CN104419765A - 核酸序列测定方法及装置、核酸序列测定用元件及其制造方法 - Google Patents

核酸序列测定方法及装置、核酸序列测定用元件及其制造方法 Download PDF

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CN104419765A CN201410423060.4A CN201410423060A CN104419765A CN 104419765 A CN104419765 A CN 104419765A CN 201410423060 A CN201410423060 A CN 201410423060A CN 104419765 A CN104419765 A CN 104419765A
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Abstract

本发明提供核酸序列测定方法及装置、核酸序列测定用元件及其制造方法，所述核酸序列测定方法包括测量来自被提供了样品溶液的核酸序列测定用元件的荧光，所述元件包括：荧光探针，附加有荧光分子；消光探针，附加有消光物质，所述荧光探针和/或所述消光探针具有检测特定的核算序列的检测部，当检测对象核酸和所述检测部的杂交未产生时，来自所述荧光分子的荧光被与所述荧光分子结合了的所述消光物质消光，当所述杂交产生了时，远离了所述消光物质的所述荧光分子呈现荧光。

Description

核酸序列测定方法及装置、核酸序列测定用元件及其制造方法
相关申请的交叉参考
本申请基于2013年08月27日向日本特许厅提交的日本专利申请2013-175500号主张优先权，因此将所述日本专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及核酸序列测定方法、核酸序列测定用元件、核酸序列测定用元件的制造方法、以及核酸序列测定装置。
背景技术
使用了通过杂交对样品中所含的具有特定的核酸序列的靶进行测定的核酸序列测定用元件的核酸序列测定方法是公知的，所述杂交是所述靶和探针的杂交。例如，使用作为核酸序列测定用元件的DNA芯片对特定的核酸的有无、或特定的核酸的量进行测量的方法已被广泛知晓。DNA芯片是在基板等固相面上固定检测探针而构成的，所述检测探针具有成为检测对象的核酸的互补序列。检测探针用其3′末端或者5′末端的任意末端固定于固相面。另一方面，对检测对象核酸(靶)施以荧光分子等的修饰。
使用了DNA芯片的测量，例如通过以下的操作步骤来实施。
(1)通过PCR等核酸扩增技术对样品中所含的检测对象核酸分子进行扩增。进而，对扩增后的分子(即检测对象核酸或靶)附加荧光分子。荧光分子的附加是通过下述方式进行的：在PCR扩增时例如混合附加有荧光色素的核酸来进行PCR扩增，或者使用预先附加有荧光色素的引物。或者，荧光色素的附加在扩增后通过化学修饰来进行。
(2)制备含有靶的溶液，添加到具有检测探针的DNA芯片中。被荧光修饰后的靶通过与检测探针的杂交而被检测探针捕集。
(3)通过洗涤DNA芯片而除去由未被捕集的分子、或非特异性结合于检测探针的核酸序列的分子所发出的荧光。根据所希望的洗涤度将该洗涤工序重复几次。洗涤后，在DNA芯片的测量之前将其固相面干透(dry up)。
(4)使用荧光读取装置对固相面进行观察。通过DNA芯片的检测探针是否呈现荧光，来对样品中有无靶进行确认。
所述的使用DNA芯片的公知方法，需要用荧光分子对靶进行标记的工序、以及在检测前对DNA芯片进行洗涤的工序。此时，方法整个变得繁琐。另外，因为洗涤的方法而会发生信号降低、或者背景噪声增加。进而，也会有因洗涤的不均而导致的芯片面内的信号的不均发生的情况。
另一方面，在生物芯片实用化手册(バイオチップ実用化ハンドブック，金子阳一等，株式会社NTS，第604页，2010年4月6日发行)中，报告了使用分子信标作为检测探针的DNA芯片。但是，在使用了利用分子信标的DNA芯片的情况下，即便在没有靶存在时，来自荧光分子的荧光的消光也是不够的。因此，偏移光量增大，DNA芯片的检测灵敏度降低。
发明内容
本发明的目的在于，提供具有简化了的核酸检测工序且检测灵敏度良好的核酸序列测定方法等。
本发明的一个实施方式的核酸序列测定方法(本测定方法)，其包括：制备含有对象核酸的样品溶液；将所述样品溶液提供给核酸序列测定用元件；以及测量来自所述核酸序列测定用元件的荧光，所述核酸序列测定用元件包括：荧光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有荧光分子；消光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有消光物质；以及基板，具有固相面，在所述固相面上固定有所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端，所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的核酸序列，所述荧光探针和所述消光探针中的至少一方具有检测部，所述检测部具有与特定的核酸序列互补的核酸序列，具有下述位置关系的所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端固定于所述固相面，所述位置关系为：当所述对象核酸和所述检测部的杂交未产生时，来自所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被维持，由此所述消光物质接近了所述荧光分子，当所述对象核酸和所述检测部的杂交产生了时，远离了所述消光物质的所述荧光分子呈现荧光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被解除，由此所述荧光分子远离了所述消光物质。
按照该核酸序列测定方法，相互独立的荧光探针以及消光探针各自的基端被固定于固相面。因此，能恰当地发挥消光效果。另外，能够使检测灵敏度良好。此外，由于不需要标记工序，所以也可以省略洗涤工序。
在本测定方法中，优选的是，在所述样品溶液的存在下，对来自所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件(本元件)，其对样品溶液中所含的对象核酸的核酸序列进行测定，所述核酸序列测定用元件包括：荧光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有荧光分子；消光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有消光物质；以及基板，具有固相面，在所述固相面上固定有所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端，所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的核酸序列，所述荧光探针和所述消光探针中的至少一方具有检测部，所述检测部具有与特定的核酸序列互补的核酸序列，具有下述位置关系的所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端固定于所述固相面，所述位置关系为：当所述对象核酸和所述检测部的杂交未产生时，来自所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被维持，由此所述消光物质接近了所述荧光分子，当所述对象核酸和所述检测部的杂交产生了时，远离了所述消光物质的所述荧光分子呈现荧光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被解除，由此所述荧光分子远离了所述消光物质。
按照该核酸序列测定用元件，相互独立的荧光探针以及消光探针各自的基端被固定于固相面。因此，能恰当地发挥消光效果。另外，能够使检测灵敏度良好。此外，由于不需要标记工序，所以也可以省略洗涤工序。
在本元件中，优选的是，所述荧光探针具有所述检测部。
在本元件中，优选的是，所述基板是平板，所述固相面是所述平板的一个平面。
在本元件中，优选的是，所述基板是球体，所述固相面是所述球体的球面。
在本元件中，优选的是，所述结合部的至少一部分作为所述检测部发挥作用。
在本元件中，优选的是，所述消光探针的数量多于所述荧光探针的数量。
在本元件中，优选的是，所述荧光探针的数量与所述消光探针的数量之比为1:3。
在本元件中，优选的是，附加有所述荧光分子以及所述消光物质的所述规定的位置，分别是所述荧光探针以及所述消光探针的中途。
在本元件中，优选的是，附加有所述荧光分子以及所述消光物质的所述规定的位置有多个。
在本元件中，优选的是，所述荧光探针以及所述消光探针双方具有所述检测部。
本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件的制造方法，其是所述的本元件的制造方法。即，所述制造方法包括：通过所述结合部使所述荧光探针以及所述消光探针结合；以及在通过所述结合部相互结合了的状态下，使所述荧光探针以及所述消光探针结合于所述固相面。
按照该核酸序列测定用元件的制造方法，在通过结合部相互结合的状态下，荧光探针以及消光探针结合于固相面。因此，能够恰当地管理荧光探针和消光探针之间的位置关系。因此，能恰当地发挥消光效果。因而，能使检测灵敏度良好。
本发明的一个实施方式的核酸序列测定装置，其包括：本元件；以及荧光读取装置，对来自本元件的荧光进行测量。
按照该核酸序列测定装置，相互独立的荧光探针以及消光探针各自的基端被固定于固相面。因此，能恰当地发挥消光效果。另外，能够使检测灵敏度良好。此外，由于不需要标记工序，所以也可以省略洗涤工序。
在所述核酸序列测定装置中，优选的是，在样品溶液的存在下，对来自所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
按照本发明的一个实施方式的核酸序列测定方法，相互独立的荧光探针以及消光探针各自的基端被固定于固相面。因此，能恰当地发挥消光效果。另外，能够使检测灵敏度良好。此外，由于不需要标记工序，所以也可以省略洗涤工序。
按照本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件，相互独立的荧光探针以及消光探针各自的基端被固定于固相面。因此，能恰当地发挥消光效果。另外，能够使检测灵敏度良好。此外，由于不需要标记工序，所以也可以省略洗涤工序。
按照本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件的制造方法，在通过结合部相互结合的状态下，荧光探针以及消光探针结合于固相面。因此，能够恰当地管理荧光探针和消光探针之间的位置关系。因而，能恰当地发挥消光效果。另外，能够使检测灵敏度良好。
按照本发明的一个实施方式的核酸序列测定装置，相互独立的荧光探针以及消光探针各自的基端被固定于固相面。因此，能恰当地发挥消光效果。另外，能够使检测灵敏度良好。此外，由于不需要标记工序，所以也可以省略洗涤工序。
附图说明
图1是表示在基于本发明的一个实施方式的核酸序列测定方法中使用的核酸序列测定用元件的构成的图。
图2是表示在图1的核酸序列测定用元件上设置的探针的一个构成例的图。
图3是示意性地表示使用图1的核酸序列测定用元件来检测与探针杂交的靶的原理的图。
图4是表示检测靶的操作步骤的图。
图5是关于没有靶存在下的的光点光量，表示将分子信标作为检测探针的DNA芯片、与在基于本发明的一个实施方式的核酸序列测定方法中使用的核酸序列测定用元件的比较的图。
图6是表示本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件的制造方法的图。
图7是表示使荧光探针和消光探针的存在比发生变化情况下的杂交光量以及偏移光量的变化的图。
图8示意性地表示消光探针数量多于荧光探针数量情况下的探针的状态的图。
图9A是表示利用珠子的表面作为固相面的、本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件的变形例的图。
图9B是表示荧光分子以及消光物质位于探针的中途的本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件的变形例的图。
图10A是表示在探针的多个部位附加有荧光分子以及消光物质的本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件的变形例的图。
图10B是表示靶结合于消光探针的本发明的一个实施方式的核酸序列测定用元件的变形例的图。
图11A是关于使靶结合于荧光探针侧的情况以及结合于消光探针侧的情况的各情况，表示杂交光量和偏移光量的比较结果的图。
图11B是表示与荧光探针邻接的未与靶结合的消光探针所导致的消光的情形的图。
具体实施方式
在下面的详细说明中，出于说明的目的，为了提供对所公开的实施方式的彻底的理解，提出了许多具体的细节。然而，显然可以在没有这些具体细节的前提下实施一个或更多的实施方式。在其它的情况下，为了简化制图，示意性地示出了公知的结构和装置。
以下，对本发明的一个实施方式的核酸序列测定方法的一个例子进行详细说明。需要说明的是，在以下的说明中将核酸作为DNA进行说明。但是，在核酸为RNA的情况下也可以应用也是当然的。因此，在核酸是DNA的情况下，核酸序列测定用元件作为DNA芯片发挥功能，在核酸是RNA的情况下，核酸序列测定用元件作为RNA芯片发挥功能。
图1是表示在本实施方式的核酸序列测定方法中使用的核酸序列测定用元件的一个构成例的图，图2是表示探针的一个构成例的图。
如图1以及图2所示，核酸序列测定用元件(以下也称为DNA芯片)包括基板等的固相面100、以及分别固定于该固相面100的荧光探针10和消光探针20。荧光探针10包含与作为成为检测对象的核酸的靶30互补的序列、以及在该序列上附加的荧光分子11。消光探针20包含与作为成为检测对象的核酸的靶30互补的序列、以及在该序列上附加的消光物质21。在本实施方式中，利用荧光共振能量转移所致的消光的原理。作为可以用作消光物质21的公知的物质，可以举出DABCYL以及BHQ等。
如图2所示，荧光探针10，自3′末端侧起依次具有作为靶30的互补序列的数个碱基的结合部(X部)12、与结合部12相连且为靶30的互补序列的检测序列13、以及与检测序列13相连且在5′末端与固相面100结合的连接子14。在荧光探针10的3′末端固定有荧光分子11。
消光探针20，自5′末端侧起依次具有数个碱基的结合部(Y部)22、与结合部22相连且为靶30的互补序列的检测序列23、以及与检测序列23相连且在3′末端与固相面100结合的连接子24。在消光探针20的5′末端固定有消光物质21。
荧光探针10以及消光探针20各自的基端，分别通过连接子14以及连接子24被固定在固相面100上。另外，荧光探针10的结合部12的核酸序列和消光探针20的结合部22的核酸序列相互互补。另外，荧光探针10以及消光探针20各自的基端，以具有满足以下2个条件的位置关系的方式被固定在固相面100上。即，所述条件是：在其基端被固定在固相面100上的状态下，荧光探针10的结合部12和消光探针20的结合部22可以相互结合；以及在荧光探针10的结合部12和消光探针20的结合部22相互结合了时，消光物质21接近荧光分子11，由此荧光分子11成为消光状态。
另外，也可以将荧光探针10和靶30的亲和性设计得比依赖于结合部12以及结合部22的、荧光探针10和消光探针20的亲和性更高。
接着，对使用DNA芯片对靶30进行检测的原理以及操作步骤进行说明。图3是示意性地表示对靶进行检测的原理的图，图4是表示对靶进行检测的操作步骤的图。
如图3左所示，在没有靶30存在时，在荧光分子11以及消光物质21上彼此邻接的数个碱基的结合部12以及结合部22(图2)，相互结合。由此，成为荧光分子11和消光物质21接近的状态。在该状态下，即便对荧光分子照射激发光，由于消光物质21的影响，荧光分子11也不呈现荧光。
在这里，如图4所示，使用本领域技术人员公知的方法制备了放入有样品50的样品溶液，然后，进行样品50中所含的、基因(靶30)的扩增(步骤1)。接着，将含有扩增后的靶30的样品溶液提供给DNA芯片的固相面100，由此进行该靶30和荧光探针10的杂交(步骤2)。
如图3右所示，在所述步骤2中，靶30与荧光探针10结合，由此结合部12和结合部22的结合脱离。由此，消光物质21和荧光分子11的距离变远，由此消光状态被解除。因此，通过对荧光分子11照射激发光，荧光分子11呈现荧光。因此，如图4所示，通过使用荧光读取装置60对固相面100进行观察，根据荧光探针10是否呈现荧光，可以确认样品中有无对象核酸(靶30)(步骤3)。另外，此时，并不会因为包含于样品溶液中且未与荧光探针10结合的靶30而呈现荧光。因此，没有必要将未被该荧光探针10捕集的靶30洗涤除去。因此，可以在含有靶的样品的溶液存在下，透过该溶液观察固相面100。因此，可以对排除了洗涤的影响的状态下的光量进行测量。另外，杂交中的实时测量也变得可能。
在进行了基因的扩增的阶段(步骤1)，可以进行确认基因是否被扩增了的试验。可以仅在基因已被扩增了的情况下进行杂交(步骤2)。由此，仅在样品50中含有基因的情况下，通过步骤2以及步骤3的操作来研究基因的种类(菌种等)。如此，可以削减DNA芯片、或测量操作所需要的不必要的成本。
另外，检查有无基因存在的时间点，并不限于扩增结束后。也可以在扩增反应中检查有无基因存在。作为检査的方法，可以适当利用电泳、抗原抗体反应、质谱分析、或实时PCR法等。
另外，核酸(靶30)可以结合于蛋白质、或糖链等。此时，可以确认蛋白质、或糖链等与核酸(靶30)的相互作用。
如此，按照本实施方式的核酸序列测定方法，对在固定在固相面100上的探针施以荧光/消光的操作。由此，可以将检测对象分子(靶30)在荧光分子等并未附加在该靶30上的状态下检测出来。因此，即便是对于含有难以进行荧光等修饰的对象分子的体系，也变得可以应用使用了阵列(DNA芯片)的杂交检测。另外，由于对象分子(靶30)自身不呈现荧光，所以在存在有未被探针捕集的、剩余的对象分子的状态下的测量也变得可能。因此，可以省略检测前的DNA芯片洗涤工序。
另外，按照本实施方式的核酸序列测定方法，不需要标记工序，并且省略洗涤工序，由此，杂交的实验所涉及的劳力和时间进一步缩减。因此，成本连同操作时间一起被削减。进而，可以避免发生洗涤工序的不完备所导致的性能恶化、光量降低、背景光上升、或偏差等风险。另一方面，在公知的方法中，会发生因洗涤的方法、洗涤度、或者洗涤的不均等所导致的信号、或背景光的上升以及偏差的风险。也就是说，按照本实施方式的核酸序列测定方法，可以避免所述的风险。因此，由于能够在阵列面上得到更为均匀的结果，所以检测的再现性也得到提高。
另外，按照本实施方式的核酸序列测定方法，与将分子信标作为检测探针的DNA芯片相比较，可以使在没有靶存在下的测定光量亦即背景光大幅度降低。
图5是对于没有靶存在下的的光点光量，表示将分子信标作为检测探针的DNA芯片、以及在本实施方式的核酸序列测定方法中使用的DNA芯片的比较的图。如图5所示，通过本发明人的实验判明了：在本实施方式的核酸序列测定方法中使用的DNA芯片，与分子信标型DNA芯片相比较，可以将没有靶存在下的的光点光量抑制到1/10以下。由此可以有如下推断，即：在本实施方式的DNA芯片中，荧光探针以及消光探针作为各自独立的探针形成。因此，在没有靶存在的情况下，消光物质附近以及荧光分子附近的探针容易形成树干结构(ステム構造)。如此，按照本实施方式，可以通过背景光的减少而使检测灵敏度或测量精度提高。
另外，按照本实施方式的核酸序列测定方法，可以进行杂交的实时观察。即，可以在将含有检测对象分子(靶)的溶液添加到DNA阵列上的状态(湿润状态)下直接进行阵列观察。由此，排除了洗涤的影响的状态下的光量确认、或杂交的实时观察成为可能。因此，根据由于样品浓度高而使杂交迅速进展的情况等状况，可以使杂交在更短时间内结束。
接着，对本实施方式的核酸序列测定方法的DNA芯片的制造方法进行说明。图6是表示本实施方式的核酸序列测定方法的DNA芯片的制造方法的图。以下参照图6对DNA芯片的制造步骤进行说明。
(1)溶液制备
首先，通过混合荧光探针10以及消光探针20来制备探针液，接着，对所述的探针浓度进行调节。
(2)偶联
接着，在加热探针液后，急冷。由此，荧光探针10和消光探针20进行偶联。即，通过结合部12以及结合部22，荧光探针10以及消光探针20相互结合。在这里，例如，将探针液加热到95℃后，保持温度5分钟，然后，急冷到25度，由此荧光探针10和消光探针20发生偶联。
(3)向固相面的固定
接着，将含有处于偶联状态的荧光探针10以及消光探针20的探针液，添加到固相面上，由此荧光探针10以及消光探针20被固定于固相面100。
(4)洗涤
接着，通过洗涤固相面100，除去未被固定的剩余的探针。通过以上的步骤来制造DNA芯片。
如此，在通过结合部12以及结合部22而处于相互结合的状态下，使荧光探针10以及消光探针20各自的基端结合于固相面100。由此，能够恰当地管理荧光探针10以及消光探针20的位置关系，能够恰当地发挥消光效果。因此，能够使检测灵敏度良好。
本发明的核酸序列测定方法并不限于所述实施方式，可以进行以下的各种变形。
改变被荧光分子修饰的荧光探针和被消光物质修饰的消光探针的存在比，将各自的基端固定于固相面，由此可以控制消光状态下的消光效率。例如，在消光探针比荧光探针多的情况下，荧光探针被消光物质偶联的概率升高。其结果，消光状态下的消光效率上升。由此，可以将没有对象分子存在时的荧光(偏移光量)抑制得较低。另外，在荧光探针比消光探针多的情况下，荧光探针受到消光作用的概率降低，由此荧光探针在检测出对象物质后呈现的荧光量(杂交光量)变得更强。
图7是表示使荧光探针和消光探针的存在比(探针液中荧光探针数量与消光探针数量之比)发生变化情况下的、杂交光量以及偏移光量的变化的图。如图7所示，按照本发明人的实验，消光探针数量越比荧光探针数量多，偏移光量越是减少(参照荧光探针数量:消光探针数量＝1:1、1:2、1:3的情况)。另外，荧光探针越比消光探针多，杂交光量越是变强(参照荧光探针数量:消光探针数量＝2:1的情况)。
图8是示意性地表示消光探针数量多于荧光探针数量情况下的状态的图。如图8所示，在固定在DNA芯片上的消光探针数量多于荧光探针数量的情况下，未与消光探针20结合的荧光探针10的发生频率降低。因此，推测偏移光量减少。在图8所示的例子中，当荧光探针数量与消光探针数量量之比为1:3时，偏移光量最是减少。
在所述实施方式中，荧光探针10的结合部12的序列与靶30互补。但是，荧光探针10的结合部12以及消光探针20的结合部22的序列也可以与靶的种类无关而为相互互补的一定的序列。即，结合部12以及结合部22，与靶的种类没有关系，始终具有相同的序列，仅仅是检测序列13以及检测序列23(图2)根据靶的种类改变即可。因此，在该情况下具有下述优点：探针的设计是容易的；以及消光/发光的特性不依赖于检测对象是一定的。
另外，固定荧光探针以及消光探针的固相面，不限于基板上的平面。例如，固相面可以是球体(以下也称为珠子)的表面(球面)。即，可以将荧光探针以及消光探针固定于珠子表面。图9A表示将荧光探针以及消光探针固定于珠子表面的例子。如图9A所示，荧光探针10以及消光探针20各自的基端固定在珠子40的表面。由此，荧光探针10以及消光探针20成为以珠子40为中心放射状扩展的形状。此时，由于固定探针的基端的固相面的表面积增大，所以可以增加单位面积的探针量。另外，通过根据大小或磁性等来回收捕集有检测对象分子的珠子，对检测对象分子的选择性回收也成为可能。回收后的分子可以在后工序中的其他试验等中使用。
荧光分子或者消光物质也可以不附着在探针的前端。例如，在图9B所示的例子中，荧光分子11以及消光物质21被分别附加在荧光探针10A以及消光探针20A的中途。此时，可以将探针设计成：在荧光探针10A以及消光探针20A已结合的状态下使消光物质21和荧光分子11位于相互相向接近这样的位置，使得发生消光作用。在将荧光分子或者消光物质附加于探针的前端以外的位置的情况下，具有还可以在探针的前端进行其他修饰的优点。
多种荧光分子以及消光物质也可以分别附加于荧光探针以及消光探针的多个部位。图10A是表示在多个部位附加有荧光分子以及消光物质的例子的图。在图10A的例子中，在荧光探针10B上附加有荧光分子11、11、11，在消光探针20B上附加有消光物质21、21、21。在将多个荧光分子以及消光物质附加于一个探针上的情况下，各荧光分子或者消光物质的种类可以不同。在一个探针上附加有多个荧光分子以及消光物质的情况下，结合了检测对象分子时的荧光量增加，更高灵敏度的检测成为可能。
在所述实施方式中，不仅仅是荧光探针10具有检测序列13，消光探针20也具有检测序列23。但是，可以是仅仅荧光探针具有与靶互补的检测序列。不过，认为通过荧光探针10和消光探针20这两种探针具有检测序列，可以进一步提高靶的结合频率。
在所述实施方式中，设计成靶30与荧光探针10结合。但是，也可以以使靶与消光探针20结合的方式来设计探针。此时，可以避免由于靶的靠近而导致的荧光分子的特性的变化。
图10B是表示靶与消光探针结合的例子的图。如图10B的例子所示，消光探针20C与荧光探针10C的序列相比，具有与靶30亲和性更强的序列，由此靶30可以不与荧光探针10C结合，而与消光探针20C结合。此时，荧光探针10C可以具有与靶互补的检测序列，也可以不具有与靶互补的检测序列。
本发明人的实验得到了下述结果：靶结合于荧光探针侧的情况与靶结合于消光探针侧的情况相比，偏移光量没有变化，但是杂交光量增大了。图11A是对于靶结合于荧光探针侧的情况和靶结合于消光探针侧的情况各情况，表示杂交光量和偏移光量的比较结果的图。如此，在靶结合于消光探针侧的情况下，杂交光量被抑制。因此，推断有与荧光探针邻接且未与靶结合的消光探针所致的消光效果。图11B是表示该效果发生的情形的图。如图11B所示，在靶30结合于消光探针20C的情况下，在与荧光探针10C邻接的、未与靶30结合的消光探针20C′的作用下，来自荧光探针10C的荧光被消光。
本发明的应用范围不限于所述实施方式。本发明可以广泛用于使用了核酸序列测定用元件的核酸序列测定方法等，所述核酸序列测定用元件通过样品中所含的具有特定的核酸序列的靶和探针的杂交对该靶进行测定。
另外，本发明的实施方式可以是以下的第一核酸序列测定方法以及第二核酸序列测定方法、第一核酸序列测定用元件～第五核酸序列测定用元件、第一核酸序列测定用元件的制造方法、第一核酸序列测定装置以及第二核酸序列测定装置。
第一核酸序列测定方法，其使用了核酸序列测定用元件，所述核酸序列测定用元件通过杂交对样品中所含的、具有特定核酸序列的靶进行测定，其中，所述核酸序列测定用元件包括：相互独立的荧光探针和消光探针；以及分别固定有所述荧光探针的基端和所述消光探针的基端的固相面，在所述荧光探针上附加有荧光分子，在所述消光探针上附加有消光物质，在所述荧光探针或者所述消光探针上分别设置有具有相互互补的序列的结合部，在所述荧光探针或者所述消光探针上设置有具有与所述核酸序列互补的序列的检测部，当未供给所述靶时，通过所述结合部的结合被维持，所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，当供给了所述靶时，所述靶与所述检测部结合，通过所述结合部的结合被解除，所述消光物质远离所述荧光分子，由此所述荧光分子呈现荧光，所述核酸序列测定方法包括：通过所述核酸序列测定用元件进行杂交的步骤；以及对来自进行了杂交后的所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量的步骤。
第二核酸序列测定方法是在第一核酸序列测定方法中，在对所述荧光进行测量的步骤中，在不对提供给所述核酸序列测定用元件的溶液进行洗涤的状态下，对来自所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
第一核酸序列测定用元件，其通过杂交对样品中所含的具有特定的核酸序列的靶进行测定，其中，所述核酸序列测定用元件包括：相互独立的荧光探针以及消光探针；以及分别固定有所述荧光探针的基端以及所述消光探针的基端的固相面，在所述荧光探针上附加有荧光分子，在所述消光探针上附加有消光物质，在所述荧光探针或者所述消光探针上分别设置有具有相互互补的序列的结合部，在所述荧光探针或者所述消光探针上设置有具有与所述核酸序列互补的序列的检测部，当未供给所述靶时，通过所述结合部的结合被维持，所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，当供给了所述靶时，所述靶与所述检测部结合，通过所述结合部的结合被解除，所述消光物质远离所述荧光分子，由此所述荧光分子呈现荧光。
第二核酸序列测定用元件是在第一核酸序列测定用元件中，所述检测部设置于所述荧光探针。
第三核酸序列测定用元件是在第一核酸序列测定用元件或第二核酸序列测定用元件中，所述固相面设置于平面基板或者珠子。
第四核酸序列测定用元件是在第一核酸序列测定用元件～第三核酸序列测定用元件中的任一元件中，所述结合部的至少一部分作为所述检测部发挥作用。
第五核酸序列测定用元件是在第一核酸序列测定用元件～第四核酸序列测定用元件中的任一元件中，所述消光探针比所述荧光探针多。
第一核酸序列测定用元件的制造方法，其是通过杂交对样品中所含的具有特定的核酸序列的靶进行测定的核酸序列测定用元件的制造方法，其中，所述核酸序列测定用元件包括：相互独立的荧光探针以及消光探针；以及分别固定有所述荧光探针的基端以及所述消光探针的基端的固相面，在所述荧光探针上附加有荧光分子，在所述消光探针上附加有消光物质，在所述荧光探针或者所述消光探针上分别设置有具有相互互补的序列的结合部，在所述荧光探针或者所述消光探针上设置有具有与所述核酸序列互补的序列的检测部，当未供给所述靶时，通过所述结合部的结合被维持，所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，当供给了所述靶时，所述靶与所述检测部结合，通过所述结合部的结合被解除，所述消光物质远离所述荧光分子，由此所述荧光分子呈现荧光，所述核酸序列测定用元件的制造方法包括：通过所述结合部使所述荧光探针以及所述消光探针结合的步骤；以及在通过所述结合部相互结合的状态下，使所述荧光探针以及所述消光探针结合于所述固相面的步骤。
第一核酸序列测定装置，其使用核酸序列测定用元件，通过杂交对样品中所含的具有特定的核酸序列的靶进行测定，其中，所述核酸序列测定用元件包括：相互独立的荧光探针以及消光探针；以及分别固定有所述荧光探针的基端以及所述消光探针的基端的固相面，在所述荧光探针上附加有荧光分子，在所述消光探针上附加有消光物质，在所述荧光探针或者所述消光探针上分别设置有具有相互互补的序列的结合部，在所述荧光探针或者所述消光探针上设置有具有与所述核酸序列互补的序列的检测部，当未供给所述靶时，通过所述结合部的结合被维持，所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，当供给了所述靶时，所述靶与所述检测部结合，通过所述结合部的结合被解除，所述消光物质远离所述荧光分子，由此所述荧光分子呈现荧光，所述核酸序列测定装置，对来自进行了杂交后的所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
第二核酸序列测定装置是在第一核酸序列测定装置中，所述核酸序列测定装置，在不对提供给所述核酸序列测定用元件的溶液进行洗涤的状态下，对来自所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
出于示例和说明的目的已经给出了所述详细的说明。根据上面的教导，许多变形和改变都是可能的。所述的详细说明并非没有遗漏或者旨在限制在这里说明的主题。尽管已经通过文字以特有的结构特征和/或方法过程对所述主题进行了说明，但应当理解的是，权利要求书中所限定的主题不是必须限于所述的具体特征或者具体过程。更确切地说，将所述的具体特征和具体过程作为实施权利要求书的示例进行了说明。

Claims (15)

1.一种核酸序列测定方法，其特征在于，
所述核酸序列测定方法包括：
制备含有对象核酸的样品溶液；
将所述样品溶液提供给核酸序列测定用元件；以及
测量来自所述核酸序列测定用元件的荧光，
所述核酸序列测定用元件包括：
荧光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有荧光分子；
消光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有消光物质；以及
基板，具有固相面，在所述固相面上固定有所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端，
所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的核酸序列，
所述荧光探针和所述消光探针中的至少一方具有检测部，所述检测部具有与特定的核酸序列互补的核酸序列，
具有下述位置关系的所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端固定于所述固相面，所述位置关系为：当所述对象核酸和所述检测部的杂交未产生时，来自所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被维持，由此所述消光物质接近了所述荧光分子，当所述对象核酸和所述检测部的杂交产生了时，远离了所述消光物质的所述荧光分子呈现荧光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被解除，由此所述荧光分子远离了所述消光物质。
2.根据权利要求1所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在所述样品溶液的存在下，对来自所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
3.一种核酸序列测定用元件，其对样品溶液中所含的对象核酸的核酸序列进行测定，所述核酸序列测定用元件的特征在于，
所述核酸序列测定用元件包括：
荧光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有荧光分子；
消光探针，具有结合部以及基端，并且在规定的位置附加有消光物质；以及
基板，具有固相面，在所述固相面上固定有所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端，
所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的核酸序列，
所述荧光探针和所述消光探针中的至少一方具有检测部，所述检测部具有与特定的核酸序列互补的核酸序列，
具有下述位置关系的所述荧光探针以及所述消光探针各自的基端固定于所述固相面，所述位置关系为：当所述对象核酸和所述检测部的杂交未产生时，来自所述荧光分子的荧光被接近了所述荧光分子的所述消光物质消光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被维持，由此所述消光物质接近了所述荧光分子，当所述对象核酸和所述检测部的杂交产生了时，远离了所述消光物质的所述荧光分子呈现荧光，通过借助了所述结合部的、所述荧光探针和所述消光探针的结合被解除，由此所述荧光分子远离了所述消光物质。
4.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，所述荧光探针具有所述检测部。
5.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，所述基板是平板，所述固相面是所述平板的一个平面。
6.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，所述基板是球体，所述固相面是所述球体的球面。
7.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，所述结合部的至少一部分作为所述检测部发挥作用。
8.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，所述消光探针的数量多于所述荧光探针的数量。
9.根据权利要求8所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，所述荧光探针的数量与所述消光探针的数量之比为1:3。
10.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，附加有所述荧光分子以及所述消光物质的所述规定的位置，分别是所述荧光探针以及所述消光探针的中途。
11.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，附加有所述荧光分子以及所述消光物质的所述规定的位置有多个。
12.根据权利要求3所述的核酸序列测定用元件，其特征在于，所述荧光探针以及所述消光探针双方具有所述检测部。
13.一种权利要求3～12中任意一项所述的核酸序列测定用元件的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括：
通过所述结合部使所述荧光探针以及所述消光探针结合；以及
在通过所述结合部相互结合了的状态下，使所述荧光探针以及所述消光探针结合于所述固相面。
14.一种核酸序列测定装置，其特征在于，所述核酸序列测定装置具有：
权利要求3～12中任意一项所述的核酸序列测定用元件；以及
荧光读取装置，对来自所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
15.根据权利要求14所述的核酸序列测定装置，其特征在于，在所述样品溶液的存在下，对来自所述核酸序列测定用元件的荧光进行测量。
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