CN104988246A - 中华绒螯蟹白斑症病毒特异性pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

中华绒螯蟹白斑症病毒特异性pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及养殖技术领域，具体为中华绒螯蟹白斑症病毒特异性PCR检测试剂盒及检测方法。本发明所述的中华绒螯蟹白斑症病毒的PCR快速检测试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液1.0mL；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了现有中华绒螯蟹白斑症病毒检测方法的不足，提供一种新型PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明对中华绒螯蟹白斑症病毒进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测中华绒螯蟹白斑症病毒提供了便利条件。

Description

中华绒螯蟹白斑症病毒特异性PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及养殖技术领域，具体涉及引起中华绒螯蟹发病病原白斑症病毒特异性PCR快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及一种中华绒螯蟹发病病原白斑症病毒的基因检测试剂及检测方法，适用于中华绒螯蟹白斑症病毒的流行病学监测、白斑症病毒的检测及基因工程技术等领域。
背景技术
白斑症病毒(WSSV)是一种严重危害当前对虾养殖业的病毒，主要引起对虾甲壳内侧白斑病变，并导致大批死亡。其流行范围广，在甲壳类、桡足类和昆虫类中均有敏感宿主。
中华绒螯蟹又称河蟹，是一种重要的经济蟹类，我国的中华绒螯蟹养殖业发展迅速，已成规模化。在生产中，为了提高养殖效益，普遍采取多品种混养的养殖模式，如克氏原螯虾与中华绒螯蟹混养等。但近几年来，经常发生克氏原螯虾大批量死亡后，处于相同养殖塘中的中华绒螯蟹同时出现大量死亡的现象。薛晖等在2010年对江苏部分地区养殖池塘发病的克氏原螯虾和中华绒螯蟹进行采样调查，证实引起这两种淡水甲壳类动物发病死亡的病原为白斑症病毒。
目前对于白斑症病毒病的诊断手段主要包括病理学方法、生物学方法、免疫学方法、分子杂交方法及PCR方法等。但是还未见检测中华绒螯蟹的快速、准确的方法，为了及早发现养殖中华绒螯蟹是否被白斑症病毒感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种中华绒螯蟹白斑症病毒特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于中华绒螯蟹白斑症病毒的检测。
本发明通过下述技术方案实现的。
中华绒螯蟹白斑症病毒的PCR快速检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：KCl，MgCl2，Tris-HCl pH5.8，dNTP；
(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的白斑症病毒基因的保守序列，设计一对特异性检测引物，上游引物WSSV-F：5’-GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3’，下游引物WSSV-R：5’-CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3’；
(3)Taq酶；
(4)灭菌的ddH2O；
(5)阳性对照液：白斑症病毒基因组DNA；
(6)阴性对照液：ddH2O。
采用试剂盒检测中华绒螯蟹白斑症病毒的方法为：
(1)中华绒螯蟹白斑症病毒DNA的提取：取中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、肌肉组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；
(2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，5U/μL Taq DNA聚合酶，DNA模板，加灭菌超纯水，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在441bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为白斑症病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的白斑症病毒。
优选的试剂盒包括：
(3)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(4)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的白斑症病毒基因的保守序列，设计一对特异性检测引物，上游引物WSSV-F：5’-GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3’，下游引物WSSV-R：5’-CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3’，浓度为10μM；
(3)Taq酶             5U/μL；
(4)灭菌的ddH2O       1.0mL；
(5)阳性对照液：白斑症病毒基因组DNA；
(6)阴性对照液：ddH2O。
优选的采用试剂盒检测中华绒螯蟹白斑症病毒的方法为：
(1)中华绒螯蟹白斑症病毒DNA的提取：取50-100mg中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、肌肉组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；
(2)PCR反应体系：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在441bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为白斑症病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的白斑症病毒。
与现有技术相比，本发明所述的中华绒螯蟹白斑症病毒的特异性PCR快速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：
(1)本发明采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测中华绒螯蟹白斑症病毒的方法，适用于对中华绒螯蟹白斑症病毒进行快速检测。
(2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括：①检测快速、效率高：从核酸提取、聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要3小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。②检测准确：检测引物只与中华绒螯蟹白斑症病毒特异性地结合，与其他病原都没有交叉反应。③检测灵敏度高，适合用于中华绒螯蟹白斑症病毒的早期监控。
附图说明
图1为感染白斑症病毒中华绒螯蟹鳃、肝胰腺、肌肉组织的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为白斑症病毒感染中华绒螯蟹组织样品；标号M为分子量标准DL2000(购自宝生物工程有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图2为对不同病原的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为白斑症病毒；标号2为螺原体；标号3为嗜水气单胞菌；标号4为传染性脾肾坏死病毒；标号5为鳜鱼弹状病毒；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图3为同一池塘所取4只发病的中华绒螯蟹组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-6为4只中华绒螯蟹组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图4为同一池塘所取2只发病克氏原螯虾和4只发病的中华绒螯蟹组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-4为2只克氏原螯虾组织样品；标号5-8为4只中华绒螯蟹组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图5为不同地区所取10只中华绒螯蟹组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-6为4只江苏地区所取中华绒螯蟹组织样品；标号7-10为4只安徽地区所取中华绒螯蟹组织样品；标号11-12为2只湖北地区所取中华绒螯蟹组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例一：中华绒螯蟹白斑症病毒PCR快速检测试剂盒
本实施例所述的中华绒螯蟹白斑症病毒PCR快速检测试剂盒的所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。
试剂盒由下列部分构成(9样份)：
(1)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(2)检测引物：上游引物WSSV-F：5’-GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3’，下游引物WSSV-R：5’-CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3’，浓度为10μM，上下游引物混合，400μL。
(3)Taq酶             5U/μL。
(4)灭菌的ddH2O       1.0mL。
(5)阳性对照液：白斑症病毒基因组DNA。
(6)阴性对照液：ddH2O。
(7)操作说明书一份。
(8)长方体盒子，可装上述1～7号部件，9.0×5.0×5.0cm3。
(9)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有2排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
上述阳性对照是取100mg白斑症病毒感染的中华绒螯蟹的鳃和肝胰腺组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的ddH2O溶解而得。
PCR扩增反应体系(20μL)为：
PCR扩增反应条件为：
95℃      5min
1个循环
95℃     30s
56℃     30s
72℃     40s
30个循环
72℃     10min
1个循环
扩增产物4℃保存。
实施例二：中华绒螯蟹白斑症病毒PCR检测方法
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)取50mg待检样品，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的ddH2O溶解，作为PCR反应的模板。
(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(WSSV-F、WSSV-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加入2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在441bp处出现明亮的反应条带，则为白斑症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中441bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR试剂盒的检测效果符合预期。
实施例三：中华绒螯蟹白斑症病毒PCR快速检测试剂盒特异性实验
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以提取的白斑症病毒、螺原体、嗜水气单胞菌、传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼弹状病毒的核酸作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(WSSV-F、WSSV-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在441bp处出现明亮的反应条带，则为白斑症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在441bp处出现明亮的反应条带，显示类立克次氏体阳性。标号2～5(分别为螺原体、嗜水气单胞菌、传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼弹状病毒)的电泳带在441bp处无反应条带出现，显示白斑症病毒阴性。表明本发明所述的试剂盒对白斑症病毒的特异性强。
实施例四：中华绒螯蟹白斑症病毒PCR快速检测试剂盒对发病中华绒螯蟹的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从同一池塘所取4只发病的中华绒螯蟹鳃和肝胰腺组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(WSSV-F、WSSV-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在441bp处出现明亮的反应条带，则为白斑症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：检测所取4只中华绒螯蟹中，4只中华绒螯蟹白斑症病毒均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为白斑症病毒，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图3。
实施例五：中华绒螯蟹白斑症病毒PCR快速检测试剂盒对发病克氏原螯虾和中华绒螯蟹的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从同一池塘所取2只发病克氏原螯虾和4只发病的中华绒螯蟹鳃和肝胰腺组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(WSSV-F、WSSV-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在441bp处出现明亮的反应条带，则为白斑症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：检测所取2只克氏原螯虾和4只中华绒螯蟹中，2只克氏原螯虾和4只中华绒螯蟹白斑症病毒均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为白斑症病毒，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图4。
实施例六：中华绒螯蟹白斑症病毒PCR快速检测试剂盒对不同地区发病中华绒螯蟹的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以江苏、安徽、湖北地区所取10只中华绒螯蟹鳃和肝胰腺组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(WSSV-F、WSSV-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；95℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在441bp处出现明亮的反应条带，则为白斑症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：检测所取10只中华绒螯蟹中，10只中华绒螯蟹白斑症病毒均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为白斑症病毒，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图5。

Claims (2)

1.中华绒螯蟹白斑症病毒的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：KCl，MgCl2，Tris-HCl pH5.8，dNTP；
(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的白斑症病毒基因的保守序列，设计一对特异性检测引物，上游引物WSSV-F：5’-GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3’，下游引物WSSV-R：5’-CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3’；
(3)Taq酶；
(4)灭菌的ddH2O；
(5)阳性对照液：白斑症病毒基因组DNA；
(6)阴性对照液：ddH2O。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测中华绒螯蟹白斑症病毒的方法为：
(1)中华绒螯蟹白斑症病毒DNA的提取：取中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、肌肉组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；
(2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，5U/μL Taq DNA聚合酶，DNA模板，加灭菌超纯水，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在441bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为白斑症病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的白斑症病毒。
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