CN104611470A - 用于检测蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法。包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、芯片围栏、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒和检测微阵列。通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，然后设计特异性探针，优化杂交条件，可对蓝舌病病毒进行检测。从而建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测蓝舌病病毒的方法。

Description

用于检测蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法

技术领域

本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及蓝舌病病毒的基因检测芯片及其检测方法。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue disease,BT)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的急性、烈性非接触性虫媒传染病。BTV主要感染绵羊、山羊、牛等家养和野生反刍动物,常见临床症状为高热、舌头变蓝和口腔粘膜水肿出血等。一般情况下，该病的死亡率为20％-30％，但对于某些品种的绵羊，致死率可高达90％，严重影响畜牧业的发展。蓝舌病病毒主要通过吸血昆虫(如库蠓等)吸吮带毒血液后叮咬易感动物进行传播,因此该病的爆发流行具有一定的季节性、地方性和周期性。另外，该病毒也可通过***和胎盘进行垂直传播。蓝舌病是一种世界性危害的虫媒性传染病，OIE将其列为A类疫病，我国将其列为一类动物疫病，主要分布于美洲、非洲、澳洲及亚洲地区，我国也在云南、湖北、安徽、四川、山西、广西等多个地区分离得到BTV。近年来，随着全球气候变暖和国际动物贸易的逐年增加，蓝舌病在全球范围内有扩大流行的趋势，可感染多种动物，对畜牧业生产发展和人类健康构成严重威胁。

蓝舌病病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属,病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜，由10个节段的双链RNA组成，编码7种结构蛋白和4种非结构蛋白，为迄今为止分子量最大的RNA病毒。目前已证实BTV至少存在24个血清型，各血清型间交叉保护力低。另外，蓝舌病病毒常与小反刍兽疫、水疱性口炎、猪水疱病毒等混合感染，大大增加对该病的诊断难度。我国蓝舌病的诊断和检疫的标准(GB/T18636-2002)方法主要有病毒的分离鉴定、抗原捕获ELISA(抗原捕获ELISA)、定型微量中和试验和空斑及空斑抑制定型试验等用于病原的检测，琼脂免疫扩散试验(AGID)和竞争ELISA(C-ELISA)用于抗体的检测。病毒分离鉴定是OIE推荐的诊断BTV的方法之一，但是该方法存在培养周期长的局限性。血清学检测方法可用于病毒分离物的血清型鉴定，也可用于BTV特异性抗体的检测。BTV核酸检测技术包括通用型检测和分型检测，主要包括核酸探针技术、RT-PCR、荧光定量PCR、基因芯片检测技术等。蓝舌病尚无有效的治疗方法和疫苗，早发现、早处理依靠于快速、准确的检测手段。因而能够准确快速检测出BTV，在动物及其副产品的进出口检疫中具有重要的意义。

基因芯片(Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成病毒检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片，检测蓝舌病病毒的基因芯片。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于检测蓝舌病病毒的基因芯片包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、芯片围栏、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO.2；

杂交阳性质控分区P2，包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.3；

杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区包含至少一个蓝舌病病毒探针：SEQ ID NO.1。

利用上述基因芯片检测蓝舌病病毒的检测方法，具体步骤如下：

(1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待测组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备cDNA，获得待检样品DNA；

(2)PCR扩增：25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix 5.4μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水4.1μL；

其中，所述引物Mix含有：

20μmol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.4 0.2μL,

20μmol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO.5 0.2μL,

20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.6 4μL，

20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.7 1μL；

按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃10min；

(3)杂交:首先配制杂交液：杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.1μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后采用15μL杂交液进行杂交；杂交缓冲液每1000μL包括20×SSC 500μL、10％SDS 10μL及无核酸酶灭菌水490μL。

(4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

本发明综合基因芯片的优点，利用寡聚核苷酸探针的稳定性，建立一种快速、准确鉴定蓝舌病病毒的基因芯片检测技术，为控制蓝舌病病毒的传播及进出境动物的检疫具有重要作用。

(1)成功地构建了BTV检测基因芯片：本发明所制备的蓝舌病病毒探针可与对应病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。

(2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。

(3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段，为今后出入境动物检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫工作的需要，控制蓝舌病病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。

附图说明

图1芯片探针分布示意图；

图2蓝舌病病毒杂交及特异性结果图；

图3蓝舌病病毒基因芯片检测灵敏度结果图；

图中：P1-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；1-***病毒A型探针分区；2-***病毒亚洲I型探针分区；3-***病毒通用型探针分区；4-***病毒O型探针分区；5-水疱性口炎病毒探针分区；6-猪水疱病病毒探针分区；7-蓝舌病病毒探针分区；8-小反刍兽疫病毒探针分区；N-杂交阴性质控分区；

杂交说明：P1：探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；

P2：杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性；

N：杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；

蓝舌病病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，7号探针亮；

图3中，A:2.99×10⁸copies/uL；B:2.99×10⁷copies/uL；C:2.99×10⁶copies/uL；D:2.99×10⁵copies/uL E:2.99×10⁴copies/uL；F:2.99×10³copies/uL。

具体实施方式

提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下实施例。

实施例1，本发明是基于对蓝舌病病毒的细胞增殖，提取病毒基因组。选取不同的特异保守序列设计了1条寡核苷酸探针，可与相应的病毒cDNA的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩增时，通用上游引物5′端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在50℃下进行杂交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来检测蓝舌病病毒。根据Genbank网站上公布的蓝舌病病毒基因序列利用Primer Premier 5.0生物软件设计PCR引物SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。克隆基因序列，并进行测序、比对分析，选取保守序列在利用Primer Premier生物软件设计所述1条特异性寡核苷酸探针，SEQ ID NO.1。通过上述引物和探针，可快速、特异、敏感的检测蓝舌病病毒。

每条探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列如下：

蓝舌病病毒探针SEQ ID NO.1为：

5'-NH₂-T₁₅-GATACGATTTCACAACCACCGAGATATGCTCCGAG

点样位置质控探针SEQ ID NO.2为：

5'-NH₂-T₁₅-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-TAMRA；

杂交阳性质控探针SEQ ID NO.3为：

5'-NH₂-T₁₅-GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATT。

实施例2，参见图1，用于蓝舌病病毒检测的基因芯片，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成7行×8列的微阵列。微阵列上探针分布从上到下依次为：点样位置质控分区P1：1行×8点，杂交阳性质控分区P2：1行×4点，***病毒A型检测探针分区1：1行×4点，***病毒亚洲型检测探针分区2：1行×4点，***病毒通用型检测探针分区3：1行×4点，***病毒O型检测探针区分4：1行×4点，水疱性口炎病毒检测探针分区5：1行×4点，猪水疱病病毒检测探针分区6：1行×4点，蓝舌病病毒检测探针分区7：1行×4点，小反刍兽疫病毒检测探针分区8：1行×4点，杂交阴性质控分区N：1行×4点，点样位置质控分区P1：1行×8点。每张芯片上有至少一个上述微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。还可以将微阵列的待测样品探针区设置为只含有蓝舌病病毒探针。

杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液，点样缓冲液为博奥生有限公司生产的市售产品。其余各分区包括对应的检测探针和质控探针。

图2和图3为利用本发明的基因芯片和检测方法进行特异性实验和灵敏度实验的结果。最低检测极限达到可达2.99×10³拷贝/uL。

实施例3、试剂准备

1)芯片洗液

根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ。

洗液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2％。如500mL洗液Ⅰ＝440mL蒸馏水+50mL 20×SSC+10mL 10％SDS，或根据需要按比例配制。

洗液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。如500mL洗液Ⅱ＝495mL蒸馏水+5mL 20×SSC，或根据需要按比例配制。

若10％SDS产生白色絮状沉淀，请置于42℃水浴中溶解混匀后配制洗液。

2)无水乙醇。

3)冰水混合物。

实施例4、病毒基因组RNA提取

按照相应商品化RNA提取试剂盒使用说明书,提取待检组织或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA，进行反转录制备待测样品的cDNA。

实施例5、PCR扩增病毒基因组cDNA

1、PCR反应体系：在PCR配液区内，在冰上融化引物Mix及基因组cDNA，按如下体系配制反应液。25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix5.4μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水4.1μL；

其中，所述引物Mix含有：

20μmol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.4 0.2μL,

20μmol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO.5 0.2μL,

20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.6 4μL，

20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.7 1μL；

蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.4：

5′-AGGTGACACTATAGAATAATGCTATCCGGGCTGATCCRA-3′

蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO.5：

5′-GTACGACTCACTATAGGGATCACRTCATCACGAAACGCTT C-3′

PCR通用上游引物SEQ ID NO.6：5′-cy3-AGGTGACACTATAGAATA-3′，

PCR通用下游引物SEQ ID NO.7：5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′

2、扩增：将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行PCR反应。

表1PCR反应程序

PCR产物要避光放置。短期保存放置4℃冰箱。

实施例6、判读

1、洗片：杂交缓冲液在42℃融化，按下面体系配制杂交液，杂交体系混合液95℃变性8分钟，冰浴5分钟，备用。配制15μL杂交液：杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.1μL。

打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约200μL灭菌水。将芯片正面朝上(围栏面朝上，标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入50℃恒温水浴中，静置，杂交3小时。

杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液Ⅰ中，42℃震荡清洗4分钟，再用42℃预热好的洗液Ⅱ，42℃震荡清洗4分钟，最后用42℃预热好的清水清洗一次，清洗后的芯片2000rpm离心2分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。

2、扫描及结果判读

洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪在晶芯LuxScanTM10K-A微阵列芯片扫描仪下进行扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

实施例7、弃物处理

按照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。

Claims (5)

1.用于检测蓝舌病病毒的基因芯片，包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH₂O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、芯片围栏、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成的微阵列，其特征是：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：

点样位置质控分区(P1)，包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO.2；

杂交阳性质控分区(P2)，包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.3；

杂交阴性质控分区(N)，包含点样缓冲液；

所述待测样品探针区内包含至少一个蓝舌病病毒探针：SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述用于检测蓝舌病病毒的基因芯片，其特征是：每张所述检测芯片上包括至少一个权利要求1所述的微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。

3.根据权利要求1所述用于检测蓝舌病病毒的基因芯片，其特征是：所述每条质控探针和待测样品探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。

4.利用权利要求1所述基因芯片检测蓝舌病病毒的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤：

(1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待检测组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备cDNA，获得待检样品DNA；

(2)PCR扩增：25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix 5.4μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水4.1μL；

其中，所述引物Mix含有：

20μmol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.40.2μL,

20μmol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO.50.2μL,

20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.64μL，

20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.71μL；

按如下步骤进行扩增:94℃ 5min；94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 25sec循环12次；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 25sec循环30次；72℃ 10min；

(3)杂交:首先配制杂交液：杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.1μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后采用15μL杂交液进行杂交；

(4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。

5.根据权利要求4所述检测方法，其特征是：所述杂交缓冲液每1000μL包括20×SSC 500μL、10％SDS 10μL及无核酸酶灭菌水490μL。