CN108251506A

CN108251506A - 一种痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN108251506A
Application number: CN201810061633.1A
Authority: CN
Inventors: 娄大伟; 关雅南; 张�浩; 祝波; 王希越; 连丽丽; 高文秀; 刘旭影; 徐阳
Original assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Current assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Priority date: 2018-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2038-01-23
Also published as: CN108251506B

Abstract

本发明公开了一种痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒及检测方法，试剂盒中的试剂包括：单链DNA1、PBS缓冲溶液、Mg²⁺溶液、核酸外切酶III、单链DNA2、抗坏血酸钠溶液、NaCl溶液、CuSO₄溶液，DNA1核苷酸序列为TTTCGTCATGGGTTGACGTTT，DNA2核苷酸序列为CGTCAACCCATGACG。检测方法通过制备双链DNA模板、合成DNA‑Cu纳米簇，基于“T‑Hg²⁺‑T”错配结构与核酸外切酶III结合，构建荧光生物传感器，实现对汞离子的痕量检测。本发明提供的痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒及检测方法，检测灵敏度高，可以显著降低汞离子检测限。

Description

一种痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于荧光生物传感器技术领域，具体为一种痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒及检测方法。

背景技术

汞及其化合物是剧毒性的环境污染物，可对人类的身体健康构成不同程度的危害。极微量的汞金属就能引发生物体内自由基过度激增，产生严重的恶心、呕吐、腹痛以及肾功能损伤等生理现象，甚至导致消化***、神经***紊乱。目前，Hg²⁺的传统检测方法主要有电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法、冷原子吸收法等，这些方法虽然可以有效的检测汞离子，但是存在设备昂贵、操作复杂、成本高、灵敏度低等问题。

发明内容

本发明的目的在于构建并制备一种新型的可用于检测Hg²⁺的荧光生物传感器，将铜纳米簇材料与核酸外切酶III循环放大技术相结合，通过对显著下降的荧光强度的检测实现对Hg²⁺的超高灵敏度检测。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒，试剂盒中的试剂包括：单链DNA1、PBS缓冲溶液、Mg²⁺溶液、核酸外切酶III、单链DNA2、抗坏血酸钠溶液、NaCl溶液、CuSO₄溶液；DNA1核苷酸序列为TTTCGTCATGGGTTGACGTTT，DNA2核苷酸序列为CGTCAACCCATGACG。

进一步的，单链DNA1浓度为100～1000nM，单链DNA2浓度为100～1000nM，PBS缓冲溶液pH7.4。

一种痕量检测汞离子的荧光生物检测方法，所用试剂包括单链DNA1、PBS缓冲溶液、Mg²⁺溶液、核酸外切酶III、单链DNA2、抗坏血酸钠溶液、NaCl溶液、CuSO₄溶液，所述单链DNA1，单链DNA2，DNA1核苷酸序列为TTTCGTCATGGGTTGACGTTT，DNA2核苷酸序列为CGTCAACCCATGACG；检测步骤包括：

1)制备双链DNA模板：将单链DNA1与Hg²⁺溶液、PBS缓冲溶液和Mg²⁺溶液混合，在37℃条件下反应，所述Hg²⁺溶液为待检测样品或不同浓度的Hg²⁺标准溶液；将核酸外切酶III加入到该混合液中，在37℃条件下孵育，再放入80℃水浴中反应；在混合溶液中加入单链DNA2，反应得双链DNA溶液；

2)合成DNA-Cu纳米簇：将含有PBS、抗坏血酸钠和NaCl的混合溶液加入到上述双链DNA溶液中；经过振动搅拌后，再加入CuSO₄溶液，并在37℃条件下静置，荧光Cu纳米簇形成，得到荧光强度待检测液；

3)将步骤2)所得的荧光强度待检测液于波长570nm条件下检测荧光强度；

步骤1)中的Hg²⁺溶液为不同浓度Hg²⁺标准溶液，经过步骤2)得到多个荧光强度待检测液，经过步骤3)测得不同的荧光强度，并绘制出Hg²⁺测定的标准曲线；步骤1)中的Hg²⁺溶液为待检测样品，通过1)、2)、3)步骤，得到荧光强度值，通过标准曲线查出对应的Hg²⁺浓度。

进一步的，所述单链DNA1浓度为100～1000nM，单链DNA2浓度为100～1000nM；检测步骤包括：

1)制备双链DNA模板：将10μL单链DNA1与5μLHg²⁺溶液、40μL浓度为20mmol/L pH7.4的PBS缓冲溶液和10μL 5mmol/L的MgCl溶液混合，在37℃条件下反应5min，所述Hg²⁺溶液为待检测样品或不同浓度的Hg²⁺标准溶液；将10μL核酸外切酶III 33U加入到该混合液中，在37℃条件下孵育1小时，再放入80℃水浴中，反应5min；在混合溶液中加入10μL单链DNA2，反应20min得双链DNA溶液；

2)合成DNA-Cu纳米簇：将含有20mmol/L PBS、0.5～2.5mmol/L抗坏血酸钠和1mol/LNaCl的混合溶液加入到上述双链DNA溶液中；经过振动搅拌后，再加入10μL浓度为40μM～200μM的CuSO₄溶液，并在37℃条件下静置10min，荧光Cu纳米簇形成，得到荧光强度待检测液；

3)将步骤2)所得的荧光强度待检测液于波长570nm条件下检测荧光强度。

本发明的荧光生物传感器是以特定的DNA双链为模板，合成DNA-Cu纳米簇，利用核酸外切酶III对特定的双链DNA进行循环酶切实现检测信号放大的荧光生物传感器。具体的是：双链DNA能诱导合成铜纳米簇，而单链DNA不能。在实验中，单链DNA1是一条折叠后碱基部分自相杂交，3’端和5’端突出，并且3’端和5’端各带三个碱基胸腺嘧啶T的DNA链。当不存在Hg离子时，加入核酸外切酶III后，核酸外切酶III不会对单链DNA1进行切割，随后，加入单链DNA2，根据碱基互补配对原则，单链DNA1打开变成一条直链与单链DNA2杂交形成双螺旋结构的双链DNA，此时，加入Cu离子和抗坏血酸钠后，形成DNA-Cu纳米簇，体系的荧光强度增强。但是当Hg离子存在时，Hg离子与单链DNA1中3’端和5’端的胸腺嘧啶T结合，形成“T-Hg²⁺-T”错配结构，使单链DNA1的3’端和5’端变得平整，当加入核酸外切酶III后，核酸外切酶III沿着双链DNA的3’端到5’端方向切割杂交部分的碱基，从而释放出Hg离子，Hg离子参与到下一个循环过程，然后，将单链DNA2加入到被切割成片段的单链DNA1中，两条单链DNA不会形成双链DNA，所以，加入Cu离子和抗坏血酸钠后，体系的荧光强度减弱。

本发明的有益效果：

1)本发明利用铜纳米簇材料代替了传统的有机荧光染料制备荧光生物传感器。而且，铜纳米簇具有价格低廉、无毒等优点。

2)本发明利用核酸外切酶III对特定的双链DNA进行循环酶切实现检测信号放大，从而提高检测汞离子的灵敏度。

3)本发明使用的仪器及试剂价格低廉，操作简单，快速。

附图说明

图1为检测Hg离子的原理图；

图2为检测Hg离子的荧光强度对比图；

a为不加待测物Hg离子和核酸外切酶III；b为加待测物Hg离子，不加核酸外切酶III；c为加核酸外切酶III，不加待测物Hg离子；d为加待测物Hg离子和核酸外切酶III，其中加待测物Hg离子浓度为40nM，核酸外切酶III为33U。图3为荧光强度与汞离子浓度的标准曲线图；

图4为传感器检测汞离子的选择性图；

在没有Hg²⁺存在的条件下，检测一系列金属离子的荧光强度。其中，Hg²⁺浓度为56nM，其它金属离子浓度为1mM，金属离子包括，Hg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、K⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺；

图5为传感器检测汞离子的抗干扰性图；

其中，Hg²⁺浓度为40nM Hg²⁺，其它金属离子浓度为1mM，金属离子包括，Hg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、K⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施方式及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施方式及实施例。凡是不背离本发明的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过具体实施方式及具体实施例说明本发明，但本发明不受下述实施方式及实施例的限定。

实施例1

一种痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒，试剂盒中的试剂包括：单链DNA1(序列：TTTCGTCATGGGTTGACGTTT)、PBS缓冲溶液、Mg²⁺溶液、核酸外切酶III、单链DNA2(序列：CGTCAACCCATGACG)、抗坏血酸钠溶液、NaCl溶液、CuSO₄溶液。单链DNA1浓度为100～1000nM，单链DNA2浓度为100～1000nM，PBS缓冲溶液pH7.4。采用本试剂盒可以检测环境中、生物样品中的汞离子。该试剂盒中DNA序列选择很重要，改变DNA序列会影响最后检测的荧光强度，影响实验的灵敏度。

实施例2

一种痕量检测汞离子的荧光生物检测方法，检测原理见图1，荧光对比见图2，采用实施例1中的试剂盒，检测步骤包括：

2)合成DNA-Cu纳米簇：将含有PBS、抗坏血酸钠和的混合溶液加入到上述双链DNA溶液中；经过振动搅拌后，再加入CuSO₄溶液，并在37℃条件下静置，荧光Cu纳米簇形成，得到荧光强度待检测液；

步骤1)中的Hg²⁺溶液为不同浓度Hg²⁺标准溶液，经过步骤2)得到多个荧光强度待检测液，经过步骤3)测得不同的荧光强度，并绘制出Hg²⁺测定的标准曲线(见图3)；步骤1)中的Hg²⁺溶液为待检测样品，通过1)、2)、3)步骤，得到荧光强度值，通过标准曲线查出对应的Hg²⁺浓度。

实施例3

在实施例2的基础上对检测条件进行进一步限定。

检测步骤包括：

1)制备双链DNA模板：将10μL单链DNA1与5μLHg²⁺溶液、40μL浓度为20mmol/L pH7.4的PBS缓冲溶液和10μL5mmol/L的MgCl₂溶液混合，在37℃条件下反应5min，所述Hg²⁺溶液为待检测样品或不同浓度的Hg²⁺标准溶液；将10μL核酸外切酶III 33U加入到该混合液中，在37℃条件下孵育1小时，再放入80℃水浴中，反应5min；在混合溶液中加入10μL单链DNA2，反应20min得双链DNA溶液；

DNA1、DNA2的浓度为优选为750nM。在步骤2)CuSO₄溶液浓度优选为120μM。在步骤2)抗坏血酸钠在混合溶液中浓度优选为1.5mmol/L。

实施例4

在实施例3的基础上对检测条件进行进一步限定。

1)将10μL DNA1(750nM)分别加入到编号为①到的11个小管中，其中，①号不加硝酸汞溶液，②号加入0.08nM硝酸汞溶液，③号加入0.4nM硝酸汞溶液，④号加入0.8nM硝酸汞溶液，⑤号加入4nM硝酸汞溶液，⑥号加入8nM硝酸汞溶液，⑦号加入24nM硝酸汞溶液，⑧号加入40nM硝酸汞溶液，⑨号加入56nM硝酸汞溶液，⑩号加入80nM硝酸汞溶液，号加入未知浓度汞溶液样品；其次分别向编号为①到的混合溶液中加入40μL 20mmol/L的PBS缓冲溶液(PH7.4)及10μL 5mmol/L氯化镁溶液，将此混合溶液放在37℃的水浴震荡中避光反应5min；将10μL核酸外切酶III33U加入到该混合液中，在37℃条件下孵育1小时；然后分别将编号为①到的混合溶液放入80℃的水浴震荡避光反应5min；再将编号为①到的混合溶液中加入10μL的另一条单链DNA2(750nM)，反应20min，此时双链DNA模板形成；

2)将含有20mmol/L的PBS缓冲溶液(PH7.4)、1.5mmol/L的抗坏血酸钠和1mol/L的NaCl的混合溶液加入到上述双链DNA溶液中；经过振动搅拌，将10μLCuSO₄溶液分别加入到编号为①到的混合溶液中，得到编号为①到的荧光强度待检测液；用1ml比色皿，编号为①不加硝酸汞溶液的作为空白参比，测定570nm处编号为①到的待测液的荧光强度；其中，从编号为①到⑩，以汞离子浓度为纵坐标，以体系的荧光强度为横坐标，可以绘制出标准曲线；号未知浓度汞溶液样品可以通过该标准曲线查出它的浓度。

将本发明提出的方法用于Hg²⁺的痕量检测，能够显著提高Hg²⁺检测的灵敏度。通过表格1可以看出，与其他荧光法相比较，此方法的检测限低。通过图4、5可见，本方法抗干扰能力强。

表1本方法与其他荧光法检测限对比表

Claims

1.一种痕量检测汞离子的荧光生物传感器试剂盒，其特征在于：试剂盒中的试剂包括：单链DNA1、PBS缓冲溶液、Mg²⁺溶液、核酸外切酶III、单链DNA2、抗坏血酸钠溶液、NaCl溶液、CuSO₄溶液；DNA1核苷酸序列为TTTCGTCATGGGTTGACGTTT；DNA2核苷酸序列为CGTCAACCCATGACG。

2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器试剂盒，其特征在于：单链DNA1浓度为100～1000nM，单链DNA2浓度为100～1000nM，PBS缓冲溶液pH7.4。

3.一种痕量检测汞离子的荧光生物检测方法，其特征在于：所用试剂包括单链DNA1、PBS缓冲溶液、Mg²⁺溶液、核酸外切酶III、单链DNA2、抗坏血酸钠溶液、NaCl溶液、CuSO₄溶液，DNA1核苷酸序列为TTTCGTCATGGGTTGACGTTT，DNA2核苷酸序列为CGTCAACCCATGACG；检测步骤包括：

1）制备双链DNA模板：将单链DNA1与Hg²⁺溶液、PBS缓冲溶液和Mg²⁺溶液混合，在37^OC条件下反应，所述Hg²⁺溶液为待检测样品或不同浓度的Hg²⁺标准溶液；将核酸外切酶III加入到该混合液中，在37^OC条件下孵育，再放入80^OC水浴中反应；在混合溶液中加入单链DNA2，反应得双链DNA溶液；

2）合成DNA-Cu纳米簇：将含有PBS 、抗坏血酸钠和NaCl的混合溶液加入到上述双链DNA溶液中；经过振动搅拌后，再加入CuSO₄溶液，并在 37^OC条件下静置，荧光Cu纳米簇形成，得到荧光强度待检测液；

3）将步骤2）所得的荧光强度待检测液于波长570nm条件下检测荧光强度；

步骤1）中的Hg²⁺溶液为不同浓度Hg²⁺标准溶液，经过步骤2)得到荧光强度待检测液，经过步骤3）测得不同的荧光强度，并绘制出Hg²⁺测定的标准曲线；步骤1）中的Hg²⁺溶液为待检测样品，通过1）、2）、3）步骤，得到荧光强度值，通过标准曲线查出对应的Hg²⁺浓度。

4.根据权利要求3所述的痕量检测汞离子的荧光生物检测方法，其特征在于：所述单链DNA1浓度为100～1000nM，单链DNA2浓度为100～1000nM；检测步骤包括：

1）制备双链DNA模板：将10µL单链DNA1与5µLHg²⁺溶液、40µL浓度为20mmol/L pH7.4的PBS缓冲溶液和10µL 5mmol/ L 的MgCl₂溶液混合，在37^OC条件下反应5min，所述Hg²⁺溶液为待检测样品或不同浓度的Hg²⁺标准溶液； 10µL 核酸外切酶III 33U加入到该混合液中，在37^OC条件下孵育1小时，再放入80^OC水浴中，反应5min；在混合溶液中加入10µL单链DNA2，反应20min得双链DNA溶液；

2）合成DNA-Cu纳米簇：将含有20mmol/L PBS 、0.5～2.5mmol/L抗坏血酸钠和1mol/LNaCl的混合溶液加入到上述双链DNA溶液中；经过振动搅拌后，再加入10µL浓度为40µM～200µM 的CuSO₄溶液，并在 37^OC条件下静置10min，荧光Cu纳米簇形成，得到荧光强度待检测液；

3）将步骤2）所得的荧光强度待检测液于波长570nm条件下检测荧光强度。

5.根据权利要求3所述的痕量检测汞离子的荧光生物检测方法，其特征在于：步骤1）单链DNA1的浓度为 750nM；步骤2）单链DNA2的浓度为 750nM。

6.根据权利要求3所述的痕量检测汞离子的荧光生物检测方法，其特征在于：在步骤2）CuSO₄溶液浓度为120µM。

7.根据权利要求3所述的痕量检测汞离子的荧光生物检测方法，其特征在于：在步骤2）抗坏血酸钠在混合溶液中浓度为1.5mmol/L。