CN101629217A - 猪流感病毒rt-lamp检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列,针对PA序列相对保守区域设计了SIV RT-LAMP简并引物6条,以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板,建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT-LAMP方法。利用LA-320 LAMP Tubidimeter仪分析反应过程并判定结果,显示在LA-320 LAMP Tubidimeter仪中63℃反应45min,所有实验用的4种亚型SIV样品RNA均获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明:本方法可对100TCID50 SIV样品RNA进行10-4稀释后仍可高效扩增,显示出本方法高度的敏感性;通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT-LAMP检测,有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性,与RT-PCR、鸡胚分离结果一致,经基因芯片分型鉴定验证,综合结果符合率为100%。显示本方法特异、敏感、快速,适合用于各种试验条件下SIV的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法,属于兽用生物制品领域中疫病诊断技术。
背景技术
猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)属正黏病毒科,它可引起猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病——猪流感。猪在禽-猪-人的流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程流感种间传播过程中,起着中间宿主及多重宿主的作用。由于猪上皮细胞具有唾液酸α-2,3半乳糖苷(SAα-2,3-Gal)和唾液酸α-2,6半乳糖苷(SAα-2,6-Gal),人流感病毒可与前者结合,而禽流感病毒与后者结合。因此,猪上皮细胞就能够被人流感病毒和禽流感病毒感染,而成为毒株间基因重排的活载体。由于流感病毒可直接感染人,导致人类患病或死亡,其公共卫生意义日渐显著。
在临床中,猪流感病毒常见以H1、H3亚型为主(李海燕等.部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定[J]动物医学进展,2003,03),后来又有从猪体分离到H5N1、H9N2亚型流感毒株的报道(李海燕等.***源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定[J]中国预防兽医学报,)。在SIV的检测工作当中,目前多使用病毒分离、HI、ELASA和RT-PCR方法。由于这些方法检测周期长、特异性与敏感性方面存在一定局限性,限制了在基层的推广使用。
环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术(Notomi,T.,et al.,Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000,28,e63.),该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶,在等温条件下可以高效、高特异地扩增靶序列。近年来,国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物,建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒,如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前国内外均未见有用于检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒及RT-LAMP方法在猪流感病毒检测中的应用的报道。
发明内容
本发明的目的是建立检测猪流感病毒的RT-LAMP检测方法,并提供一种用于以上目的的RT-LAMP试剂盒。
本发明的技术方案
本发明的原理及技术路线
新型的核酸扩增(LAMP)技术在检测工作中具有速度快、特异性强、敏感度高的优势,但是由于猪流感病毒不同亚型间的基因序列差异比较大,难以设计猪流感病毒不同亚型通用的RT-LAMP检测引物,对LAMP技术在SIV的检测中应用造成了很大的困难。
本发明人为解决RT-LAMP在猪流感通用检测上存在的困难,在猪流感病毒PA基因上截取长300bp相对保守的序列基因设计SIV RT-LAMP的工作引物,并进行了简并处理,增加了引物对不同亚型SIV中存在的目的序列扩增的敏感性。建立针对SIV的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,本方法具有多引物同时扩增,并在两端形成了带有引物功能的环状结构,这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点,由于RT和LAMP反应在同管中同时进行简化了操作步骤,同时因为RT-LAMP反应的产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀,可以用荧光剂显色肉眼来判定,适用于各种实验条件下检测工作的使用。
本发明的方法具体实施
1SIV RT-LAMP检测方法的建立和验证
(1)反应用试剂的制备
1)SIV RT-LAMP引物设计根据GenBank公布的SIV包括多种亚型HA和NA序列共54株,利用DNAMAN5.9和DNAstar5.0进行序列分析。在54株SIV毒株的比对中发现其PA序列中550nt~780nt之间的突变较少,其长度适合RT-LAMP实验要求。参考H1N1型SIV序列设计引物。将设计的引物和54株SIV的序列再次进行比对,将引物靠近5’端和3’处各亚型SIV中存在差异的序列采取简并处理(图1),按照RNA LAMP kit的说明建立SIV RT-LAMP的反应体系对各套引物进行试验筛选,通过试验筛选结果的分析,确定以下这套引物为本方法的工作引物,序列1、2、3、4、5和6如下:
序列1(F3-PA):AGGGGTCTATGGGATTCCTT
序列2(B3-PA):GAAAGCTTGCCCTCAATG
序列3(FIP-PA):WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC
序列4(BIP-PA):RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA
序列5(LF-PA):AATCTTTCTTCAATTGTGTC
序列6(LB-PA):CCGAACTTCTCCAGCCTTGA
2)RT-LAMP反应体系中试剂的配制(50个反应量)
①引物混合液PM:取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μlFIP-PA 20.0μl,100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μlLB-PA 10.0μl混合,灭菌去离子水定容至总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。
②反应缓冲混合液RM:取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μldNTPs 50μl,溶于475μl PCR级水中定溶至625μl。每个反应需取12.5μl RM。
③反应酶混合液EM:取16U/μl Bst大片段DNA聚合酶24μl,400U/μl AMV反转录酶24μl,1μmol/μl DTT 2μl。每个反应需要取1μl EM。
④显色剂:,取1μlSYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49μl PCR级水。每个反应加1μl。
(2)样品RNA的制备
1)RNA提取试剂(LBBII-RNA)
RA:取1%2-巯基乙醇0.60ml、1%Tris-HCL(pH 8.0)0.60ml、10mmol/ml EDTA 1ml溶于5.0ml灭菌双蒸水中。
RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml.
RC:无水乙醇15ml。
RD:100u/μl DNAse A 20μl溶于10ml DEPC H2O。
2)样品RNA的提取
取100μl细胞培养物(或鼻腔拭子浸出样品),经反复冻融3次后,按如下步骤进行操作:
样品中加入样品等体积RA,涡旋15s,12000g离心1min,取上清置于新管中;
在1中上清液中加入3倍的RB溶液,涡旋或剧烈震荡90s,静置3min;
加入1/3体积的RC溶液,涡旋1min,12000g离心1min。弃去上清液;放置5min后样品干燥,再加入11μl RD,溶解沉淀,即为样品RNA,作为扩增用的RNA模板。
(3)样品检测
1)本发明的反应体系为20μl
①配制RT-LAMP反应液:RM 12.5μl,EM 1.0μl,PM 1.5μl;
②取5.0μl样品RNA加到①项配制的RT-LAMP反应液中;
③混和后在63℃恒温水浴锅中作用45min。
④结果判定:反应结束后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂,肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色,阳性样品的反应液呈绿色。
(4)反应结果的验证
1)SIV RT-LAMP产物的Tubidimeter real-time的鉴定按照以上本发明确定的引物及建立的反应体系,对不同亚型SIV毒株的RT-LAMP产物进行Tubidimeter real-time吸光度鉴定,图2为SIV RT-LAMP产物的Tubidimeter real-time吸光度鉴定曲线图和柱形图。其中CH1为阴性对照,2~7分别为各亚型SIV毒株,CH8水为模版扩增对照,图2显示结果与预期相符。CH2~7各亚型SIV毒株RNA模版SIV RT-LAMP反应达到阳性判定值时最快耗时23min,全部反应结束共用时45min。
2)SIV RT-LAMP特异性试验图3为Tubidimeter LA-320LAMP反应的柱形结果图,横轴数字表示1~8为样品,纵轴为反应产物吸光度值。图3表明:以SIV参考株H1N1、H3N2作为阳性对照,DEPC处理的水作为阴性对照,检测按本发明提出的方法提取的RRSV、CHLV、PRV、PPV、PCV2核酸模板,验证所建立LAMP方法的特异性,结果阳性、阴性对照成立,SIV两个亚型参考毒株RNA模版RT-LAMP反应呈阳性,其它试验样品呈阴性,说明该引物及建立的SIV RT-LAMP方法具有很高的特异性
3)SIV-RT-LAMP敏感性试验用建立的SIV RT-LAMP方法扩增按本发明提出的提取SIV参考毒株(H1N1)的RNA模板(10ng/μl),稀释成1~10-5稀释度,用TubidimeterLA-320分析结果。结果见图4,表明:按照45分钟作为判定时限,100TCID50的SIV病毒RNA模板稀释到10-4时仍能快速有效的扩增。通过敏感性试验的曲线分析图(图5)发现,随着模版的稀释度增加只反应起点时间延长,而反应的速率和峰值变化很小。
4)SIV-RT-LAMP检测应用实验结果对临床采集19份疑似SIV的发病猪病料,按照本发明提出的方法抽提样品的总RNA,用建立的SIV RT-LAMP方法检测同RT-PCR、鸡胚分离鉴定进行比较,其中的阳性样品用基因芯片分型鉴定(委托韩雪清博士鉴定HanXueqing,Lin Xiangmei,et al..Simutaneously subtyping of all influenza A viruses using DNAmicroarrays.Journal of Virological Methods,2008,152117-121),结果见表3。
表3.几种方法对19份病料部分检测结果比较(阳性+/阴性-)
样品名称 | RT-LAMP | RT-PCR | 病毒分离 | 基因芯片分型鉴定 |
H1N1(参考株)H3N2(参考株)SD12SX4223TJ2231HB2325HN14HN33GD1092 | +++-++-++ | +++-++-++ | +++--+-+- | H1N1H3N2H1N1-H3N2H1N1-H5N1H9N2 |
采用SIV RT-AMP方法对19份疑似SIV的发病猪病料检测,结果显示:其中检测出有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性,与RT-PCR、鸡胚分离综合结果一致,经基因芯片分型鉴定结果为4中不同亚型,验证结果符合率为100%。
2试剂盒的制备(50个反应量/盒)
(1)提取样品RNA的所需试剂LBBII-RNA的配制:
RA:取1%2-巯基乙醇0.6ml、pH 8.0 1%Tris-HCL 0.6ml、10mmol/ml EDTA 1ml溶于5.0ml灭菌双蒸水中,装至无核酶的塑料容器中。
RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml,装至无核酶的塑料容器中。
RC:无水乙醇15ml,装至无核酶的塑料容器中。
RD:100u/μl DNAse A 20μl溶于10ml DEPC H2O,装至无核酶的塑料容器中。
(2)反应用试剂的制备
1)SIV RT-LAMP引物的扩增将本发明设计的如下序列引物分别扩增后备用:
F3-PA:AGGGGTCTATGGGATTCCTT
B3-PA:GAAAGCTTGCCCTCAATG
FIP-PA:WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC
BIP-PA:RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA
LF-PA:AATCTTTCTTCAATTGTGTC
LB-PA:CCGAACTTCTCCAGCCTTGA
2)RT-LAMP反应体系中试剂的配制
①PM:取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μl FIP-PA20.0μl,100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μl LB-PA10.0μl,加灭菌去离子水定容至总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。
②RM:取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μl dNTPs 50μl,溶于475μl PCR级水中定溶至625μl,装至无核酶的塑料容器中。
③EM:取16U/μl Bst大片段DNA聚合酶24μl,400U/μl AMV反转录酶24μl,1μmol/μlDTT 2μl,装至无核酶的塑料容器中。
④显色剂:取1μlSYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49μl PCR级水,装至无核酶的塑料容器中。
3.试剂盒的使用
1)使用LBBII-RNA提取样品RNA
取100μl细胞培养物(或血清、组织研磨样品),经反复冻融3次后,按如下步骤操作:
样品中加入样品等体积RA,涡旋15s,12000g离心1min,取上清置于小管中;在上清液中加入3倍的RB溶液,涡旋或剧烈震荡90s,静置3min;加入1/3体积的RC溶液,涡旋1min,12000g离心1min。弃去上清液;待样品干燥后加入11μl RD,溶解沉淀,即为样品RNA。
2)RT-LAMP反应
①配制RT-LAMP反应液:RM 12.5μl,EM 1.0μl,PM 1.5μl;
②取5.0μl样品RNA加到①项配制的反应液中
③混和后在63℃恒温水浴锅中作用45min。
3)结果判定:反应后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂,肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色,阳性样品的反应液呈绿色。
附图说明
图1:简并引物设计图示R=A/G,W=A/T
图2:为SIV RT-LAMP产物的Tubidimeter real-time吸光度鉴定曲线图(2-1)和柱形图(2-2)其中CH1为阴性对照,CH 2~7分别为各亚型SIV毒株,CH8水为模版扩增对照,。
图3:特异性试验SIV RT-LAMP Tubidimeter LA-320柱形图 CH1:SIV H1N1,CH2:PRRSV,CH3:SIV H3N2,CH4:CHLV,CH5:PRV,CH6:PPV,CH7:PCV2,CH8:DEPCH2O(横轴数字表示1~8为样品,纵轴为反应产物吸光度值)。
图4:SIV H1N1参考毒株的敏感度试验Tubidimeter LA-320结果分析柱形图其中CH1为水对照,CH2为10-1,CH3为10-2,CH4为10-3,CH5为10-4,CH6为10-5。
图5:SIV H1N1参考毒株的敏感度试验Tubidimeter LA-320结果分析曲线图其中:LINE1为10-1,LINE2为10-2,LINE3为10-3,LINE4为10-4。
图6:SIV-RT-LAMP反应产物混合显色剂后显色图例。1:阳性样品,2:阴性样品
本发明的积极意义
本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列,针对PA序列相对保守区域设计了SIV RT-LAMP简并引物6条,以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板,建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT-LAMP方法。利用LA-320LAMP Tubidimeter仪分析反应过程并判定结果,显示在LA-320LAMPTubidimeter仪中63℃反应45min,所有实验用的4种亚型SIV样品RNA均获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明:本方法可对100TCID50SIV样品RNA进行10-4稀释后仍可高效扩增,显示出本方法高度的敏感性;通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT-LAMP检测,有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性,与RT-PCR、鸡胚分离结果一致,经基因芯片分型鉴定验证,综合结果符合率为100%。显示本方法特异、敏感、快速,适合用于各种试验条件下SIV的检测。
实施例
以下实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。
实施例1
SIV RT-LAMP引物设计与筛选
根据GenBank公布的SIV包括多种亚型HA和NA序列共54株,利用DNAMAN5.9和DNAstar5.0进行序列分析。在54株SIV毒株的比对中发现其PA序列中550nt~780nt之间的突变较少,长度适合RT-LAMP实验的要求。参考H1N1型SIV序列设计引物。将设计的引物和54株SIV的序列再次进行比对,将引物靠近5’端和3’处各亚型SIV中存在差异的序列采取简并处理(图1),按照RNA LAMP kit的说明建立SIV RT-LAMP的反应体系对各套引物进行试验筛选,通过试验筛选结果的分析,确定以下这套引物为本方法的工作引物,序列如下:
F3-PA:AGGGGTCTATGGGATTCCTT
B3-PA:GAAAGCTTGCCCTCAATG
FIP-PA:WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC
BIP-PA:RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA
LF-PA:AATCTTTCTTCAATTGTGTC
LB-PA:CCGAACTTCTCCAGCCTTGA
并确定以上引物在引物混合液(PrimerMix,PM)各成分的比例:
取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μl FIP-PA 20.0μl,100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μl LB-PA 10.0μl混合,总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。
实施例2
试剂盒内组分的配制:
按以下各种组分的配方(50个反应量)配制成各种组分并分装到玻璃或塑料小容器中并用相应的塞子密封:
1.LBB II-RNA,本试剂组由RA、RB、RC、RD四部分构成:
RA:取1%2-巯基乙醇0.6ml、pH 8.01%Tris-HCL 0.6ml、10mmol/ml EDTA 1ml溶于5.0ml灭菌双蒸水中。
RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml。
RC:无水乙醇15ml。
RD:100u/μl DNAse A 20μl溶于10ml DEPC H2O,
2.RT-LAMP反应试剂
1)PM:取100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μl FIP-PA20.0μl,100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μl LB-PA10.0μl,加灭菌去离子水定容至总体系75.0μl。每个反应需取1.5μl PM。
2)RM:取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μl dNTPs 50μl,溶于475μl PCR级水中定溶至625μl。每个反应需取12.5μl RB。
3)EM:取16U/μl Bst大片段DNA聚合酶24μl,400U/μlAMV反转录酶24μl,1μmol/μlDTT 2μl。每个反应需要取1μl EB。
4)显色剂:取1μlSYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49μl PCR级水。每个反应加1μl。
实施例3
SIV RT-LAMP试剂盒的使用
1.使用LBBII-RNA提取样品RNA
取100μl细胞培养物(或拭子、组织研磨样品),经反复冻融3次后,按如下步骤操作:
样品中加入样品等体积RA,涡旋15s,12000g离心1min,取上清置于小管中;在上清液中加入3倍的RB溶液,涡旋或剧烈震荡90s,静置3min;加入1/3体积的RC溶液,涡旋1min,12000g离心1min。弃去上清液;待样品干燥后加入11μl RD,溶解沉淀,即为样品RNA。
2.SIV RT-LAMP反应
①配制RT-LAMP反应液:将RM 12.5μl,EM 1.0μl,PM 1.5μl加到反应管中;
②取5.0μl样品RNA加到①项配制的反应液的管中;
③混和后将反应管置于63℃恒温水浴锅中作用45min。
3结果判定:反应后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂,肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色,阳性样品的反应液呈绿色。
序列表
<110>中国兽医药品监察所
<120>猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>引物F3-PA
<223>人工序列
<400>1
AGGGGTCTAT GGGATTCCTT 20
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>引物B3-PA:
<223>人工序列
<400>2
GAAAGCTTGC CCTCAATG 18
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>引物FIP-PA:
<223>人工序列
<400>3
AWCGCATGGT TCCTGCGATT TCATCGTCAG TCCGAAAGAG GC 42
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>引物BIP-PA
<223>人工序列
<400>4
ARRCTTGCCG ACCAAAGTCT CTCGGTTCGA ATCCATCCAC A 41
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>引物LF-PA:
<223>人工序列
<400>5
AATCTTTCTT CAATTGTGTC 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>引物LB-PA
<223>人工序列
<400>6
CCGAACTTCT CCAGCCTTGA 20
Claims (5)
1.一种检测猪流感病毒的RT-LAMP检测试剂盒,其特征包含提取RNA试剂LBB II-RNA;含有序列1、2、3、4、5和6三对引物配制成引物混合液的RT-LAMP反应试剂两个组分。
2.如权利要求1所述的一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒,其特征在于所述的提取RNA试剂LBB II-RNA含有以下溶液组成:
RA:取1%2-巯基乙醇0.6ml、pH 8.01%Tris-HCL 0.6ml、10mmol/ml EDTA 1ml灭菌双蒸水5.0ml;
RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml;
RC:无水乙醇15ml;
RD:100u/μl DNAseA 20μl、10ml DEPC H2O。
3.如权利要求1所述的一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒,其特征在于所述的反应试剂含有引物混合液PM、反应缓冲混合液RM、反应酶混合液EM及显色剂,其中引物混合液所用的引物序列1、2、3、4、5和6及其在混合液中各自的浓度为:
F3-PA:AGGGGTCTATGGGATTCCTT
B3-PA:GAAAGCTTGCCCTCAATG
FIP-PA:WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC
BIP-PA:RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA
LF-PA:AATCTTTCTTCAATTGTGTC
LB-PA:CCGAACTTCTCCAGCCTTGA
按总体系75.0μl含:100pmol/μl F3-PA 2.5μl、100pmol/μl B3-PA 2.5μl、100pmol/μlFIP-PA 20.0μl,100pmol/μl BIP-PA 20.0μl、100pmol/μl LF-PA 10.0μl、100pmol/μlLB-PA 10.0μl,灭菌去离子水定容至75.0μl。
4.一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒的检测方法,其特征是包括以下步骤:
1)提取待测样品中的核酸;
2)配制RT-LAMP反应液:RM 12.5μl,EM 1.0μl,PM 1.5μl;
3)取5.0μl样品RNA加到①项配制的RT-LAMP反应液中;
4)混和后在63℃恒温水浴锅中作用45min;
5)结果判定:反应结束后在SIV RT-LAMP反应产物中加入1μL的显色剂,肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色,阳性样品的反应液呈绿色。
5.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP试剂盒的检测方法,其特征是用LBB II-RNA提取样品RNA包括以下步骤:
取100μl细胞培养物或鼻腔拭子浸出样品,经反复冻融3次后,样品中加入样品等体积RA,涡旋15s,12000g离心1min,取上清置于新管中;在上清液中加入3倍的RB溶液,涡旋或剧烈震荡90s,静置3min;加入1/3体积的RC溶液,涡旋1min,12000g离心1min,弃去上清液放置5min后样品干燥,再加入11μl RD,溶解沉淀,即为样品RNA。
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