CN104975042A - 在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下表达荧光素酶的动物模型及其用途 - Google Patents
在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下表达荧光素酶的动物模型及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下表达荧光素酶(MBP-LUCI)的动物模型和所述模型用于生物发光体内成像的用途。具体地使用与萤火虫荧光素酶报道基因偶联的髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子产生表达荧光素酶的转基因动物。髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物成像模型提供了监测髓鞘形成状态及调节髓鞘再生的试验化合物的功效的方法。生物成像的优点为，受试者在纵向研究中可作为自己的对照。可历经至少10周持续追踪相同受试者的脱髓鞘作用及髓鞘再生过程。这种模型使得能够标准化个别动物成像应答，并提供大量降低差异性的优质数据。此外，由于不需要在不同时间点牺牲动物组群，可减少化合物功效研究所需的数量。
Description
本发明申请是基于申请日为2010年12月3日，申请号为201080064215.X(国际申请号为PCT/US2010/058823)，名称为“在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下表达荧光素酶(MBP-LUCI)的动物模型和所述模型用于生物发光体内成像的用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用活体动物生物成像技术制造的髓鞘碱性蛋白荧光素酶(MBP-luci)生物成像模型，例如用于在转录水平实时显现及量化脱髓鞘作用/髓鞘再生活动。
背景技术
药物开发的损耗率高，据声称仅五分之一的化合物可由开发至批准(DiMasi,JA等,J Health Econ 22,151-185)。此外，尽管大幅增加投资，在过去三十年来引进新药物的速度仍保持相对固定，仅每年两到三种新药物进展最终投入市场(Lindsay MA,Nature Rev Drug Discovery,2,831-838)。
应用于药物开发初期阶段的分子与功能性成像可提供生物活性的证据，并确认在标靶上的药效。因此，投资在分子成像技术有望提升药物开发(Rudin M等,Progress in Drug Res,2005,vol 62,185-255)。分子成像技术较更常规读数的一项优点是，它们能够以足够的空间与时间分辨率在完整生物体中实施，用于研究体内生物过程。此外，这些分子成像技术允许在不同的时间点重复性、非侵袭性、一致性及相对自动化地研究相同的动物，从而增加纵向研究的统计效力及减少所需动物数量与成本。MBP-luci模型支持增加体内早期候选药物筛选的生产力以及增加生物检测的灵敏度。早期铅化合物作为上市的药品经常不是最佳的，然而，在体内特异性及显著活性的检测可导致优化化学结构，以实现可接受的活性水平并最小化体内毒性，以治疗特定中枢神经***疾病。
分子成像
分子成像是指来自各种学科方法(例如，细胞及分子生物学、化学、医学、药学、物理学、生物信息及工程学)的汇集，以在活体生物中在细胞及亚细胞水平评价特定分子过程中利用与整合成像技术(Massoud T.F.,GenesDev.17:545-580)。
基因工程的出现对应用科学带来重大变化，例如包括药物研发路线。以相同的方式，动物成像操作的开发及利用为临床前研究提供新方法(MaggieA,Ciana P.Nat.Rev.Drug Discvy.4,249-255)。由于难以实时量化生理活动，动物模型传统上难以处理。多年来开发了新成像方法以克服此困难(例如，MRI、CT、PET)。最近，基于体内表达荧光素酶(萤火虫的发光酶)的生物发光成像已应用于靶标基因活性的非侵袭性检测。
通过结合动物基因工程与分子成像技术，使在活体动物中对特定分子过程进行动态研究成为可能。这种方法能够潜在地影响临床前规程，从而广泛改变医学的所有方面(Maggie A.Trends Pharmacolo.Sci.25,337)。
分子成像：生物发光
体内生物发光成像(BLI)是一种灵敏工具，其基于检测来自细胞或组织的放射光。报道基因技术的应用使得可通过体内成像方法分析活体动物内特定细胞与生物过程。生物发光(活体生物酶促产生可见光)是许多非哺乳动物物种中自然发生的现象(Contag,CH,Mol.Microbiol.18:593-603)。荧光素酶是催化底物氧化以释放光的光子的酶(Greer LFIII,Luminescence 17:43-74)。来自北美萤火虫的生物发光最为广泛应用。萤火虫荧光素酶基因(luc)的表达产生荧光素酶，其将底物D-荧光素转化为非反应性的氧化荧光素，从而导致放射562纳米的绿光。由于哺乳动物组织不会天然放射生物发光，体内BLI具有相当吸引力，因为可产生具非常小背景信号的图像。
BLI需要使用由生物发光报道基因组成的表达盒(expression cassette)在选择的驱动光报道基因的基因启动子的控制下基因工程化细胞或组织(FIG1)。为了诱发光产生，通过颈内、血管内、腹膜内内或皮下注射给药底物(例如，荧光素)。
荧光素酶/荧光素放射的光能够穿透数毫米至厘米的组织深度；然而对于每一厘米组织深度，光子强度减少约十倍(Contag CH Mol.Microbio.18:593-603)。必须使用灵敏的光检测仪器检测体内生物发光。该检测器测量每一单位面积放射的光子数目。波长介于400及1000纳米之间的低水平光可被电荷耦合组件相机检测，电荷耦合组件相机将撞击硅片的光子转换为电子(Spibey CP等Electrophoresis 22:829-836)。软件能够将电子信号转换为二维图像。软件也能够量化放射光线的强度(撞击检测器的放射光子的数目)，并将这些数值转换为假色图形。实际数据以光子计数测量，但假色图形使得能够快速目视判读。对于更细微的差异，可能需要在关注区域内的定量测量。冷却电荷耦合组件相机的使用降低热噪声，以及暗箱使荧光素酶产生的光可被最佳显现及量化(Contag CH,Annu.Rev.Biomed.Eng.4:235-260)。
有用的是，将荧光素酶图像叠加在其它类型图像如自显影照片或放射线照片上用于放射信号的解剖定位(图2)。该软件叠加图像用于显现及判读。
脱髓鞘疾病、少突胶质细胞及髓鞘碱性蛋白
髓鞘碱性蛋白(MBP)为正常髓鞘紧密性及功能所需。与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)及蛋白脂质蛋白(PLP)一起，这些蛋白质构成髓鞘结构蛋白家族的成员，并由以下的髓鞘生成细胞合成：在中枢神经***(CNS)中的少突胶质细胞，和在周围神经***(PNS)中的许旺细胞。在发育中的中枢神经***中，髓鞘碱性蛋白的表达与髓鞘形成时期一致。因此，在本领域中将髓鞘碱性蛋白视为少突胶质细胞成熟的标记。髓鞘碱性蛋白(与其它蛋白质一起)的高水平表达与髓鞘精细化过程一致，在髓鞘形成的整个过程中持续，并在轴突***时结束(Gupta等Brain Res.464:133-141)。
影响髓鞘完整性的疾病导致在受影响的神经元中轴突信号传导受损，以及可导致感觉、运动、认知或其它功能受损，取决于涉及的神经元。术语脱髓鞘疾病描述该疾病的结果，而非原因，以及可由遗传、传染剂、自身免疫反应及未知因素导致。所有这些仍为庞大未满足医疗需求的人类病痛，常与康复疗法的需求有关。
中枢神经***的脱髓鞘疾病包括：
·多发性硬化(与类似疾病一起称为自发性炎性脱髓鞘疾病)
·横贯性脊髓炎
·德维克病
·进行性多病灶脑白质病
·视神经炎
·脑白质营养不良
·Pelizaeus-Merzbacher病(Pelizaeus-Merzbacher disease)
·髓鞘功能障碍/丧失，也与脊髓损伤、阿尔茨海默病与帕金森病及精神***症有关
周围神经***的脱髓鞘疾病包括：
·吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)及其慢性相似病，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病
·周围神经病(毒素引起、糖尿病、抗-MAG等)
·夏科-马里-图斯病(Charcot-Marie-Tooth Disease)
脱髓鞘作用的体内模型
在开发对抗脱髓鞘疾病的临床前候选药物中的一般步骤是评价治疗性候选药物在动物模型中的作用，该动物模型概括部分或全部的脱髓鞘作用，且其具有内源性髓鞘再生能力。可在动物模型中实现化学诱导的脱髓鞘作用，以及6-8周龄的年轻成年雄性小鼠易受4-6周的0.2％铜宗(cuprizone；双环己酮草酰二腙)饮食造成的脱髓鞘作用影响(Ludwin SK,1978,Lab Invest39:597-612)。经铜宗处理，脱髓鞘作用发生在整个脑部，但在高度集中的白质区(胼胝体)内最易检测(Merkler et al,2005,NMR Biomed 18:395-403)。在开始铜宗饮食后的3周内脱髓鞘作用明显。以正常食物替代该饮食，在4-6周内允许几乎完全髓鞘再生(Matsushima et al,2001,Brain Pathol 11:107-116)。使用淀粉样前蛋白或比尔朔夫斯基银浸渗法(Bielschowsky’silverimpregnation)对轴突损伤的免疫组织化学染色无法在8周龄小鼠中显露很多轴突损伤(Merkler)。然而，在6-7月龄的小鼠中，轴突横断显著增加，部分造成在老年动物中可见的髓鞘再生下降(Irvine KA等,2006,J Neuroimmunol175:69-76)。少突胶质细胞祖细胞在分化后取代髓鞘，以及小神经胶质细胞与巨噬细胞二者在铜宗饮食约4周时达到高峰，并且为有效髓鞘再生所需(Franco RJM,2002,Nat Rev 3:705-714)。
为量化髓鞘含量的变化，可收取整个大脑或亚区，并由斑点印迹或Western分析评价。可选择地，追踪髓鞘丧失及修复的亚区的更高分辨率的敏锐(与纵向相对)方法涉及定量立体学。例如，计算机辅助立体学工具箱(CAST)***可用于评价胼胝体中的髓鞘勒克司坚牢蓝(Luxol Fast Blue)(髓鞘染剂)的变化。甲苯胺蓝及电镜术是必要的最后步骤，以确保致密髓鞘完全套住先前裸露的轴突。至于纵向评价方面，T2加权的磁共振成像提供了定量评价喂食铜宗的小鼠的胼胝体中髓鞘变化的方法(sanofi-aventis Neurology,2008unpublished results)。
实时追踪体内髓鞘形成状态的髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物成像模型
在一篇2003年的论文，Farhadi等人(The Journal of Neuroscience,November 12,2003,23(32):10214–10223)报导，髓鞘碱性蛋白启动子含有调节元件—四个宽阔间隔的保守模块：M1、M2、M3及M4，范围为0.1至0.4千碱基对，其对髓鞘形成与髓鞘再生的时机调节非常重要(参见图1、3及4)。他们使用半乳糖酶基因(Lac Z)为报道基因，证明当中枢神经***发育时，近端模块M1及M2在少突胶质细胞中驱动相对低水平的表达，而上游M3区域在少突胶质细胞整个发育过程及成熟中枢神经***中驱动高水平的表达。而且，在脱髓鞘损伤后髓鞘再生期间的表达需要此M3区域。M4也在髓鞘化许旺细胞中驱动髓鞘碱性蛋白的表达。
目前方法使用动物模型测定体内髓鞘的变化十分耗时，一般花费4至8周且需大量动物。该髓鞘碱性蛋白脱氧核糖核酸启动子包含表达荧光素酶基因的所有4个特异性调节区，构成鼠髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因生物成像模型的基础，所述鼠髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因生物成像模型被开发以实时追踪脑、脊髓和/或周围神经***中髓鞘碱性蛋白(MBP)转录活性的变化。可将这种啮齿动物转基因模型用于选择治疗人类脱髓鞘疾病候选药物开发的基础研究的体外及体内证明，并对现有模型提供多重改良：
o通过生物发光非侵袭性追踪神经***髓鞘形成的变化的能力显著降低与事后组织化学及组织表达分析相关的资源及人力需求。
o纵向研究大大增加模型对髓鞘形成的变化的灵敏度。先前的测定法必须在每一时间点使用单独动物群，如此则限制研究过程中可收集的数据点数量。由于需要单独动物群而导入额外变量。
o迅速处理生物成像数据，通常在同一日，因此允许调整(即，延长研究期间以达到显著性或由于缺乏药物的影响而提早终止)，以优化研究设计并减少不必要的资源投资。
o动物群及相应的处理法均可在零时间点测定，其在降低每一处理群动物数量的同时优化研究的统计显著性。可将研究数据标准化为初始值，从而大大降低固有的生物学上的变异，同时支持对特定疗法效果的更有力的结论。
发明内容
本发明提供一种新的体内模型，以评价治疗个体对于脱髓鞘作用(例如，神经保护、髓鞘保护)与髓鞘再生(例如，修复)的程度的效果。本发明的生物成像动物及化合物筛选方法允许通过在活体动物中产生相关实时高分辨率数据，来筛选和/或检验药用化合物及其它治疗剂的本质确证。此外，可获得关于潜在毒性、PK/PD及治疗窗的评价，从而对灵长类及人类的剂量有更精准预测。
本发明提供对使用活体转基因模型生物体研究髓鞘形成活动的改良工具及方法。与其它模型相比，由于每个受试者可作为其本身纵向研究的基线对照，本发明降低所需的受试者总量。生物间差异性因此降低，从而增进统计结果的可信度。在本发明的各个方面，实现不同的优势。在下面的讨论中描述多种用途中的数种的特点。
通过与髓鞘碱性蛋白表达的相关性，本发明提供在活体模型生物体中监测脱髓鞘作用和/或髓鞘再生活动的方法。该方法可包含转基因修饰祖细胞，以产生表达通过髓鞘碱性蛋白启动子驱动的荧光素酶基因的模型生物体。当表达时，荧光素酶基因可起作用以在底物如荧光素的存在下产生光(生物发光)。通过监测来自该生物体的生物发光，可评价髓鞘形成与脱髓鞘作用活性。成像设备及分析允许快速使生物发光及髓鞘形成活动与生物的身体的特定部分相关联。
对于研究中枢与周围神经***的活动，在神经组织中使用髓鞘的脊椎动物生物体是特别适宜的模型生物体。哺乳动物是在中枢与周围神经***中使用髓鞘帮助神经传导的生物体。普通哺乳动物模型如啮齿动物(例如，大鼠、小鼠)、兔、绵羊、灵长动物、天竺鼠等为适用于实践本发明的模型生物体。
生物体尺寸本质上不是限制因素。然而，可将仪器尺寸优化为特定生物体形状或尺寸。
单一生物成像活动可提供所需的信号。然而，本发明的优点提供在相同动物上历经多个时间点重复测量并比较多个测量结果的能力。单一生物体因此作为其本身对照或基线。
因此，在单一生物体中历经一个或多个脱髓鞘作用或髓鞘再生间隔的生物成像是可能的。此外，贯穿脱髓鞘作用或髓鞘再生间隔的成像信号标准化产生更多有力数据，其中贯穿重复间隔的成像可有效检测历经一个或多个活动在生物体中髓鞘碱性蛋白转录水平的变化。
生物发光信号被身体组织衰减。因此，近体表的神经组织产生较强信号。检测器的信号可通过以下方法提高：通过使更多荧光素酶反应而产生较高信号输出，例如，使用较高浓度，或增加酶活性或表达水平。使用较高灵敏度的检测器也可改善数据收集。较高灵敏度的检测器常需要冷却设备以产生明显信号并最小化噪声。也使用收集数据的时间增加信号的数量。
本发明的模型生物体可为含有荧光素酶基因的转基因动物，所述荧光素酶基因通过髓鞘碱性蛋白启动子驱动。该动物可为哺乳动物，例如，用作动物模型的任何哺乳动物。大鼠与小鼠是普通动物模型。当将启动子活化或开启时，在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下荧光素酶基因在模型的特定目标组织中表达。
该髓鞘碱性蛋白启动子可含有M1至M3，或可含有M1至M4。
可通过简单操作实现信号的改善，例如，选择毛发造成较少衰减的模型。例如，毛发较C57/B6小鼠较少影响衰减的模型将提供较优于C57/B6小鼠的信号。
本发明也提供研发用于生物成像的模型生物体的方法。研发可通过以下方法实现：以例如小鼠品系开始并生产转基因动物，然后选择一个或多个系，其中在出生后髓鞘形成高峰时的体内完整小鼠成像显现特异性成像(例如，中枢神经***)；然后选择一个或多个系，其中体外成像确认在希望区域(例如，主要在脑的致密白质区)中的荧光素酶转基因的表达。然后可选择一个或多个系，其中荧光素酶图像强度与脱髓鞘作用及髓鞘再生的变化高度相关。为了改进数据，可选择在适当操作期间显示明显组织脱髓鞘作用的一个或多个系。
铜宗脱髓鞘作用模型适合用于本发明。生物成像的时机将取决于模型生物体的发育特性，例如，可考虑出生后髓鞘形成的高峰一般是约3-5周的第一代小鼠(G1 mice)而选择时机。
本发明可用于筛选可影响生物体中髓鞘活动的化学化合物、生物制品及其它治疗性物质。化合物可调节基因表达或细胞内或细胞间信号活动而影响髓鞘活动。这些仅为一些具体实例，不应视为本发明的全部范围，本发明的全部范围在权利要求中表征。
虽然如上述(例如，Farhadi)，已使用半乳糖酶报道基因充分表征髓鞘碱性蛋白激活子，但是由于用于β-半乳糖苷酶(半乳糖酶报道基因的产物)检测的组织收取及固定的需要，髓鞘碱性蛋白-半乳糖酶基因模型的使用受到限制。这种方法需要与活体动物检测法不相容的组织化学技术。为了绕开此问题，已提出使用生物发光或荧光***以开发转基因生物成像模型，其中由大部分的髓鞘碱性蛋白启动子选择性地控制荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)报道基因。
这种新型生物成像模型设计用于实时显现与量化活体动物(例如，小鼠)中的脱髓鞘作用和/或髓鞘再生活动。可将这种监测与自动生物成像技术结合使用。这种模型是一种有用工具，用于例如，靶标确证(例如，当将生物成像模型小鼠互交以敲除基因，且转基因小鼠具有希望性状时)，以及也用于在比较及定量基础上的化合物确证(例如，在模型如铜宗或实验性自身免疫性脑脊髓炎[EAE]中测量化合物的功效)，以决定关于靶标选择及化合物发展的决定性路径。
本生物成像模型(MBP-luci TG)已被开发并用于量化体内的脱髓鞘作用/髓鞘再生活动。本生物成像模型的优点是可纵向研究，使得每个生物体可作为其本身的对照。而避免在特定时间点牺牲动物。可持续追踪个体小鼠的脱髓鞘作用与髓鞘再生过程。
这种生物成像方法学需要较少时间及资源来追踪活体小鼠中的生物应答。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.监测在活体生物中脱髓鞘作用或髓鞘再生的方法，所述方法包括：
转基因修饰所述生物，以表达通过髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子驱动的荧光素酶基因；
监测来自所述生物的生物发光；及
将所述光输出与所述生物的身体的特定部分相关联。
2.如项1的方法，其中所述模型生物为哺乳动物。
3.如项2的方法，其中所述哺乳动物为小鼠。
4.如项1的方法，其进一步包括：
在相同生物中，在不同于所述最初监测的时间重复所述监测；
并比较所述监测活动的输出数据，以观察在相同生物中髓鞘形成的变化。
5.如项4的方法，其进一步包括：
通过脱髓鞘作用或髓鞘再生间隔的成像信号标准化，其中所述通过间隔的成像有效检测历经所述间隔在所述生物中髓鞘碱性蛋白转录水平的变化。
6.转基因生物，其含有通过髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子驱动的荧光素酶基因。
7.如项6的转基因生物，其中所述生物为小鼠。
8.表达荧光素酶基因的转基因生物，所述荧光素酶基因在髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子的控制之下。
9.如项8的转基因生物，其中所述模型生物为小鼠。
10.如项6的转基因生物，其中所述髓鞘碱性蛋白启动子包含M1至M4。
11.如项6的转基因生物，其中所述髓鞘碱性蛋白启动子包含M1至M3。
12.如项1的方法，其中所述生物为哺乳动物，且所述哺乳动物具有白色毛发或减少的毛发。
13.如项12的方法，其中所述哺乳动物的毛发与C57/B6相比吸收较少的波长范围为530-640纳米的光。
14.开发生物成像品系的方法，包括：
(1)选择一个系，其中在出生后髓鞘形成高峰时的体内全小鼠成像呈现中枢神经***特异性成像；
(2)选择一个系，其中体外成像确认荧光素酶转基因表达主要在脑或脊髓的白质区；
(3)选择一个系，其中荧光素酶图像强度与在脱髓鞘作用模型中引发的脱髓鞘作用及髓鞘再生的变化高度相关；及
(4)选择一个系，其作为模型呈现清楚的组织学脱髓鞘作用。
15.如项14的方法，其中所述出生后髓鞘形成的高峰是约3-5周的第一代小鼠。
16.如项14的方法，其中所述模型是铜宗脱髓鞘作用模型。
17.如项1的方法，其中所述方法监测化合物对至少一种脱髓鞘作用或髓鞘再生活动的功效。
18.如项1的方法，其中所述方法监测基因活动的效应。
19.监测髓鞘形成的改良方法，所述改良包括成像表达髓鞘碱性蛋白荧光素酶的转基因动物。
20.降低髓鞘形成研究中的差异性的方法，所述方法包括在至少两个不同的时间点监测动物中的髓鞘碱性蛋白控制的荧光素酶。
21.如项1的方法，其中所述生物的身体的特定部分选自周围神经***与中枢神经***。
附图说明
图1显示髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因模型的示意性简图，其用于追踪髓鞘表达的实时变化。MBP荧光素酶转基因模型设计目标是实时体内追踪在CNS中髓鞘形成的状态。其中(A)为即将在IVIS机器中生物成像之前将荧光素底物注射至MBPluci生物成像模型中；(B)为用于全动物成像的低光设备；(C)MBPluci模型的设计目标是在引发脱髓鞘作用期间或者在提高髓鞘再生的对受损CNS区域的治疗中非侵袭性地定量评价髓鞘形成。
图2显示MBP-Iuci转基因结构和MBP转录本表达的内源性控制，显示该内源性髓鞘碱性蛋白启动子具有4个元件，其在发育及进入成熟期间差异地调节髓鞘碱性蛋白在少突胶质细胞中的表达(HF Farhadi:J.Neurosc.2003,23(32),10214-10223)。M1/M2二者调节出生后早期的转录本。M3涉及整个成熟期中表达的转录本调节。M4帮助许旺细胞表达髓鞘碱性蛋白转录本。所述髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因的结构具有两种形式的髓鞘碱性蛋白启动子。121系含有M4元件，预定在脑、脊髓及周围神经***中表达荧光素酶。171系由较短的髓鞘碱性蛋白启动子(例如，缺少M4元件)组成，主要在脑中表达荧光素酶，已由生物成像分析确认。
图3显示髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因表达盒，包括在荧光素酶表达载体中具有5千碱基对的5’端脱氧核糖核酸的髓鞘碱性蛋白启动子。
图4显示髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因表达盒，包括在荧光素酶表达载体中具有10千碱基对的5’端脱氧核糖核酸的髓鞘碱性蛋白启动子。
图5显示髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因系的筛选树的实例。其中从35个初始创始系，使用四项测定来过滤和选择符合模型的设计目标的最佳MBP-luci系。
图6显示来自第一级筛选的髓鞘碱性蛋白荧光素酶创始系(founders)的体内荧光素酶图像。该荧光素酶强度范围为105(+++)至103(+)(光子/平方厘米/秒)。
图7显示在7周(A)及10月(B)生物图像化的模型生物体538，说明脑中荧光素酶图像随年龄增加而减退，其与在早期出生后发育后观察到的髓鞘形成减退有关。
图8显示髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠的体内生物成像：左方是负转基因野生型小鼠(WT)，背景生物发光在头颅(ROI：关注区域)中测量，相当于2.7x103光子/秒。呈现在右方的是杂合髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠，关注区域的生物发光相当于1.327x105光子/秒。呈现在中央的是纯合髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠，关注区域值为3.2924x105光子/秒，其大致如同预期为杂合值的两倍。
图9显示中枢神经***特异性在时间上荧光素酶的表达。所示的来自髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因小鼠的头颅生物发光从第4周(A及*)至第8周(B及**)减退并平行于Taqman分析法(C)测定的内源性髓鞘碱性蛋白转录本水平。
图10显示荧光素酶在髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠中的中枢神经***特异性及亚区的表达。在切片的生物成像后，髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因小鼠脑的两个矢状切面(A及B)显示，脑中的胼胝体亚区含有最高生物发光信号并与铜宗损伤模型中最大的脱髓鞘作用及髓鞘再生作用有关。
图11显示在髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型中的生物成像及已知发生在铜宗损伤饮食中的其它生物应答。在此施行铜宗饮食4周，导致在图左方示出的生物成像及细胞变化。预期所指(箭头)的每周生物成像平行于内源性髓鞘碱性蛋白的表达水平变化(Matsushima GK and Morell P,Brain Pathology 11,1-10,2001)。
图12显示应答于持续性铜宗饮食处理，在野生型C57BL/6J小鼠中的内源性髓鞘碱性蛋白稳定态信使核糖核酸的变化。8周龄的小鼠在其饮食中置放铜宗达12周(实心三角)。在第二组(空心三角)中，在放置6周后移除铜宗食物，使小鼠得以在至多另外6周中复原。通过northern印迹法(northernblot)单独测定信使核糖核酸水平的数据，并相对于三个对照的平均值绘图(Jurevics H,et al,Journal of Neurochemistry,2002,82,126-136)。
图13显示示出的铜宗饮食对髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物成像模型的影响。所述成像信号可清楚模拟内源性髓鞘碱性蛋白基因的表达模式。历经4周的铜宗饮食处理在M8P-luci小鼠中导致脱髓鞘作用和相应的生物成像值降低(ROI＝圆圈)，在第5周时恢复成正常饮食提高生物成像信号，直到在第7周研究结束时。非侵袭性生物成像在整个研究中支持在相同小鼠上的重复测定。在喂食铜宗食物期间(由第0周至第4周)，有2-3倍的成像信号降低，而移除铜宗食物后(由第4周至第7周)，也有3-4倍的成像信号增加。
图14显示在髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型中的胼胝体的勒克司坚牢蓝(LFB)染色。将小鼠用铜宗或正常食物处理4周，然后二者回复至正常饮食。在第6周时，与正常饮食处理组(A)相比，可在铜宗处理的髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的胼胝体(B)中使用勒克司坚牢蓝染色以组织化学方式检测到清楚脱髓鞘作用。髓鞘形成的结构变化的组织化学测定与经处理的髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的生物成像信号变化有关。
图15显示在自发髓鞘再生期间，过氧化物酶体增生物活化受体δ(PPARδ)激动剂工具化合物(以下称为'517)在171系杂合小鼠中提高荧光素酶的成像信号。将8周龄的髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠(171杂合的，B6C3H品系)用含有0.2％铜宗的饮食处理4周，然后用正常饮食(normal chow diet)处理，使髓鞘再生。然后将小鼠每日二次口服媒介物(0.6％羧甲基纤维素钠盐与0.5％聚山梨醇酯80)或30毫克/公斤的过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具化合物'517达8日，并在指定时间点图像化。将数据标准化至零周的基线信号。与媒介物组(n＝12)相比，工具化合物'517(n＝12)导致荧光素酶信号相对增加30-100％，其已被归因于所述化合物刺激少突胶质细胞的祖细胞分化作用的影响(例如，与体外研究结果一致)。
图16：过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具化合物'517改善在髓鞘再生期间勒克司坚牢蓝(LFB)髓鞘染色(171系杂合的，B6C3H品系)。将来自***固定石蜡包埋的脑部的矢状窦旁组织切片以勒克司坚牢蓝染色，用于定性评价胼胝体中的髓鞘。对每一时间点的染色切片进行评分及分级，等级由0(完全髓鞘形成)至5(完全脱髓鞘)。评分***如下：0＝正常髓鞘，无脱髓鞘作用；1＝最小局部脱髓鞘；2＝轻至中度局部脱髓鞘；3＝中度局部广泛性脱髓鞘；4＝严重局部广泛性脱髓鞘；5＝严重扩散性脱髓鞘。在4周铜宗处理后，来自小鼠的勒克司坚牢蓝染色脑切片的组织学评价证实在171系杂合小鼠(n＝5)中的胼胝体的中度至严重脱髓鞘作用。工具化合物'517组(n＝5)与媒介物对照组(n＝3)相比，在髓鞘再生期间从第4周至第5周的'517处理导致通过勒克司坚牢蓝在第7周时间点所测的可测量的髓鞘增加。尽管实验个体数量少，但是组织学数据支持体内荧光素酶生物成像数据，显示当与媒介物对照相比时，用'517化合物处理的小鼠的髓鞘再生增加。
图17：在铜宗模型中，在脱髓鞘作用期间的30毫克/公斤的***受体β(ERβ)激动剂(以下称为‘5a)及10毫克/公斤的正对照喹硫平(Quetiapine)为保护性的。将髓鞘碱性蛋白荧光素酶171系杂合B6C3H小鼠喂食铜宗饮食4周，并口服'5a(10毫克/公斤或30毫克/公斤)或正对照喹硫平(QTP)。将小鼠在第0周(基线)、第3周及第4周图像化，并将数据标准化至第0周的基线。对于第3周及第4周的时间点，在10毫克/公斤，喹硫平组与媒介物对照相比呈现显著成像信号增加。喹硫平处理组的结果与Yanbo Zhang等人发表的数据一致，其标题为“喹硫平缓解C57BL/6小鼠脑中由铜宗引起的脑白质病变(Quetiapinealleviates the cuprizone-induced white matter pathology in brain of C57BL/6mouse)”(Schizophrenia Research,2008,Dec 106,182-91)。与媒介物相比，30毫克/公斤的化合物'5a在铜宗饮食第3周(趋势)及第4周(明显)显示信号增强。10毫克/公斤的'5a在第3及第4周无显著效果。结果表明，该髓鞘碱性蛋白荧光素酶成像模型足以灵敏至检测铜宗模型中的剂量依赖性变化。
图18：与第3及第4周的媒介物对照组相比，'5a(30毫克/公斤)与喹硫平(10毫克/公斤)组具有显著较强的转基因活性。成像模型数据支持喹硫平及'5a二者减弱铜宗引起的脑脱髓鞘作用及髓鞘破坏。
图19显示在纯合与杂合小鼠(B6C3H，171系)之间的铜宗模型成像信号比较。将N3代的杂合小鼠品种间互交以产生髓鞘碱性蛋白荧光素酶等位基因的纯合小鼠。在铜宗处理期间，纯合小鼠较杂合小鼠表达超过2倍的生物成像信号窗。纯合子中的两份报道基因拷贝在脱髓鞘期间(例如，铜宗饮食4周后)呈现超过2倍的信号降低，且在髓鞘再生期间(例如，移除铜宗饮食并回复正常饮食1周后)呈现2倍信号增加。
虽然数据已证明171杂合系(B6C3H品系)在铜宗模型中起作用，并可检测化合物功效，但是该模型可通过育种进一步改良为纯合性，以增加生物成像信号强度。由于可将小鼠群落维持为纯合子，这也简化模型生产，并降低基因分型成本。总的来说，更大成像窗可在药理化合物分析研究中扩大化合物功效的检测。
图20：以勒克司坚牢蓝染色的来自***固定石蜡包埋的小鼠脑的矢状窦旁组织切片中的胼胝体(括号201中的暗纵向结构)的显微照片表示评价髓鞘状态的白质区域。此区域用于胼胝体的勒克司坚牢蓝(LFB)染色的定量数字成像分析。
图21：三种不同髓鞘碱性蛋白荧光素酶系(171系B6C3H杂合品系、121系C57BL/6杂合品系及171系B6C3H纯合品系)的成像窗及组织学窗的比较。将小鼠用含有0.2％铜宗的饮食处理4周或5周。将成像数据标准化至第0周的基线测量值。在每一研究结束时收取小鼠脑，并以勒克司坚牢蓝(LFB)针对髓鞘染色连续石蜡切片。平均定性勒克司坚牢蓝评分(0至5)显示在表中。171系B6C3H纯合小鼠呈现最大成像信号降低，也证实如定性组织学所评价的最严重脱髓鞘作用。171系B6C3H杂合小鼠呈现最小成像窗，也在第4周呈现最少组织学脱髓鞘作用。
图22通过对喹硫平(QTP)治疗应答的示范，进一步证实铜宗模型中171系纯合小鼠的用途。将小鼠喂食铜宗饮食5周，并同时每日口服喹硫平(10毫克/公斤)。将小鼠在第0周(基线)、第3周及第5周成像。将数据标准化至第0周基线测量值。与媒介物对照相比，喹硫平(10毫克/公斤)在第3周及第4周的时间点都导致显著成像信号增加。结果与171系杂合小鼠获得的结果(图17及18)一致。数据表示，171系纯合小鼠可用于评价在铜宗模型中化合物维持髓鞘表达及完整性的功效。
图23：来自121系小鼠的体外脊髓成像。发光的覆盖说明，将转基因表达定位于脑与脊髓的白质区。这进一步支持由全动物生物成像实验所得的结论。
图24：在C57Bl/6小鼠、野生型、171系杂合及171系纯合小鼠中的胼胝体的勒克司坚牢蓝(LFB)染色的定量数字图像分析。在染色载玻片的扫描数字图像上的胼胝体人工略画区域上，使用色彩反卷积运算法计算胼胝体中阳性勒克司坚牢蓝染色百分面积的量。对于每只动物，评价一片切片。每组的动物数量在9至10只之间变动。对于每只动物及各组，计算阳性勒克司坚牢蓝染色百分面积。通过配对t检定评价各组之间的统计显著性。在4周铜宗喂食后，171纯合小鼠及野生C57BL/6小鼠都呈现严重脱髓鞘作用(阳性染色百分面积介于40％至60％)。相对地，171系杂合小鼠仅呈现轻微脱髓鞘作用(阳性染色百分面积介于65％至80％)。因此，171系纯合小鼠被认定为在铜宗引发的脱髓鞘作用模型中使用的优选系。
具体实施方式
以下五个标准已成功连续应用于对生物成像模型的优化选择：
依据以下方法，可由5千碱基对或10千碱基对载体转基因操作的小鼠系产生具体实施方案。下述结果来自用35个转基因系开始的一个这种筛选方法。图5图示总结此方法。
由制备的转基因系中，选择这样的系：在出生后髓鞘形成高峰时(例如，3-5周第一代小鼠)的体内全动物(例如，小鼠)成像显示中枢神经***特异性成像。所选35个系中的6个系进行下一选择阶段。
接着，选择这样的系：体外成像确认，荧光素酶转基因的表达主要在脑白质区中。来自步骤1的6个系中的5个进行至下一阶段。
然后，选择这样的系：荧光素酶图像强度与在此例中的铜宗脱髓鞘作用模型中引发的脱髓鞘作用与髓鞘再生的变化高度相关。来自步骤2的5个系中的3个进行至下一阶段。
接着，选择这样的系：在上述铜宗模型中呈现清楚组织学脱髓鞘作用。来自步骤3的3个系中的2个被选为优选系。
作为概念的最后验证，我们选择了一个系，其中可在该生物成像模型中最理想检测A003398711(一种过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性激动剂)的功效。
使用以上五个标准选出示例性的系，名为171系(B6C3品系，杂合)，并用作优选模型。
这种方法的更详细的描述在下述实施例中描述。
定义
除非另有说明，本申请使用的术语意义如广泛使用的科学用语，其可能异于口语一般用法。
基因应作广义解释，以包括转录及非转录区。
化合物应作广义解释，以包括化学化合物，例如，有机化学实体，生物化合物，例如抗体及抗原辨识片段与结构，核酸，例如干扰性核糖核酸等。
制备表达萤火虫荧光素酶的转基因小鼠。在这些动物中，使报道基因—荧光素酶与髓鞘碱性蛋白启动子连接，从而当启动髓鞘碱性蛋白表达时，驱动荧光素酶在白质(有髓)区如中枢神经***的细胞中的表达。***性注射(静脉内、腹膜内、皮下)底物荧光素，由活体小鼠头部产生可检测且可计量的光信号。通过施用铜宗脱髓鞘作用模型以选择髓鞘碱性蛋白荧光素酶系，并反复以荧光素注射这些动物，可通过非侵袭性生物发光成像，纵向(例如，历时2个月)连续监测及量化脱髓鞘作用与髓鞘再生。此模型成功定量监测铜宗引发的脱髓鞘作用及过氧化物酶体增生物活化受体δ化合物引发的髓鞘再生。
检测器技术的进步导致灵敏度及成像质量的实质改善。现今由专门电荷耦合组件(CCD)相机检测光子，当光子撞击硅片时，该相机将光子转化为电子。电荷耦合组件相机在空间上将入射光子强度编码为电荷分布图，其然后经处理而产生图像。噪声通过以下方法降低：超冷却电荷耦合组件相机及将相机安装在暗箱中。在图像获取及分析期间，这些相机通常由计算机控制。第二代相机***小得多，因此可装置在实验室台顶上，使得该技术对于日常实验可行及实用。Xenogene公司(Xenogene Company)已将生物成像技术商业化。
在现有成像样式中，基于生物发光或荧光的光学技术已变得最方便及容易操作。由于来自组织的本底发光(噪声)极低，生物发光成像(BLI)的特征在于显著的灵敏度。迄今为止，生物发光成像已成功用于监测生物过程，例如，在各种动物模型中的细胞运动、肿瘤发展、基因表达及病毒感染。
萤火虫荧光素酶需要细胞内辅因子如三磷酸腺苷用于活动。这将其使用限于基因工程化以表达该酶的细胞。因此，许多有用的成像应用如监测循环因子的分布、检测细胞外抗原表达以及标记内源性细胞不适用于萤火虫荧光素酶成像。萤火虫荧光素酶的另一缺点是在固定的细胞与组织样品中缺乏替代的底物来检测它。这使得难以结合体内成像与显微分析。
从内部器官放射的光的检测灵敏度取决于数种因素，包括荧光素酶表达的水平、标记细胞在体内的深度(光子必须通过组织的距离)，以及检测***的灵敏度。
使用非侵袭性全动物成像监测荧光素酶报道基因表达盒的表达已有描述(Contag,C.,U.S.Pat.No.5,650,135,Jul.22,1997,herein incorporated byreference；Contag,P.等,Nature Medicine 4(2):245-247,1998；Contag,C.等,OSA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3:220-224,1996；Contag,C.H.,,Photochemistry and Photobiology 66(4):523-531,1997；Contag,C.H.,al,Molecular Microbiology 18(4):593-603,1995)。这种成像一般使用至少一种光检测仪器设备，例如电荷耦合组件(CCD)相机。
髓鞘碱性蛋白基因的控制元件
髓鞘碱性蛋白(MBP)是多肽家族，主要表达在神经***中，其中它们在髓鞘形成中扮演重要角色。主要在转录水平调节髓鞘碱性蛋白的表达，例如在分化少突胶质细胞中。在神经科学期刊(Journal of Neuroscience)中，Farhadi等人描述了新的调节组合元件，其在时间上控制髓鞘碱性蛋白基因的表达。
Farhadi等人证实，神经胶质细胞在髓鞘形成开始期间及随后的各个阶段使用不同的调节序列组合来控制髓鞘碱性蛋白的表达。
髓鞘碱性蛋白(MBP)为正常髓鞘致密性所需，并牵涉在实验性及人类脱髓鞘疾病如多发性硬化(MS)中。
为了进一步促进髓鞘生物学的理解并在活体动物中测试髓鞘强化化合物，本发明使用髓鞘碱性蛋白启动子性质及最灵敏的荧光素酶报道基因技术产生本发明髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型。该模型目前允许在活体动物中灵敏地体内测量髓鞘基因转录应答。
髓鞘碱性蛋白荧光素酶报告盒的构建
以位于髓鞘碱性蛋白启动子M3区域中的探针筛选129SvEv细菌人工染色体基因库(Cell&Molecular Technologies)。该探针具有507个碱基对，并由引物对(5’-actccttaccacacttcttgcagg-3’5’-tctattgggtgatgtgtgccatc-3)(SEQ ID Nos.1及2)产生。通过Southern分析(Southern analysis)，用相同探针确认髓鞘碱性蛋白的细菌人工染色体(使用EcoRI切割7.6K片段，和/或以BamHI切割13.8K片段)。
将用引物组(MBP-L-SP25-gggggatccacctgggacgtagcttttgctg及MBP-AP15-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg)(SEQ ID Nos.3及4)通过高保真聚合酶链反应扩增的含有M1至M4(10K)的“长段”髓鞘碱性蛋白启动子克隆入Invitrogen’s xl-topo载体，产生中间载体(Topo MBP 10k载体)。然后将髓鞘碱性蛋白10k启动子(BamH1及PmeI片段)***至pGL3hygro neo载体(BglII及PmeI位置)中。将该最终10K载体称为pGL3-hygro-long MBP-luci(参见例如图4)。
将用引物组(MBP-S-SP25-gggggatccatccctggatgcctcagaagag及MBP-AP15-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg)(SEQ ID Nos.5及6)通过高保真聚合酶链反应扩增的含有M1至M3(5K)的“短段”髓鞘碱性蛋白启动子克隆入Invitrogen’s p2.1-topo载体中，产生中间载体(Topo MBP5k载体)。然后将髓鞘碱性蛋白5k启动子(BamH1及PmeI片段)***至pGL3hygro neo载体(BglII及PmeI位置)中。将该最终5K载体称为pGL3-hygro-short MBP-luci(参见例如图3)。
来自两种pGL3-hygo-MBP质粒的脱氧核糖核酸序列确认M1、M2、M3及M4的读序。此外，瞬时转染这些质粒至293T细胞中得到可检测的荧光素酶活性。
动物处理及转基因小鼠的产生
依据联邦指导方针进行所有动物工作。使用三种不同品系的小鼠(FVB、B6C3及C57BL/6)。在吸入异氟醚(Baxter,Deerfield,IL)麻醉的状态下进行成像；观察小鼠直至完全复原。
如下产生转基因小鼠：用Not I及BamH1酶切割pGL3-hygro-MBP10k-luci或pGL3-hygro-MBP5k-luci质粒。然后将含有髓鞘碱性蛋白启动子、荧光素酶及多腺苷酸化信号的片段凝胶纯化。通过标准原核注射(standard pronuclear injection)至FVB、B6C3或C57BL/6胚胎中产生转基因小鼠。简而言之，在原核显微注射期间，将髓鞘碱性蛋白荧光素酶基因盒脱氧核糖核酸直接导入至刚刚受精的小鼠卵中。使用细针将脱氧核糖核酸注射至源自***的大型雄性原核中。脱氧核糖核酸倾向于以许多串联排列的拷贝的形式整合在基因组中的随机位置，经常在发生一次或二次细胞***之后。因此，所得的小鼠仅为部分转基因。如果转基因细胞促成生殖系，那么将产生一些转基因卵或***，且下一代小鼠将为完全转基因。
使用萤火虫荧光素酶基因特异性引物(聚合酶链反应引物：5'gaaatgtccgttcggttggcagaagc-3'及5'ccaaaaccgtgatggaatggaacaaca-3')(SEQ IDNos.7及8)，通过尾部活检脱氧核糖核酸的聚合酶链反应(PCR)鉴定转基因始祖小鼠及其转基因第一代子代。
使用体内成像***(IVIS 100；Xenogen,Alameda,CA)图像化25个阳性始祖小鼠的子代，并以脑部成像信号鉴定6个转基因系(2个FVB系及4个B6C3HF1系)。由于在此实验中没有产生阳性脑部成像的C57BL/6始祖，使一个FVB系与C57BL/6小鼠回交，得到C57BL/6品系。随后将B6C3171系小鼠互交繁殖，以产生纯合转基因交配对。也使B6C3F1171系与C57白化系回交。
表1
将体内生物发光成像用于筛选髓鞘碱性蛋白荧光素酶系。以异氟醚麻醉第一代小鼠，并通过尾静脉或皮下注射剂量为250毫克/公斤的荧光素。荧光素注射8分钟后，将小鼠图像化。以脑部成像信号鉴定6个系(图5，2个FVB品系：58及121，以及4个B6C3品系：12、23、85及171)。除了58系，其它5系在脑白质区呈现体外荧光素酶成像信号。
表1显示在出生后不久通过尾部活检聚合酶链反应基因型鉴定的35个转基因脱氧核糖核酸阳性始祖小鼠的数据。15个脱氧核糖核酸阳性始祖系产生MBP-10k luci，20个脱氧核糖核酸阳性始祖系产生MBP-5k luci。在整个应用中，将转基因及转基因小鼠缩写为MBP-luci。
表1：将髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因小鼠作为6个不同的模型产生，以改善生物成像应用
图7及图9显示，髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物发光良好地与中枢神经***亚区和年龄相关髓鞘形成有关。
体外成像与发光计测定
在皮下注射荧光素(250毫克/公斤)10分钟后，以二氧化碳对动物施行安乐死，然后立即对分离出的器官进行体外荧光素酶成像。将解剖的器官置于覆盖塑料片的黑纸上并以IVIS图像化；在解剖后20至30分钟内仍可检测到强生物发光信号。使用Living Image software(Xenogen Corp.)进行图像分析及生物发光的定量。
将组织样品置于含有抑制剂的裂解缓冲液(被动裂解缓冲液[Promega]及少量全蛋白酶抑制剂混合液[Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail,Roche,Indianapolis,IN])中。使用组织均化器将组织均化。以短暂超声处理进一步均化组织。离心组织匀浆并将澄清的裂解物用于发光计测定。为了发光计测定，依厂商指示制备荧光素酶测定底物(Luciferase Assay System,Promega)。混合组织匀浆(20微升)及底物(100微升)(100μl)并在发光计中测量。获取本底发光读数，并从发光数据扣除背景读数。遵循厂商的规程，使用BCA蛋白质测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit(Pierce,Rockford,IL))测定蛋白质浓度。将每一蛋白质裂解物的发光计算为每微克蛋白质的任意单位的光。
铜宗引发的脱髓鞘作用与组织学确证
对小鼠施用铜宗4周，导致广泛的胼胝体脱髓鞘作用。铜宗引发的脱髓鞘作用与显著的小神经胶质细胞增生(microgliosis)及巨噬细胞募集相关(Bakker and Ludwin,J Neurol Sci 78:125-37,1987；Hiremath et al.,JNeuroimmunol 92:38-49,1998；McMahon et al.,J Neuroimmunol 130:32-45,2002)，但不具有最低T细胞应答(Matsushima and Morell,Brain Pathol 11:107-16,2001)。在此模型中髓鞘损伤位置的一致及可预测的性质使胼胝体髓鞘形成的变化易于量化。这些变化可能由少突胶质细胞祖细胞的新生髓鞘形成作用造成，然而，由免疫调节机制对末期脱髓鞘的预防作用(Pluchino et al.,Nature 436:266-71,2005)可能是另一可行的解释。
如上所述，对多个品系的髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因(MBP-luci Tg)小鼠评价铜宗引发的脱髓鞘作用/髓鞘再生活动的体内评价值。髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子驱动的荧光素酶(luci)的表达允许在表达髓鞘碱性蛋白的转基因(Tg)哺乳动物的脑中体内生物成像定量髓鞘。例如，该模型可使用在饮食中喂食0.2％铜宗的野生型C57/BL6小鼠。为了在各种化合物处理后评价髓鞘，先前的模型需要在多个时间点最后牺牲动物。由于需要多个动物，动物间的差异性是需要额外受试者(更多个体)以达到显著性的一项因素。
当通过勒克司坚牢蓝(LFB)组织化学染色评价时，饮食含0.2％铜宗4周的MBP 5k-luci 171系(B6C3)小鼠在脑部胼胝体中显示突出和显著的脱髓鞘作用。这种脱髓鞘作用进一步与体内生物成像荧光素酶信号的降低有关。
然而，MBP 10-Luci 121系小鼠的FVB品系未呈现可相比的脱髓鞘作用。在FVB小鼠中进行了额外研究，试图找出可导致显著脱髓鞘作用的在饮食中铜宗的变化量及铜宗处理的变化时段的潜在制度。结果显示，在胼胝体中，勒克司坚牢蓝评价仅有中度脱髓鞘作用。因此，优选开发171系。
不同品系对铜宗模型的影响：
由于其高繁殖力，常使用FVB/NJ(FVB)品系制造转基因小鼠。而由于它们白色的相对不吸光毛色，FVB品系小鼠也广泛用于转基因生物成像模型。在FVB或其它品系中，也可去除毛发(例如通过修剪)，从而减少毛发或毛皮的吸收或散射所导致的信号损失。
因为在铜宗模型中发现品系间差异，所以品系的选择可影响结果。为特定目的而选择最佳品系被视为常规优化，例如取决于所选的测定法及设备。然而，制造转基因哺乳动物不被视为限制因素；而是使用特定品系及转基因系对例如影响髓鞘形成的条件的敏感度作为改善数据质量的选择标准。取决于所选的髓鞘形成/脱髓鞘作用活动，品系或遗传背景的选择可能影响结果。据认为，特殊脱髓鞘作用模型在特定品系中可作用更好。如此选择模型及品系可被视为例行测定开发的一部分。虽然铜宗喂食是研究脱髓鞘作用与髓鞘再生的优良模型，但是在品系差异中明显观察到，在这种模型中存在强的遗传因素。
FVB品系
来自FVB品系的小鼠被选中，部分归因于其白毛色。FVB小鼠提供适于多数转基因实验及随后基因分析的***。例如，近交FVB品系的特征在于强繁殖能力及一贯的大窝(large litters)。这降低产生大种群的成本及力气。而且，已受精FVB卵含有大而明显的原核，方便显微注射脱氧核糖核酸。此外，该FVB品系具有白化毛色，使其成为生物成像的首选。这些特色使FVB品系有利于研究转基因生物成像模型。然而，当其它品系呈现希望的特征时，可使用其它品系。
FVB品系小鼠在体重减轻方面对0.2％铜宗十分敏感。每周需要补充2至3次正常食物/转胶(transgel)，以避免严重体重减轻及毒性。此外，本发明人的经验显示，在各种铜宗喂食制度下，FVB品系小鼠呈现最小组织学脱髓鞘作用。
因此，将MBP 10k-luci 121系(FVB品系)与C57Bl/6回交，以促进将来的确证及应用。
B6C3/Tac品系
B6C3杂交品系可通过以下方法产生：将C57BL/6Ntac雌性小鼠与来自Taconic US’s商业群(Taconic US’s commercial colonies)的C3H/HeNTac雄性小鼠互交。它具有黑色或野鼠色(agouti)毛色。B6C3将为基因座杂合的，其中C57BL/6与C3H不同，和基因座纯合的，其中它们相同。
B6C3/Tac小鼠呈现明显组织学脱髓鞘作用。具体地，与野生型C57BL6相比，在生物成像模型171系MBP 5k-Luci纯合小鼠中的脱髓鞘作用仅为轻度较不广泛的，差异性轻微。与C57BL6及171系MBP 5k-Luci纯合小鼠相比，在171系MBP 5k-Luci杂合小鼠中的脱髓鞘作用被认为较不严重，更局部性和更易变。这些结果说明，髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型可用于测定个体、品系或品种对影响髓鞘形成的活动的敏感性。此外，髓鞘碱性蛋白荧光素酶结构即使在黑毛哺乳动物中也不失去效用。
BALB/cJ品系
也调研在BALB/cJ小鼠中铜宗对皮层脱髓鞘作用的影响。在这些小鼠中，皮层脱髓鞘作用仅为局部性。
此外，在BALB/cJ小鼠中，皮层小神经胶质细胞的累积明显增加，而在C57BL/6小鼠的皮质中无小神经胶质细胞。因此品系的差异性可用于支持不同研究目的。
C57BL/6J Jax品系
C57BL/6遗传背景的动物适用于许多铜宗模型研究，并在过去的三十年中已应用于数个实验室。当8周龄的C57BL/6小鼠在饮食中喂食0.2％铜宗时，成熟少突神经胶质细胞被特异性攻击(无法满足大量髓鞘支持的代谢需求)并走向细胞凋亡。紧接着是小神经胶质细胞的募集及髓鞘吞噬作用。髓鞘基因表达的研究配合形态学研究指出，即使面临持续代谢激发，少突神经胶质细胞的祖细胞增生并侵袭脱髓鞘区域。如果终止铜宗激发，在大概数周内发生几乎完全的髓鞘再生。可推断，通过可溶性因子在不同细胞类型之间细胞间通讯。本发明的方法及模型可用于研究细胞间通讯活动，例如，测定是否有假定因素涉及髓鞘形成的募集，筛选促进募集的化合物，以及筛选抑制募集的化合物。
此外，髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的再现性指出，其可允许测试操作(例如，在共有遗传背景(common genetic background)上可获得的基因敲除或转基因，或干扰核糖核酸或药物处理)，其可加速或抑制脱髓鞘作用和/或髓鞘再生的过程。
髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的改良
虽然171系(B6C3H品系，杂合子)已经显示在髓鞘形成/脱髓鞘作用研究中起作用，但是可将该模型通过以下方法进一步改良：(1)繁殖成纯合体型以增加生物成像信号强度，并减少模型生产及基因型成本；(2)繁殖成白化品系如C57品系，以用白毛降低成像信号衰减，和减轻多次除毛后的皮肤反应；(3)将121系繁殖成C57BL/6品系，以匹配内部研发的中枢神经***铜宗模型品系。
我们目前已经证实，171系纯合系比171系杂合系(每一细胞2个报道基因基因盒拷贝)呈现超过两倍的生物成像窗。其它实验也证实白化C57应答于铜宗模型。
成像***与数据分析
使用IVIS成像***(Xenogen Corp.,Alameda,CA)非侵袭性测量生物发光。除非本申请另有说明，在腹膜内注射荧光素(250毫克/公斤-1；XenogeneCorp.)10分钟后成像，60秒采集(60-s acquisition)，面元10(binning 10)。在图像采集期间，通过吸入～2％异氟醚(Abbott Laboratories Ltd.,Kent,UnitedKingdom)持续镇静小鼠。
成像***描述
成像***100(Imaging System 100(Xenogene))用于收集证实此发明的数据。Xenogen灵敏成像***100系列(Xenogen’s sensitiveImaging System 100Series)提供可调式矩形视野，例如，10–25厘米，可成像5只小鼠或2只大型大鼠，以及一个标准微孔板。该***特色为25毫米(1.0英寸)正方形背部薄化背照式CCD(电荷耦合组件)相机，将其通过闭合循环冷却***(不具液态氮)低温冷却至约-90至-120℃，例如-105℃，以最小化电子背景并最大化灵敏度。电荷耦合组件相机设计用于高效率光子检测，特别是在光谱的红光区中。它可检测极少量的光子，以及如同传统相机一样操作；在该宽信号范围内显示图像是Xenogen Living软件的功能。具有六位滤光轮以分隔不同带宽。这种光谱信息可揭示更多来源细胞的深度及分布。冷却电荷耦合组件相机并优化电子读数，使得搜集的产生实时体内图像的数据具有极低噪声。
防光成像室
极度防光的低背景成像室允许在标准实验室照明环境中使用成像***100系列。上下移动成像室中的样品搁板以调整视野。研究者可观看完整动物，或聚焦于一部分以得到更多细节。加热搁板以增进麻醉动物(例如，小鼠或大鼠)的幸福感。该***包括动物操作组件，例如，加热的样品搁板、气体麻醉管线及Xenogen的完全气体麻醉选件—XGI-8气体麻醉***(XGI-8Gas Anesthesia System)(在网页上显示)。较大的成像室可允许使用较大受试者或较多数量的受试者。
用于体内生物发光测定法的荧光素的制备
在实施例中使用下列材料：
萤火虫D-荧光素钾盐1.0克/瓶(例如，Xenogen XR-1001或BiosynthL-8220)
不含镁离子与钙离子的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)
孔径0.2微米的瓶口过滤器
使用下列步骤成像：
制备25毫克/毫升的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水荧光素原液，并通过0.2微米过滤器过滤消毒。分装为5毫升储存在-20℃。注射剂量为10微升/克体重。每一小鼠的目标是接受250毫克荧光素/公斤体重(例如，对20克的小鼠注射200微升，以递送2.0毫克的荧光素)。在成像之前数分钟，皮下注射或腹膜内注射或静脉内注射荧光素。任选对每个动物模型进行荧光素动力学研究，以测定高峰信号窗。
3.6髓鞘碱性蛋白荧光素酶成像方法
如上所述，小鼠经皮下注射、腹膜内注射或静脉内注射250毫克/公斤的D-荧光素。在5分钟(静脉内注射)或8分钟(腹膜内注射或皮下注射)之后，将小鼠使用IVIS 100(Xenogen)图像化16分钟(成像60秒并间隔60秒，共8张图像，面元大小为8)。为了量化生物发光，定位所研究的相同圆形区域以包围每一小鼠的头部区域，并使用LIVINGIMAGE软件(2.5版，Xenogen)将成像信号量化为平均亮度(光子/秒/平方厘米/球面度)。所研究的头部区域在所有实验中保持固定面积及位置。在开始处理每一动物时将数据标准化为生物发光。
3.7统计分析
对于统计分析，使用EverStat V5及Sigma Stat统计软件包。采用组中的平均成像为平均值，并计算所有组的标准误差(SE)。
当比较两组的平均值时，进行成对魏氏检验(paired Wilcoxon test)或非成对魏氏检验(unpaired Wilcoxon test)。将P<0.05的双尾数值视为具统计显著性。
实施例
转基因小鼠的产生
“长段”启动子是一段约10千碱基对，含有M1、M2、M3及M4，“短段”启动子是约5千碱基对，含有M1、M2及M3。这些启动子以高保真聚合酶链反应方法克隆自含有髓鞘碱性蛋白基因的小鼠的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)。然后将每一启动子片段克隆至载体中，例如克隆至pGL3-hygro载体的多联结位置(图1及图2)。
将质粒用Not I及BamH1限制酶切，以释放髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因表达盒(图3)，其被用于以标准原核显微注射技术产生FVB/Tac及B6C3/Tac品系转基因小鼠。
产生转基因(Tg)动物的一般策略为本领域所熟知，例如，如以下文献所述：Pinkert,C.A.(ed.)1994.Transgenic animal technology:A laboratory handbook.Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Monastersky G.M.and Robl,J.M.(ed.)(1995)Strategies in transgenic animal science.ASM Press.Washington D.C.。
与脱髓鞘作用/髓鞘再生活动相关的髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因信号
在铜宗模型中使用被发现具有白质区荧光素酶表达的MBP 10K-luci121转基因系(FVB品系)确证实验。如图11中所示进行第一项铜宗研究，在第1、2及4周(0.2％铜宗饮食)反复进行荧光素酶成像，然后恢复至不含铜宗的正常饮食，并在第5、6及7周反复进行荧光素酶成像(重复第1至3周)。如图中所示，121系的荧光素酶表达明显与铜宗引发的脱髓鞘作用和髓鞘再生时间过程相关。这与已发表的内源性髓鞘碱性蛋白信使核糖核酸研究一致(Jurevics et al.,Journal of Neurochemistry,2002,82,126-136)。FVB品系小鼠只有一种品系，已知对铜宗敏感(通过体重减轻看出)。通常，需要每周补充2至3次正常食物/转胶，以避免此品系中的严重体重减轻及毒性。
铜宗模型确证
一种熟知且广泛使用的脱髓鞘作用/髓鞘再生模型是小鼠铜宗模型。此模型涉及饮食性消耗铜宗，一种铜螯合剂(一般约0.2％w/w，双环己酮草酰二腙(CAS#370-81-0,Sigma C9012))，在粉末状啮齿动物实验室食物(powderedrodent lab chow)中给药一段时间，例如连续4至6周(参见例如，Matsushima andMorell,2001)。已显示铜宗对成熟少突胶质细胞具选择性毒性。随后转换铜宗食物为正常食物，制造有利于复原的环境，使得在停止铜宗喂食4至6周后，小鼠将在胼胝体中呈现广泛髓鞘再生。因此，铜宗模型提供完全体内范例，以在其中研究脱髓鞘作用与髓鞘再生的情况(图11及12)。
作为进一步证明，测试MBP 5k-luci 171系(B6C3品系)。这种品系也呈现对铜宗引发的脱髓鞘作用与髓鞘再生活动的相关成像应答，如图13中所示。7只转基因阳性小鼠以0.2％铜宗处理6周，3只转基因阳性小鼠以正常食物处理6周。所有7只小鼠可耐受0.2％铜宗饮食，且平均体重减轻为15至25％。以铜宗处理(脱髓鞘作用)会有明显成像信号降低。例如，从第0周至第4周降低43％的信号，而从第0周至第6周降低74％的信号。
髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠铜宗模型的组织学确证
对于组织学确证，目的是在生物成像模型中证实，报道基因在铜宗处理期间的应答与铜宗处理的小鼠胼胝体中的结构上可检测的脱髓鞘作用相关。通过勒克司坚牢蓝(LFB)染色显现这些病理现象(参看图20及24)。
具体地，在最初试验中，以0.2％铜宗喂食的MBP 10k-luci 121系(FVB品系)通过勒克司坚牢蓝染色仅测得少量脱髓鞘作用。为了使这些FVB品系小鼠产生明显的组织学脱髓鞘作用，随后使用多种喂食铜宗的制度，以试图避免严重体重减轻。0.2％、0.175％及0.15％铜宗剂量组(6周的研究)每周需要补充3-4次正常食物/转胶，以避免严重体重减轻及毒性。此外，进一步降低铜宗浓度而延长处理时间。测试了铜宗浓度(0.14％、0.12％及0.1％)与处理时间(7周及9周)的研究，最多每周一次正常食物/转胶补充。然而，所有数据显示，在各种喂食铜宗的制度下，FVB品系小鼠(8周龄，体重28.5±3克)具有较少组织学脱髓鞘作用。不选择该FVB系作为这种研究模型初步开发的特别优选实施方案。虽然FVB品系有益于成像，且对铜宗毒性敏感，但是体重减轻可能引入混淆变量，通过使用其它品系，可在这些初步研究中容易地避免该变量。
在其它品系中，MBP 5k-luci 171系(B6C3)小鼠(8周龄，体重25±3克)呈现明显组织学脱髓鞘作用。
在6周0.2％铜宗处理的末期收取小鼠脑部组织。所有7只铜宗处理小鼠在胼胝体区域具有明显脱髓鞘作用，而所有3只对照小鼠在胼胝体区域呈现正常髓鞘形成。这些来自MBP 5K-luci 171系的数据提供了成像信号追随铜宗引发的脱髓鞘作用期的进一步证据。
另外的勒克司坚牢蓝定量分析(图14)证实，在第4周时与B6C3H 171系杂合小鼠(8周龄，体重25.5±3克)相比，髓鞘碱性蛋白荧光素酶B6C3 171系纯合小鼠(8周龄，体重21±3克)呈现更一致及稍微更严重的脱髓鞘作用。在椭圆形的较致密区中显示染色的髓鞘。
此外，喂食0.2％铜宗的C57BI/6品系野生型雄性小鼠(8周龄，体重20±3克)呈现最严重及一致的脱髓鞘作用。将C57 BL/6品系用作在初步研究中描述的铜宗模型及过氧化物酶体增生物活化受体δ试验化合物功效的正对照系。
1.髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠确认过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性激动剂工具化合物对中枢神经***髓鞘再生的正向功效
将髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠用于评价是否可使用这种体内生物成像模型检测过氧化物酶体增生物活化受体δ(PPARδ)激动剂工具化合物('571)对中枢神经***髓鞘再生的功效。
过氧化物酶体增生物活化受体(PPAR)属于核受体超级家族，其功能为调节目标基因表达的转录因子。与其它转录因子相反，核受体的活性可通过与轻易穿透生物膜的对应的小配体亲脂分子结合而调节。尽管核受体家族的细胞信号途径复杂，但是使用核受体作为药物靶标已有漫长成功历史。过氧化物酶体增生物活化受体在细胞分化、发育及代谢的调节中扮演重要角色。迄今为止，已经发现过氧化物酶体增生物活化受体具有三种由单独基因编码的密切相关的同工型，一般称为：过氧化物酶体增生物活化受体α、过氧化物酶体增生物活化受体γ及过氧化物酶体增生物活化受体δ，也称为过氧化物酶体增生物活化受体β(J.Berger and D.E.Miller,Annu.Rev.Med.,2002,53,409-435)。每一受体亚型具有特征脱氧核糖核酸结合域(DBD)及配体结合域(LBD)，二者对于配体活化基因表达是必须的。过氧化物酶体增生物活化受体与类视色素X受体(RXR)结合为异二聚体。
过氧化物酶体增生物活化受体δ似乎在中枢神经***中显著表达；然而，它的许多功能仍未确定。然而，异常有趣的是发现，过氧化物酶体增生物活化受体δ在啮齿动物少突神经胶质细胞(中枢神经***的主要脂质产生细胞)中表达(J.Granneman等.,J.Neurosci.Res.,1998,51,563-573)。此外还发现，过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性激动剂在小鼠培养物中显著增加少突神经胶质细胞的髓鞘基因表达与髓鞘直径(I.Saluja et al.,Glia,2001,33,194-204)。过氧化物酶体增生物活化受体δ敲除小鼠具有整体较小的脑部尺寸，和在白质中降低的髓鞘形成水平(Mol cell Biology 20020:5119)。此外，过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂在多发性硬化的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型中发挥保护效果(Polak et al.,J Neuroimmunology 2005168:65-75)。
先前已经证实，选择性过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂在神经组织中扮演功能性角色，并刺激少突胶质细胞的祖细胞分化。SAR117145为口服可生物利用的可穿透脑的过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性激动剂，在体外以浓度依赖性形式刺激啮齿动物及人类少突胶质细胞的祖细胞分化；能够用过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性拮抗剂阻断这种功效。
在大鼠少突胶质细胞中，髓鞘碱性蛋白表达增加之前为下游过氧化物酶体增生物活化受体靶标Angptl4的信使核糖核酸表达增加，且此上调作用被过氧化物酶体增生物活化受体δ的慢病毒短发夹核糖核酸(shRNA)敲下而阻断。在急性脱髓鞘作用的小鼠铜宗模型中，其中小鼠被喂食2％铜宗饮食达4周，SAR117145增强中枢神经***髓鞘再生，增加Angptl4的信使核糖核酸表达，并增进胼胝体的轴突传导。Angptl4的中枢神经***活化作用伴随腓肠肌表达增加，暗示这可作为潜在替代标志物。这些数据证实，过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂可增强中枢神经***髓鞘再生与增进轴突功能，并暗示它们用于治疗脱髓鞘障碍在刺激内源性修复过程中的潜在用途(US Patent application 20070149580,USE OF PEROXISOMEPROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR DELTA AG0NISTS FOR THETREATMENT OF MS AND OTHER DEMYELINATING DISEASES)。
在B6C3H 171系杂合小鼠中测试了过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具化合物('517；图15)。将8周龄小鼠用含有0.2％铜宗的饮食处理4周，然后给予正常饮食使髓鞘再生。然后将小鼠每日二次口服媒介物(0.6％羧甲基纤维素钠盐与0.5％吐温80)或30毫克/公斤的过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具化合物'517达8日，并在图中指定的时间点图像化。将数据标准化至零周的基线信号。与媒介物组(n＝13)相比，在工具化合物'517组(n＝15)中具有30-100％的相对荧光素酶信号增加，我们认为这归因于少突胶质细胞的祖细胞分化作用的增进。
在相同研究中，通过勒克司坚牢蓝(LFB)染色进一步组织学确认'517的功效(图16)。将来自***固定石蜡包埋的脑部矢状窦旁组织切片用勒克司坚牢蓝染色，用于定性评价胼胝体中的髓鞘。对每一时间点的染色切片进行评分及分级，等级为0(完全髓鞘形成)至5(完全脱髓鞘)。评分***如下：0＝正常髓鞘，无脱髓鞘作用；1＝最小局部脱髓鞘；2＝轻至中度局部脱髓鞘；3＝中度局部广泛性脱髓鞘；4＝严重局部广泛性脱髓鞘；5＝严重扩散性脱髓鞘。在4周铜宗处理后，来自小鼠的勒克司坚牢蓝染色脑切片的组织学评价证实171系杂合小鼠(n＝5)中的胼胝体的中度至严重脱髓鞘作用。工具化合物'517组(n＝5)与媒介物对照组(n＝3)相比，在髓鞘再生期间从第4周至第5周用'517处理导致如通过勒克司坚牢蓝在第7周的时间点所测的可测量的髓鞘增加。尽管实验个体数量少，但是组织学数据支持体内荧光素酶生物成像的数据，显示当与媒介物对照相比时，用'517化合物处理的小鼠的髓鞘再生增加。
171系杂合小鼠的第二项PPARδ517研究显示类似结果(未显示数据，并同样延长’517处理至3周)。与第一项研究(图15)一致，第二项研究也表明，'517在髓鞘再生过程的早期恢复阶段加速少突胶质细胞的祖细胞分化(MLindner and S Heine等,Neuropathology and Applied Neurobiology,34,105-114,2008)。
2.髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠检测***受体β激动剂'5a，或正对照化合物喹硫平对髓鞘表达的保护性功效。
***受体(ER)属于类固醇核受体家族，通过特异性应答元件直接作用于脱氧核糖核酸，并调节基因表达。***受体有两种亚型—***受体α及***受体β。***受体α在子宫、***、卵巢、骨、***及脑中高度表达，而***受体β存在于结肠、***、卵巢、骨髓及脑中。***受体β的选择性靶向作用是具有吸引力的治疗方法，以避免***受体α的副作用。已鉴定出***受体亚型的选择性化合物。
例如，***受体β(非***受体α)激动剂已显示可体外保护少突胶质细胞及成神经瘤细胞免于细胞凋亡。此外，***受体β或***受体激动剂改善实验性自身免疫脑脊髓炎，并具有保护神经功效(保护髓鞘与轴突)。基于先前的过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具化合物'517，在铜宗模型中使用髓鞘碱性蛋白荧光素酶系分析***受体β激动剂'5a。而且，我们囊括AstraZeneca的精神***症药物喹硫平(10毫克/公斤，口服，每日一次)作为正对照，基于喹硫平对铜宗引发的脱髓鞘作用的保护功效(Schizophrenia Research,2008,Dec 106,182-91)。使用B6CH 171系杂合小鼠进行两项独立研究。
第一项研究(图17)显示，***受体β激动剂'5a及正对照喹硫平(QTP)在铜宗模型脱髓鞘作用期间是保护性的。将髓鞘碱性蛋白荧光素酶171系杂合B6C3H小鼠喂食铜宗饮食4周，并口服'5a(10毫克/公斤，n＝12，或30毫克/公斤，n＝16)或喹硫平(10毫克/公斤，n＝14)。将小鼠在第0周(基线)、第3周及第4周图像化。将数据标准化至第0周的基线。与先前研究(图15)类似，媒介物组导致49％(第3周)与45％(第4周)生物成像信号降低。对于第3周及第4周的时间点，在10毫克/公斤，与媒介物对照相比，喹硫平组呈现显著成像信号增加。喹硫平处理组的结果与Zhang等人发表的数据一致(Schizophrenia Research,2008,Dec 106,182-91)。30毫克/公斤的化合物'5a在第4周显示超过媒介物的显著增加，但10毫克/公斤的化合物'5a在第3周或第4周与媒介物无显著差别。这些结果表明，髓鞘碱性蛋白荧光素酶成像模型可用于评价在铜宗模型中的剂量依赖性保护功效。
设计进一步研究(图18)，以确认第一项研究的结果(图17)，但是媒介物及30毫克/公斤'5a化合物处理组具有更大的组群。与第一项研究结果一致，当与媒介物处理对照组(n＝25)相比时，用10毫克/公斤喹硫平处理的小鼠(n＝17)产生对铜宗引发的信号降低的统计上显著的抑制作用，时间点为第3周(25％对比47％降低，p＝0.028)及第4周(6％增加对比25％降低)。此外，与媒介物对照组相比，30毫克/公斤的'5a(N＝27)造成显著较强的转基因活性，时间点为第3周(31％对比47％降低，p＝0.0079)及第4周(6％降低对比25％降低，p＝0.0015)。
这两项研究证实，30毫克/公斤的'5a明显防止在中枢神经***中由铜宗饮食引发的生物成像信号降低，尽管未达到与10毫克/公斤的正对照喹硫平相同的程度(在这些实验中使用的条件下)。由于先前的研究已经证实了在中枢神经***髓鞘形成程度与髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物成像信号之间的直接关系，这些目前的结果表明，'5a及喹硫平都防止在铜宗饮食给药期间中枢神经***的脱髓鞘作用。成像模型的数据支持'5a及喹硫平都减弱铜宗引发的脑部脱髓鞘作用与髓鞘破坏。
3.在铜宗模型中髓鞘碱性蛋白荧光素酶系的比较
制成在各种品系背景上的6个转基因系，用于不同的生物成像应用。
比较在铜宗模型中B6C3H 171系纯合及杂合小鼠的成像信号(图19)。纯合子中的两个报道基因拷贝在脱髓鞘作用期呈现超过2倍的信号降低，及在髓鞘再生期呈现2倍信号增加。尽管已经证实，杂合171系(B6C3H品系)在铜宗模型中起作用并可检测化合物功效，但是预期可通过繁殖成纯合体型而进一步改善模型以增强生物成像信号强度。由于可将小鼠群落维持为纯合子，这也简化模型生产，并降低基因分型成本。此外，成像窗越大，模型检测化合物引发的变化就越灵敏。
图20显示在铜宗模型中来自三个不同系的组织学勒克司坚牢蓝数据的比较。定量勒克司坚牢蓝数据证实了171系B6C3H的生物成像结果，纯合小鼠呈现最严重的铜宗引发的脱髓鞘作用；严重度类似于对通常使用的野生型C57BL/6小鼠品系所观察到的严重度。171系杂合小鼠呈现较不严重的脱髓鞘作用，而这些171系杂合小鼠呈现最少量的铜宗引发的脱髓鞘作用。
在图21中证实，具有最大生物成像信号降低的髓鞘碱性蛋白荧光素酶系也具有最大脱髓鞘作用，如通过组织学评价。通过生物成像及勒克司坚牢蓝(LFB，髓鞘染色)组织学比较三种不同髓鞘碱性蛋白荧光素酶系(171系B6C3H杂合品系、121系C57BL/6杂合品系及171系B6C3H纯合品系)。将小鼠用含有0.2％铜宗的饮食处理4周或5周。将成像数据标准化至第0周的基线测量值。在每一研究结束时，收取小鼠脑并将连续石蜡切片用勒克司坚牢蓝针对髓鞘染色。平均定性的勒克司坚牢蓝评分(0至5)显示在图21的图表中。171系B6C3H纯合小鼠呈现最大成像信号降低，也证实最严重脱髓鞘作用，如通过定性组织学分析所评价。171系B6C3H杂合小鼠呈现最小成像窗，也在第4周呈现最少组织学脱髓鞘作用。参考在喂食铜宗饮食之前的基线成像，171系B6C3H纯合小鼠在喂食铜宗饮食期间具有最大生物成像信号降低。例如，在铜宗饮食3周后，171系B6C3H纯合小鼠具有72％信号降低(第3周参考第0周，p<0.05)，而171系B6C3H杂合小鼠具有45％生物成像信号降低(参考第0周，p<0.05)。121系C57BL/6杂合小鼠具有最小降低的荧光素酶信号(第3周相对于第0周降低33％，p<0.05)。
通过用喹硫平(10毫克/公斤)处理171系B6C3H纯合小鼠，进一步证实髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的灵敏度及应答性，显示在图22中。与使用171系B6C3H杂合小鼠的结果(图17及18)一致，喹硫平(10毫克/公斤)显著防止生物成像信号降低。基于这些结果，将171系纯合小鼠认定为用于铜宗引发的脱髓鞘作用生物成像模型的最佳系。
4.髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的其它应用
髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠具有脑部与脊髓荧光素酶的表达。如图23中所示，发光信号主要来自脑部与脊髓的白质区。除了已经成功示范用于铜宗模型的来自脑部的荧光素酶成像之外，来自脊髓的荧光素酶成像信号可用于多发性硬化的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型中，或应用为脊髓模型。
Claims (10)
1.监测在活体生物中脱髓鞘作用或髓鞘再生的方法，所述方法包括：
转基因修饰所述生物，以表达通过髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子驱动的荧光素酶基因；
监测来自所述生物的生物发光；及
将所述光输出与所述生物的身体的特定部分相关联。
2.转基因生物，其含有通过髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子驱动的荧光素酶基因。
3.如权利要求2的转基因生物，其中所述生物为小鼠。
4.表达荧光素酶基因的转基因生物，所述荧光素酶基因在髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子的控制之下。
5.如权利要求4的转基因生物，其中所述髓鞘碱性蛋白启动子包含M1至M4或M1至M3。
6.开发生物成像品系的方法，包括：
(1)选择一个系，其中在出生后髓鞘形成高峰时的体内全小鼠成像呈现中枢神经***特异性成像；
(2)选择一个系，其中体外成像确认荧光素酶转基因表达主要在脑或脊髓的白质区；
(3)选择一个系，其中荧光素酶图像强度与在脱髓鞘作用模型中引发的脱髓鞘作用及髓鞘再生的变化高度相关；及
(4)选择一个系，其作为模型呈现清楚的组织学脱髓鞘作用。
7.如权利要求6的方法，其中所述出生后髓鞘形成的高峰是约3-5周的第一代小鼠。
8.如权利要求6的方法，其中所述模型是铜宗脱髓鞘作用模型。
9.监测髓鞘形成的改良方法，所述改良包括成像表达髓鞘碱性蛋白荧光素酶的转基因动物。
10.降低髓鞘形成研究中的差异性的方法，所述方法包括在至少两个不同的时间点监测动物中的髓鞘碱性蛋白控制的荧光素酶。
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