KR101510252B1 - 배추 유래 광 파장 특이적 ＢｒＥＸＰＡ１ 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

배추 유래 광 파장 특이적 ＢｒＥＸＰＡ１ 프로모터 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배추 유래 광 파장 특이적 BrEXPA1 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 배추로부터 분리한 BrEXPA1(brassica rapa a-expansin 1) 프로모터는 목적 유전자를 식물의 전체 조직에서 발현시키면서 동시에 광 파장에 따라 발현이 달라지므로 LED 광원의 다양한 광 파장을 이용한 작물의 성장 조절에 활용할 수 있다.

Description

배추 유래 광 파장 특이적 ＢｒＥＸＰＡ１ 프로모터 및 이의 용도{Specific light wavelength BrEXPA1 promoter from brassica rapa and uses thereof}
본 발명은 배추로부터 분리한 광 파장 특이적 BrEXPA1 프로모터 및 BrEXPA1 프로모터를 포함하는 형질전환 식물체를 제작하는 기술에 관한 것이다.
프로모터(promoter)는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.
광 파장별 발현 유도 활성을 지닌 프로모터를 개발하는 것은 매우 중요하다. 예를 들어, 이종 유전자가 광 파장에 따라 특이적으로 발현되기를 원하는 경우, 관심있는 이종 유전자를 타겟 조직에 광 파장 특이 발현 활성을 지닌 프로모터에 작동 가능하게 연결시킨 재조합 발현 벡터를 제작하여 식물에 도입하면, 타겟 조직 내에서 관심 있는 이종 유전자의 광 파장에 대하여 특이적으로 발현이 가능하다. 이종 유전자의 광 파장별 특이적인 발현 식물에 변형된 특성을 나타내도록 할 수 있기 때문에 연구, 식물공장 적용 및 원예 산업 분야에서 중요한 가치를 지닌다.
이에, 본 발명자들은 배추로부터 광 파장에 따라 특이적으로 발현하는 프로모터를 탐색하였으며, BrEXPA1 프로모터가 광 파장의 종류에 따라 발현이 다른 것을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 배추 유래 광 파장 특이적 BrEXPA1(Brassica rapa a-expansin 1) 프로모터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 상기 BrEXPA1 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 BrEXPA1 프로모터를 포함하는 광 파장 특이적 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 광 파장 특이적 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 광 파장에 따라 특이적으로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 배추 유래 광 파장 특이적 BrEXPA1(brassica rapa a-expansin 1) 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 상기 BrEXPA1 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 BrEXPA1 프로모터를 포함하는 광 파장 특이적 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 광 파장 특이적 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 광 파장 특이적 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 재조합된 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 광 파장에 따라 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 배추 유래 광 파장 특이적 BrEXPA1(Brassica rapa a-expansin 1) 프로모터는 목적 유전자를 식물의 전체 조직에서 발현시키면서 동시에 광 파장에 따라 발현이 달라지므로 LED 광원의 다양한 광 파장을 이용한 작물의 성장 조절에 활용할 수 있다.
도 1은 BrEXPA1 프로모터 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 BrEXPA1 프로모터를 포함하고, BrEXPA1 프로모터에 의해 리포터 유전자 GUS가 조절 받고 항생제 선별유전자로 카나마이신 저항성 유전자를 포함하는 벡터의 모식도이다.
도 3은 BrEXPA1 프로모터를 포함하는 벡터로 형질전환된 애기 장대의 생장 단계별 BrEXPA1 프로모터 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다:
0d부터 30d: 형질전환 애기장대의 종자 발아 전에서 발아 후 30일째 애기장대.
도 4는 BrEXPA1 유전자의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대의 조직별 GUS 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다: A 잎의 모용(trichome), B 잎, C와 D 뿌리의 정단분열조직, E 화아(flower bud), F 약(anther), G 잎의 끝조직, 및 H 정단분열조직 및 하배축 뿌리 연결부위.
도 5는 BrEXPA1 유전자의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대에 백색광, 초적색광, 적색광, 청색광 및 암상태 처리 후 BrEXPA1 유전자의 발현을 확인한 도이다.
도 6은 배추 유래 BrEXPA1 프로모터 도입한 애기장대 형질전환체에서의 광 파장별 처리 후 시기별 GUS 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다: 형질전환 애기장대의 종자 발아 전에서 발아 후 7일째 애기장대.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 배추 유래 광 파장 특이적 BrEXPA1(brassica rapa a-expansin 1) 프로모터를 제공한다.
상기 유전자는 배추로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 상기 BrEXPA1 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 BrEXPA1 프로모터를 포함하는 광 파장 특이적 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 광 파장 특이적 발현 벡터는 리포터 유전자인 GUS가 융합된 식물 형질전환용 벡터 pLSI04이며 도 2에 나타내었다.
본 발명의 광 파장 특이적 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 광 파장 특이적 발현 벡터는 카나마이신 항생제가 포함되어 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 광 파장 특이적 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
상기 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa 또는 Brassica campestris) 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 광 파장 특이적 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 재조합된 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 광 파장에 따라 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa 또는 Brassica campestris) 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 배추 BrEXPA1 프로모터 영역 분리 및 염기서열 분석
배추 유래의 알파-익스패신(alpha-expansin) 계열 유전자 중 하나인BrEXPA1(Brassica rapa a-Expansin 1) 유전자의 프로모터 영역을 분리하여 염기서열을 분석하였다.
구체적으로, 배추 유묘의 광 파장별 처리 후 마이크로어레이(microarray) 분석 결과 BrEXPA1 유전자는 백색광(자연광에 가까움)을 기준으로 청색광, 적색광에서 더 강하게 발현됨을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로 배추 BAC 클론 이용 배추의 BrEXPA1 프로모터 영역(-1.5 kb)을 찾은 후 염기서열 정보 분석을 하였으며, 이 프로모터 영역은 광과 관련한 6개의 빛 반응 도메인(light responsive domain, 3-AF1, G-box, Gap-box, HD-ZIP3, Box I, Box4) 을 가지고 있음으로 배추의 BrEXPA1 유전자는 광과 관련이 있는 것을 확인하였다.
배추 BAC 클론 이용 BrEXPA1 프로모터 영역(-1.5 kb) 분리하기 위하여 특이적 프라이머를 제작하여 하기 표 1에 나타내었다. 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 유전자 증폭반응(PCR: polymerase chain reaction)을 통해 배추 BAC 클론(KBrH012E04)으로부터 서열번호 1의 BrEXPA1 프로모터(-1.5 kb) 분리하였다(도 1).
구체적으로, 배추로부터 분리한 2 ㎍ RNA는 MMLV 역전사효소 (RNaseH free)를 이용하여 1 ㎍ oligo(dT)18 프라이머를 첨가한 후 총 용량은 30 ㎕로 맞추어 역전사 반응을 유도하였다. 합성된 cDNA 시료는 1:3으로 희석한 후 1 ㎕를 이용하여 총 25 ㎕으로 맞춘 후 PCR 중합연쇄반응(PCR 조건: 95℃ 5분 1 사이클, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 45초 35 사이클, 72℃ 10분 1 사이클)에 이용하였다. PCR 반응에 의해 생성된 생성물은 5 ㎕를 이용하여 전기영동 후 브롬화 에티듐(ethidium bromide)으로 염색하여 확인하였다. 모든 PCR 생성물은 pGEM-T-Easy 벡터에 클로닝하였으며, DNA 서열에 의해 배추 유래 BrEXPA1 프로모터 여부를 확인하였다.
서열번호 이름 서열
2 BrEXPA1-Pro-Forward 5'-cttcatcatcaaacacatgtaacaa-3'
3 BrEXPA1-Pro-Reverse 5'-catcttgttataacctgcacatagg-3'
< 실시예 2> 식물형질전환용 벡터 작성 및 형질전환체 제작
<2-1> 식물형질전환용 벡터 제작
상기 실시예 1에서 분리한 BrEXPA1 프로모터는 pGEM-T-Easy 벡터에 삽입시킨 후 EcoRI으로 절단 후 EcoRI으로 절단된 pCAMBIA1391Z에 삽입시켰다. BrEXPA1 프로모터에 리포터 유전자인 GUS가 융합된 식물 형질전환용 벡터 pLSI04를 작성하였다(도 2).
<2-2> 형질전환체 제작
상기 실시예 2-1에서 제작한 식물 형질전환용 벡터 pLSI04를 애기장대에 도입하기 위하여 아그로박테리움 투메페시안스 GV3101를 이용하였다.
구체적으로, 실시예 2-1에서 제작한 식물 형질전환용 벡터인 pLSI04는 아그로박테리움 투메페시안스 GV3101에 얼리기와 녹이기를 2-3번 반복한 후 37℃의 히트 샥(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 항생제 카나마이신 50 mg이 포함된 YEP 배지에서 콜로니를 확인하였다. 형질전환된 GV3101 균주를 이용하여 야생형 애기장대 Col-o(Arabidopsis thaliana ecotype Col-o)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 22℃ 생장상(16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시킨다. 4 주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도한다. 벡터 도입이 확인된 아그로박테리움을 카나마이신 50 ㎎/ℓ, 리팜피신 10 ㎎/ℓ, 겐타마이신 40 ㎎/ℓ가 함유된 LB 배지에 접종하여 28℃에서 3-4일 정도 배양한다. 완전히 자란 아그로박테리움을 원심분리하여 침전시킨 5% 수크로스와 0.05% silwet77이 함유된 용액에 O.D=0.8 정도로 희석하여 현탁액을 제조하였다. 상기 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 22℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 상기와 동일한 방법으로 형질전환을 반복하였다. 이 후, 22℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리 (silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 30 ㎍/㎖ 하이그로마이신이 포함된 MS 배지에 파종하여 형질전환체 선발한 후 선발된 형질전환체로부터 GUS염색을 통한 BrEXPA1 프로모터의 발현 양상 분석하였다.
그 결과, 애기장대로의 형질전환 유도 및 BrEXPA1 프로모터(-1.5 kb)에 리포터 유전자 GUS가 융합된 벡터가 도입된 애기장대 형질전환체 확보하였다.
< 실험예 1> 형질전환 식물체의 생장발달 단계별 BrEXPA1 프로모터 활성 분석
생장 발달 단계에서 리포터 유전자 GUS 발현을 통한 BrEXPA1 유전자 프로모터의 활성을 분석하였다.
구체적으로, 형질전환 애기장대들 중에서 4개의 라인(line)을 선발하여 유묘 및 발달 단계에서 GUS 염색을 통한 BrEXPA1 프로모터의 발현 양상을 확인하였다.
그 결과, 종자 발아 후 1일부터 GUS 발현이 나타나기 시작하여 30일까지 하배축(hypocotyl)을 포함한 정단분열조직(apical meristem), 뿌리 및 잎 전체와 하배축과 뿌리 연결 부위에서 GUS가 강하게 발현되는 것을 확인하였다(도 3).
< 실험예 2> 형질전환 식물체의 조직별 BrEXPA1 프로모터 활성 분석
BrEXPA1 유전자의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대에서 조직별 GUS 발현을 분석하였다.
구체적으로, 배추 BrEXPA1 유전자의 프로모터가 식물체 내에서 유전자 발현을 특이적으로 유도하는지 확인하기 위하여 배추 BrEXPA1 프로모터가 삽입된 재조합 발현 벡터로 형질전환된 애기장대의 생장 발달 단계와 각 조직에서 GUS 유전자 발현 양상을 분석하였다. 즉, 상기 실시예 2에서 형질전환된 애기장대로부터 독립된 3개 라인을 선발하여 수확한 종자를 일부는 MS배지에서 발아시켜 유묘의 발달단계에서 GUS(청색 발색 유전자) 발현 양상을 관찰하였다. 상기 발아시킨 유묘를 GUS 분석 버퍼(20 mMX-gluc(cyslohexyl ammonium salt), 100mM NaH2PO4 ·H2O, 10mM NaEDTA, 0.1% 프립톤-X-100, pH 7.5)에 침지하고 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올로 클로로필(chlorophyll)을 완전히 제거하여 GUS 유전자 발현 양상을 실체현미경(Olympus, SZX12)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, BrEXPA1 프로모터에 의한 GUS 발현은 잎의 모용(trichome)에서 발현 되었고(도 4A), 잎의 주맥(midrib)을 따라 잎맥(vein) 뿐만 아니라 잎 전체에서도 강하게 발현되었으며(도 4B), 뿌리의 정단분열조직(도 4C 및 4D)과 화아(flower bud)의 약(anther)에서도 GUS가 강하게 발현되었고(도 4F), 유묘 발달 시 잎맥(vein), 잎의 끝 조직과 정단분열조직 및 하배축과 뿌리 연결 부위에서 GUS가 강하게 발현되는 것을 확인하였다(도 4G 및 4H). 따라서 BrEXPA1 프로모터는 생장 발달 시기 동안 조직 특이적으로도 유전자 발현을 유도하는 특이적 프로모터로 확인되었다.
< 실험예 3> BrEXPA1 프로모터가 도입된 형질전환 식물체에 광 반응 분석
<3-1> 배추 유묘의 광 파장별 처리 후 BrEXPA1 유전자의 발현 패턴 분석
광 파장별 처리 후 마이크로 어레이(microarray)에 의한 분석과 RT-PCR에 의해 BrEXPA1 유전자는 백색광(자연광에 가까움)에 비해 적색광 및 청색광에서 더 강하게 발현됨을 확인하였으며, 초적색광과 암상태에서는 약하게 발현되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 광 파장별 처리 유묘로부터 분리한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, BrEXPA1 특이 프라이머 [BrEXPA1(F): 5'-GTCTTGTCGGCTTCTTGCTT-3'(서열번호 4) BrEXPA1(R): 5'-CTATATCTGTGCGCCGGTGA-3'(서열번호 5)를 이용하여 역전사 유전자 증폭반응(RT-PCR:reverse transcription polymerase chain reaction)에 의해 발현을 확인하였다(도 5).
<3-2> 애기장대 형질전환체 이용 광 파장별 처리 후 GUS 발현 비교
애기장대 형질전환체 이용 광 파장별(백색, 적색, 청색, 초적색광 및 암상태) 처리 후 백색강을 기준으로 GUS 발현 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 형질전환된 애기장대로부터 독립된 3개 라인을 선발하여 수확한 종자를 MS배지에서 발아시켜 LED 챔버(chamber)(백색, 적색, 청색, 초적색광 및 암상태)에서 배양하였으며, 유묘의 발달단계에서 시기별(1, 3, 5, 7일)로 샘플링 후 GUS 발현 분석을 하였다.
그 결과, 백색광(white) 처리시 1일째는 GUS가 발현되지 않았으며, 3일째부터 5, 7일까지 자엽, 하배축, 뿌리에서 GUS가 발현되었고, 청색광(blue)과 적색광(red) 처리 후 1일째부터 GUS가 발현되었으며, 3일째는 자엽과 뿌리 및 하배축과 뿌리 연결 부위에서 GUS가 강하게 발현되었으며 5일 및 7일째에도 자엽과 뿌리에서 강하게 발현되었다. 또한, 초적색광(far-red) 처리시에는 1일째부터 GUS가 발현되었으나, 자엽과 뿌리에서 약하게 발현되었고, 암상태(dark)에서 1일째는 GUS가 발현되었으나 3일째부터 7일째까지 거의 발현되지 않았으며, 배추 유래 BrEXPA1 유전자는 적색광과 청색광 처리 시에 백색광에 비해 발현량이 약간 많았으며, 초적색광과 암상태에 비해서는 발현량이 더 많은 것을 확인하였다(도 6).
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Specific light wavelength BrEXPA1 promoter from brassica rapa and uses thereof <130> P131134 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1500 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 gaagaagatc ctcacaagtt agatacttca tcatcaaaca catgtaacaa ttttttcttt 60 tgtcattaag taatttattt tatgtacttt agcgacattg ttcacaaaac aaggcacgac 120 tgctgatagt acatagtttt gatagctttt aaacagatat aattattaag atggctacag 180 atcgaaatgt agattgagga aaacgaacga caaagctata cgtttcgtga tacatcgaac 240 tcaaagcaga ccactttgtg acccacttgg attccaactt gaattttttt tgtcttcatt 300 ttattttcgg gattttcttt tctttccttt ccttctattt actattgaat gacaaattcc 360 ataactattt acatcaagca tagcaaatgc aatttttaca cgacctaata tttactagtt 420 tatatatctt aattttatat tgatagaata aatctatttt ccaactgaaa ttgatgtcta 480 aaagcattta tattcttaaa atattcttat acaaaatatc agtattaaga tgtaatataa 540 ctatttaatt aatttttaac taataaaaat acaatgaatt acctaataaa aatacaatca 600 attataaagt tatatgtgta aactgaatct cgaaatattc aaataagata tccttggcaa 660 tggtaagagt gttacatgaa tctctcaaaa taaaaataaa ataaaagcga aattatattc 720 tttttttttg aaacttaatg cgaaattata ttcattcact ttatttttaa acatgtagga 780 attttatgtt gcatgacttt ttttttaatt gctttgactt tgtatttgaa atttaatcaa 840 aaactaaacg atattagtat tataccacat aagatagttt agtggtaaac tatatcaatg 900 ttgatggttt gagtatctcg gtgagatgtt tcaaatggag aagctagacg cctcgccaaa 960 agaaaacaca cgacccgtct tgaagctaac atgtgtcttt gcctctttgc tttttcatgc 1020 cattaaatat tattacgact tcggcggttt ttggtcccaa caataaaata actcttttac 1080 tctaccccgt tcattatagt tacatttaat aatcccaata tttttaaaat gtgggaaaaa 1140 acgaaaaaaa gaaagaaata gcatttcggc cttgatttaa ttgaaaagaa aataataatg 1200 aattgaaaat gagtgcatgg tagttgcata taaaccagtg gctgaaacgt aaatttccac 1260 tcactatgtt tttctatata ttgaactact gcctcctctg ttttttccaa ttctaaacca 1320 aacaacacat tcacataatc atctctcttt ctttcctctt taagaaagga acaaagttca 1380 aagcttccaa gtaatcattt cctctctatc tctcacatac acattactag tttaagatcc 1440 tttcatctcc ttctagaaac tgatcaatct tattacctat gtgcaggtta taacaagatg 1500 1500 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrEXPA1-Pro-Forward <400> 2 cttcatcatc aaacacatgt aacaa 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrEXPA1-Pro-Reverse <400> 3 catcttgtta taacctgcac atagg 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrEXPA1(F) <400> 4 gtcttgtcgg cttcttgctt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrEXPA1(R) <400> 5 ctatatctgt gcgccggtga 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 배추 유래 광 파장 특이적 BrEXPA1(Brassica rapa a-expansin 1) 프로모터.
  2. 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 제 1항의 BrEXPA1 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제 1항의 BrEXPA1 프로모터를 포함하는 광 파장 특이적 발현 벡터.
  4. 제 3항의 광 파장 특이적 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa 또는 Brassica campestris) 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  6. 1) 제 4항의 광 파장 특이적 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 재조합된 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 광 파장에 따라 특이적으로 발현시키는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa 또는 Brassica campestris) 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 광 파장에 따라 특이적으로 발현시키는 방법.


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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20120107113A (ko) * 2009-12-17 2012-09-28 사노피 수초 염기성 단백질 프로모터(ｍｂｐ-ｌｕｃｉ)의 조절 하에 루시페라제를 발현하는 동물 모델 및 생물발광 생체내 영상화를 위한 상기 동물 모델의 용도

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