到一株锁掷孢酵母表现为能同时产生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，可用于制备成酵母饲料添加剂。
所述深海来源的酵母菌Q7-7为近玫色锁掷酵母(Sporidiobolus pararoseus)Q7-7，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2019662。
所述深海来源的酵母菌Q7-7的微生物学特征为：在YPD平板上28℃培养72h后，菌落正面呈现橘红色，反面呈橘粉色。菌落表面凹凸不平光泽较暗，边缘不规则，菌落中央与边缘的颜色一致。表面粘稠，易挑起，随着培养时间增加，菌落颜色变暗，主菌落周围会分生出各种小菌落(参见图1和2)，扫描电镜下酵母单个或成团分布，单细胞(3～4)×(5～6)μm，呈圆形至椭圆形(参见图3)。
2、所述深海来源的酵母菌Q7-7的基因组DNA提取方法包括以下步骤：
1)将保种或已纯化的真菌接种到YPD平板上，28℃生长2～3天后，挑取菌丝体至EP管，放入液氮中冻30～60min；
2)取出冷冻的菌体，每管加入400μL 65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃；
3)取出冷冻的菌体，每管加入400μL 65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃振荡水浴摇床中保温45～60min；
4)加入等体积的酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1)，充分混匀，13000r/min离心20～30min，将上层水相移入新管；
5)取出冷冻的菌体，每新管加入400μL 65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃振荡水浴摇床中保温45～60min；
6)上清加入0.7倍体积的异丙醇，于4℃中静置30min或者过夜；
7)13000r/min离心15min，除去上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，吹干；
8)以20μL DDW溶解沉淀，-20℃保存。
9)取5μL DNA与1μL溴酚蓝；在0.8％的琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度。
3、所述深海来源的酵母菌Q7-7的鉴定
本发明通过引物ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’和ITS5 5’-GGA AGTAAA AGT CGT AAC AAG G-3’对A65基因组DNA进行扩增，PCR为95℃预变性3min 95℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸45s：32个循环，72℃延伸10min，4℃保温。克隆片段跑胶参见图4。
所述深海来源的酵母菌Q7-7的ITS序列结果如下：
Figure BDA0002296245670000051
Figure BDA0002296245670000061
对深海来源的酵母菌Q7-7的ITS序列(GENE Bank ID：HQ832836.1)进行BLAST分析，结果显示该序列和Sporidiobolus pararoseus culture CBS:499(GENE Bank ID：KY105483.1)相似度最高，达到100％。故可鉴定该株菌属于酵母菌属(Sporidioboluspararoseus)。
实施例2深海来源的酵母菌Q7-7的ITS序列发酵培养基的优化配制
本发明选取了多种能用于酵母菌Q7-7发酵培养基的碳源、氮源和其他生长因子，在28℃，裝液量ml/250m，接种量1％，转速180r/min的同一培养条件下进行酵母Q7-7发酵培养比较，综合考虑菌含量和酶等指标，在发酵至72h进行称重筛选出其中最适合酵母菌Y5发酵的培养基。优化发酵培养基通常采用单因子法和正交试验设计法，单因子方差分析是一种简单的方差分析模型。它只需将因子效应与误差效应分离开，并通过比较均方来判断因子效应的显著性。正交实验法则凭借其只要较少的实验次数即可引出许多有价值的结论，正交实验法通常和单因子法结合使用。
单因子法：利用单一变量法从待选的各种碳源氮源无机盐中逐一筛选出最合适的发酵碳源是蔗糖，最合适的发酵氮源是酵母膏提取物和蛋白胨，最合适的发酵无机盐是MgSO4。
正交实验法：采用正交表安排多因素试验的方法，称为正交试验设计法。其特点为：
①完成试验要求所需的实验次数少；
②数据点的分布很均匀；
③可用相应的极差分析方法、方差分析方法、回归分析方法等对试验结果进行分析，引出许多有价值的结论。
正交试验设计方法采用正交表试验，酵母菌Q7-7发酵培养基正交实验因素水平参见表1。
表1
Figure BDA0002296245670000062
结果最终得到酵母菌最佳培养基为：pH7，蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母膏2％，MgSO41％。
酵母菌Q7-7发酵培养基优化正交试验及结果参见表2
表2
Figure BDA0002296245670000063
Figure BDA0002296245670000071
实施例3酵母菌Q7-7发酵条件的优化及生长曲线
发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用，尤其是在发酵生产中，它是提高发酵指标的一项非常必要的技术手段。发酵工艺优化的方法有很多，它们之间不是孤立的，而是相互联系的，往往是多种优化方法的结合，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，为其提供最佳的环境条件，最终才能得到其最大生物量以及最优的代谢产物。
微生物生长曲线是以微生物数量(活细菌个数或细菌重量)为纵坐标，培养时间为横坐标画得的曲线。了解微生物的生长过程对于工业发酵是非常有必要的。采用比浊法来测量酵母菌Q7-7的生长曲线参见图5。
采用一系列正交试验的正交试验，利用优化后的培养基，研究温度、接种量、摇床转速以及摇瓶装液量对海洋酵母Q7-7的发酵影响，酵母菌Q7-7发酵条件优化正交试验及结果参见表3。
表3
Figure BDA0002296245670000081
Figure BDA0002296245670000091
实施例4酵母菌Q7-7蛋白酶产酶效果
蛋白质是动物养殖中非常重要的营养元素之一，蛋白酶是作用于蛋白质或多肽、催化肽键水解的酶。水产动物在食用了富含蛋白酶的饲料后能够促进动物对各类蛋白的消化吸收，从而是各类水产动物增重增产。
将筛选出的酵母菌在YPD平板上划线分离，在28℃培养2d后长出单菌落，用牙签挑取单菌落点种在蛋白酶培养基平板上，再培养3d，每天观察水解圈情况，将能产生水解圈的所有菌株作为复筛的出发菌株。
蛋白酶筛选培养基：干酪素8.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4 0.5g，NaCl 5.0g，牛肉浸出粉1.0g，琼脂粉15g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.4。培养48h后看是否有透明菌圈产生。如图6和7所示，Q7-7在蛋白酶培养至48h后周围产生了大于1cm的透明圈，表明，该菌具有良好的产蛋白酶效果。
实施例5酵母菌Q7-7脂肪酶产酶效果
将筛选出的酵母菌在YPD平板上划线分离，在28℃培养2d长出单菌落，用牙签挑取单菌落点种在脂肪酶培养基平板上，再培养3d，每天观察水解圈情况，能产生水解圈的菌株即为产酶菌株。
脂肪酶筛选培养基：Na2HPO4 2.0g，MgSO4 0.5g，NaCl 5.0g，蛋白胨20g，葡萄糖10g，酵母膏10g，琼脂粉15g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.4。培养48h后看是否有水解圈产生。如图8和9所示，Q7-7在脂肪酶培养至48小时后周围产生了半径为0.8cm的水解圈，表明该菌具有产脂肪酶效果。
实施例6酵母菌Q7-7淀粉酶产酶效果
将筛选出的酵母菌在YPD平板上划线分离，在28℃培养2d长出单菌落，用牙签挑取单菌落点种在脂肪酶培养基平板上，培养3天后将配置好的碘原液倒入平板中进行显色反应，10分钟后，观察平板是否有透明圈。
脂肪酶筛选培养基：1％的酵母提取物、2％胰蛋白胨、2％可溶性淀粉、1.5％琼脂，滤过海水配制，121℃高压灭菌20min。
碘原液：采用1︰10的比例配置碘液，0.5g碘结晶、5gKI、100ml蒸馏水。
如图10和11所示，Q7-7在淀粉酶培养至48h后周围产生了半径大于1.5cm的透明圈，表明，该菌具有良好的产淀粉酶效果。
实施例7酵母菌Q7-7饲料添加剂的制备及对虾养殖中的应用
将菌株红酵母的培养按斜面、液体种子、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为的YPD培养基(酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖％)。将保种管中的Y5活化到斜面培养基上，待其生长48h后，挑取单菌落加入到YPD种子液培养基中，种子液摇培24h后，按接种量接入到扩大发酵瓶中。液体发酵培养基配方:蔗糖4％，蛋白胨2％，酵母膏2％，MgSO41％，pH7。所有发酵培养条件均为30℃，180r/min，接种量4％，1L三角瓶中裝液500ml，通气培养72h，测得活菌数＞108CFU/mL。将上述发酵液加入维生素C(2g/L)作为保护剂，起协调保护的作用，有利于微生物制剂的保藏。将混合发酵液放入真空冷冻干燥机中进行干燥处理，除去去多余的水分，得到固态粉末，有利于微生物制剂的保存。加入麦糠、豆粕、鱼粉等固体辅佐料制得混合饲水产饲料。
上述饲料添加剂作为凡纳滨对虾幼体饵料添加剂，以市面上的2种虾幼体饵料为对照，3组试验组在育苗池4m×6m×1.8m中进行育苗实验。育苗用海水经沉淀沙滤、再经5μm孔径的滤袋过滤进人育苗池，海水比重1.018～1.022，育苗温度26～31℃。通过检测存活率和出苗率进行评估新型饲料添加剂的作用效果。发现，加入9-1干燥粉的混合饲料组可显著性提高凡纳滨对虾幼苗的存活率和出苗率。
序列表
<110> 自然资源部第三海洋研究所
<120> 一株深海来源的酵母菌Q7-7及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 590
<212> DNA
<213> diobovata sp.
<400> 1
acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattatt gaaaacaagg gtgtccaatt 60
taacttggaa cccaaacttc tcaattctaa ctttgtgcat ctgtattaat ggcgagcaac 120
ttcggttgtg agccttcact tacaaaacac tagtctatga atgtaaaatt tttataacaa 180
ataaaaactt tcaacaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 240
cgatacgtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcatcttgcg 300
ctctctggta ttccggagag catgtctgtt tgagtgtcat gaattcttca acccaatctt 360
ttcttgtaat cgattggtgt ttggattctg agcgttgctg gcgtttgcct agctcgttcg 420
taatacatta gcatccctaa tacaagtttg gattgacttg gcgtaataga ctattcgcta 480
aggattcggt ggaaacatcg agccaacttc attaaggaag ctcctaattt aaaagtctac 540
cttttgatta gatctcaaat caggcaggat tacccgctga acttaagcat 590

Claims (4)

1.一株深海来源的酵母菌Q7-7，其特征在于其为近玫色锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）Q7-7，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2019662。
2.一株如权利要求1所述的深海来源的酵母菌Q7-7的基因组DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将保种或已纯化的真菌接种到YPD平板上，18～35℃生长2～3天后，挑取菌丝体至EP管，放入液氮中冻30～60min；
2）取出冷冻的菌体，每管加入400μL 65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃振荡水浴摇床中保温45～60min；
3）加入等体积的酚︰氯仿︰异戊醇=25︰24︰1，充分混匀，13000 r/min离心20～30 min，将上层水相移入新管；
4）重复步骤3）；
5）上清加入0.7倍体积的异丙醇，于4℃中静置30min或者过夜；
6）13000 r/min离心15 min，除去上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，吹干；
7）以20μL DDW溶解沉淀，-20℃保存；
8）取5μL DNA与1μL 溴酚蓝；在0.8%的琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度。
3.如权利要求1所述一株深海来源的酵母菌Q7-7，其特征在于其ITS序列如下：
ACAAGGTTTC CGTAGGTGAA CCTGCGGAAG GATCATTATT GAAAACAAGG GTGTCCAATTTAACTTGGAA CCCAAACTTC TCAATTCTAA CTTTGTGCAT CTGTATTAAT GGCGAGCAAC TTCGGTTGTGAGCCTTCACT TACAAAACAC TAGTCTATGA ATGTAAAATT TTTATAACAA ATAAAAACTT TCAACAACGGATCTCTTGGC TCTCGCATCG ATGAAGAACG CAGCGAAATG CGATACGTAA TGTGAATTGC AGAATTCAGTGAATCATCGA ATCTTTGAAC GCATCTTGCG CTCTCTGGTA TTCCGGAGAG CATGTCTGTT TGAGTGTCATGAATTCTTCA ACCCAATCTT TTCTTGTAAT CGATTGGTGT TTGGATTCTG AGCGTTGCTG GCGTTTGCCTAGCTCGTTCG TAATACATTA GCATCCCTAA TACAAGTTTG GATTGACTTG GCGTAATAGA CTATTCGCTAAGGATTCGGT GGAAACATCG AGCCAACTTC ATTAAGGAAG CTCCTAATTT AAAAGTCTAC CTTTTGATTAGATCTCAAAT CAGGCAGGAT TACCCGCTGA ACTTAAGCAT。
4.如权利要求1所述一株深海来源的酵母菌Q7-7在制备水产饲料添加剂中应用。
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