CN106980022B - 基于靶标蛋白诱导dna酶循环生成的均相免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法，该方法的检测溶液包括抗体1‑DNA1偶联物、抗体2‑DNA2偶联物、血红素hemin、核酸外切酶III和DNA3/DNA4双链DNA。当靶标蛋白存在时，可被抗体1‑DNA1和抗体2‑DNA2同时免疫识别，基于邻位效应，DNA1与DNA2会进行杂交而后与双链DNA上的DNA3发生链取代反应，进而释放出富含G序列的DNA4与hemin结合形成G‑四链体/hemin DNA酶，此外，与DNA1和DNA2反应的DNA3能被核酸外切酶III识别并切断，使得DNA1和DNA2可与另一个DNA3发生链取代反应，从而释放另一个DNA4生成DNA酶，如此循环，生成大量的DNA酶。该DNA酶可催化TMB显色和鲁米诺发光，通过比色或化学发光成像的方法可对靶标蛋白进行灵敏的定量分析。该方法操作简单、快速、灵敏、普适性高，具有一定的临床应用价值。

Description

基于靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法
一、技术领域
本发明为一种基于靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法，用于对靶标蛋白的简单、快速、灵敏检测。通过制备抗体-DNA偶联物，利用夹心免疫识别反应产生邻位效应，诱导核酸杂交、链取代、DNA酶生成及核酸外切酶III循环放大，使得大量DNA酶在位生成，通过DNA酶对TMB显色剂或化学发光底物的催化，利用比色或化学发光成像的方法对靶标蛋白进行灵敏的定量分析。
二、背景技术
免疫分析因具有良好的特异性已广泛用于临床疾病诊断、食品安全检测、环境监测等领域。最常见的免疫分析方法有酶联免疫分析、电化学免疫分析、荧光免疫分析和化学发光免疫分析，虽然这些免疫分析方法具有高的检测灵敏度，但它们通常为异相分析，需要在固体基底如96孔板、磁性纳米粒子、载玻片等上固定捕获抗体，然后通过两步夹心免疫反应修饰上信号分子，最后加入底物进行检测。上述过程至少需要2步清洗分离过程，另外，由于是异相免疫反应，温育时间比较长，导致整个分析过程耗时长、操作复杂、成本高、大多情况下需要专业技术人员操作专用仪器，不适合现场检测。因此，迫切需要开发简单、快速、便宜、灵敏的免疫分析方法。
比色免疫分析由于其成本低、简单、实用的特性得到了广泛的关注，尤其是通过裸眼读数即可实现实时半定量分析，使其在野外检测、现场诊断方面具有极大优势。传统的比色免疫分析中，常常把酶标记在二抗上，通过显色反应来检测，灵敏度低。为了提高灵敏度，近年来发展了等离子体比色法，即利用酶催化纳米粒子(如金纳米粒子、银纳米粒子)的增长或刻蚀，使纳米粒子的大小、形状、分布或组成成分发生变化，从而实现颜色的变化。虽然这些方法大大提高了检测灵敏度，但是一些物理或化学因素会极大地影响纳米粒子的聚集和酶的活性，如pH值、离子强度、温度、其他杂质等。此外，标记酶的过程相当复杂，使酶的催化活性大大降低。上述这些因素不可避免地影响了比色免疫分析的准确度和重现性，限制了其在实际样品检测中的应用。因此采用新颖的设计，构建无纳米粒子、无标记的可视化检测平台是非常有必要的。
邻位诱导效应通过免疫反应使一对与抗体偶联的DNA间距离拉近，进而引发DNA组装、触发级联DNA组装并产生检测信号，使对蛋白质的检测转化为对DNA的检测。通过与各种DNA信号放大技术相结合，可实现对蛋白质的灵敏检测。该方法可均相进行，简单、快速、灵敏。
本发明结合邻位免疫反应、DNA链取代反应、核酸外切酶放大技术，设计了一种靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法。由于DNA酶具有很好的类辣根过氧化物酶性质，可以催化TMB显色或者鲁米诺发光，所以该均相免疫分析方法可以通过比色或者化学发光成像进行检测。该方法快速直观、步骤简单、灵敏度高，在临床分析中具有很大的应用前景。
三、发明内容
本发明的内容是：合成抗体-DNA偶联物，结合邻位诱导效应、DNA链取代反应和核酸外切酶放大技术，发展了一种靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法，通过比色或者化学发光成像检测，实现了靶标蛋白的简单、快速、高灵敏检测。
本发明通过以下技术方案来实现：
合成抗体1-DNA1和抗体2-DNA2偶联物，并使DNA3和DNA4杂交形成双链DNA，以上述制备的DNA-抗体偶联物、DNA3/DNA4双链和血红素hemin、核酸外切酶III混合后作为检测溶液，当加入待测样品时，抗体1-DNA1和抗体2-DNA2同时对靶标蛋白进行识别反应，使DNA1与DNA2距离靠近产生邻位杂交而形成复合物，该复合物可与双链DNA上的DNA3发生链取代反应，进而释放出富含G序列的DNA4与hemin结合形成G-四链体/hemin DNA酶，在核酸外切酶III的作用下上述DNA酶生成过程可以循环进行(如图1)，基于DNA酶对TMB显色反应或者鲁米诺化学发光的催化，通过比色或者化学发光成像方法实现对靶标蛋白的灵敏检测。
上述的抗体1-DNA1、抗体2-DNA2为对靶标蛋白特异的抗体与DNA1、DNA2的偶联物，其中DNA1与DNA2有6个碱基完全互补，如图2所示。
上述的DNA3/DNA4双链DNA有23个碱基互补，同时DNA3和DNA4的3′端分别有7和6个碱基突出，用于抗核酸外切酶III剪切，如图3所示。
上述的DNA1与DNA2形成的复合物与DNA3的所有碱基完全互补，同时DNA1的5′端和DNA2的3′端分别有5个碱基突出，如图4所示。
上述的DNA4为富G序列，在单链状态时能与hemin结合形成G-四链体/hemin DNA酶，进而催化TMB显色及鲁米诺化学发光。
上述的抗体1-DNA1、抗体2-DNA2与靶标蛋白形成的邻位复合物与DNA3/DNA4发生链取代反应，与DNA3结合后使DNA3的3′端凹陷，可被核酸外切酶剪切。
本检测***测定靶标蛋白的原理：
本发明设计的基于靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法，原理如图1所示：将含有靶标蛋白的样品溶液与含有抗体1-DNA1、抗体2-DNA2、DNA3/DNA4双链、血红素hemin、核酸外切酶III的检测溶液混合，37℃下温育30分钟。温育过程中，靶标蛋白同时被抗体1和抗体2识别并发生夹心免疫反应，使得DNA1和DNA2相互靠近，在邻位效应下，DNA1与DNA2杂交形成复合物，该复合物可与双链DNA上的DNA3发生链取代反应，进而释放出富含G序列的DNA4与hemin结合形成G-四链体/hemin DNA酶，在核酸外切酶III的作用下上述DNA酶生成过程可以循环进行，产生大量DNA酶。温育完成后，加入TMB显示溶液，在避光条件下反应20分钟后通过裸眼及酶标仪检测，或者在温育完成后，加入鲁米诺-H2O2化学发光底物溶液，立即通过CCD拍照进行成像分析。溶液的吸光度或化学发光强度与靶标蛋白的浓度成正相关。用652nm处吸光度或化学发光强度对靶标浓度的对数作图，获得标准曲线，通过标准曲线测得样品溶液中靶标蛋白的浓度。
本发明与现有技术相比，具有以下特点：
本发明结合邻位效应、DNA链取代反应、核酸外切酶放大技术，设计了一种简单、快速、灵敏的均相免疫新分析方法。相比于现有的免疫分析方法，具有以下特点：
(1)本方法为均相免疫分析方法，可通过样品与检测溶液的直接混合完成蛋白质的检测，无需固体生物识别载体和复杂的清洗、分离步骤，操作简单，成本低廉；
(2)该方法通过免疫识别激发邻位效应，进而进行DNA链取代反应，产生信号实现对靶标蛋白的检测，所以通过使用相应的抗体-DNA偶联物，该方法可普适性的应用于检测多种蛋白质；
(3)通过引入核酸外切酶III的循环放大，在位生成大量DNA酶，检测信号被放大，提高检测灵敏度，使得裸眼检测靶标蛋白的检测限可达亚ng/mL水平；
(4)信号读出简便，利用DNA酶催化显色反应或化学发光反应，信号可由裸眼观察或比色、化学发光成像读出。
四、附图说明
图1.基于靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法过程示意图
图2.夹心免疫反应诱导DNA1与DNA2邻位杂交示意图
图3.DNA3/DNA4双链DNA的结构示意图
图4.夹心免疫复合物与DNA3链取代反应后的结构示意图
五、具体实施方式
实施例1：结合附图1，以癌胚抗原CEA为例，说明靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法对蛋白质的检测：
(1)温育过程：将2μL不同浓度的CEA标准溶液或者样品溶液与18μL反应液混合，其中DNA3/DNA4双链、hemin、核酸外切酶III和抗体-DNA偶联物的浓度分别为2μM、5μM、0.4U/μL和0.25μM，然后37℃下避光温育30分钟；
(2)裸眼半定量分析：向(1)温育液中加入180μL TMB显色剂，室温避光反应20分钟，直接裸眼看溶液的颜色，样品溶液与标准溶液的颜色进行对比，实现半定量分析。
(3)比色分析：以酶标仪对(2)中加入显色剂避光反应后的溶液进行检测，采集其652nm处的吸光度，根据获得的吸光度画出CEA的标准曲线和算出样品溶液中CEA的浓度。
(4)化学发光成像分析：取5μL(1)中的温育液，加入45μL化学发光底物溶液，立即用CCD收集动态积分方式曝光15杪的化学发光信号，根据记录的化学发光值，获得CEA的标准曲线和待测溶液中CEA的浓度。

Claims (6)

1.一种基于靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法，其特征在于该免疫分析方法以抗体1-DNA1偶联物、抗体2-DNA2偶联物、血红素hemin、核酸外切酶III和DNA3/DNA4双链DNA的混合液为检测溶液，当靶标蛋白存在时，首先被抗体1-DNA1偶联物和抗体2-DNA2偶联物同时免疫识别，基于邻位效应，DNA1与DNA2进行杂交形成复合物，而后与双链DNA上的DNA3发生链取代反应，进而释放出富含G序列的DNA4与hemin结合形成G-四链体/hemin DNA酶，然后核酸外切酶III识别并切断杂交在DNA1和DNA2上的DNA3，使得DNA1和DNA2可与另一个双链DNA上的DNA3发生链取代反应，从而释放另一个DNA4生成DNA酶，如此循环，生成大量的DNA酶，最后，在检测溶液中加入显示剂或化学发光底物，获得灵敏的比色或化学发光信号。
2.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的DNA1与DNA2有6个碱基完全互补，在邻位效应下，能进行杂交形成双链结构。
3.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的DNA3/DNA4双链DNA有23个碱基互补，同时DNA3和DNA4的3′端分别有7和6个碱基突出，用于抗核酸外切酶III剪切。
4.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的DNA1与DNA2形成的复合物与DNA3的所有碱基完全互补，同时DNA1的5′端和DNA2的3′端分别有5个碱基突出。
5.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的DNA4为富G序列，在单链状态时能与hemin结合形成G-四链体/hemin DNA酶，进而催化TMB显色及鲁米诺化学发光。
6.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于检测步骤如下：
(1)将样品和检测溶液混合，37℃温育30分钟；
(2)加入TMB显色剂避光反应20分钟后用酶标仪检测，或者，加入化学发光底物后立即用CCD进行成像检测；
(3)利用标准曲线法，求出样品中靶标蛋白的浓度。
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