CN105044067B - 一步放大法荧光检测汞离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种一步放大法荧光检测汞离子的方法，本发明基于汞离子可以稳定DNA中T‑T错配的原理实现汞离子的检测，利用了核酸适配体的特异型识别，利用汞离子的适体作为识别物质实现了对目标物汞离子的高特异性检测；使用荧光检测方法的提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一步放大法荧光检测汞离子的方法，属于检测用荧光技术领域。
背景技术
汞及其化合物对人体健康存在多种危害，若存在于天然水体中，则会对大范围的人群造成威胁。它能够在生物体中积累，通过生物链转移到人体内，人体内积累的微量汞，人体内积累的微量汞无法通过自身代谢进行***，将直接导致心脏、肝、甲状腺疾病，引起神经***紊乱，慢性汞中毒，甚至引发恶性肿瘤的形成。
溶解态的汞离子往往具有较高的化学活性，是排入天然水体中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有较高的水溶性，也是各种汞形态转化的枢纽。因此，确立一个灵敏的高选择性的方法诊断和在水样分析中检测汞离子的含量是至关重要的。检测汞离子的方法主要有分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法等，然后这些方法存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂等缺点,难以适应汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的需要。
发明内容
为了解决以上问题，分子生物学技术的发展为汞离子的特异性检测提供了有利条件。本发明基于汞离子可以稳定DNA中T-T错配的原理实现汞离子的检测，基本原理是：汞离子的存在可以稳定ss-DNA序列中的T-T错配，使ss-DNA形成相对稳定的双链结构。而汞离子不存在则无法形成双链结构。
本发明是通过以下步骤得到的：
本发明中一共用到三条链：两条probe链：probe1和probe2，一条发夹链：HAP。两条probe链的一端分别修饰有poly-T结构，用来与目标物汞离子结合；发夹上设置一个酶切位点，发夹两端修饰有荧光基团和猝灭基团。
Probe1：5’-CTT CTT CTT CTT CTTGAT GTT GA-3’（SEQ ID NO:1）；
Probe2：5’- GCT GAG GA TTG TTG TTG TTG TTG-3’（SEQ ID NO:2）；
HAP：5’-GGG CCT CAT TTT TTT TTC AAC ATC CCT CAG CGC TGA GGC CC-3’（SEQID NO:3）。
其中Probe1与Probe2中画横线部分的T之间可特异性结合汞离子，从而形成“T-Hg2+-T”结构。HAP的3’端修饰FAM发光基团，5’端修饰Dabcyl猝灭基团，没有目标物汞离子时，发夹未被打开，猝灭基团Dabcyl将发光基团FAM猝灭；目标物存在时，发夹被打开，发光基团FAM发光，可用荧光仪检测荧光强度。本文中用到了一种酶： Nt.BbvCI。这是一种限制性内切酶，它识别双链，但只在一条链上进行切割。对单链没有切割。
本发明中汞离子的检测是用荧光仪实现的，通过一步循环的方式来实现信号放大，从而实现汞离子的高灵敏快速检测，并具有良好的特异性。
均相中发生的反应主要有：在有目标物存在的情况下, Probe1与Probe2中T碱基之间会由目标物连接形成“T-Hg2+-T”结构，从而使Probe1与Probe2的poly-T部分固定到一起，剩余的部分序列由于拉近了距离，可以与HAP作用形成稳定的结构。此时在内切酶Nt.BbvCI的作用下，将链按照酶切位点切开掉下，发夹打开，猝灭基团与发光基团分离，产生荧光。同时释放游离态的目标物，可再次被利用，从而实现循环放大，即目标物诱导的Probe1循环放大。
在均相反应中，循环放大的反应条件为37℃，反应时间是2h。
所述的制备方法：Probe1：Probe2：HAP 物质量比为1：1：50。
所述的制备方法均相部分，是通过以下步骤得到的：
（1）在200μl离心管中依次放入8μl H2O；0.5μM，2μl Probe1链,；0.5μM，2μlProbe2链；10μM，5μl HAP链；Nt.BbvCI的buffer 2μl，Nt.BbvCI酶100U/ml 1μl，制成20μl均相体系；在振荡器上振荡30s，混合均匀。
（2）然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h。
所述的制备方法检测方法，是通过以下步骤得到的：
(1) 向混合液中加入180μlH2O溶液，混合均匀，形成200μl体系，将其全部置入荧光杯中，放入荧光仪；
(2) 设置激发波长为494nm，发射波长范围为500nm-630nm，入射狭缝5nm，出射狭缝宽度为3nm；开始测试其荧光强度。
本发明的工作原理：
本发明基于汞离子可以稳定DNA中T-T错配的原理实现汞离子的检测，基本原理是：汞离子的存在可以稳定ss-DNA序列中的T-T错配，使ss-DNA形成相对稳定的双链结构。而汞离子不存在则无法形成双链结构。
本发明中一共用到三条链：两条probe链：probe1和probe2，一条发夹链：HAP。两条probe链的一端分别修饰有poly-T结构，用来与目标物汞离子结合；发夹上设置一个酶切位点，发夹两端修饰有荧光基团和猝灭基团，在有汞离子的存在下，两条probe链的poly-T部分与汞离子形成稳定的“T-Hg²+-T”结构，probe链的剩余部分可以与HAP链互补配对，形成稳定的结构。此时，在内切酶的作用下，发夹沿着酶切位点被酶切成两条链，因此发夹被打开，荧光基团与猝灭基团分离，从而产生荧光信号。在没有目标物的时候，HAP链呈现发夹状，由于猝灭基团靠近荧光基团，所以不产生荧光。同时，由于发夹被切断，原本稳定的结构变得不稳定，携带汞离子的两条probe链游离出来，再次结合HAP，因此循环产生荧光信号。目标物汞离子越多，则结合的Probe链越多，结合的HAP也越多，产生的荧光信号也就越强，循环可以放大信号。
本发明的有益效果：
1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用汞离子的适体作为识别物质实现了对目标物汞离子的高特异性检测；
2、利用内切酶的切割作用，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用，实现了对目标物的高敏检测，提高了检测的灵敏度；
3、检测原理的主要过程是在均相中实现的，反应条件温和，反应速度快；
4、使用荧光检测方法的提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。
附图说明
图1为HAP浓度的优化曲线；
图2为反应时间的优化曲线；
图3为内切酶浓度的优化曲线；
图4为不同浓度汞离子的荧光强度梯度；
图5为汞离子浓度其对数与荧光强度的线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
（1）在200μl离心管中依次放入7μlH2O，Probe1链2μl（0.1μM）,Probe2链2μl（0.1μM），1μl目标物汞离子，不同浓度的HAP链5μl（1μM,5μM,10μM，20μM），Nt.BbvCI的buffer 2μl，Nt.BbvCI酶100U/ml 1μl，制成20μl均相体系。在振荡器上振荡30s，混合均匀。
（2）然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h。
（3） 设置激发波长为494nm，发射波长范围为500nm-630nm，入射狭缝5nm，出射狭缝宽度为3nm；开始测试其荧光强度。
实验结果如下图1所示，随着HAP链浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，直至浓度为10μM时，荧光强度基本保持不变。所以在HAP链浓度为10μM时，所得实验效果最明显，加入的酶以及probe探针得到充分利用，由此也验证了实验循环放大的效果。
实施例2
（1）在200μl离心管中依次放入8μlH2O， Probe1链2μl（0.1μM），Probe2链2μl（0.1μM），1μl目标物汞离子， HAP链5μl（50μM），Nt.BbvCI的buffer 2μl，Nt.BbvCI酶100U/ml 1μl，制成20μl均相体系。在振荡器上振荡30s，混合均匀。
（2）然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育不同的时间（30，60，90，120，150，180 min）。
（3）设置激发波长为494nm，发射波长范围为500nm-630nm，入射狭缝5nm，出射狭缝宽度为3nm；开始测试其荧光强度。
实验结果下图2表明，随着孵育时间的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在反应时间120min之后，荧光强度基本保持不变。所以在反应时间120min时，实验原料得到充分利用，所得荧光强度达到最大。
实施例3
（1）在200μl离心管中依次放入目标物汞离子1μl， 8μlH2O， Probe1链2μl（0.1μM）,Probe2链2μl（0.1μM），HAP链5μl（10μM），Nt.BbvCI的buffer 2μl，加入不同的Nt.BbvCI酶量（10U/ml，50U/ml，100U/ml，200U/ml，500U/ml）制成20μl均相体系。在振荡器上振荡30s，混合均匀。
（2）然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育120min。
（3）设置激发波长为494nm，发射波长范围为500nm-630nm，入射狭缝5nm，出射狭缝宽度为3nm；开始测试其荧光强度。
实验结果如下图3表明，随着内切酶量的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在酶量达到100U/ml之后，荧光强度基本不变。说明催化切割5μlHAP链，所需酶量为1μl。
实施例4
（1）在200μl离心管中依次放入不同浓度的目标物汞离子1μl（1nM,10nM，50nM，100nM， 1μM，5μM，10 μM）， 8μlH2O， Probe1链2μl（0.1μM），Probe2链2μl（0.1μM），HAP链5μl（10μM），Nt.BbvCI的buffer 2μl，Nt.BbvCI酶100Uml，制成20μl均相体系。在振荡器上振荡30s，混合均匀。
（2）然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育120min。
（3）设置激发波长为494nm，发射波长范围为500nm-630nm，入射狭缝5nm，出射狭缝宽度为3nm；开始测试其荧光强度。
实验结果如下图4、图5表明，随着目标物浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强。本实验的线性范围是10nM -10μM,检出限是7.6nM，其回归方程为：I=160.11325+40.59lgC，相关系数是0.99148。
实际样品检测：
为了证明我们的检测方法检测实际样品的有效性，加标污水样品的定量测定进行了审议。不同浓度的汞离子被掺入的污水样品中，并未经过预处理直接用缓冲溶液稀释。下表表明在测定的加标样品中的数据。据观察，该方法的回收率在93.7-102.7％的范围内。此外，加标样品通过一个经典酶联级免疫吸附法进一步量化，并与由我们的方法所获得的结果进行比较。我们发现通过我们的方法所获得的数据分别在与使用酶联级免疫吸附法得到良好的一致性，并且这两种方法之间的差异比10.0％的所有小。这些清楚地证明了我们的设计的方法数据可应用于复杂的样品。
表1
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一步放大法荧光检测汞离子的方法，其特征在于，是通过以下步骤得到的：
（1）在200μl离心管中依次放入8μl H2O；0.5μM，2μl Probe1链；0.5μM，2μl Probe2链；10μM，5μl HAP链；Nt.BbvCI的bμffer 2μl；Nt.BbvCI酶100U/ml 1μl，制成20μl均相体系；在振荡器上振荡30s，混合均匀；
（2）然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；
（3）向混合液中加入180μlH2O溶液，混合均匀，形成200μl体系，将其全部置入荧光杯中，放入荧光仪；
（4）设置激发波长为494nm，发射波长范围为500nm-630nm，入射狭缝5nm，出射狭缝宽度为3nm；开始测试其荧光强度；
所述的HAP的3’端修饰FAM发光基团，5’端修饰Dabcyl猝灭基团；
所述的Probe1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的Probe2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的HAP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
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