CN105040110A - 用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法。提供了探针和PCR引物，通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，然后设计特异性探针，可对猪传染性胃肠炎病毒进行鉴定。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的检测猪传染性胃肠炎病毒的芯片方法。

Description

用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法

技术领域

本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的芯片检测装置。

背景技术

猪传染性胃肠炎(porcinetransmissiblegastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,TGEV)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的高度接触性传染病，对养猪业造成巨大的损失。该病可感染不同年龄的猪，但对新生仔猪的致死率高达100%，成年猪感染后发病温和，可能会出现生长障碍和无乳等现象。近年来，该病在世界各地频频发生，我国四川、湖北、吉林、陕西、台湾、北京、广州等多个地区也均有流行，并且呈上升趋势。由于TGEV经常与其他病毒混合感染，或常伴细菌的继发感染，使临床症状复杂多样，混合感染和继发感染大大增加了TGEV诊断的难度。

猪传染性胃肠炎病毒(porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,TGEV)属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属的不分节段的单股正链RNA病毒。TGEV基因组由7个开放阅读框（ORF1-ORF7）组成,5’端有甲基化的帽子结构，3’端有PloyA尾，使得病毒RNA具有感染性。TGEV不仅能引起急性肠炎，而且常为持续感染，即在感染100d后，在康复猪的呼吸道中仍能检测到病毒的存在，严重影响了养猪业的持续健康发展。猪对TGEV最为易感，而猪以外的动物猫、狗、狐狸等不致病，但可带毒、排毒。大量的带毒动物促进了猪传染性胃肠炎的爆发。因此，建立一种快速、准确检测该病毒的方法，有利于保障我国养猪业的发展。在对其它动物或者肉制品的出入境快速检测中也有重要作用。

基因芯片(Genechip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾病检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。目前，基因芯片检测技术已应用于多种疾病的检测，但缺乏猪传染性胃肠炎病毒基因芯片的检测方法。综合寡聚核苷酸芯片的优点，本发明建立一种快速、准确鉴定猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片检测技术，为控制猪传染性胃肠炎病毒的传播及进出境动物的检疫具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区（P1），包含至少一个点样位置质控探针:SEQIDNO.2；

杂交阳性质控分区（P2），包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQIDNO.3；

杂交阴性质控分区（N），包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区内设置至少一个猪传染性胃肠炎病毒探针分区，其中猪传染性胃肠炎病毒探针DNA序列为SEQIDNO.1。

利用上述基因芯片检测猪传染性胃肠炎病毒的检测方法，包括如下步骤：

（1）待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组RNA，进行反转录，制备待测样品cDNA；

（2）PCR扩增：25μLPCR反应液包含rTaq酶12.5μL、引物Mix:2.4μL、待测样品DNA5μL、无核酸酶灭菌水5.1μL；

其中，所引物Mix含有：

序列为SEQIDNO.4的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.2μL，

序列为SEQIDNO.5的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0.2μL，

序列为SEQIDNO.6的20μmol/L通用引物上游引物1μL，

序列为SEQIDNO.7的20μmol/L通用引物下游引物1μL.

按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃5min；

（3）杂交：首先配制杂交缓冲液：杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物8μL、杂交阳性对照0.1μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后取15μL杂交液进行杂交；

（4）结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

本发明具有如下优点:

（1）成功地构建了TGEV检测基因芯片：本发明所制备的基因芯片采用的各条筛选探针可与对应病原体目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。

（2）制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征。本发明建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。

（3）检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段，为今后出入境动物检疫、出入境食品安全和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫工作的需要，控制猪传染性胃肠炎病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。

附图说明

图1为芯片探针分布示意图；

图2为猪传染性胃肠炎病毒核酸杂交结果；

图中：P1-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；N-杂交阴性质控分区；1-猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区；2-副猪嗜血杆菌探针分区；3-猪肺炎支原体探针分区；4-猪圆环病毒2型探针分区；5-猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区；6-猪瘟病毒探针分区;7-猪传染性胃肠炎病毒探针分区；

杂交说明：P1：探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；

P2：杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性；

N：杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；

猪传染性胃肠炎病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，7号探针亮。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。

实施例1，本发明是分别对猪传染性胃肠炎病毒细胞增殖，提取病毒基因组RNA,并进行反转录。对猪传染性胃肠炎病毒的特异保守序列进行克隆、测序分析，根据测序结果设计了1条寡核苷酸探针，可与相应病原体的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩增时，上游通用引物5′端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在42℃下进行杂交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来检测猪传染性胃肠炎病毒。根据Genbank网站上公布的猪传染性胃肠炎病毒的全基因序列利用PrimerPremier5.0生物软件设计PCR引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5。同时，克隆基因序列，并进行测序、比对分析，利用fastPCR生物软件设计1条特异性寡核苷酸探针SEQIDNO.1。通过这4条PCR引物和1条特异性的探针，可以特异的、敏感的快速检测株传染性胃肠炎病毒。根据国家质量监督检验检疫总局文件（2009.178号）《关于进一步加强进出境猪甲型H1N1流感检验检疫工作的通知——A型流感分型基因芯片检测方法》提供的质控序列合成本发明用质控序列SEQIDNO.2、SEQIDNO.3。

每条探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列如下：

SEQIDNO.1为：

5'-NH₂-T₁₅-GCACCATCCTTGGCAACCCAGACAACTCCATCTAATT；

SEQIDNO.2为：

5'-NH₂-T₁₅-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-TAMRA；

SEQIDNO.3为：

5'-NH₂-T₁₅-GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATT。

实施例2，参见图1，用于猪传染性胃肠炎病毒检测的基因芯片，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成8行×7列的微阵列。微阵列上探针分布从上到下依次为：点样位置质控分区P1：1行×8点，杂交阳性质控分区P2：1行×4点，杂交阴性质控分区N：1行×4点，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检测探针分区1：1行×4点，副猪嗜血杆菌检测探针分区2：1行×4点，猪肺炎支原体检测探针分区3：1行×4点，猪圆环病毒2型检测探针区分4：1行×4点，猪繁殖与呼吸综合征病毒检测探针分区5：1行×4点，猪瘟病毒检测探针分区6：1行×4点，猪传染性胃肠炎病毒探针分区7：1行×4点，杂交阴性质控分区N：1行×4点，点样位置质控分区P1：1行×8点。每张芯片上有至少一个上述微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。

杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液，点样缓冲液为市售产品，例如博奥生有限公司生产的。其余各分区包括对应的检测探针和质控探针。

图2为本发明的具体实施方式，为猪传染性胃肠炎病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果。

实施例3、试剂准备

1）芯片洗液

根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ。

洗液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2%。如600mL洗液Ⅰ=528mL蒸馏水+60mL20×SSC+12mL10%SDS，或根据需要按比例配制。

洗液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。如600mL洗液Ⅱ=594mL蒸馏水+6mL20×SSC，或根据需要按比例配制。

若10%SDS产生白色絮状沉淀，请置于42℃水浴中溶解混匀后配制洗液。

2）无水乙醇。

3）冰水混合物。

实施例4、病毒基因组的提取

按照相应商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，进行反转录，制备样品cDNA。

实施例5、PCR扩增病毒基因组cDNA

1、PCR反应体系：在PCR配液区内，在冰上融化引物Mix及cDNA，按如下体系配制反应液。25μLPCR反应液包含rTaq酶12.5μL、引物Mix:2.4μL、待测样品DNA5μL、无核酸酶灭菌水5.1μL；

其中，所述引物Mix含有：

序列为SEQIDNO.4的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.2μL，

序列为SEQIDNO.5的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0.2μL，

序列为SEQIDNO.6的20μmol/L通用引物上游引物1μL，

序列为SEQIDNO.7的20μmol/L通用引物下游引物1μL.

猪传染性胃肠炎病毒上游引物SEQIDNO.4：

5′-AGGTGACACTATAGAATAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGG-3′；

猪传染性胃肠炎病毒下游引物SEQIDNO.5：

5′-GTACGACTCACTATAGGGAACTGTCATCCTTCTTGTTATTGG-3′；

通用上游引物SEQIDNO.6：5′-cy3-AGGTGACACTATAGAATA-3′;

通用下游引物SEQIDNO.7：5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′。

2、扩增：将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行PCR反应。

表1PCR反应程序

PCR产物要避光放置。短期保存放置4℃冰箱。

实施例6、判读

1、洗片：杂交缓冲液在42℃融化，按下面体系配制杂交液，杂交体系混合液95℃变性8分钟，冰浴5分钟，备用。配制16μL杂交液：杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物8μL、杂交阳性对照0.1μL。

打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约200μL灭菌水。将芯片正面朝上（围栏面朝上，标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入42℃恒温水浴中，静置，杂交2-3小时均可。

杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液Ⅰ中，42℃震荡清洗5分钟，再用42℃预热好的洗液Ⅱ，42℃震荡清洗5分钟（冬季洗液Ⅱ可清洗两次，每次两分钟），最后用42℃预热好的清水清洗一次，清洗后的芯片2000rpm离心2分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。

2、扫描及结果判读

洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪在晶芯LuxScanTM10K-A微阵列芯片扫描仪下进行扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

实施例7、弃物处理

按照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。

SEQUENCELISTING

<110>重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法

<160>7

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>SEQIDNO.1

NH2-t15-gcaccatccttggcaacccagacaactccatctaatt37

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>SEQIDNO.2

NH2-t15-gctgcctcggcaaggagt-TAMRA18

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>SEQIDNO.3

NH2-t15-gtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagatt38

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>SEQIDNO.4

aggtgacactatagaataaggtggttcttctactacttagg41

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>SEQIDNO.5

gtacgactcactatagggaactgtcatccttcttgttattgg42

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>SEQIDNO.26

cy3-aggtgacactatagaata18

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>SEQIDNO.7

gtacgactcactataggga19

Claims (5)

1.用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区（P1），包含至少一个点样位置质控探针:SEQIDNO.2；

杂交阳性质控分区（P2），包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQIDNO.3；

杂交阴性质控分区（N），包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区内设置至少一个猪传染性胃肠炎病毒探针分区，其中猪传染性胃肠炎病毒探针DNA序列为SEQIDNO.1。

2.根据权利要求1所述用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，其特征在于：每张所述检测芯片上包括至少一个权利要求1所述的微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。

3.根据权利要求1所述用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，其特征在于：所述每条质控探针和猪传染性胃肠炎病毒探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。

4.利用权利要求1所述基因芯片检测猪传染性胃肠炎病毒的非疾病检测目的的检测方法，包括如下步骤：

（1）待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待测样品全基因组RNA，进行反转录，制备待测样品cDNA；

（2）PCR扩增：25μLPCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix:2.4μL、待测样品cDNA5μL、无核酸酶灭菌水5.1μL；

其中，所述引物Mix含有：

序列为SEQIDNO.4的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.2μL，

序列为SEQIDNO.5的10μmol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0.2μL，

序列为SEQIDNO.6的20μmol/L通用引物上游引物1μL，

序列为SEQIDNO.7的20μmol/L通用引物下游引物1μL.

按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃5min；

（3）杂交:首先配制杂交缓冲液：杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物8μL、杂交阳性对照0.1μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后采用15μL杂交液进行杂交；

（4）结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：所述杂交缓冲液每1000μL包括20×SSC500μL、10%SDS10μL及DEPCH₂O490μL。