KR20120106774A - 동시 당화 발효 반응의 효율을 향상시키는 방법 - Google Patents

동시 당화 발효 반응의 효율을 향상시키는 방법 Download PDF

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크리스티나 구티에레즈
콜린 미친슨
톰 티 황
브루스 에이 디너
폴 조셉 페이건
윌리엄 디 히츠
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

본 발명은, 동시 당화 발효 반응에서, 제1 태양에서 전화 베타-자일로시다아제 효소를 사용하여 부산물 형성을 감소시키고 발효 생성물의 수율을 증가시키는 것에 관한 것이며, 이외에도, 제2 태양에서 유지 베타-자일로시다아제 효소를 사용하여 알킬-베타-자일로피라노사이드 화합물의 생성을 향상시키는 것에 관한 것이다.

Description

동시 당화 발효 반응의 효율을 향상시키는 방법{METHODS FOR IMPROVING THE EFFICIENCY OF SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION AND FERMENTATION REACTIONS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2010년 12월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/289,917호의 이득을 청구하며, 상기 미국 가특허 출원은 전체적으로 참고로 포함된다.
일반적으로 본 발명은 동시 당화 발효 반응으로부터의 생성물 수율을 향상시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
액체 연료의 대안으로서의 역할을 할 수 있는 알코올 (예를 들어, 에탄올 또는 "바이오에탄올")이 생성되도록 후속적으로 발효되는 발효성 당으로의 재생성 리그노셀룰로오스계 바이오매스(biomass)의 생물변환은, OPEC가 석유 생산량을 감소시켰기 때문에 오일 위기가 일어났던 때인 1970년대 이래로 연구자들의 집중적인 관심을 끌었다 (문헌[Bungay, "Energy: the biomass options". NY: Wiley; 1981]; 문헌[Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Enzyme Microb. Technol. 18:312-31]; 문헌[Zaldivar et al., 2001, Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:17-34]; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:618-28]). 에탄올은 지난 20년간 미국에서 가솔린에 대하여 10% 블렌드로서 또는 브라질에서 차량용 순 연료로서 널리 사용되어 왔다. 연료용 바이오에탄올의 중요성은 오일의 가격 급등 및 그의 공급원의 점진적인 고갈과 병행하여 증가할 것이다.
리그노셀룰로오스계 바이오매스는 세계의 증가 중인 에너지에 대한 필요성에 유의하게 대처하기에 충분히 큰 규모로 바이오연료(예를 들어, 바이오에탄올)의 지속가능한 생산을 지원할 수 있는 저가의 재생성 자원인 것으로 예측된다. 리그노셀룰로오스계 물질은 제한 없이, 옥수수의 줄기와 잎(옥수수 식물체에서 낟알 및 뿌리를 제외한 것), 임학적 잔여물, 예를 들어 톱밥 및 종이, 도시 고형 폐기물로부터의 야드 폐기물, 초본 식물, 예를 들어 스위치그래스(switchgrass) 및 목본 식물, 예를 들어 포플러 나무를 포함한다. 리그노셀룰로오스계 바이오매스는 3가지 주요 성분, 즉 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스 및 리그닌을 갖는다. 헤미셀룰로오스는 일반적으로 주로 5가지의 당(아라비노스, 갈락토스, 글루코스, 만노스 및 자일로스)로 구성된 무정형, 분지형 중합체이다. 셀룰로오스는 평행 사슬들 사이의 수소 결합으로 인하여 고도 결정성 구조로 전형적으로 함께 연결된 글루코스 분자의 큰 선형 중합체이다. 리그닌은 복합 페닐-프로판 중합체이다.
리그노셀룰로오스계 바이오매스의 생물학적 프로세싱은 전형적으로 가수분해 반응에 의해 각각 헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스로부터 당을 방출시키기 위하여 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제를 사용하는 것을 포함한다. 이어서 생성된 당은 적합한 발효 미생물을 이용하여 바이오에탄올과 같은 바이오연료로 발효된다.
셀룰라아제에 의해 셀룰로오스가 분해될 때 방출되는 글루코스는 흔히 이러한 부류의 효소의 강한 저해제일 수 있다. 셀룰로오스 분해 (또는, 본 명세서에서 "당화") 동안의 글루코스 축적의 감소를 위하여, 발효 미생물을 첨가하여 당이 당화로부터 나타남과 동시에 방출된 당을 바이오에탄올로 전환시킬 수 있다. 이러한 구성은 동시 당화 발효(simultaneous saccharification and fermentation; "SSF")로 불리운다. 일반적으로, SSF는, 분리 당화 가수분해 발효(separate hydrolysis and fermentation; "SHF") 구성보다 더 우수한/더 높은 속도, 수율 및 농도의 생산된 에탄올을 제공하며, 이는 이들 발효 공정에 연루된 대부분의 효소에 대해 최적인 것보다 더 낮은 온도에서 작동함에도 불구하고 그러하다. 그럼에도 불구하고, 전형적인 SSF 반응은 온당한 에탄올 농도의 성취를 위하여 극도로 길고 지속적일 수 있으며, 예를 들어 수일일 수 있다 (예를 들어, 문헌[Kadam et al., 2004, Biotechnol. Progr. 20(3):705] 참조).
따라서, SSF 반응의 효율을 개선시키고 바이오연료, 예를 들어 바이오에탄올의 수율을 증가시키기 위한 방법 및 그에 관련된 조성물을 확인할 필요성이 당업계에 존재한다.
개요
본 발명은 동시 당화 발효("SSF") 반응에 있어서 소정의 β-자일로시다아제가 존재하면 알킬-β-자일로피라노사이드 부산물이 급속하게 축적된다는 발견을 기반으로 한다. 특히, SSF 반응에 사용될 때, 유지하는 작용 메커니즘을 갖는 소정의 β-자일로시다아제는 발효 생성물의 수율을 감소시키는 알킬-β-자일로피라노사이드 부산물의 급속 축적으로 이어질 수 있음을 발견하였다. 추가로 본 발명은 SSF 반응에 있어서 전화하는 작용 메커니즘을 갖는 소정의 다른 β-자일로시다아제의 존재가 알킬-β-자일로피라노사이드 부산물의 축적을 감소시키거나 최소화할 수 있다는 발견을 기반으로 한다. SSF 반응에 있어서 전화하는 작용 메커니즘을 갖는 β-자일로시다아제의 포함은 발효 생성물의 수율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 목적상, 전화하는 작용 메커니즘을 갖는 β-자일로시다아제는 "전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소", "전화 β-자일로시다아제", 또는 "전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드"로도 칭해진다. 역으로, 유지하는 작용 메커니즘을 갖는 β-자일로시다아제는 "유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소", "유지 β-자일로시다아제" 또는 "유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드"로도 칭해진다.
따라서, 유지 β-자일로시다아제의 양의 감소를 수반하는 SSF 반응을 행하는 개선된 방법이 본 발명에서 제공된다. 전화 β-자일로시다아제의 양의 증가를 수반하는 SSF 반응을 행하는 개선된 방법이 또한 본 발명에서 제공된다. 유지 β-자일로시다아제의 양의 감소 및 전화 β-자일로시다아제의 양의 증가를 수반하는 SSF 반응을 행하는 개선된 방법이 본 발명에서 추가로 제공된다. 상기에 기재된 개선된 방법 및 본 명세서에 개시된 기타 방법에 관련된 조성물이 또한 고려된다.
소정의 태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제 및 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 적어도 하나의 효소를 포함하는 완전 발효 배지를 발효 생성물의 형성에 적합한 기간 동안 그리고 그러한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 SSF 방법을 제공한다.
본 발명에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 하나 이상의 효소 (또는 본 명세서에서 대안적으로 그리고 상호교환가능하게 "적어도 하나의 효소"로 기술됨)는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 상기 하나 이상의 효소가 결여된 대조 발효 배지와 비교하여 단쇄 알킬-β-자일로피라노사이드("AXP")(예를 들어, 메틸-β-자일로피라노사이드("MXP"), 에틸-β-자일로피라노사이드("EXP"), 프로필-β-자일로피라노사이드("PXP"), 또는 부틸-β-자일로피라노사이드("BXP")) 형성을 감소시키기에 유효한 양으로 상기 완전 발효 배지에 존재할 수 있다. 예를 들어, 이러한 효소(들)는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 상기 하나 이상의 효소가 결여된 대조 발효 배지의 것과 비교하여, (a) AXP 형성량을 20% 이상만큼, 30% 이상만큼, 40% 이상만큼, 50% 이상만큼, 60% 이상만큼, 70% 이상만큼, 또는 80% 이상만큼 감소시키고/시키거나 (b) 발효 생성물(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 프로판-1,3-다이올 또는 부탄올과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 알코올)의 수율을 (예를 들어, 0.1% 이상만큼, 0.5% 이상만큼, 0.7% 이상만큼, 1% 이상만큼, 2% 이상만큼, 3% 이상만큼, 5% 이상만큼, 7.5% 이상만큼 또는10% 이상만큼) 증가시키기에 유효한 양으로 존재한다. 소정의 실시 형태에서, 이러한 효소(들)는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 상기 하나 이상의 효소가 결여된 대조 발효 배지의 것과 비교하여, AXP 형성량을 반응 평형에서의 AXP 수준의 50% 이내, 40% 이내, 30% 이내, 20% 이내 또는 10% 이내에서 더 높은 수준으로 감소시키기에 유효한 양으로 존재한다.
소정의 태양에서, 발효 미생물은 적어도 하나의 발효성 탄소원으로부터 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 프로판-1,3-다이올, 또는 부탄올을 생산할 수 있다. 소정의 태양에서, 발효 미생물은 박테리아, 예를 들어 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 또는 진균류, 예를 들어 효모 또는 사상균이다.
소정의 태양에서, 상기 적어도 하나의 전화 β-자일로시다아제는 GH43 패밀리 효소이다. 소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제는 Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A, 또는 XynB3 폴리펩티드로부터 선택된다. 구체적으로, Fv43D 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 2에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Pf43A 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 8에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Fv43E 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 10에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Fv43B 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 12에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 12의 잔기 17 내지 574에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Af43A 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 14에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 14의 잔기 15 내지 558에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Fo43A 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 24에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Gz43A 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 22에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. XynB3 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 25에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다.
소정의 태양에서, 상기 완전 배지 중 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드의 양은 완전 발효 배지의 성분이기도 한 상기 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 약 0.2 ㎎ 이상, 약 0.3 ㎎ 이상, 약 0.4 ㎎ 이상, 약 0.5 ㎎ 이상, 약 0.7 ㎎ 이상, 약 1 ㎎ 이상, 약 2 ㎎ 이상, 또는 약 3 ㎎ 이상이다. 다른 태양에서, 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드의 양은 상기 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 약 3 ㎎ 이하, 약 2 ㎎ 이하, 약 1.5 ㎎ 이하, 약 1.0 ㎎ 이하, 약 0.7 ㎎ 이하, 약 0.5 ㎎ 이하, 약 0.4 ㎎ 이하, 약 0.3 ㎎ 이하, 또는 약 0.2 ㎎ 이하이다. 소정의 태양에서, 상기 완전 배지 중 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드의 양은 상기 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 예를 들어 (a) 0.4 ㎎ 내지 10 ㎎, (b) 0.5 ㎎ 내지 2 ㎎, (c) 0.4 ㎎ 내지 5 ㎎, (d) 0.5 ㎎ 내지 1.5 ㎎, (e) 1 ㎎ 내지 2 ㎎, (f) 0.3 ㎎ 내지 3 ㎎, (g) 0.2 ㎎ 내지 5 ㎎, (h) 0.3 ㎎ 내지 5 ㎎, 또는 (i) 0.3 ㎎ 내지 10 ㎎의 범위이거나, 또는 상기 양은 상한치 및 하한치가 전술한 값으로부터 각각 독립적으로 선택되는 범위 이내이다.
소정의 태양에서, 상기 완전 발효 배지 중 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드(들)의 양은 몰 기준으로, 분자량 기준으로, 또는 몰 및 분자량 둘 모두를 기준으로 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드(들)의 양을 초과한다. 특정 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드(들) 대 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드(들)의 비는 몰 기준으로, 분자량 기준으로, 또는 몰 및 분자량 둘 모두를 기준으로 2:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상, 5:1 이상, 10:1 이상, 또는 50:1 이상이다. 특정 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소(들)는 완전 발효 배지에 없거나 또는 탐지불가능하다. 소정의 실시 형태에서, 완전 발효 배지 중 검출가능한 유지 β-자일로시다아제 활성이 전혀 없다.
본 발명에서 개시된 방법에 따르면, 완전 발효 배지의 배양은 연속식, 배치식(batch), 또는 유가식(fed-batch) 조건 하에 행해진다. 예를 들어, 본 발명의 완전 발효 배지의 배양은 연속식 SSF 반응, 배치식 SSF 반응 또는 유가식 SSF 반응이다.
본 발명의 방법은, 소정의 태양에서, 배양 단계 이전에 완전 배양 배지의 형성을 추가로 포함한다. 예를 들어, 완전 발효 배지는 (a) 적어도 하나의 발효 미생물, (b) 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, (c) 적어도 하나의 셀룰라아제, (d) 적어도 하나의 헤미셀룰라아제, (e) 적어도 하나의 전화 β-자일로시다아제, 및 (f) 성분 (a) 내지 (e) 중 하나 이상이 결여된 배지의 조합에 의해 형성될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 셀룰라아제는 셀룰라아제 제제의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 셀룰라아제 제제는 전 셀룰라아제 제제일 수 있으며, 이는 선택적으로 적어도 하나의 헤미셀룰라아제를 또한 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 셀룰라아제 제제는 사상균 배양물, 예를 들어, 티. 레에세이(T. reesei) 세포를 사용하여 제조한 티. 레에세이 배양물로부터의 배양 브로쓰(borth)이다. 소정의 태양에서, 티. 레에세이 세포는 천연 β-자일로시다아제 유전자가 불활성화되거나 또는 결실되도록 조작되었다. "천연 β-자일로시다아제 유전자가 불활성화되거나 또는 결실된 티. 레에세이 세포"는 불활성화가 처음에 일어났던 원래 세포 또는 모 세포뿐만 아니라 천연 β-자일로시다아제 유전자가 불활성화되거나 또는 결실된 그 세포의 자손도 포함함을 주목해야 한다.
소정의 태양에서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스를 포함하는 발효 브로쓰의 배양에 관계된다. 소정의 태양에서, 자일란-함유 바이오매스는 예를 들어 옥수수의 줄기와 잎, 바가스(bagasse), 수수류, 물대, 코끼리풀(elephant grass), 억새(miscanthus), 삼나무(Japanese cedar), 밀짚, 스위치그래스, 활엽수 펄프, 또는 침엽수 펄프이다. 예를 들어, 자일란-함유 바이오매스는 적합하게는 슬러리의 형태로 SSF 반응물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 자일란-함유 바이오매스는 고형물의 형태로 SSF 반응물에 첨가될 수 있다. 따라서, 자일란-함유 바이오매스는 적합하게는 액체 형태 (이는 예를 들어 용액, 현탁액, 또는 고형물과 액체의 혼합물일 수 있음) 또는 고형물 형태로 SSF 반응물에 첨가될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 자일란-함유 바이오매스는 전처리에 처해졌다.
SSF 반응이 일어나 선택적으로 완료된 후, 회수 단계가 뒤따를 수 있으며, 여기서 발효 생성물(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 프로판-1,3-다이올, 또는 부탄올)이 회수된다.
본 발명은 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, β-자일로시다아제 및 발효 미생물 성분에 관하여 예를 들어 이상에서 그리고 이하에서 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용하기에 적합한 완전 발효 배지를 추가로 제공한다.
또한 본 발명은 천연 β-자일로시다아제 유전자가 불활성화되거나 또는 결실되도록 조작된 티. 레에세이 세포를 제공한다. 티. 레에세이 세포는 GH43 패밀리의 효소, 예를 들어, Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A, 또는 XynB3 폴리펩티드로부터 선택되는 효소를 재조합적으로 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Fv43D 폴리펩티드는 서열 번호 2에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. Pf43A 폴리펩티드는 서열 번호 8에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. Fv43E 폴리펩티드는 서열 번호 10에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. Fv43B 폴리펩티드는 서열 번호 12에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 12의 잔기 17 내지 574에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. Af43A 폴리펩티드는 서열 번호 14에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 14의 잔기 15 내지 558에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. Fo43A 폴리펩티드는 서열 번호 24에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. Gz43A 폴리펩티드는 서열 번호 22에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. XynB3 폴리펩티드는 서열 번호 25에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다.
본 발명은 (a) 이상에서 및/또는 이하에서 기재된 것과 같은 그러한 티. 레에세이 세포를 하나 이상의 셀룰라아제 폴리펩티드의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계, 및 (b) 예를 들어 셀룰라아제 폴리펩티드를 포함하는 배양 브로쓰를 회수함으로써 셀룰라아제 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 셀룰라아제 폴리펩티드를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 티. 레에세이 세포에 의해 생성된 배양 브로쓰, 및 예를 들어 SSF 반응을 비롯한 당화 반응에서의 그의 용도를 추가로 제공한다.
소정의 태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 전화 β-자일로시다아제, 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제, 및 발효 배지를 포함하는 완전 발효 배지 조성물을 제공한다. 전화 β-자일로시다아제는 예를 들어 GH43 패밀리 효소이다. 소정의 태양에서, 전화 β-자일로시다아제는 Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A, 또는 XynB3 폴리펩티드로부터 선택되는 것일 수 있다. 적합하게는, 발효 미생물은 적합한 탄소원, 예를 들어 자일란-함유 바이오매스, 또는 당, 예를 들어 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 갈락토스 또는 올리고당을 예를 들어 메탄올("MeOH"), 에탄올("EtOH"), 프로판올, 프로판-1,3-다이올, 또는 부탄올을 포함하는 원하는 발효 생성물로 직접적으로 또는 간접적으로 발효시킬 수 있는 것이다. 발효 미생물은 진균류, 예를 들어 효모 또는 사상균, 박테리아, 예를 들어 자이모모나스 모빌리스 또는 클로스트리듐 서모셀룸(Clostridium thermocellum)으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 적합한 탄소원 또는 기질은 예를 들어 리그노셀룰로오스계 기질 또는 기타 탄수화물-함유 원료로부터 선택되는 자일란-함유 바이오매스 기질을 포함한다. 소정의 리그노셀룰로오스계 기질은 예를 들어 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및/또는 리그닌을 포함할 수 있다.
셀룰라아제는 예를 들어 β-글루코시다아제, 엔도글루카나아제, 또는 셀로바이오하이드롤라아제 폴리펩티드이다. 효소는 본 명세서에서 그의 명칭으로, 또는 그가 속하는 효소 패밀리로(예를 들어, GH43 패밀리 효소; 또는 EC 3.2.1.91에서 또는 EC 3.2.1.91 하에서 분류된 효소) 칭해지며; 효소가 그의 명칭으로 칭해질 때, 효소는 또한 "폴리펩티드명"으로 상호교환가능하게 칭해질 수 있다(예를 들어, β-글루코시다아제는 또한 β-글루코시다아제 폴리펩티드로 상호교환가능하게 칭해질 수 있음). 셀룰라아제는 또한 예를 들어 전 셀룰라아제 제제의 형태로 존재할 수 있다. 헤미셀룰라아제는 예를 들어 자일라나아제, β-자일로시다아제, L-α-아라비노푸라노시다아제, 또는 보조(accessory) 단백질이다. 소정의 실시 형태에서, 전 셀룰라아제 제제는 헤미셀룰라아제 폴리펩티드들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
발효 배지는 부분 당화 공정에서 생기는 것, 또는 소정량의 당화 생성물을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 조성물은 관심있는 발효 생성물(들)의 생산을 허용하는 조건 하에 예를 들어 SSF 반응을 포함하는 당화 반응에서 적합하게 사용될 수 있다.
소정의 태양에서, 하나 이상의 셀룰라아제 및/또는 하나 이상의 헤미셀룰라아제는 하나 이상의 (하나 초과의 천연 β-자일로시다아제가 존재할 경우) 천연 β-자일로시다아제를 코딩하는 유전자가 결실되었거나 또는 검출가능한 천연 β-자일로시다아제 활성이 전혀 없는 유전자 조작된 미생물에 의해 생산된다. 소정의 실시 형태에서, 하나 이상의 셀룰라아제 및/또는 하나 이상의 헤미셀룰라아제를 생산하도록 조작된 미생물은 유지 β-자일로시다아제를 포함하지 않거나 또는 검출가능한 유지 β-자일로시다아제 활성을 전혀 갖지 않는다.
일부 태양에서, 본 발명은 바이오에탄올 발효 생성물을 얻기 위하여 자일란-함유 바이오매스에서 SSF 반응을 행하는 개선된 방법에 관한 것이며, 여기서 본 방법은 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제, 및 적어도 하나의 발효 미생물을 포함하는 발효 배지를 배양하는 단계를 포함하고, 개선은 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소의 사용을 포함한다.
관련된 태양에서, 본 발명은 다수의 산업적 응용에 있어서 유용하며 가치있는 것으로 공지된 알킬-β-자일로피라노사이드의 생산을, 그러한 생산이 바람직한 상황에서 개선시키는 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 알킬-β-자일로피라노사이드는 적합하게는 생분해성 계면활성제 및 유화제로서 유용한 알킬-글루코사이드의 합성에서 화학적 중간체로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[K. Schmid & H. Tesmann, 2001, Alkyl Polyglucosides, in Detergency of Specialty Surfactants, Surfactant science series, vol. 98; (F.E. Fried ed.); Marcel Dekker Inc., NY, pp.1-70] 참조). 이들 화합물은 또한 유도제 그 자체이거나 또는 다수의 미생물에서 자일라나아제 생성의 유도제의 제조에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[M. Marui et al., 1985, Agric. Biol. Chem. 49(12):3399-3407]; 문헌[H. Shinoyama et al., 1988, Agric. Biol. Chem. 52(9): 2197-2202] 참조). 게다가, 다양한 알킬-피라노사이드는 콘드로이틴 설페이트의 프라이머로서 그리고 프로테오글리칸의 생합성의 촉진제로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[H. Shinoyama et al., 1988, Agric. Biol. Chem. 52(9): 2197-2202] 참조). 본 발명의 다른 태양에서, SSF 반응에서 유지하는 작용 메커니즘을 갖는 β-자일로시다아제의 포함 또는 증가된 생성은 이들 유용한 알킬-β-자일로피라노사이드의 수율을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 유지 β-자일로시다아제의 양을 증가시키는 단계를 포함한다. 유지 β-자일로시다아제의 양의 증가를 수반하는 SSF 반응을 행하는 개선된 방법이 또한 본 발명에서 제공된다. 추가의 실시예에서, 전화 β-자일로시다아제의 양을 감소시키면서 유지 β-자일로시다아제의 양을 증가시키는 것을 수반하는 SSF 반응을 행하는 개선된 방법이 고려된다.
다른 태양에서, 본 발명은 완전 발효 배지를 예를 들어 메틸-β-자일로피라노사이드("MXP"), 에틸-β-자일로피라노사이드("EXP"), 프로필-β-자일로피라노사이드("PXP"), 또는 부틸-β-자일로피라노사이드("BXP")와 같은 알킬-β-자일로피라노사이드의 형성에 적합한 기간 동안 그리고 그러한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 SSF 방법을 제공하며, 상기 완전 발효 배지는 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제, 및 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 적어도 하나의 효소를 포함한다.
소정의 태양에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 상기 적어도 하나의 효소는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 상기 효소가 결여되거나 또는 더 적은 양으로 있는 대조 발효 배지와 비교하여 단쇄 알킬-β-자일로피라노사이드 ("AXP") (예를 들어, 메틸-β-자일로피라노사이드 ("MXP"), 에틸-β-자일로피라노사이드 ("EXP"), 프로필-β-자일로피라노사이드 ("PXP"), 또는 부틸-β-자일로피라노사이드 ("BXP")) 형성을 증가시키기에 유효한 양으로 상기 완전 발효 배지에 존재할 수 있다. 예를 들어 이러한 효소(들)는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 상기 하나 이상의 효소가 결여되거나 또는 더 적은 양으로 있는 대조 발효 배지의 것과 비교하여, AXP 형성량을 20% 이상만큼, 30% 이상만큼, 40% 이상만큼, 50% 이상만큼, 60% 이상만큼, 70% 이상만큼 또는 80% 이상만큼 증가시키기에 유효한 양으로 존재한다.
소정의 태양에서, 발효 미생물은 제한 없이 메틸-β-자일로피라노사이드("MXP"), 에틸-β-자일로피라노사이드("EXP"), 프로필-β-자일로피라노사이드("PXP"), 또는 부틸-β-자일로피라노사이드("BXP") 화합물을 포함하는 다수의 단쇄 알킬-β-자일로피라노사이드("AXP") 화합물을 생산할 수 있다. 일부 태양에서, 발효 미생물은 박테리아, 예를 들어 자이모모나스 모빌리스 또는 진균류, 예를 들어 효모 또는 사상균이다.
소정의 태양에서, 상기 적어도 하나의 유지β-자일로시다아제는 GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54, 또는 GH116 패밀리 효소이다. 소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제는XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA, 또는 Xyl1 폴리펩티드로부터 선택된다. 구체적으로, XlnD 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 40에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 40의 잔기 18 내지 804에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Fv30A 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 42에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 42의 잔기 20 내지 537에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Fv30B 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 44에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 44의 잔기 25 내지 485에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Fv39A 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 46에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 46의 잔기 20 내지 439에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Fv39B 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 48에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 48의 잔기 19 내지 456에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. XynB 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 50에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. XylA 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 52에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다. Xyl1 폴리펩티드는 완전 발효 배지에 존재할 경우 서열 번호 54에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 54의 잔기 22 내지 500에 대하여 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드이다.
소정의 태양에서, 상기 완전 배지 중 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드의 양은 완전 발효 배지의 성분이기도 한 상기 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 약 0.2 ㎎ 이상, 약 0.5 ㎎ 이상, 약 0.7 ㎎ 이상, 약 1 ㎎ 이상, 약 2 ㎎ 이상 또는 약 5 ㎎ 이상이다. 다른 태양에서, 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드(들)의 양은 상기 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 약 10 ㎎ 이하, 약 5 ㎎ 이하, 약 2 ㎎ 이하, 약 1 ㎎ 이하, 약 0.7 ㎎ 이하, 약 0.5 ㎎ 이하, 또는 약 0.2 ㎎ 이하이다. 소정의 태양에서, 상기 완전 배지 중 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드의 양은 상기 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 예를 들어 (a) 0.2 ㎎ 내지 10 ㎎, (b) 0.2 ㎎ 내지 5 ㎎, (c) 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎, (d) 1 ㎎ 내지 10 ㎎, (e) 2 ㎎ 내지 10 ㎎, (f) 0.2 ㎎ 내지 5 ㎎, (g) 0.2 ㎎ 내지 2 ㎎, 또는 (h) 0.5 ㎎ 내지 10 ㎎의 범위이거나, 또는 상기 양은 상한치 및 하한치가 전술한 값으로부터 각각 독립적으로 선택되는 범위 이내이다.
소정의 태양에서, 상기 완전 발효 배지 중 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드(들)의 양은 몰 기준으로, 분자량 기준으로, 또는 몰 및 분자량 둘 모두를 기준으로 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드(들)의 양을 초과한다. 특정 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드 대 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드의 비는 몰 기준으로, 분자량 기준으로, 또는 몰 및 분자량 둘 모두를 기준으로 2:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상, 5:1 이상, 10:1 이상, 또는 50:1 이상이다. 특정 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 완전 발효 배지에 없거나 또는 탐지불가능하다. 소정의 실시 형태에서, 완전 발효 배지 중 검출가능한 전화 β-자일로시다아제 활성이 전혀 없다.
본 발명에서 개시된 방법에 따르면, 완전 발효 배지의 배양은 연속식, 배치식, 또는 유가식 조건 하에 행해진다. 예를 들어, 본 발명의 완전 발효 배지의 배양은 연속식 SSF 반응, 배치식 SSF 반응 또는 유가식 SSF 반응이다.
본 발명의 방법은, 소정의 태양에서, 배양 단계 이전에 완전 배양 배지의 형성을 추가로 포함한다. 예를 들어, 완전 발효 은 (a) 적어도 하나의 발효 미생물, (b) 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, (c) 적어도 하나의 셀룰라아제, (d) 적어도 하나의 헤미셀룰라아제, (e) 적어도 하나의 유지 β-자일로시다아제, 및 (f) 성분 (a) 내지 (e) 중 하나 이상이 결여된 배지의 조합에 의해 형성될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 셀룰라아제는 셀룰라아제 제제의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 셀룰라아제 제제는 전 셀룰라아제 제제일 수 있으며, 이는 선택적으로 적어도 하나의 헤미셀룰라아제를 또한 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 셀룰라아제 제제는 사상균 배양물, 예를 들어, 티. 레에세이 세포를 사용하여 제조한 티. 레에세이 배양물로부터의 배양 브로쓰이다. 소정의 태양에서, 티. 레에세이 세포는 천연 유지 β-자일로시다아제 유전자가 과다발현되거나 또는 외래 유지 β-자일로시다아제 유전자가 도입되어 내부에서 발현되도록 조작되었다. "천연 유지 β-자일로시다아제 유전자가 과다발현되거나 또는 외래 유지 β-자일로시다아제 유전자가 도입되어 내부에서 발현되도록 조작된 티. 레에세이 세포"는 불활성화가 처음 일어난 원래 세포 또는 모 세포뿐만 아니라 그 세포의 자손도 포함함을 주목해야 한다.
소정의 태양에서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스를 포함하는 발효 브로쓰의 배양에 관계된다. 소정의 태양에서, 자일란-함유 바이오매스는 예를 들어 옥수수의 줄기와 잎, 바가스, 수수류, 물대, 코끼리풀, 억새, 삼나무, 밀짚, 스위치그래스, 활엽수 펄프, 또는 침엽수 펄프이다. 예를 들어, 자일란-함유 바이오매스는 적합하게는 슬러리의 형태로 SSF 반응물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 자일란-함유 바이오매스는 고형물의 형태로 SSF 반응물에 첨가될 수 있다. 따라서, 자일란-함유 바이오매스는 적합하게는 액체 형태 (이는 예를 들어 용액, 현탁액, 또는 고형물과 액체의 혼합물일 수 있음) 또는 고형물 형태로 SSF 반응물에 첨가될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 자일란-함유 바이오매스는 전처리에 처해졌다.
SSF 반응이 일어나 선택적으로 완료된 후, 회수 단계가 뒤따를 수 있으며, 여기서 AXP 생성물(예를 들어, MXP, EXP, PXP, 또는 BXP)이 회수된다.
본 발명은 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, β-자일로시다아제 및 발효 미생물 성분에 관하여 예를 들어 이상에서 그리고 이하에서 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용하기에 적합한 완전 발효 배지를 추가로 제공한다.
또한 본 발명은 천연 유지 β -자일로시다아제 유전자가 과다발현되거나 또는 외래 유지 β-자일로시다아제 유전자가 내부에서 발현되도록 조작된 티. 레에세이 세포를 제공한다. 티. 레에세이 세포는 GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54, 또는 GH116 패밀리의 효소, 예를 들어 XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA, 또는 Xyl1 폴리펩티드로부터 선택된 것을 재조합적으로 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, XlnD 폴리펩티드는 서열 번호 40에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 40의 잔기 18 내지 804에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. Fv30A 폴리펩티드는 서열 번호 42에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 42의 잔기 20 내지 537에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. Fv30B 폴리펩티드는 서열 번호 44에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 44의 잔기 25 내지 485에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. Fv39A 폴리펩티드는 서열 번호 46에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 46의 잔기 20 내지 439에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. Fv39B 폴리펩티드는 서열 번호 48에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 48의 잔기 19 내지 456에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. XynB 폴리펩티드는 서열 번호 50에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%이다. XylA 폴리펩티드는 서열 번호 52에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 52의 잔기 19 내지 705에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. Xyl1 폴리펩티드는 서열 번호 54에 상응하는 아미노산 서열에 대하여 또는 서열 번호 54의 잔기 22 내지 500에 대하여 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다.
본 발명은 (a) 이상에서 및/또는 이하에서 기재된 것과 같은 그러한 티. 레에세이 세포를 하나 이상의 셀룰라아제 폴리펩티드의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계, 및 (b) 예를 들어 셀룰라아제 폴리펩티드를 포함하는 배양 브로쓰를 회수함으로써 셀룰라아제 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 셀룰라아제 폴리펩티드를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 티. 레에세이 세포에 의해 생성된 배양 브로쓰, 및 예를 들어 SSF 반응을 비롯한 당화 반응에서의 그의 용도를 추가로 제공한다.
소정의 태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 유지 β-자일로시다아제, 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제, 및 발효 배지를 포함하는 완전 발효 배지 조성물을 제공한다. 유지 β-자일로시다아제는 예를 들어 과다발현된 천연 유지 β-자일로시다아제 또는 적합한 숙주 세포 내로 도입된 외래 β-자일로시다아제이다. 유지 β-자일로시다아제는 예를 들어 GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54, 또는 GH 116 패밀리 효소이다. 소정의 태양에서, 유지 β-자일로시다아제는 XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA, 또는 Xyl1 폴리펩티드로부터 선택되는 것일 수 있다. 적합하게는, 발효 미생물은 적합한 탄소원, 예를 들어 자일란-함유 바이오매스, 또는 당, 예를 들어 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 갈락토스 또는 올리고당을 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 프로판-1,3-다이올, 또는 부탄올을 포함하는 원하는 발효 생성물로 직접적으로 또는 간접적으로 발효시킬 수 있는 것이다. 발효 미생물은 진균류, 예를 들어 효모 또는 사상균, 또는 박테리아, 예를 들어 자이모모나스 모빌리스 또는 클로스트리듐 서모셀룸으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 적합한 탄소원 또는 기질은 예를 들어 리그노셀룰로오스계 기질 또는 기타 탄수화물-함유 원료로부터 선택되는 자일란-함유 바이오매스 기질일 수 있다. 소정의 리그노셀룰로오스계 기질은 예를 들어 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및/또는 리그닌을 포함할 수 있다.
셀룰라아제는 예를 들어 β-글루코시다아제, 엔도글루카나아제, 또는 셀로바이오하이드롤라아제 폴리펩티드이다. 셀룰라아제는 또한 예를 들어 전 셀룰라아제 제제의 형태로 존재할 수 있다. 헤미셀룰라아제는 예를 들어 자일라나아제, β-자일로시다아제, L-α-아라비노푸라노시다아제, 또는 보조(accessory) 단백질이다. 소정의 실시 형태에서, 전 셀룰라아제 제제는 하나 이상의 헤미셀룰라아제 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
발효 배지는 부분 당화 공정에서 생기는 것, 또는 소정량의 당화 생성물을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어 MXP, EXP, PXP, or BXP를 비롯한 AXP 화합물의 생성을 허용하는 조건 하에 예를 들어 SSF 반응을 포함하는 당화 반응에서 적합하게 사용될 수 있다.
소정의 태양에서, 하나 이상의 셀룰라아제 또는 하나 이상의 헤미셀룰라아제는 하나 이상의 (하나 초과의 천연 β-자일로시다아제가 존재할 경우) 천연 β-자일로시다아제가 과다발현되었거나 또는 외래 β-자일로시다아제를 코딩하는 유전자가 도입 및/또는 발현된 유전자 조작된 미생물에 의해 생산된다. 소정의 실시 형태에서, 하나 이상의 셀룰라아제 및/또는 하나 이상의 헤미셀룰라아제를 생산하도록 조작된 미생물은 동일한 유전자 조작을 겪지 않은 대조 미생물에 비하여 유지 β-자일로시다아제 활성의 증가된 발현을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 하나 이상의 셀룰라아제 및/또는 하나 이상의 헤미셀룰라아제를 생산하도록 조작된 미생물은 전화 β-자일로시다아제를 포함하지 않거나 또는 검출가능한 전화 β-자일로시다아제 활성을 전혀 갖지 않는다.
소정의 관련된 태양에서, 본 발명은 AXP 생성물을 얻기 위하여 자일란-함유 바이오매스에서 SSF 반응을 행하는 개선된 방법에 관한 것이며, 여기서 본 방법은 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제, 및 적어도 하나의 발효 미생물을 포함하는 발효 배지를 배양하는 단계를 포함하고, 개선은 천연 β-자일로시다아제 유전자를 과다발현하거나 또는 외래 β-자일로시다아제를 발현하도록 조작된 티. 레에세이 세포로부터 만들어진 셀룰라아제 제제의 사용을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 과다발현되는 천연 β-자일로시다아제 유전자 또는 발현되는 외래 β-자일로시다아제 유전자는 유지 β-자일로시다아제를 코딩하는 유전자이다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 젠뱅크(GenBank) 서열 및 ATCC 기탁은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 명백히 포함된다.
도면 및 표의 간단한 설명
<표 1>
SSF 조건 하에 재조합 자이모모나스 모빌리스를 이용한, 옥수수 속대 및 글루코스/자일로스로부터의 EXP 형성.
<표 2>
다양한 유형의 바이오매스 기질을 이용한 EXP 형성.
<표 3>
멀티펙트(Multifect)(등록상표) 자일라나아제 ("MF," 560 ㎍/㎖) 및 정제된 Fv43D (36 ㎍/㎖) 또는 Fv3A (54 ㎍/㎖)의 존재 하에서의 46℃에서의, 50 mM 시트르산나트륨, pH 4.7 + 0.9 M EtOH 중 자일로바이오스 (20 ㎎/㎖)에 의한 EXP 및/또는 자일로스 형성 (RI 면적으로 표현, ㎎/㎖에 비례)의 타임 코스.
<표 4>
bxl1 결실 카세트의 제작을 위한 프라이머 서열.
<표 5>
에프. 베르티실리오이데스(F. verticillioides) β-자일로시다아제 Fv43D 발현 카세트의 제작을 위한 프라이머 서열.
<표 6>
SSF 반응에서 사용되는 소정의 효소에 있어서의 서열 확인자에 대한 요약을 제공.
<도 1>
46℃에서의 48시간의 인큐베이션 후 취해진, pH 4.6의 50 mM 시트르산나트륨 중 자일로스 (10 ㎎/㎖), 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 (1.35 ㎎/㎖), 그리고 알코올을 포함하지 않거나, 각각 0.72 M의 에탄올("EtOH")을 포함하거나, 메탄올("MeOH")을 포함하거나, 또는 n-프로판올("n-PrOH")을 포함하는 것의 샘플의 HPLC 크로마토그램. HPLC 조건: 컬럼: HPX-87H, 60℃, 0.60 ㎖/min의 0.01 N H2SO4, RI 검출기.
<도 2>
도 1의 실험에서 설명한 것과 동일한 조건 하에서의 알킬-자일로피라노사이드("AXP")의 출현/형성 이후의 타임 코스. 형성된 발효 생성물의 양은 자일로스 피크의 것과 비교하여 생성물 피크의 면적의 비로서 표현된다.
<도 3>
에틸-β-자일로피라노사이드의 존재를 나타내는 NMR 스펙트럼.
<도 4>
SSF 조건 하에서의 효모 및 야생형 자이모모나스 모빌리스를 이용한 EXP 형성.
<도 5>
티. 레에세이 Bxl1를 첨가한, 그리고 그를 첨가하지 않은 효모 SSF 조건 하에서의 EXP 형성.
<도 6>
재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 통합 티. 레에세이 주 #229로부터 생성된 효소 복합물에 티. 레에세이 Bxl1을 첨가한 후의 EXP 용량 응답.
<도 7>
당화를 위한 하기 효소 구성/혼합물을 이용한 SSF 반응 동안의 EXP 형성: 액셀러라아제(Accellerase™) 1500 ("A1500")+멀티펙트(등록상표) 자일라나아제, 액셀러라아제™ 1500 ("A1500") +XlnA, 및 헤미셀룰라아제(Fv3A, Fv51A, 또는 Bxl1)의 첨가에 의해 통합 티. 레에세이 주 #229로부터 생성된 효소 복합물.
<도 8>
당화를 위한 다양한 정제 셀룰라아제 효소 및 XynB3을 이용한 SSF 반응 동안의 EXP 형성.
<도 9>
티. 레에세이 Bxl1의 존재 하에서 또는 소정의 다른 GH43 패밀리 β-자일로시다아제 효소의 존재 하에서 통합 티. 레에세이 주 #229로부터 생성된 효소 복합물을 이용한 SSF 반응 동안의 EXP 형성.
<도 10>
재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 Fv43D의 첨가에 의해 관찰된 감소된 EXP 형성.
<도 11>
효모 SSF 조건 하에서 Fv43D의 첨가에 의해 관찰된 감소된 EXP 형성.
<도 12>
Fv43D를 액셀러라아제™ 1500+멀티펙트(등록상표) 자일라나아제에, 액셀러라아제™ 1500+XlnA에, 그리고 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 통합 티. 레에세이 주 #229로부터 생성된 효소 복합물에 첨가한 후 관찰된 감소된 EXP 형성.
<도 13>
Fv43D를 정제된 셀룰라아제 효소 및 XynB3에 첨가한 것에 의해 관찰된 감소된 EXP 형성.
<도 14a 내지 도 14b>
도 14a는 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 티. 레에세이 통합 주 #229 + 티. 레에세이 Bxl1로부터 생성된 효소 조성물 또는 블렌드에 Fv43D을 첨가한 것에 의한 EXP 감소의 용량 응답을 나타낸다. 도 14b는 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 통합 티. 레에세이 주 #229 + 티. 레에세이 Bxl1로부터 생성된 효소 복합물에 Fo43A 또는 Gz43A를 첨가한 것에 의한 EXP 감소를 나타낸다.
<도 15>
멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 (560 ㎍/㎖) 및 정제된 Fv43D (36 ㎍/㎖) 및 Fv3A (54 ㎍/㎖)의 존재 하에서의 46℃에서의, 50 mM 시트르산나트륨, pH 4.7 + 0.9 M 에탄올 중 자일로바이오스 (20 ㎎/㎖)에 의한 자일로스 및 EXP 형성 (RI 면적으로 표현, 이는 ㎎/㎖에 비례함)의 타임 코스.
<도 16>
멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 (560 ㎍/㎖), Fv43D (36 ㎍/㎖) 또는 Fv3A (54 ㎍/㎖)의 존재 하에서의 46℃에서의, 50 mM 시트르산나트륨, pH 4.7 + 0.9 M 에탄올 중 자일로바이오스 (20 ㎎/㎖, 좌측) 또는 자일로스 올리고머 (20 ㎎/㎖, 우측)에 의한 자일로스 및 EXP 형성의 타임 코스. 그 결과는 형성된 자일로스의 양에 대한 EXP의 양의 비로 표현된다.
<도 17>
pCR-Blunt II-TOPO, bxl1 결실, hph-loxP의 플라스미드 지도.
<도 18>
TOPO Blunt/Pegl1-F의 플라스미드 지도v43D.
<도 19a 내지 도 19b>
도 19a: Fv43D의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1). 도 19b: Fv43D의 아미노산 서열 (서열 번호 2). 서열 번호 2는 미성숙 Fv43D의 서열이다. Fv43D는 서열 번호 2의 잔기 1 내지 20에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 20a 내지 도 20b>
도 20a: 티. 레에세이 Bxl1의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 3). 도 20b: 티. 레에세이 Bxl1의 아미노산 서열 (서열 번호 4). 신호 서열을 밑줄로 나타낸다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 21a 내지 도 21b>
도 21a: Fv3A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5). 도 21b: Fv3A의 아미노산 서열 (서열 번호 6). 서열 번호 6은 미성숙 Fv3A의 서열이다. Fv3A는 서열 번호 6의 잔기 1 내지 23에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 6의 잔기 24 내지 766에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 22a 내지 도 22b>
도 22a: Pf43A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7). 도 22b: Pf43A의 아미노산 서열 (서열 번호 8). 서열 번호 8은 미성숙 Pf43A의 서열이다. Pf43A는 서열 번호 8의 잔기 1 내지 20에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있으며, 예측된 탄수화물 결합 모듈(carbohydrate binding module; "CBM") 잔기는 대문자형으로 되어 있고, CD와 CBM을 분리하는 예측된 링커는 이탤릭체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 23a 내지 도 23b>
도 23a: Fv43E의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9). 도 23b: Fv43E의 아미노산 서열 (서열 번호 10). 서열 번호 10은 미성숙 Fv43E의 서열이다. Fv43E는 서열 번호 10의 잔기 1 내지 18에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 24a 내지 도 24b>
도 24a: Fv43B의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 11). 도 24b: Fv43B의 아미노산 서열 (서열 번호 12). 서열 번호 12는 미성숙 Fv43B의 서열이다. Fv43B는 서열 번호 12의 잔기 1 내지 16에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 12의 잔기 17 내지 574에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 25a 내지 도 25b>
도 25a: Af43A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 13). 도 25b: Af43A의 아미노산 서열 (서열 번호 14). 서열 번호 14는 미성숙 Af43A의 서열이다. Af43A는 예측 신호 서열을 갖지 않는데, 상기 신호 서열은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 추론될 수 있다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 26a 내지 도 26b>
도 26a: Fv51A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 15). 도 26b: Fv51A의 아미노산 서열 (서열 번호 16). 서열 번호 16은 미성숙 Fv51A의 서열이다. Fv51A는 서열 번호 16의 잔기 1 내지 19에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 16의 잔기 20 내지 660에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 L-α-아라비노푸라노시다아제 보존 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 27a 내지 도 27b>
도 27a: 티. 레에세이 Xyn3의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 17). 도 27b: 티. 레에세이 Xyn3의 아미노산 서열 (서열 번호 18). 서열 번호 18은 미성숙 티. 레에세이 Xyn3의 서열이다. 티. 레에세이 Xyn3은 서열 번호 18의 잔기 1 내지 16에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 18의 잔기 17 내지 347에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 28a 내지 도 28b>
도 28a: XlnA의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 19). 도 28b: XlnA의 아미노산 서열 (서열 번호 20). 서열 번호 20은 미성숙 XlnA 단백질의 서열이다. XlnA는 서열 번호 20의 잔기 1 내지 27에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 20의 잔기 28 내지 211에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 서열 번호 19는 XlnA의 게놈 서열이며; 개시 및 종결 코돈 잔기는 도 28a에서 볼드체로 나타내어져 있고, XlnA 유전자의 인트론 A는 도 28a에서 밑줄로 나타내어져 있다.
<도 29>
도 29는 글루코스의 "α" 및 "β" 아노머 배위를 나타낸다. 아노머는 고리 내에서 흔히 가장 멀리 있는 키랄 중심인 배위적 원자 (당을 D 또는 L로 규정)에 부착된 산소와 아노머 탄소의 환외 산소 원자의 입체화학적 특성 사이의 관련성을 기반으로 한 "α" 또는 "β"로서 확인된다. α아노머는 이들 두 위치가 동일한 배위를 갖는 것이며; 상기 두 위치는β 아노머에서는 반대쪽에 있다. 따라서, α-D-글루코스의 구조는 C1 및 C5 둘 모두에서 동일한 입체화학적 특성을 가지며, 반면에 β-D-글루코스는 C5와 비교하여 C1에서 반대의 입체화학적 특성을 갖는다.
<도 30a 내지 도 30b>
도 30a: Gz43A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 21). 도 30b: Gz43A의 아미노산 서열 (서열 번호 22). 서열 번호 22는 미성숙 Gz43A의 서열이다. Gz43A는 서열 번호 22의 잔기 1 내지 18에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 31a 내지 도 31b>
도 31a: Fo43A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 23). 도 31b: Fo43A의 아미노산 서열 (서열 번호 24). 서열 번호 24는 미성숙 Fo43A의 서열이다. Fo43A는 서열 번호 24의 잔기 1 내지 20에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이터베이스를 기반으로 하여 행하였다.
<도 32>
GH43 패밀리 하이드롤라아제들의 정렬. 상기 패밀리의 구성원들 사이에서 고도로 보존된 아미노산 잔기는 볼드체 및 밑줄이 그어진 유형으로 나타내어져 있다.
<도 33>
XynB3의 아미노산 서열 (서열 번호 25).
<도 34>
티. 레에세이 Bgl1의 아미노산 서열 (서열 번호 45). 신호 서열을 밑줄로 나타낸다. 예측된 보존된 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있다. 코딩 서열은 문헌[Barnett et al., 1991, Bio-Technology 9(6):562-567]에 기재되어 있다.
<도 35a 내지 35b>
도 35a: XlnD의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 39). 도 35b: XlnD의 아미노산 서열 (서열 번호 40). 서열 번호 40은 미성숙 XlnD의 서열이다. XlnD는 서열 번호 40의 잔기 1 내지 17에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 40의 잔기 18 내지 804에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다.
<도 36a 내지 도 36b>
도 36a: Fv30A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 41). 도 36b: Fv30A의 아미노산 서열 (서열 번호 42). 서열 번호 42는 미성숙 Fv30A의 서열이다. Fv30A는 서열 번호 42의 잔기 1 내지 19에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 42의 잔기 20 내지 537에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다.
<도 37a 내지 도 37b>
도 37a: Fv30B의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 43). 도 37b: Fv30B의 아미노산 서열 (서열 번호 44). 서열 번호 44는 미성숙 Fv30B의 서열이다. Fv30B는 서열 번호 44의 잔기 1 내지 24에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 44의 잔기 25 내지 485에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다.
<도 38a 내지 도 38b>
도 38a: Fv39A의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 45). 도 38b: Fv39A의 아미노산 서열 (서열 번호 46). 서열 번호 46은 미성숙 Fv39A의 서열이다. Fv39A는 서열 번호 46의 잔기 1 내지 19에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 46의 잔기 20 내지 439에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다.
<도 39a 내지 도 39b>
도 39a: Fv39B의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 47). 도 39b: Fv39B의 아미노산 서열 (서열 번호 48). 서열 번호 48은 미성숙 Fv39B의 서열이다. Fv39B는 서열 번호 48의 잔기 1 내지 18에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 48의 잔기 19 내지 456에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다.
<도 40a 내지 도 40b>
도 40a: XynB의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 49). 도 40b: XynB의 아미노산 서열 (서열 번호 50). XynB는 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)으로부터의 예측 신호 서열을 갖지 않는다.
<도 41a 내지 도 41b>
도 41a: XylA의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 51). 도 41b: XylA의 아미노산 서열 (서열 번호 52). XylA는 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)으로부터의 예측 신호 서열을 갖지 않지만, Uniprot 알고리즘(http://www.uniprot.org/uniprot에서 이용가능함)으로부터 예측되는, 서열 번호 52의 잔기 1 내지 18에 상응하는 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 52의 잔기 19 내지 705에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
<도 42a 내지 도 42b>
도 42a: Xyl1의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 53). 도 42b: Xyl1의 아미노산 서열 (서열 번호 54). 서열 번호 54는 미성숙 Xyl1의 서열이다. Xyl1은 서열 번호 54의 잔기 1 내지 21에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 54의 잔기 22 내지 500에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 신호 서열 예측은 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)을 이용하여 행하였다.
<도 43a 내지 도 43b>
도 43a: bxl1- 티. 레에세이 주 #229를 이용하거나, 자일란 1 g 당 0.5 또는 1.5 ㎎의 정제된 티. 레에세이 Bxl1을 SSF 반응물에 첨가한 경우 또는 자일란 1 g 당 1 ㎎의 정제된 Fv43D를 첨가한 경우 SSF 반응으로부터 1일째에 측정한 EXP 및 에탄올 농도; 도 43b: bxl1- 티. 레에세이 주 #229를 이용하거나, 자일란 1 g 당 0.5 또는 1.0 ㎎의 정제된 티. 레에세이 Bxl1을 SSF 반응물에 첨가한 경우 또는 자일란 1 g 당 1 ㎎의 정제된 Fv43D를 첨가한 경우 SSF 반응으로부터 3일째에 측정한 EXP 및 에탄올 농도. SSF 반응(들)의 조건이 하기 실시예 6에 기재되어 있다.
상세한 설명
본 명세서에 사용되는 약어의 의미가 하기에 열거되어 있다: "min"은 분을 의미하며, "mins" 은 분들을 의미하며; "hr"은 시간을 의미하며, "hrs"는 시간들을 의미하며, "d" 는 일(들)을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터(들)를 의미하며, "㎖"는 밀리리터(들)를 의미하며, "L"는 리터(들)를 의미하며, "㎚"는 나노미터(들)를 의미하며, "㎜"는 밀리미터(들)를 의미하며, "㎝"는 센티미터(들)를 의미하며, "㎛"는 마이크로미터(들)를 의미하며, "mM"은 밀리몰(들)을 의미하며, "M"은 몰(들)을 의미하며, "mmoL"은 밀리몰(들)을 의미하며, "μmole"은 마이크로몰(들)을 의미하며, "g"은 그램(들)을 의미하며, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하며, "㎎"은 밀리그램(들)을 의미하며, "㎏"은 킬로그램(들)을 의미하며, "RPM" 또는 "rpm"은 분 당 회전수(revolutions per minute)를 의미하며, "vol.%"는 부피%를 의미하며, "wt.% "는 중량%를 의미하며, "RPS"는 초 당 회전수(revolutions per second)를 의미한다.
6.1. 일반적인 정의
달리 나타내지 않으면, 본 명세서에 인용된 모든 미국 특허 및 미국 특허 출원은 전체적으로 참고로 포함된다. 게다가, 양, 농도, 또는 기타 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위, 또는 바람직한 상한치 또는 바람직한 하한치의 목록으로 주어질 때, 이것은 그 범위 내에 형성된 연속체를 따르는 모든 범위 또는 수를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 값의 범위가 본 명세서에서 나열될 때, 달리 나타내지 않으면 그 범위는 그 범위의 종점과, 그 범위 내의 모든 정수 및 분수를 포함하고자 한다. 본 발명의 범주는 범위를 규정할 때 나열된 특정 값에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 발명의 요소 또는 구성요소 앞의 단수형("a", "an", 및 "the")은 그 요소 또는 구성요소의 실례(예를 들어, 출현)의 수에 관하여 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 단수형은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 요소 또는 구성요소의 단수형 단어 형태는 그 수가 명백하게 단수임을 의미하는 것이 아니라면 복수형을 또한 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 특허청구범위에서 언급될 때 기술된 특징부, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 의미하지만, 이것이 그의 하나 이상의 다른 특징부, 정수, 단계, 구성요소 또는 군의 존재 또는 부가를 배제하는 것은 아님을 의미한다. 용어 "포함하는"은 용어 "~로 본질적으로 이루어진" 및 "~로 이루어진"에 의해 포함되는 실시 형태들을 포함하는 것으로 의도된다. 이와 유사하게, 용어 "~로 본질적으로 이루어진"은 용어 "~로 이루어진"에 의해 포함되는 실시 형태들을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 발명의 성분 또는 반응물의 양, 또는 파라미터의 양을 수식하는 용어 "약"은, 예를 들어 현실 세계에서 농축물 또는 용액의 제조에 사용되는 전형적인 측정 및 액체 취급 절차를 통하여, 이들 절차에서의 고의가 아닌 실수를 통하여, 조성물의 제조 또는 방법의 수행에 이용되는 성분의 순도, 공급원 또는 제조의 차이 등을 통하여 발생할 수 있는 수치적 양에서의 변동을 말한다. 또한 용어 "약"은 특정한 초기 혼합물에서 생기는 조성물에 있어서 상이한 평형 조건으로 인하여 상이해지는 양을 포함한다. 용어 "약"으로 수식되든지 그렇지 않든지 간에, 특허청구범위는 그가 나열하는 양과 등가인 것을 포함한다.
용어 "동시 당화 발효" 또는 "SSF"는, 전형적으로 동일한 반응 용기에서 생성물 전부를 동시에 생성하기 위하여 바이오매스를 당화시키고 당화에 의해 생성된 발효성 당을 효소가 그리고/또는 발효 미생물이 사용하는 공정 또는 반응 구성을 말한다.
용어 "하이브리드 당화 발효(hybrid saccharification and fermentation)" 또는 "HSF"는 바이오매스를 한정된 정도로 당화시키고 (불완전 또는 부분 당화), 이어서 동시에 일어나는 당화 및 발효를 계속하는 공정 또는 반응 구성을 말한다.
용어 "분리 당화 발효(separate saccharification and fermentation)" "분리 가수분해 발효" 및 "SHF"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들은 바이오매스를 당화시키거나 또는 가수분해하여 상당히 완료시키거나 (예를 들어, 약 60% 이상 완료, 약 70% 이상 완료, 약 80% 이상 완료, 약 90% 이상 완료, 또는 약 95% 이상 완료) 또는 완료시키고 (예를 들어, 약 99% 이상 완료, 또는 약 100% 완료시켜서 주어진 당화 반응으로부터 방출되는 모든 발효성 당이 방출되게 함), 이어서 당화 또는 가수분해 단계에 의해 생성된 발효 당을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 별도의 그리고 특유한 발효 단계가 있는 공정 또는 반응 구성을 말한다.
용어 "발효성 당"은 발효 공정에서 미생물이 탄소원으로서 사용할 수 있는 올리고당류 및 단당류를 말한다.
용어 "부분 당화"는, 발효성 당이 당화가 진행되어 완료될 경우 방출되는 전체 발효성 당보다 더 적은 바이오매스의 한정된 당화를 말한다.
용어 "셀룰로오스계"는 셀룰로오스와, 예를 들어 헤미셀룰로오스를 포함하는 추가의 성분을 포함하는 조성물을 말한다.
용어 "당화"는 다당류 또는 다당류-함유 물질로부터의 발효성 당의 생성을 말한다.
용어 "바이오매스"는 임의의 셀룰로오스계 또는 리그노셀룰로오스계 물질을 말하며, 이는 셀룰로오스를 포함하며 선택적으로 헤미셀룰로오스, 리그닌, 전분, 올리고당류 및/또는 단당류를 추가로 포함하는 물질을 포함한다. 바이오매스는 또한 추가의 성분, 예를 들어 단백질 및/또는 지질을 포함할 수 있다. 바이오매스는 단일 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 바이오매스는 하나 초과의 공급원으로부터 유래되는 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 옥수수 속대 및 옥수수의 줄기와 잎의 혼합물, 또는 그래스 및 잎의 혼합물을 포함할 수 있다. 바이오매스는 바이오에너지 작물, 농업적 잔여물, 도시 고형 폐기물, 고형 산업 폐기물, 종이 제조업으로부터의 슬러지, 야드 폐기물, 목재 및 임학적 폐기물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바이오매스의 예에는, 제한 없이, 옥수수 속대, 작물 잔여물, 예를 들어 옥수수 껍질, 옥수수의 줄기와 잎, 풀, 밀, 밀짚, 보릿짚, 건조, 볏짚, 스위치그래스, 폐지, 사탕수수 바가스, 수수류, 물대, 코끼리풀, 억새, 삼나무, 곡물, 유연한 어린 가지(tress), 나뭇가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 덤불의 밀링으로부터 얻어진 구성요소, 야채류, 과실류, 꽃 및 동물성 퇴비가 포함된다.
용어 "당화 효소"는 발효성 당으로의 바이오매스의 성분의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 말한다. 흔히, 이 효소는 바이오매스가 전처리될 때 발효성 당을 생성함에 있어서 더욱 효과적임이 사실이다.
6.2. 상세한 설명
셀룰로오스계 재료로부터의 물질 또는 발효 생성물의 생성은 전형적으로 3개의 주요 단계를 포함한다. 이들 3개의 단계는 (1) 전처리 또는 사전 가수분해, (2) 효소적 가수분해 또는 당화, 및 (3) 발효이며, 그 후 당해 물질 또는 발효 생성물이 회수될 수 있다. 에탄올의 제조 공정이 하기에 예시되어 있지만, 유사한 공정이 다른 물질의 생성에 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
전처리. 전처리 또는 사전 가수분해 단계에서, 셀룰로오스계 재료 (예를 들어, 리그노셀룰로오스계 재료를 포함함)를 가열하여 리그닌 및 탄수화물 구조를 분해하여 대부분의 헤미셀룰로오스를 가용화하고 셀룰로오스 분획물이 셀룰로오스 분해 효소에 접근가능해지도록 한다. 가열 단계는 직접적으로 스팀을 이용하여 또는 촉매를 당해 재료에 선택적으로 첨가하여 반응을 가속화할 수 있는 슬러리 또는 혼합물에서 실시된다. 적합한 촉매는 예를 들어 강산, 예를 들어 황산 및 SO2, 또는 강염기, 예를 들어 수산화나트륨을 포함한다. 당해 전처리 단계는 효소 및 미생물의 투과를 돕는다. 셀룰로오스계 바이오매스는 또한 열수 스팀 폭발 전처리에 처해질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2002/0164730호 참조).
당화. 당화 단계로도 공지된 효소적 가수분해 단계에서, 본 명세서에 기재된 효소를 전처리된 재료에 첨가하여 셀룰로오스 분획물을 글루코스 및/또는 기타 당으로 전환시킨다. 일반적으로 당화 단계는 제어된 pH, 온도 및 혼합 조건 하에 교반 탱크 반응기 또는 발효기에서 실시된다. 당화 단계는 소정의 경우 최대 200 hr까지 지속될 수 있다. 당화는 약 30℃ 내지 약 65℃, 특히 약 50℃의 온도에서, 그리고 약 4 내지 약 5의 pH에서, 특히 약 pH 4.5에서 수행될 수 있다. 발효 미생물, 예를 들어 진균류(예를 들어, 효모 또는 사상균) 또는 박테리아(예를 들어, 자이모모나스 모빌리스 또는 클로스트리듐 서모셀룸)에 의해 대사될 수 있는 글루코스를 생성하기 위하여, 효소적 가수분해 단계는 전형적으로 β-글루코시다아제의 존재 하에 실시된다.
발효. 발효 단계에서, 전처리 및 효소적 가수분해 단계의 결과로서 셀룰로오스계 재료로부터 방출되는 당은 발효 유기체, 예를 들어 진균류(예를 들어, 효모 또는 사상균) 또는 박테리아(예를 들어, 자이모모나스 모빌리스 또는 클로스트리듐 서모셀룸)에 의해 에탄올 (또는 기타 물질)로 발효된다.
SSF. 본 발명은 발효 단계가, 특유한 또는 별도의 단계, 이어서 효소적 가수분해 단계라기보다는 오히려 동일한 용기에서, 바람직하게는 제어된 pH, 온도, 및 혼합 조건 하에 효소적 가수분해 단계와 동시에 수행되는, 반응 수율을 향상시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 소정의 태양에서, 당화 및 발효는 동일한 용기에서 동시에 실시되며, 따라서 동시 당화 발효 또는 "SSF"이다. 이 공정은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, "하이브리드 당화 발효" 또는 "HSF" 구성을 이용하여 수행되는 공정을 또한 포함한다. 소정의 태양에서, SSF 반응은 바이오매스의 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 당화될 때 (예를 들어, 발효 미생물을 당화 반응물에 첨가함으로써, 또는 발효를 유리하게 하는 세트의 조건을 시작함으로써) 개시된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "SSF"는 또한 다수의 당의 동시 발효를 포함한다 (문헌[Sheehan and Himmel, 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827]).
6.3 효소적 가수분해
더욱 고도한 식물의 세포벽은 다양한 탄수화물 중합체(carbohydrate polymer; CP) 성분으로 이루어진다. 이들 CP 성분은 공유적 및 비공유적 수단을 통하여 상호작용하여, 강성 세포벽 형성 및 팽압에 대한 저항에 필요한 구조적 완전성을 식물에 제공한다. 식물에서 발견되는 주요 CP는 셀룰로오스이며, 이는 식물 세포벽의 구조적 골격을 형성한다. 셀룰로오스 생합성 동안, 폴리-β-1,4-D-글루코스의 사슬들은 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통하여 자가 회합되어 셀룰로오스 마이크로피브릴을 형성하며, 이는 추가로 자가 회합되어 더욱 큰 피브릴을 형성한다. 셀룰로오스 마이크로피브릴은 약간 불규칙적이며, 다양한 결정도의 영역을 함유한다. 셀룰로오스 피브릴의 결정도는 수소 결합이 임의의 두 구성요소 셀룰로오스 사슬들 사이에서 얼마나 단단히 질서화되는지에 따라 달라진다. 덜 질서화된 결합을 가지며 따라서 글루코스 사슬에의 접근성이 더욱 큰 영역은 비결정성 영역으로 칭해진다.
셀룰로오스를 글루코스로 전환시키거나 또는 탈중합시키는 일반적인 모델은 3가지 효소 활성을 포함한다. 엔도글루카나아제는 셀룰로오스 사슬을 내부적으로 절단하여 더욱 짧은 사슬을 생성하고 접근가능한 말단의 수를 증가시키는데, 상기 말단에는 그 후 엑소글루카나아제가 작용한다. 엑소글루카나아제는 더욱 짧은 사슬의 환원 말단 또는 비환원 말단에 특이적이며, 글루코스의 이량체인 셀로바이오스를 유리시킬 수 있다. 엑소글루카나아제의 예에는 제한 없이 다양한 셀로바이오하이드롤라아제가 포함된다. 그 후 축적 셀로바이오스는 셀로바이아제에 의해 글루코스가 형성되도록 절단된다. 셀로바이아제의 예에는 제한 없이 다양한 β-1,4-글루코시다아제가 포함된다.
헤미셀룰로오스는 무수-글루코스를 함유하는 셀룰로오스의 것과는 상이한 당 단량체 세트를 함유한다. 예를 들어, 글루코스 이외에, 헤미셀룰로오스 중 당 단량체는 자일로스, 만노스, 갈락토스, 람노스 및 아라비노스를 포함할 수 있다. 헤미셀룰로오스는 대부분은 D-펜토스 당을 함유하며, 가끔 소량의 L-당도 함유한다. 자일로스는 가장 많은 양으로 존재하는 당 단량체이지만, 만누론산 및 갈락투론산이 또한 존재하는 경향이 있다. 헤미셀룰로오스는 예를 들어 자일란, 글루큐로노자일란, 아라비노자일란, 글루코만난 및 자일로글루칸을 포함한다.
본 발명의 효소 및 다중 효소 조성물은 헤미셀룰로오스 재료, 예를 들어 자일란, 아라비노자일란 및 자일란- 또는 아라비노자일란-함유 기질의 당화에 유용하다. 아라비노자일란은 자일로스 및 아라비노스로 구성된 다당류이며, 여기서 L-α-아라비노푸라노스 잔기는 β-(1,4)-결합 자일로스 중합체 골격에 분지점으로서 부착된다.
다른 성분들 중에서 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴, 리그닌, 단백질 및 회분을 함유할 수 있는 대부분의 바이오매스 공급원의 복잡성으로 인하여, 소정의 태양에서 본 발명의 효소 블렌드는 함께 작용하여 바이오매스를 효율적인 방식으로 발효성 당으로 분해시키는 일련의 기질 특이성을 갖는 효소를 함유할 수 있다. 리그노셀룰로오스 당화를 위한 다중 효소 복합물의 한 가지 예에는 셀로바이오하이드롤라아제(들), 자일라나아제(들), 엔도글루카나아제(들), β-글루코시다아제(들), β-자일로시다아제(들) 및 선택적으로 다양한 보조 단백질의 혼합물이 포함된다.
따라서, 본 발명은 에탄올과 같은 발효 생성물의 생성에 있어서 SSF 반응에서 발효 유기체(들)에 의해 에너지원으로 사용될 수 있는 탄수화물을 개별적으로 또는 총체적으로 생성할 수 있는 하나 이상의 효소의 용도를 고려한다.
소정의 태양에서, 다중 효소 조성물은 발효 유기체에 의해 SSF 반응에서 발효되는 당을 생성하도록 탄수화물 또는 탄수화물-함유 바이오매스 기질의 가수분해를 위한 SSF 반응에서 사용된다. 다중 효소 조성물 (제조 제품, 효소 앙상블(ensemble), 또는 "블렌드"를 포함함)은 소정의 태양에서 자연 비-발생성인 효소의 혼합물 (또는 "블렌드")을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "블렌드"는 하기를 말한다:
(1) 발효 브로쓰의 형태이든지 또는 부분적으로 또는 완전히 단리되거나 또는 정제된 폴리펩티드의 형태이든지 간에 성분 효소들을 조합함으로써 만들어진 조성물;
(2) 하나 이상의 성분 효소를 발현하도록 변경된 유기체에 의해 생성된 조성물; 선택적으로, 상기 유기체는 하나 이상의 유전자가 결실되도록 또는 하나 이상의 유전자 생성물이 불활성화되도록 변경될 수 있으며, 여기서 상기 유전자는 자일란 가수분해, 헤미셀룰로오스 가수분해 및/또는 셀룰로오스 가수분해에 영향을 주는 단백질을 코딩함;
(3) SSF 반응 동안 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 성분 효소들을 조합함으로써 만들어진 조성물; 및
(4) 예를 들어 SSF 반응 동안 원위치에서 생성된 효소 혼합물;
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 임의의 것 또는 이들 전부의 조합.
본 명세서에 구체적으로 기재된 효소들 중 임의의 것은 본 명세서에 기재된 효소들 중 임의의 하나 이상과, 또는 임의의 다른 입수가능한 그리고 적합한 효소와 조합되어 다중 효소 조성물을 생성할 수 있음을 또한 이해하여야 한다. 본 발명은 본 명세서에 열거되거나 또는 예시된 특정한 예시적인 조합에 제한되지 않거나 또는 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 본 명세서에 기재된 효소(들) 중 임의의 것은 SSF 반응 이전 또는 SSF 반응 동안 첨가될 수 있으며, 이는 발효 미생물(들)의 번식 동안 또는 그 후를 포함한다. 효소들은 개별적으로, 효소 블렌드로서, 또는 발효 브로쓰 등으로서 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 참조된 효소는 예를 들어 박테리아, 진균류, 효모 또는 포유류 기원을 포함하는 임의의 적합한 기원으로부터 유래되거나 또는 얻어질 수 있다. 용어 "얻어진"은 천연 효소로서 효소를 자연적으로 생산하는 유기체로부터 효소가 단리될 수 있거나, 또는 효소가 숙주 유기체에서 재조합적으로 생성될 수 있음을 의미하며, 여기서 재조합적으로 생성된 효소는 숙주 유기체에 대하여 외래 효소이거나 또는 천연 효소이며, 예를 들어 결실되고/되거나 삽입되고/되거나 치환된 하나 이상의 아미노산을 갖는 변경된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 당업계에 공지된 핵산 셔플링(shuffling) 과정에 의해 생성된 효소이다. 예를 들어, 재조합적으로 생성된 효소는 돌연변이체이고/이거나 천연 아미노산 서열의 단편인 것일 수 있다. "천연 효소"라는 것은 유기체의 게놈 내의 그의 천연 위치의 유전자 생성물을 포함하고 또한 천연 변이체를 포함하는 것으로 의미되며; "외래 유전자"라는 것은 숙주 유기체에서 보통은 발견되지 않지만 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자의 생성물, 또는 비천연 유기체 내로 삽입된 유전자, 또는 키메라 유전자 - 이는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 셔플링에 의한 것과 같이 재조합적으로 얻어지는 효소를 포함함 - 를 포함하는 것으로 의미된다.
소정의 태양에서, 효소는 정제될 수 있다. 효소, 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 기타 성분과 같은 물질을 수식하기 위하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된"은 그가 유래된 유기체의 다른 성분이 없거나 또는 사실상 없는 효소를 말한다. 소정의 태양에서, 용어 "정제된"은 또한 효소가 얻어진 천연 유기체의 성분이 효소에 없거나 또는 사실상 없는 상황을 포함한다. 효소는 "정제된" 것으로 생각될 수 있지만, 소량의 다른 단백질의 존재 하에 또는 회합된 채 남아있을 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다른 단백질"은 특히 다른 효소를 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된"은 또한 다른 성분들의 제거, 특히 다른 단백질, 그리고 더욱 특히는 본 발명의 효소의 기원 세포에 존재하는 다른 효소의 제거를 말한다. 따라서, 효소는 예를 들어 다른 성분이 사실상 없는 "사실상 순수한 폴리펩티드"일 수 있다. 주어진 효소가 생성되는 유기체는 예를 들어 재조합적 생성 효소에 적합한 숙주 유기체일 수 있다. 예를 들어, 사실상 순수한 폴리펩티드는 그가 일부분이 되는 혼합물 중 50 wt.% 이상, 60 wt.% 이상, 70 wt.% 이상, 80 wt.% 이상, 90 wt.% 이상, 95 wt.% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 수준으로 존재하는 폴리펩티드를 말할 수 있다. 다른 성분이 사실상 없는 폴리펩티드는 40 wt.% 미만, 30 wt.% 미만, 20 wt.% 미만, 10 wt.% 미만, 5 wt.% 미만, 2 wt.% 미만, 또는 1 wt.% 미만의 다른 성분을 함유하는 혼합물 형태로 있는 것이다.
1.1.1. 셀룰라아제
본 발명의 효소 블렌드는 하나 이상의 셀룰라아제를 포함할 수 있다. 셀룰라아제는 셀룰로오스 (β-1,4-글루칸 또는 β-D-글루코시딕 결합체)를 가수분해하여 글루코스, 셀로바이오스, 셀로올리고당류 등을 형성하는 효소이다. 셀룰라아제는 전통적으로 3가지 주요 부류, 즉 엔도글루카나아제 (EC 3.2.1.4) ("EG"), 엑소글루카나아제 또는 셀로바이오하이드롤라아제 (EC 3.2.1.91) ("CBH") 및 β-글루코시다아제 (β -D-글루코시드 글루코하이드롤라아제; EC 3.2.1.21) ("BG")로 분류된다 (문헌[Knowles et al., 1987, Trends in Biotechnol. 5(9):255-261] 및 문헌[Schulein, 1988, Methods of Enzymology 160:234-242]). 엔도글루카나아제는 셀룰로오스 섬유의 비결정성 부분에 주로 작용하며, 반면에 셀로바이오하이드롤라아제는 결정성 셀룰로오스를 분해할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 따라 사용하기 위한 셀룰라아제는 특히 하기 유기체 중 하나 이상으로부터 얻어질 수 있다: 크리니펠리스 스카펠라(Crinipellis scapella), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 마이셀리오프토라 서모필라(Myceliophthora thermophila), 소르다리아 피미콜라(Sordaria fimicola), 볼루텔라 콜레토트리코이데스(Volutella colletotrichoides), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 아크레모늄(Acremonium) sp., 엑시디아 글란둘로사(Exidia glandulosa), 포메스 포멘타리우스(Fomes fomentarius), 스폰기펠리스(Spongipellis) sp., 리조플라익티스 로세아(Rhizophlyctis rosea), 리조무코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus), 파이코마이세스 니테우스(Phycomyces niteus), 카에토스틸룸 프레세니이(Chaetostylum fresenii), 디플로디아 고사이피나(Diplodia gossypina), 울로스포라 빌그라미이(Ulospora bilgramii), 사코볼루스 딜루텔루스(Saccobolus dilutellus), 페니실륨 베루쿨로숨(Penicillium verruculosum), 페니실륨 크라이소게눔(Penicillium chrysogenum), 서모마이세스 베루코수스(Thermomyces verrucosus), 디아포르테 사인게네시아(Diaporthe syngenesia), 콜레토트리쿰 라게나륨(Colletotrichum lagenarium), 니그로스포라(Nigrospora) sp., 자일라리아 하이폭실론(Xylaria hypoxylon), 넥트리아 피네아(Nectria pinea), 소르다리아 마크로스포라(Sordaria macrospora), 티엘라비아 서모필라(Thielavia thermophila), 카에토뮴 모로룸(Chaetomium mororum), 카에토뮴 비르센스(Chaetomium virscens), 카에토뮴 브라실리엔시스(Chaetomium brasiliensis), 카에토뮴 쿠니콜로룸(Chaetomium cunicolorum), 사이스파스토스포라 보니넨시스(Syspastospora boninensis), 클라도리눔 포에쿤디시뭄(Cladorrhinum foecundissimum), 사이탈리듐 서모필라(Scytalidium thermophila), 글리오클라듐 카테눌라툼(Gliocladium catenulatum), 푸사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) ssp. 라이코페르시시(lycopersici), 푸사륨 옥시스포룸 ssp. 파시플로라(passiflora), 푸사륨 솔라니(Fusarium solani), 푸사륨 안구이오이데스(Fusarium anguioides), 푸사륨 포아에(Fusarium poae), 후미콜라 니그레센스(Humicola nigrescens), 후미콜라 그리세아(Humicola grisea), 파나에올루스 레티루기스(Panaeolus retirugis), 트라메테스 상귀네아(Trametes sanguinea), 쉬조필룸 코뮤네(Schizophyllum commune), 트리코테슘 로세움(Trichothecium roseum), 미크로스파에롭시스(Microsphaeropsis) sp., 악소볼루스 스틱토이데우스(Acsobolus stictoideus) spej., 포로니아 푼크타타(Poronia punctata), 노둘리스포룸(Nodulisporum) sp., 트리코데르마(Trichoderma) sp. (예를 들어, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)) 및 사일린드로카르폰(Cylindrocarpon) sp. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 셀룰라아제는 하기 하위 섹션에 기재된 바와 같이 칼코플루오르 분석법에 의해 측정할 때 0.1 이상, 0.2 이상, 0.3 이상, 0.4 이상, 또는 0.5 이상의 분율의 생성물을 성취할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 셀룰라아제는 전 셀룰라아제이고/이거나 하기 하위 섹션에 기재된 바와 같이 칼코플루오르 분석법에 의해 측정할 때 0.1 이상, 0.2 이상, 0.3 이상, 0.4 이상, 또는 0.5 이상의 분율의 생성물을 성취할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 셀룰라아제는 전 셀룰라아제이고/이거나 칼코플루오르 분석법에 의해 측정할 때 약 0.1 내지 약 0.5, 또는 약 0.1 내지 약 0.4, 또는 약 0.2 내지 약 0.4, 또는 약 0.3 내지 약 0.4, 또는 약 0.2 내지 약 0.5, 또는 약 0.3 내지 약 0.5의 분율의 생성물을 성취할 수 있다.
6.3.1.1. 칼코플루오르 화이트( Calcofluor White )를 이용한 셀룰라아제 활성 분석
인산 팽윤 셀룰로오스(Phosphoric acid swollen cellulose; PASC)는 문헌[Walseth, 1971, TAPPI 35:228] 및 문헌[Wood, 1971, Biochem. J. 121:353-362]의 수정된 프로토콜을 이용하여 아비셀(Avicel) PH-101로부터 제조된다. 짧게 말하면, 예시적인 방법에서, 아비셀은 진한 인산에 가용화하고 그 후 냉 탈이온수를 이용하여 침전시킨다. 셀룰로오스를 수집하고 물로 세척하여 중성 pH를 성취한 후, 이것을 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨 완충제 중 1% 고형물로 희석시킨다.
모든 효소 희석물은 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨 완충제를 이용하여 만들어진다. GC220 셀룰라아제 (다니스코 유에스 인크.(Danisco US Inc.), 제넨코르(Genencor))를 PASC 1 g 당 2.5, 5, 10, 및 15 ㎎의 단백질로 희석시켜 선형 보정 곡선을 생성한다. 시험할 샘플은 보정 곡선의 범위 내에 있도록, 즉 0.1 내지 0.4의 분율의 생성물의 응답이 얻어지도록 희석시킨다. 백 오십(150) μL의 1% 냉 PASC를 적합한 용기, 예를 들어 96웰 마이크로타이터 플레이트 내의 각각 20 μL의 효소 용액에 첨가한다. 플레이트의 뚜껑을 덮고, 플레이트를 인큐베이터/진탕기에서 50℃에서 2 hr 동안 인큐베이션하고 200 rpm에서 스핀시킨다. 그 후 반응물을 pH 10의 100 mM 글라이신 중 50 ㎍/㎖의 칼코플루오르 100 μL를 이용하여 급랭시킨다. 형광은 여기 파장 Ex = 365 ㎚, 그리고 방사 파장 Em = 435 ㎚에서 형광 마이크로플레이트 판독기에서 판독한다. 결과는 하기 등식에 따라 분수의 곱(fraction product)으로서 표현된다:
FP = 1-(Fl 샘플 - Fl 셀로바이오스를 포함하는 완충제)/(Fl 제로(zero) 효소 - Fl 셀로바이오스를 포함하는 완충제)
여기서, "FP"는 분수의 곱이며, "Fl"는 형광 단위(fluorescence unit)이다.
6.3.1.2. β- 글루코시다아제
본 발명의 효소 블렌드는 선택적으로 하나 이상의 β-글루코시다아제를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "β-글루코시다아제"는 EC 3.2.1.21에서 또는 EC 3.2.1.21 하에서 분류된 β-D-글루코시드 글루코하이드롤라아제를 말하고/말하거나, 소정의 글리코실 하이드롤라아제("GH") 패밀리의 구성원인 효소를 말하는데, 상기 GH 패밀리는 제한 없이 GH 패밀리 1, 3, 9 또는 48을 포함한다. 소정의 태양에서, 상기 용어는 셀로바이오스의 가수분해를 촉매하여 β-D-글루코스를 방출할 수 있는 효소를 말한다.
β-글루코시다아제는 임의의 적합한 미생물로부터 얻어질 수 있다. 이는 재조합적 수단에 의해 얻어지거나 또는 생성될 수 있거나, 또는 상업적 공급처로부터 획득될 수 있다. 적합한 β-글루코시다아제는 예를 들어 박테리아 및 진균류와 같은 미생물로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 적합한 β-글루코시다아제는 사상균으로부터 얻어질 수 있다.
소정의 태양에서, 적합한 β-글루코시다아제는 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus) (문헌[Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288], 아스페르길루스 카와치(Aspergillus kawachi) (문헌[Iwashita et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 5546-5553]), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) (국제특허 공개 WO 2002/095014호), 셀룰로모나스 비아조테아(Cellulomonas biazotea) (문헌[Wong et al., 1998, Gene 207:79-86]), 페니실륨 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum) (국제특허 공개 WO 200478919호), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) (문헌[Machida et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54: 3147-3155]), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (문헌[Wood et al., 2002, Nature 415: 871-880]), 또는 트리코데르마 레에세이로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 트리코데르마 레에세이 유래의 적합한 β-글루코시다아제는 β-글루코시다아제 1 (미국 특허 제6,022,725호), 트리코데르마 레에세이 β-글루코시다아제 3 (미국 특허 제6,982,159호), 트리코데르마 레에세이 β-글루코시다아제 4 (미국 특허 제7,045,332호), 트리코데르마 레에세이 β-글루코시다아제 5 (미국 특허 제7,005,289호), 트리코데르마 레에세이 β-글루코시다아제 6 (미국 특허 공개 제20060258554호), 또는 트리코데르마 레에세이 β-글루코시다아제 7 (미국 특허 공개 제20060258554호)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 적합한 β-글루코시다아제는 β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자의 발현에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 적합한 β-글루코시다아제는 예를 들어 소정의 그람(Gram)-양성 유기체 (예를 들어, 바실루스(Bacillus) 또는 방선균류(Actinomycetes))에 의해 또는 진핵 숙주 (예를 들어, 트리코데르마, 아스페르길루스, 사카로마이세스, 또는 피키아(Pichia))에 의해 세포외 공간 내로 분비될 수 있다.
적합한 β-글루코시다아제는 또한 상업적 공급처로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 방법, 조성물 및 기타 실시 형태에서 사용하기에 적합한 상업적 β-글루코시다아제 제제의 예에는 제한 없이 액셀러라아제™ BG (다니스코 유에스 인크., 제넨코르) 형태의 트리코데르마 레에세이 β-글루코시다아제; 노보자임(NOVOZYM™) 188 (아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 유래의 β-글루코시다아제); 메가자임(Megazyme) (메가자임 인터내셔널 아일랜드 엘티디.(Megazyme International Ireland Ltd.), 아일랜드 위클로우카운티 브레이시 브레이 비즈니스 파크 소재)으로부터 입수가능한 서마토가 마리티마(Thermatoga maritima) β-글루코시다아제 및 아그로박테리움(Agrobacterium) sp. β-글루코시다아제가 포함된다.
소정의 태양에서, 적합한 β-글루코시다아제는 하기 섹션 6.3.1.5에 기재된 바와 같이 전 셀룰라아제의 성분일 수 있다.
β-글루코시다아제 활성은 당업계에 공지된 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chen et al., 1992, Biochimica et Biophysica Acta 121:54-60]에 기재된 분석법이 이용될 수 있다. 이 분석법에서, 1 단위의 pNPG는 50℃ (또는 122 ℉) 및 pH 4.8에서 10 min 내에 파라-니트로페닐-B-D-글루코피라노사이드로부터 유리되는 1 μmoL의 니트로페놀을 나타낸다.
6.3.1.3. 엔도글루카나아제
본 발명의 효소 블렌드는 하나 이상의 엔도글루카나아제를 선택적으로 포함한다. 용어 "엔도글루카나아제"는 EC 3.2.1.4.에서 분류된 임의의 폴리펩티드를 말한다.
일부 태양에서, 트리코데르마 레에세이 EG1 (문헌[Penttila et al., 1986, Gene 63:103-112]) 및/또는 티. 레에세이 EGII (문헌[Saloheimo et al., 1988, Gene 63:11-21])가 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용된다. 다른 태양에서, 엔도글루카나아제는 티. 레에세이 엔도글루카나아제 VI (예를 들어, 미국 특허 제7,351,568호 참조), 엔도글루카나아제 VII (예를 들어, 미국 특허 제7,449,319호 참조), 또는 엔도글루카나아제 VIII (예를 들어, 미국 특허 제7,049,125호 참조)일 수 있다.
특정 실시 형태에서, 적합한 엔도글루카나아제는 티엘라비아 테레스트리스 열안정성 엔도글루카나아제 (문헌[Kvesitadaze et al., 1995, Appl. Biochem. Biotechnol. 50:137-143]); 트리코데르마 레에세이 EGIII (문헌[Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64:555-563]), EGIV (문헌[Saloheimo et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249:584-591]), EG5 (문헌[Saloheimo et al., 1994, Mol. Microbiol. 13:219-228]), EGVI (미국 특허 공개 제20070213249호), 또는 EGVII (미국 특허 공개 제20090170181호); 아시도서무스 셀룰로라이티쿠스(Acidothermus cellulolyticus) EI 엔도글루카나아제 (미국 특허 제5,536,655호); 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 엔도글루카나아제 V (EGV) (단백질 데이터 뱅크 엔트리 4ENG); 스타필로트리쿰 코코스포룸(Staphylotrichum coccosporum) 엔도글루카나아제 (미국 특허 공개 제20070111278호); 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus) 엔도글루카나아제 F1-CMC (문헌[Ooi et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18:5884]); 아스페르길루스 카와치이(Aspergillus kawachii) IFO 4308 엔도글루카나아제 CMC아제-1 (문헌[Sakamoto et al.,1995, Curr. Genet. 27:435-439]); 또는 에르위니아 카로토바라(Erwinia carotovara) (문헌[Saarilahti et al., 1990, Gene 90:9-14]); 아크레모늄 서모필룸(Acremonium thermophilum) ALKO4245 엔도글루카나아제 (미국 특허 공개 제20070148732호)일 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합한 엔도글루카나아제는 또한 예를 들어 국제특허 공개 WO 91/17243호, 국제특허 공개 WO 91/17244호, 국제특허 공개 WO 91/10732호 또는 미국 특허 제6,001,639호에 기재된 것일 수 있다.
6.3.1.4. 셀로바이오하이드롤라아제
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "셀로바이오하이드롤라아제"는 EC 3.2.1.91에서 분류된 임의의 셀로바이오하이드롤라아제를 말한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 적합하게는 하나 이상의 셀로바이오하이드롤라아제("CBH")를 포함할 수 있다.
일부 태양에서, 트리코데르마 레에세이 CBHI (문헌[Shoemaker et al., 1983, Bio/Technology 1:691-696]) 및/또는 CBHII (문헌[Teeri et al., 1983, Bio/Technolgy 1:696-699])가 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
일부 태양에서, 적합한 CBH는 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) CBH1 (스위스(Swiss) Prot 등록 번호 Q92400); 아스페르길루스 아쿨레아투스 CBH1 (스위스 Prot 등록 번호 O59843); 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) CBHA (젠뱅크 등록 번호 AF420019); 아스페르길루스 니둘란스 CBHB (젠뱅크 등록 번호 AF420020); 아스페르길루스 니게르 CBHA (젠뱅크 등록 번호 AF156268); 아스페르길루스 니게르 CBHB (젠뱅크 등록 번호 AF156269); 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea) CBH1 (스위스 Prot 등록 번호 O00082); 콘클리오볼루스 카르보나룸(Cochliobolus carbonarum) CBH1 (스위스 Prot 등록 번호 Q00328); 크라이포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica) CBH1 (스위스 Prot 등록 번호 Q00548); 푸사륨 옥시스포룸 CBH1 (Cel7A) (스위스 Prot 등록 번호 P46238); 후미콜라 그리세아 cbh1.2 (젠뱅크 등록 번호 U50594); 후미콜라 그리세아 변종 서모이데아(thermoidea) CBH1 (젠뱅크 등록 번호 D63515); 후미콜라 그리세아 변종 서모이데아 CBHI.2 (젠뱅크 등록 번호 AF123441); 후미콜라 그리세아 변종 서모이데아 exo1 (젠뱅크 등록 번호 AB003105); 멜라노카르푸스 알보마이세스(Melanocarpus albomyces) Cel7B (젠뱅크 등록 번호 AJ515705), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) CBHI (젠뱅크 등록 번호 X77778); 페니실륨 푸니쿨로숨 CBHI (Cel7A) (미국 특허 공개 제20070148730호); 페니실륨 잔티넬룸(Penicillium janthinellum) CBHI (젠뱅크 등록 번호 S56178); 파네로카에테 크라이소스포륨(Phanerochaete chrysosporium) CBH (젠뱅크 등록 번호 M22220); 파네로카에테 크라이소스포륨 CBHI-2 (Cel7D) (젠뱅크 등록 번호 L22656); 탈라로마이세스 에메르소니이(Talaromyces emersonii) Cbh1A (젠뱅크 등록 번호 AF439935); 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) CBH1 (젠뱅크 등록 번호 X53931), 또는 볼바리엘라 볼바세아(Volvariella volvacea) V14 Cbh1 (젠뱅크 등록 번호 AF156693)일 수 있다.
6.3.1.5. 전 셀룰라아제
소정의 태양에서, 본 발명의 효소 블렌드는 전 셀룰라아제를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전 셀룰라아제"는 천연 발생 및 천연 비발생 셀룰라아제-함유 조성물 둘 모두를 말하며, 이는 (1) 셀룰로오스의 내부 β-1,4 결합을 절단하여 더욱 짧은 글루코올리고당류를 생성하는 엔도글루카나아제, (2) "엑소" 방식으로 작용하여 셀로바이오스 단위를 상기 더욱 짧은 글루코올리고당류로부터 방출시키는 셀로바이오하이드롤라아제로서; 셀로바이오스 단위의 예에는 β-1,4 글루코스-글루코스 이당이 포함되는 것, 및 (3) 짧은 셀로올리고당류 또는 글루코스 이량체인 셀로바이오스로부터 글루코스 단량체의 방출을 촉매하는 β-글루코시다아제를 포함한다.
"천연 발생 셀룰라아제-함유" 조성물은 하나 이상의 셀로바이오하이드롤라아제계, 하나 이상의 엔도글루카나아제계, 및 하나 이상의 β-글루코시다아제계 성분 또는 활성을 포함하는 천연 발생 공급원에 의해 생성되는 것이며, 여기서 이들 성분 또는 활성 각각은 인간의 손이 닿지 않은 자연에서 생성되는 비 및 수준으로 발견된다. 따라서, 자연 발생 셀룰라아제-함유 조성물은 예를 들어 성분 효소의 비 또는 수준이 자연에서의 천연 유기체에 의해 생성되는 것으로부터 변경되지 않도록 셀룰로오스 분해 효소와 관련하여 변경되지 않은 유기체에 의해 생성되는 것이다. "자연 비발생 셀룰라아제-함유 조성물"은 (1) 자연 발생 비로 또는 자연 비발생 비로, 즉 변경된 비로 성분 셀룰로오스 분해 효소들을 조합함으로써; 또는 (2) 하나 이상의 셀룰로오스 분해 효소를 과다발현하거나 또는 과소발현하도록 유기체를 변경시킴으로써; 또는 (3) 적어도 하나의 셀룰로오스 분해 효소가 결실되도록 유기체를 변경시킴으로써 생성된 조성물을 말한다. "자연 비발생 셀룰라아제 함유" 조성물은 또한 자연 발생 유기체가 비-천연 조건 하에 성장하고 변경된 수준 또는 비의 효소를 생성하도록 자연 발생 유기체의 배양 조건을 조정하여 생긴 조성물을 말할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 전 셀룰라아제 제제는 하나 이상의 EG 및/또는 CBH 및/또는 β-글루코시다아제가 결실되고/되거나 과다발현될 수 있다. 본 발명에서, 전 셀룰라아제 제제는 셀룰로오스계 물질을 가수분해할 수 있는 임의의 미생물 유래의 것일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 전 셀룰라아제 제제는 사상균 전 셀룰라아제이다. 예를 들어, 전 셀룰라아제 제제는 아크레모늄, 아스페르길루스, 에메리셀라, 푸사륨, 후미콜라, 무코르(Mucor), 마이셀리오프토라, 뉴로스포라, 페니실륨, 사이탈리듐, 티엘라비아, 톨리포클라듐(Tolypocladium), 또는 트리코데르마 종 유래의 것일 수 있다. 전 셀룰라아제 제제는 예를 들어 아스페르길루스 아쿨레아투스, 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 또는 아스페르길루스 오리자에 전 셀룰라아제이다. 게다가, 전 셀룰라아제 제제는 푸사륨 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사륨 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사륨 크루크웰렌세(Fusarium crookwellense), 푸사륨 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사륨 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사륨 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사륨 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사륨 네군디(Fusarium negundi), 푸사륨 옥시스포룸, 푸사륨 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사륨 로세움(Fusarium roseum), 푸사륨 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사륨 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사륨 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사륨 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사륨 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사륨 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 또는 푸사륨 베네나툼(Fusarium venenatum) 전 셀룰라아제 제제일 수 있다. 전 셀룰라아제 제제는 또한 크라이소스포륨 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 후미콜라 인솔렌스, 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 서모필라, 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 페니실륨 푸니쿨로숨, 사이탈리듐 서모필룸(Scytalidium thermophilum), 또는 티엘라비아 테레스트리스 전 셀룰라아제 제제일 수 있다. 게다가, 전 셀룰라아제 제제는 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닝기이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 레에세이 (예를 들어, RL-P37 (문헌[Sheir-Neiss G et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984, 20, pp.46-53]), QM9414 (ATCC 번호 26921), NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767), 또는 트리코데르마 비리데 (예를 들어, ATCC 32098 및 32086) 전 셀룰라아제 제제일 수 있다.
전 셀룰라아제 제제는 특히 적합하게는 트리코데르마 레에세이 RutC30 전 셀룰라아제 제제일 수 있으며, 이는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 트리코데르마 레에세이 ATCC 56765로 입수가능하다. 예를 들어, 전 셀룰라아제 제제는 또한 적합하게는 페니실륨 푸니쿨로숨의 전 셀룰라아제일 수 있으며, 이는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 페니실륨 푸니쿨로숨 ATCC 번호 10446으로 입수가능하다.
전 셀룰라아제 제제는 또한 상업적 공급처로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합한 상업적 셀룰라아제 제제의 예에는 예를 들어 셀루클라스트(CELLUCLAST™) 및 셀릭(Cellic™) (노보자임즈 에이/에스(Novozymes A/S)) 및 라미넥스(LAMINEX™) BG, 인디에이지(IndiAge™) 44L, 프리마패스트(Primafast™) 100, 프리마패스트™ 200, 스페자임(Spezyme™) CP, 액셀러라아제™ 1000, 및 액셀러라아제™ 1500 (다니스코 유에스. 인크., 제넨코르)이 포함된다.
적합한 전 셀룰라아제 제제는 당업계에 공지된 임의의 미생물 배양법, 특히 발효를 사용하여 만들어질 수 있으며, 이는 셀룰로오스계 물질을 가수분해시킬 수 있는 효소의 발현으로 이어진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효"는 진탕 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 발효, 예를 들어 관심있는 셀룰라아제 및/또는 효소가 발현되고/되거나 단리되게 하는 조건 하에서 그리고 적합한 배지에서 실시되는 실험실 또는 공업용 발효기에서의 연속식, 배치식, 유가식 또는 고체 상태 발효를 말한다.
일반적으로, 미생물은 셀룰로오스계 물질을 가수분해시킬 수 있는 효소의 생성에 적합한 세포 배양 배지에서 배양된다. 배양은 당업계에 공지된 절차 및 변화를 이용하여 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 일어난다. 성장 및 셀룰라아제 생산에 적합한 배양 배지, 온도 범위 및 기타 조건은 당업계에 공지되어 있다. 비제한적 예로서, 트리코데르마 레에세이에 의한 셀룰라아제의 생산에 있어서의 전형적인 온도 범위는 24℃ 내지 28℃이다.
전 셀룰라아제 제제는 이것이 발효에 의해 생성된 그대로 사용될 수 있으며, 이때 회수 및/또는 정제는 전혀 없거나 최소로 있다. 예를 들어, 일단 셀룰라아제가 세포 배양 배지 내로 분비되면, 셀룰라아제를 함유하는 세포 배양 배지는 직접적으로 사용될 수 있다. 전 셀룰라아제 제제는 소비된 세포 배양 배지, 세포외 효소 및 세포를 포함하는 발효 재료의 분획화되지 않은 내용물을 포함할 수 있다. 반면, 전 셀룰라아제 제제는 또한 다수의 일상적인 단계, 예를 들어, 침전, 원심분리, 친화성 크로마토그래피, 여과 등에서 추가의 프로세싱에 처해질 수 있다. 예를 들어, 전 셀룰라아제 제제는 농축되고, 그 후 추가의 정제 없이 사용될 수 있다. 전 셀룰라아제 제제는 예를 들어 발효 후 세포를 사멸시키거나 세포 생육성을 감소시키는 소정의 화학적 에이전트를 포함하도록 조제될 수 있다. 세포는 예를 들어 당업계에 공지된 방법을 이용하여 용해되거나 또는 투과성으로 만들 수 있다.
전 셀룰라아제 제제의 엔도글루카나아제 활성은 기질로서 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)를 사용하여 결정될 수 있다. 적합한 분석법은 CMC에 작용하는 효소 혼합물에 의해 생성되는 환원 말단의 생성을 측정하며, 여기서 1 단위는 분 당 1 μmoL의 생성물을 유리시키는 효소의 양이다 (문헌[Ghose, T. K., Pure & Appl. Chem. 1987, 59, pp. 257-268]).
전 셀룰라아제는 β-글루코시다아제-풍부화 셀룰라아제일 수 있다. β-글루코시다아제-풍부화 전 셀룰라아제는 일반적으로 β-글루코시다아제 및 전 셀룰라아제 제제를 포함한다. β-글루코시다아제-풍부화 전 셀룰라아제 조성물은 재조합적 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 그러한 전 셀룰라아제 제제는 전 셀룰라아제를 생성할 수 있는 미생물에서의 β-글루코시다아제의 발현에 의해 성취될 수 있다. β-글루코시다아제-풍부화 전 셀룰라아제 조성물은 또한 예를 들어 전 셀룰라아제 제제 및 β-글루코시다아제를 포함할 수 있다. 예를 들어, β-글루코시다아제-풍부화 전 셀룰라아제 조성물은 적합하게는 그 블렌드/조성물 중 단백질의 총 중량을 기준으로 5 wt.%, 7 wt.%, 10 wt.%, 15 wt.% 또는 20 wt.% 이상, 그리고 25 wt.%, 30 wt.%, 35 wt.%, 40 wt.%, 또는 50 wt.% 이하의 β-글루코시다아제를 포함할 수 있다.
소정의 태양에서, 적합한 전 셀룰라아제는 유지 β-자일로시다아제 활성이 감소되거나 제거되도록 유전자 조작되었거나 유전자 조작되는 미생물로부터 얻어질 수 있다. 다른 태양에서, 적합한 전 셀룰라아제는 전화 β-자일로시다아제 활성이 증가되도록 유전자 조작되었거나 유전자 조작되는 미생물로부터 얻어질 수 있다. 또 다른 태양에서, 적합한 전 셀룰라아제는 유지 β-자일로시다아제 활성이 감소되었거나 제거되었을 뿐만 아니라 전화 β-자일로시다아제 활성이 증가되도록 유전자 조작된 또는 유전자 조작되는 미생물로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 전 셀룰라아제는 적합하게는 천연 bxl1 유전자가 결실되도록 조작된 트리코데르마 레에세이로부터 얻어질 수 있다. 다른 예에서, 전 셀룰라아제는 적합하게는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소를 재조합적으로 발현하도록 조작된 트리코데르마 레에세이로부터 얻어질 수 있다. 또 다른 예에서, 전 셀룰라아제는 적합하게는 천연 bxl1 유전자가 결실되도록 그리고 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소를 재조합적으로 발현하도록 조작된 트리코데르마 레에세이로부터 얻어질 수 있다. 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소의 예에는 제한 없이 Fv43D 및 본 명세서에 섹션 6.4에 기재된 기타의 것이 포함된다.
β-자일로시다아제 활성은 인공 기질 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드의 가수분해의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 가수분해 반응에는 반응 코스 동안 1H-NMR 분석의 이용이 뒤따를 수 있다. 글라이코시딕 결합의 환원 말단에 기여하는 잔기의 아노머 양성자는 그의 축 또는 적도 배향에 따라 특유한 화학적 이동을 갖는데, 이는 가수분해 후 새롭게 형성된 환원 당의 아노머 양성자가 그러한 것과 같다. 축 및 적도 형태의 평형 혼합물에 대한 새롭게 형성된 환원 당 아노머 양성자의 변선광은 가수분해 반응과 비교하여 더 느리다. 따라서, 기질에 존재하는 형태와 비교하여 첫 번째의 형성된 환원 말단 아노머 양성자의 배향의 1H-NMR 분석법은 배위를 전화시키는 것에 대하여 배위를 유지하는 메커니즘에 대한 분석법이다. 실험 방법은 예를 들어 문헌[Pauly et al., 1999, Glycobiology 9:93-100]에 기재되어 있다.
대안적으로, 가수분해 수준은 전화 효소에는 없는 유지 효소의 트랜스글리코실라아제 활성의 구별에 의해 결정될 수 있다. 이러한 분석법의 일례가 도 16에 예시되어 있다. 자일로바이오스 또는 자일로스 올리고머는, 유지 효소(예를 들어, 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 또는 Fv3A)의 존재 하에, EtOH의 존재 하에서의 평형 비의 7 내지 8배까지 EXP/자일로스의 급속한 상승을 나타내며, 그 후 EXP/자일로스는 평형 비 쪽으로 감소된다. 전화 효소(예를 들어, Fv43D)의 경우, 동일한 조건 하에서, EXP/자일로스는 평형 비 쪽으로 단조 증가한다.
6.3.2. 헤미셀룰라아제
매우 다양한 진균류 및 박테리아는 헤미셀룰로오스를 효소적으로 가수분해할 수 있다. 셀룰로오스 분해와 유사하게, 헤미셀룰로오스 가수분해는 다수의 효소들의 조화된 작용을 포함한다. 헤미셀룰라아제는 흔히 하기의 3가지 일반 카테고리, 즉 다당류 사슬 내의 내부 결합을 공격하는 엔도-작용 효소, 다당류 사슬의 환원 또는 비환원 말단으로부터 전진적으로 작용하는 엑소-작용 효소, 및 보조 효소인 아세틸에스테라아제 및/또는 리그닌 글리코시드 결합을 가수분해하는 에스테라아제로 분류된다. 에스테라아제의 예에는 쿠마르산 에스테라아제 및 페룰산 에스테라아제가 포함될 수 있다 (문헌[Wong et al., 1988, Microbiol. Rev. 52:305-317]; 문헌[Tenkanen and Poutanen, 1992, Significance of esterases in the degradation of xylans, in Xylans and Xylanases, Visser et al., eds., Elsevier, New York, N.Y., pp. 203-212]; 문헌[Coughlan and Hazlewood, 1993, Hemicellulose and hemicellulases, Portland, London, UK]; 문헌[Brigham et al., 1996, Hemicellulases: Diversity and applications, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, D.C., pp. 119-141]).
본 발명의 조성물 및/또는 방법에 사용하기에 적합한 헤미셀룰라아제는 예를 들어, 자일라나아제, 아라비노푸라노시다아제, 아세틸 자일란 에스테라아제, 글루큐로니다아제, 엔도-갈락타나아제, 만나아제, 엔도 또는 엑소 아라비나아제, 엑소-갈락타나아제 및 그 혼합물을 포함한다. 엔도-작용 헤미셀룰라아제 및 부속 효소의 예에는 제한 없이 엔도아라비나아제, 엔도아라비노갈락타나아제, 엔도글루카나아제, 엔도만나나아제, 엔도자일라나아제 및 페락산 엔도자일라나아제가 포함된다. 엑소-작용 헤미셀룰라아제 및 부속 효소의 예에는 제한 없이 α-L-아라비노시다아제,β-L-아라비노시다아제, α-1,2-L-푸코시다아제, α-D-갈락토시다아제, β-D-갈락토시다아제, β-D-글루코시다아제, β-D-글루큐로니다아제, β-D-만노시다아제, β-D-자일로시다아제, 엑소글루코시다아제, 엑소셀로바이오하이드롤라아제, 엑소만노바이오하이드롤라아제, 엑소만나나아제, 엑소자일라나아제, 자일란 α-글루큐로니다아제, 및 코니페린 β-글루코시다아제가 포함된다. 에스테라아제의 예에는 제한 없이 아세틸 에스테라아제(아세틸갈락탄 에스테라아제, 아세틸만난 에스테라아제, 및 아세틸자일란 에스테라아제) 및 아릴 에스테라아제 (쿠마르산 에스테라아제 및 페룰산 에스테라아제)가 포함된다.
소정의 태양에서, 헤미셀룰라아제는 엑소-작용 헤미셀룰라아제이다. 바람직하게는, 엑소-작용 헤미셀룰라아제는 산성 조건 하에, 예를 들어 pH 7 이하에서 헤미셀룰로오스를 가수분해하는 능력을 갖는다.
소정의 태양에서, 헤미셀룰라아제는 유효량으로 첨가된다. 예를 들어, 헤미셀룰라아제는 완전 발효 배지 중 고형물의 중량에 대하여 약 0.001 wt.% 이상, 약 0.002 wt.% 이상, 약 0.0025 wt.% 이상, 약 0.005 wt.% 이상, 또는 약 0.01 wt.% 이상의 양으로 본 발명의 다중효소 블렌드에 첨가된다. 다른 예에서, 헤미셀룰라아제는 완전 발효 배지 중 고형물의 중량에 대하여 약 0.001 wt.% 내지 약 5.0 wt.%, 예를 들어, 약 0.025 wt.% 내지 약 4.0 wt.%, 약 0.005 wt.% 내지 약 2.0 wt.%의 양으로 본 발명의 다중효소 블렌드에 첨가된다.
6.3.2.1. 자일라나아제
본 발명의 효소 블렌드는 선택적으로 하나 이상의 자일라나아제를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "자일라나아제"는 EC 3.2.1.8에서 또는 EC 3.2.1.8 하에서 분류된 임의의 자일라나아제를 말한다. 적합한 자일라나아제는 예를 들어 칼도셀룸 사카로라이티쿰(Caldocellum saccharolyticum) 자일라나아제 (문헌[Luthi et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56(9):2677-2683]), 서마토가 마리티마 자일라나아제 (문헌[Winterhalter & Liebel, 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61(5):1810-1815]), 서마토가 Sp. 주 FJSS-B.1 자일라나아제 (문헌[Simpson et al., 1991, Biochem. J. 277, 413-417]), 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans) 자일라나아제 (BcX) (미국 특허 제5,405,769호), 아스페르길루스 니게르 자일라나아제 (문헌[Kinoshita et al., 1995, J. Ferment. Bioeng. 79(5):422-428]); 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 자일라나아제 (문헌[Shareck et al., 1991, Gene 107:75-82; Morosoli et al., 1986, Biochem. J. 239:587-592]; 문헌[Kluepfel et al., 1990, Biochem. J. 287:45-50]); 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 자일라나아제 (문헌[Bernier et al., 1983, Gene 26(1):59-65]); 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 자일라나아제 (문헌[Clarke et al., 1996, FEMS Microbiol. Lett. 139:27-35]), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 자일라나아제 (문헌[Gilbert et al., 1988, J. Gen. Microbiol. 134:3239-3247]); 클로스트리듐 서모셀룸 자일라나아제 (문헌[Dominguez et al.,1995, Nat. Struct. Biol. 2(7):569-76]); 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 자일라나아제 (문헌[Nuyens et al., 2001, Appl. Microbiol. Biotech. 56:431-434]; 문헌[Yang et al.,1988, Nucleic Acids Res. 16(14B):7187]); 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) P262 자일라나아제 (문헌[Zappe et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18(8):2179]) 또는 트리코데르마 하르지아눔 자일라나아제 (문헌Rose et al., 1987, J. Mol. Biol. 194(4):755-756])를 포함한다.
자일라나아제는 적합하게는 예를 들어 진균류 및 박테리아 유기체, 예를 들어 아스페르길루스, 디스포로트리쿰(Disporotrichum), 페니실륨, 뉴로스포라, 푸사륨, 트리코데르마, 후미콜라, 서모마이세스, 및 바실루스를 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 자일라나아제(들)를 포함하는 소정의 구매가능한 제제가 본 발명의 조성물 및 방법에서 또한 사용될 수 있으며, 이는 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제, 라미넥스(등록상표) BG 및 스페자임(Spezyme)(등록상표) CP (다니스코 유에스, 제넨코르), 및 셀루클라스트(등록상표) 및 비스코자임(Viscozyme)(등록상표) (노보자임즈 에이/에스)을 포함한다.
소정의 태양에서, 자일라나아제는 유지 β-자일로시다아제 활성 및/또는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖지 않는다. 효소는 상기 섹션 6.3.1.5에 기재된 유지 대 전화 활성에 대하여 시험될 수 있다.
6.3.2.2. β- 자일로시다아제
본 발명의 효소 블렌드는 선택적으로 하나 이상의 β-자일로시다아제를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "β-자일로시다아제"는 EC 3.2.1.37에서 또는 EC 3.2.1.37 하에서 분류된 임의의 β-자일로시다아제를 말한다. 적합한 β-자일로시다아제는 예를 들어 탈라로마이세스 에메르소니이 Bxl1 (문헌[Reen et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun. 305(3):579-85])과; 제오바실루스 스테아로서모필루스(GeoBacillus stearothermophilus) (문헌[Shallom et al., 2005, Biochem. 44:387-397]); 사이탈리듐 서모필룸 (문헌[Zanoelo et al., 2004, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:170-176]); 트리코데르마 리그노룸(Trichoderma lignorum) (문헌[Schmidt, 1988, Methods Enzymol. 160:662-671]); 아스페르길루스 아와모리 (문헌[Kurakake et al., 2005, Biochim. Biophys. Acta 1726:272-279]); 아스페르길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor) (문헌[Andrade et al., Process Biochem. 39:1931-1938]); 스트렙토마이세스 sp. (문헌[Pinphanichakarn et al., 2004, World J. Microbiol. Biotechnol. 20:727-733]); 서모토가 마리티마(Thermotoga maritima) (문헌[Xue and Shao, 2004, Biotechnol. Lett. 26:1511-1515]); 트리코데르마 sp. SY (문헌[Kim et al., 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:643-645]); 아스페르길루스 니게르 (문헌[Oguntimein and Reilly, 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:1143-1154]); 또는 페니실륨 워트만니(Penicillium wortmanni) (문헌[Matsuo et al., 1987, Agric. Biol. Chem. 51:2367-2379])로부터 얻어진 β-자일로시다아제를 포함한다.
소정의 태양에서, β-자일로시다아제는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖지 않는다. 다른 태양에서, β-자일로시다아제는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 다른 추가의 태양에서, β-자일로시다아제는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖지 않지만 전화 β-자일로시다아제 활성은 갖는다. 효소는 상기 섹션 6.3.1.5에 기재된 유지 대 전화 활성에 대하여 시험될 수 있다.
6.3.2.3. L-α- 아라비노푸라노시다아제
본 발명의 효소 블렌드는 선택적으로 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "L-α-아라비노푸라노시다아제"는 EC 3.2.1.55에서 또는 EC 3.2.1.55 하에서 분류된 임의의 효소를 말한다. 적합한 L-α-아라비노푸라노시다아제 예를 들어 아스페르길루스 오리자에 (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 아스페르길루스 소재(Aspergillus sojae) (문헌[Oshima et al., 2005, J. Appl. Glycosci. 52:261-265]); 바실루스 브레비스(Bacillus brevis) (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 바실루스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus) (문헌[Kim et al., 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:474-482]); 비피도박테륨 브레베(Bifidobacterium breve) (문헌[Shin et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:7116-7123]; 비피도박테륨 롱굼(Bifidobacterium longum) (문헌[Margolles et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:5096-5103]);클로스트리듐 서모셀룸 (문헌[Taylor et al., 2006, Biochem. J. 395:31-37]); 푸사륨 옥시스포룸 (문헌[Panagiotou et al., 2003, Can. J. Microbiol. 49:639-644]); 푸사륨 옥시스포룸 에프.(f.) sp. 디안티(dianthi) (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 제오바실루스 스테아로서모필루스 T-6 (문헌[Shallom et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:43667-43673]); 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) (문헌[Lee et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:5377-5387]); 페니실륨 크라이소게눔 (문헌[Sakamoto et al., 2003, Biophys. Acta 1621:204-210]); 페니실륨 sp. (문헌[Rahman et al., 2003, Can. J. Microbiol. 49:58-64]);
슈도모나스 셀룰로사(Pseudomonas cellulosa) (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 리조무코르 푸실루스 (문헌[Rahman et al., 2003, Carbohydr. Res. 338:1469-1476]) ; 스트렙토마이세스 카르트레우시스(Streptomyces chartreusis) (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 스트렙토마이세스 서모비올라쿠스(Streptomyces thermoviolacus) (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 서모언에어로박터 에타놀리쿠스(Thermoanaerobacter ethanolicus) (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 서모바실루스 자일라니라이티쿠스(Thermobacillus xylanilyticus) (문헌[Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260]); 서모모노스포라 푸스카(Thermomonospora fusca) (문헌[Tuncer and Ball, 2003, Folia Microbiol. (Praha) 48:168-172]); 서모토가 마리티마 (문헌[Miyazaki, 2005, Extremophiles 9:399-406]); 트리코데르마 sp. SY (문헌[Jung et al., 2005, Agric. Chem. Biotechnol. 48:7-10]); 아스페르길루스 카와치이 (문헌[Koseki et al., 2006, Biochim. Biophys. Acta 1760:1458-1464]); 푸사륨 옥시스포룸 에프. sp. 디안티 (문헌[Chacon-Martinez et al., 2004, Physiol. Mol. Plant Pathol. 64:201-208]); 서모바실루스 자일라니라이티쿠스 (문헌[Debeche et al., 2002, Protein Eng. 15:21-28]); 후미콜라 인솔렌스 (문헌[Sorensen et al., 2007, Biotechnol. Prog. 23:100-107]); 메리필루스 기간테우스(Meripilus giganteus) (문헌[Sorensen et al., 2007, Biotechnol. Prog. 23:100-107]); 또는 라파누스 사티부스(Raphanus sativus) (문헌[Kotake et al., 2006, J. Exp. Bot. 57:2353-2362])로부터 얻어질 수 있다.
소정의 태양에서, L-α-아라비노푸라노시다아제는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖지 않는다. 다른 태양에서, L-α-아라비노푸라노시다아제는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 다른 추가의 태양에서, L-α-아라비노푸라노시다아제는 유지 β-자일로시다아제를 갖지 않지만 전화 β-자일로시다아제 활성은 갖는다. 효소는 상기 섹션 6.3.1.5에 기재된 유지 대 전화 활성에 대하여 시험될 수 있다.
6.3.3. 보조 단백질
셀룰로오스 분해 향상 활성을 갖는 다수의 폴리펩티드는 또한 상기에 나타낸 효소 및/또는 셀룰로오스 분해 단백질과 함께 사용되어 바이오매스 기질의 셀룰로오스 성분을 추가로 분해할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Brigham et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, ed.), pp. 119-141, Taylor & Francis, Washington D.C.]; 문헌[Lee, 1997, J. Biotechnol. 56: 1-24] 참조).
셀룰로오스 분해 향상 활성을 갖는 이러한 폴리펩티드의 그리고 셀룰로오스 분해 단백질의 최적의 양은 다수의 인자에 따라 달라지며, 상기 인자는 제한 없이 성분 셀룰로오스 분해 단백질들의 특정 혼합물, 셀룰로오스계 기질, 셀룰로오스계 기질의 농도, 셀룰로오스계 기질의 전처리(들), 온도, 시간, 및 pH, 및 발효 유기체의 성질을 포함한다.
본 발명의 효소 블렌드/조성물은 예를 들어 적합하게는 하나 이상의 보조 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 보조 단백질의 예에는 제한 없이 만나나아제 (예를 들어, 엔도만나나아제, 엑소만나나아제, 및 β-만노시다아제), 갈락타나아제 (예를 들어, 엔도- 및 엑소-갈락타나아제), 아라비나아제 (예를 들어, 엔도-아라비나아제 및 엑소-아라비나아제), 리그니나아제, 아밀라아제, 글루큐로니다아제, 프로테아제, 에스테라아제 (예를 들어, 페룰산 에스테라아제, 아세틸 자일란 에스테라아제, 쿠마르산 에스테라아제 또는 펙틴 메틸 에스테라아제), 리파아제, 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 61 폴리펩티드, 자일로글루카나아제, CIP1, CIP2, 스월레닌, 엑스판신, 및 셀룰로오스 파괴 단백질이 포함된다. 보조 단백질의 예에는 또한 CIP1-유사 단백질, CIP2-유사 단백질, 셀로바이오스 데하이드로게나아제 및 망간 퍼옥시다아제가 포함될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 셀룰로오스 파괴 단백질은 셀룰로오스 결합 모듈이다.
6.4 전화 β- 자일로시다아제 활성을 갖는 효소
본 발명에 따르면, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 SSF 반응에서 AXP (예를 들어, EXP) 형성을 감소시키기 위하여 사용된다. 따라서, 본 발명은 일 태양에서 적어도 하나의 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 다른 태양에서, 본 발명은 완전 발효 배지를 배양하는 단계를 포함하는, SSF 반응에서 원하는 발효 생성물을 생성하는 방법에 관한 것이며, 상기 완전 발효 배지는 적어도 하나의 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드를 포함한다.
적합한 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드는 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 43("GH43")의 구성원인 것으로부터 선택될 수 있다. GH43 패밀리 효소는 다수의 공지된 활성을 갖는다. 예를 들어, GH43 패밀리 효소는 EC 3.2.1.55 하에 분류된 것일 수 있으며, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 가질 수 있다. 다른 예에서, GH43 패밀리 효소는 EC 3.2.1.99 하에 분류된 것일 수 있으며, 엔도-아라비나아제 활성을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, GH43 패밀리 효소는 EC 3.2.1.145 하에 분류될 수 있으며, 갈락탄 1,3-β-갈락토시다아제 활성을 가질 수 있다. 다른 예에서, GH43 패밀리의 효소는 EC 3.2.1.37 하에 분류될 수 있으며, β-자일로시다아제 활성을 가질 수 있다. GH43 패밀리의 β-자일로시다아제, 예를 들어 상기에 기재된 것은 흔히 단지 전화 가수분해를 수행할 수 있지만, 이와는 대조적으로 GH3, -39, -52, 및 -54 패밀리로부터의 다양한 β-자일로시다아제는 유지 활성을 가지며 가수분해 및 트랜스글리코실화 반응 둘 모두를 수행할 수 있는 것으로 보고되었다. (문헌[Smaali et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:582-590]).
GH43 패밀리 효소는 전형적으로 5개 블레이드(bladed)-β-프로펠러 3차원 구조를 나타낸다. 상기 구조체의 "프로펠러" 부분은 4개 가닥 β-시트를 포함하는 "블레이드"-유사 구조의 5개 폴드(fold) 반복체를 기반으로 한다. 촉매적 일반 염기, 아스파르테이트, 촉매적 일반 산, 글루타메이트, 및 일반 염기의 pKa를 조정하는 아스파르테이트 잔기가 셀비브리오 자포니쿠스(Cellvibrio japonicus) CjArb43A,의 결정 구조를 통하여 확인되었으며, 이는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 확증되었다 (문헌[Nurizzo et al., 2002, Nat. Struct. Biol. 9(9) 665-8] 참조). 촉매적 잔기는 3개의 보존된 블록으로 배열되며, 상기 블록은 아미노산 서열 전체에 걸쳐 널리 퍼져 있다 (문헌[Pons et al., 2004, Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 54:424-432]). GH43 패밀리의 β-자일로시다아제 효소에 있어서, 예측된 촉매적 잔기가 도 32의 서열에 볼드체의 그리고 밑줄로 나타낸 유형의 페이스 폰트(face font)로 나타내어져 있다. 제오바실루스 스테아로서모필루스 자일로시다아제의 결정 구조 (문헌[Brux et al. 2006, J. Mol. Bio. 359:97-109])는 그 효소에서 기질 결합에 중요할 수 있는 몇몇 추가의 잔기를 제안한다.
상기 섹션 6.3.1.5에 기재된 바와 같이, 전화 β-자일로시다아제 활성은 적합한 분석법에 의해 측정될 수 있다.
따라서, 소정의 태양에서, 본 발명에서 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 GH43 패밀리 구성원이다. 예를 들어, 상기 효소는 Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A, 또는 XynB3 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 하기에 기재되어 있다.
6.4.1. Fv43D 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fv43D 폴리펩티드이다. Fv43D의 아미노산 서열 (서열 번호 2)이 도 19b에 그리고 도 32의 첫 번째 행에 예시되어 있다. 서열 번호 2는 미성숙 Fv43D의 서열이다. Fv43D는 서열 번호 2의 잔기 1 내지 20에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 19b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 예측된 보존 도메인 잔기는 도 19b에서 볼드체로 되어 있다. Fv43D는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스, 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D37 또는 D71 중 어느 하나; D155; 및 E251이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv43D 폴리펩티드"는 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 또는 320개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. Fv43D 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 Fv43D와 비교하여 잔기 D37 또는 D71; D155, 및 E251에서 변경되지 않는다. Fv43D 폴리펩티드는 바람직하게는 도 32의 정렬에서 예시된 바와 같이 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, 및 Fv43E, 중 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 또는 모든 9가지 사이에서 보존된 아미노산 잔기들 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 변경되지 않는다. Fv43D 폴리펩티드는 적합하게는 도 19b에 예시된 천연 Fv43D의 전체 예측 보존 도메인을 포함한다. 본 발명의 예시적인 Fv43D 폴리펩티드는 도 19b에 예시된 성숙 Fv43D 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv43D 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fv43D 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.2. Pf43A 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Pf43A 폴리펩티드이다. Pf43A의 아미노산 서열 (서열 번호 8)이 도 22b에 그리고 도 32의 네 번 째 행에 예시되어 있다. 서열 번호 8은 미성숙 Pf43A의 서열이다. Pf43A는 서열 번호 8의 잔기 1 내지 20에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 22b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 도 22b에서 예측된 촉매적 도메인 잔기는 볼드체로 되어 있으며, 에측된 탄수화물 결합 도메인 잔기는 대문자형으로 되어 있고, 촉매적 도메인과 탄수화물 결합 도메인을 분리하는 예측된 링커 잔기는 이탤릭체로 되어 있다. Pf43A는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D32 또는 D60 중 어느 하나; D145; 및 E196이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Pf43A 폴리펩티드"는 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. Pf43A 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 Pf43A와 비교하여 잔기 D32 또는 D60; D145, 및 E196에서 변경되지 않는다. Pf43A 폴리펩티드는 바람직하게는 도 32의 정렬에서 예시된 바와 같이 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, 및 Fv43E, 중 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 또는 모든 9가지 사이에서 보존된 아미노산 잔기들 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 변경되지 않는다. Pf43A 폴리펩티드는 적합하게는 도 22b에 예시된 천연 Pf43A의 전체 예측 보존 도메인을 포함한다. 본 발명의 예시적인 Pf43A 폴리펩티드는 도 22b에 예시된 성숙 Pf43A 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Pf43A 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Pf43A 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.3. Fv43E 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fv43E 폴리펩티드이다. Fv43E의 아미노산 서열 (서열 번호 10)이 도 23b에 그리고 도 32의 아홉 번째 행에 예시되어 있다. 서열 번호 10은 미성숙 Fv43E의 서열이다. Fv43E는 서열 번호 10의 잔기 1 내지 18에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 23b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 예측된 촉매적 도메인 잔기는 도 23b에서 볼드체로 되어 있다. Fv43E는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 및 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D40 또는 D71 중 어느 하나; D155; 및 E242이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv43E 폴리펩티드"는 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. Fv43E 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 Fv43E와 비교하여 잔기 D40 또는 D71; D155; 및 E242에서 변경되지 않는다. Fv43E 폴리펩티드는 바람직하게는 도 32의 정렬에서 예시된 바와 같이 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, 및 Fv43E, 중 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 또는 모든 9가지 사이에서 보존된 아미노산 잔기들 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 변경되지 않는다. Fv43E 폴리펩티드는 적합하게는 도 23b에 예시된 천연 Fv43E의 전체 예측 보존 도메인을 포함한다. 본 발명의 예시적인 Fv43E 폴리펩티드는 도 23b에 예시된 성숙 Fv43E 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv43E 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fv43E 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.4. Fv43B 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fv43B 폴리펩티드이다. Fv43B의 아미노산 서열 (서열 번호 12)이 도 24b에 그리고 도 32의 여섯 번째 행에 예시되어 있다. 서열 번호 12는 미성숙 Fv43B의 서열이다. Fv43B는 서열 번호 12의 잔기 1 내지 16에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 24b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 12의 잔기 17 내지 574에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 예측된 촉매적 도메인 잔기는 도 24b에서 볼드체로 되어 있다. Fv43B는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드 및/또는 p-니트로페닐-α-L-아라비노푸라노시드를 기질로서 이용한 분석에서 β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성 둘 모두를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이것은 다른 자일로시다아제 효소의 존재 하에 올리고머 혼합물로부터 자일로스 방출을 증가시키고 분지형 아라비노자일로올리고머로부터 아라비노스를 방출시키는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D38 또는 D68 중 어느 하나; D151; 및 E236이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv43B 폴리펩티드"는 서열 번호 12의 잔기 17 내지 472 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 550개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. Fv43B 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 Fv43B와 비교하여 잔기 D38 또는 D68; D151; 및 E236에서 변경되지 않는다. Fv43B 폴리펩티드는 바람직하게는 도 32의 정렬에서 예시된 바와 같이 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, 및 Fv43E, 중 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 또는 모든 9가지 사이에서 보존된 아미노산 잔기들 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 변경되지 않는다. Fv43B 폴리펩티드는 적합하게는 도 24b에 예시된 천연 Fv43B의 전체 예측 보존 도메인을 포함한다. 본 발명의 예시적인 Fv43B 폴리펩티드는 도 24b에 예시된 성숙 Fv43B 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv43B 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fv43B 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.5. Af43A 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Af43A 폴리펩티드이다. Af43A의 아미노산 서열 (서열 번호 14)이 도 25b에 그리고 도 32의 일곱 번째 행에 예시되어 있다. 서열 번호 14는 미성숙 Af43A의 서열이다. 예측된 보존 도메인 잔기는 도 25b에서 볼드체로 되어 있다. Af43A는 p-니트로페닐-α-L-아라비노푸라노시드를 사용한 분석에서 그리고 엔도자일라나아제의 작용을 통하여 생성된 올리고머 세트의 전환에 의한 아라비노스의 방출에 의해 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D26 또는 D58 중 어느 하나; D139; 및 E227이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Af43A 폴리펩티드"는 서열 번호 14의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 300개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. Af43A 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 Af43A와 비교하여 잔기 D26 또는 D58 ; D139; 및 E227에서 변경되지 않는다. Af43A 폴리펩티드는 바람직하게는 도 32의 정렬에서 예시된 바와 같이 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, 및 Fv43E, 중 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 또는 모든 9가지 사이에서 보존된 아미노산 잔기들 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 변경되지 않는다. Af43A 폴리펩티드는 적합하게는 도 25b에 예시된 천연 Af43A의 전체 예측 보존 도메인을 포함한다. 본 발명의 예시적인 Fv43B 폴리펩티드는 도 25b에 예시된 성숙 Af43A 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Af43A 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Af43A 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.6. Fo43A 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fo43A 폴리펩티드이다. Fo43A의 아미노산 서열 (서열 번호 24)이 도 31b에 그리고 도 32의 두 번째 행에 예시되어 있다. 서열 번호 24는 미성숙 Fo43A의 서열이다. Fo43A는 서열 번호 24의 잔기 1 내지 17에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 31b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 예측된 보존 도메인 잔기는 도 31b에서 볼드체로 되어 있다. Fo43A는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D37 또는 D72 중 어느 하나; D159; 및 E251이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fo43A 폴리펩티드"는 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 또는 320개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. Fo43A 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 Fo43A와 비교하여 잔기 D37 또는 D72; D159; 및 E251에서 변경되지 않는다. Fo43A 폴리펩티드는 바람직하게는 도 32의 정렬에서 예시된 바와 같이 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, 및 Fv43E, 중 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 또는 모든 9가지 사이에서 보존된 아미노산 잔기들 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 변경되지 않는다. Fo43A 폴리펩티드는 적합하게는 도 31b에 예시된 천연 Fo43A의 전체 예측 보존 도메인을 포함한다. 본 발명의 예시적인 Fo43A 폴리펩티드는 도 31b에 예시된 성숙 Fo43A 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fo43A 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fo43A 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.7. Gz43A 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Gz43A 폴리펩티드이다. Gz43A의 아미노산 서열 (서열 번호 22)이 도 30b에 그리고 도 32의 세 번째 행에 예시되어 있다. 서열 번호 22는 미성숙 Gz43A의 서열이다. Gz43A는 서열 번호 22의 잔기 1 내지 18에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 30b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 예측된 보존 도메인 잔기는 도 30b에서 볼드체로 되어 있다. Gz43A는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D33 또는 D68 중 어느 하나; D154; 및 E243이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Gz43A 폴리펩티드"는 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 300개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. Gz43A 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 Gz43A와 비교하여 잔기 D33 또는 D68 중 어느 하나; D154; 및 E243에서 변경되지 않는다. Gz43A 폴리펩티드는 바람직하게는 도 32의 정렬에서 예시된 바와 같이 Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, 및 Fv43E, 중 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 또는 모든 9가지 사이에서 보존된 아미노산 잔기들 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에서 변경되지 않는다. Gz43A 폴리펩티드는 적합하게는 도 30b에 예시된 천연 Gz43A의 전체 예측 보존 도메인을 포함한다. 본 발명의 예시적인 Gz43A 폴리펩티드는 도 30b에 예시된 성숙 Fo43A 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Gz43A 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Gz43A 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.8. 지. 스테아로서모필루스 XynB3 폴리펩티드
다른 태양에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 지. 스테아로서모필루스 XynB3 폴리펩티드이다. 지. 스테아로서모필루스 XynB3의 서열은 서열 번호 25로 제시된다. 지. 스테아로서모필루스 XynB3은 제오바실루스 스테아로서모필루스 T-6 유래의 535개 아미노산의 GH43 패밀리 효소이다. 상기 효소는 자일로올리고머의 비환원 말단으로부터 단일 자일로스 단위를 절단하며; 3개의 촉매적 잔기 D15, D128, 및 E187이 그의 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다 (문헌[Shallom et al., 2005, Biochemistry, 44:387-397]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "지. 스테아로서모필루스 XynB3 폴리펩티드"는 서열 번호 25의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 지. 스테아로서모필루스 XynB3 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 XynB3과 비교하여 잔기 D15, D128, 및 E187에서 변경되지 않는다. 본 발명의 지. 스테아로서모필루스 XynB3 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 지. 스테아로서모필루스 XynB3 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.4.9. 비브리오( Vibrio ) sp . XloA 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 비브리오 sp. XloA 폴리펩티드이다. 비브리오 sp. XloA는 비브리오 sp. 주 XY-214 유래의 β-1,3-자일로시다아제이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비브리오 sp. XloA 폴리펩티드"는 비브리오 sp. 주 XY-214 (문헌Umemoto et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74(1): 305-308]; 젠뱅크 등록 번호 AB300564) 유래의 β-1,3-자일로시다아제의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 비브리오 sp. XloA 폴리펩티드는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 비브리오 sp. XloA 폴리펩티드는 전화 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5 유지 β- 자일로시다아제 활성을 갖는 효소
본 발명에 따르면, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 SSF 반응에서 AXP (예를 들어, EXP) 생성을 향상시키거나 또는 증가시키기 위하여 사용된다. 따라서, 본 발명은 일 태양에서 적어도 하나의 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 다른 태양에서, 본 발명은 완전 발효 배지를 배양하는 단계를 포함하는, SSF 반응에서 원하는 AXP 화합물 또는 향상되거나 또는 증가된 양의 AXP 생성물을 생성하는 방법에 관한 것이며, 상기 완전 발효 배지는 적어도 하나의 유지 β-자일로시다아제 폴리펩티드를 포함한다.
적합한 전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드는 글리코시드 하이드롤라아제 패밀리 3("GH3"), GH30, GH31, GH39, GH52, GH54, 또는 GH116 패밀리 효소의 구성원인 것으로부터 선택될 수 있다.
상기 섹션 6.3.1.5에 기재된 바와 같이, 유지 β-자일로시다아제 활성은 적합한 분석법에 의해 측정될 수 있다.
따라서, 소정의 태양에서, 본 명세서에서 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54, 또는 GH116 패밀리 구성원이다. 예를 들어, 상기 효소는 아스페르길루스 자포니쿠스 XlnD, 푸사륨 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides) Fv30A, 푸사륨 베르티실리오이데스 Fv30B, 푸사륨 베르티실리오이데스 Fv39A, 푸사륨 베르티실리오이데스 Fv39B, 서모언에어로박터 사카로라이티쿰(Thermoanaerobacter saccharolyticum) XynB, 제오바실루스 스테아로서모필루스 XylA, 또는 트리코데르마 코닝기이 (Hypocrea koningii) Xyl1 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 하기에 기재되어 있다.
6.5.1. 아스페르길루스 자포니쿠스 XlnD 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 XlnD 폴리펩티드이다. XlnD의 아미노산 서열 (서열 번호 40)은 도 35b에 예시되어 있다. 서열 번호 40은 미성숙 XlnD의 서열이다. XlnD는 서열 번호 40의 잔기 1 내지 17에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 35b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 40의 잔기 18 내지 804에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "XlnD 폴리펩티드"는 서열 번호 40의 잔기 18 내지 804 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 750개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 XlnD 폴리펩티드는 도 35b에 예시된 성숙 XlnD 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 XlnB 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 XlnB 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5.2. 푸사륨 베르티실리오이데스 Fv30A 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fv30A 폴리펩티드이다. XlnD의 아미노산 서열 (서열 번호 42)은 도 36b에 예시되어 있다. 서열 번호 42는 미성숙 Fv30A의 서열이다. XlnD는 서열 번호 42의 잔기 1 내지 19에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 36b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 42의 잔기 20 내지 537에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv30A 폴리펩티드"는 서열 번호 42의 잔기 20 내지 537 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 Fv30A 폴리펩티드는 도 36b에 예시된 성숙 Fv30A 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv30A 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fv30A 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5.3. 푸사륨 베르티실리오이데스 Fv30B 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fv30B 폴리펩티드이다. Fv30B의 아미노산 서열 (서열 번호 44)은 도 37b에 예시되어 있다. 서열 번호 44는 미성숙 Fv30B의 서열이다. Fv30B는 서열 번호 44의 잔기 1 내지 24에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 37b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 44의 잔기 25 내지 485에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv30B 폴리펩티드"는 서열 번호 44의 잔기 25 내지 485 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 Fv30B 폴리펩티드는 도 37b에 예시된 성숙 Fv30B 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv30B 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fv30B 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5.4. 푸사륨 베르티실리오이데스 Fv39A 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fv39A 폴리펩티드이다. Fv39A의 아미노산 서열 (서열 번호 46)은 도 38b에 예시되어 있다. 서열 번호 46은 미성숙 Fv39A의 서열이다. Fv39A는 서열 번호 46의 잔기 1 내지 19에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 38b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 46의 잔기 20 내지 439에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv39A 폴리펩티드"는 서열 번호 46의 잔기 20 내지 439 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 Fv39A 폴리펩티드는 도 38b에 예시된 성숙 Fv39A 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv39A 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fv39A 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5.5. 푸사륨 베르티실리오이데스 Fv39B 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Fv39B 폴리펩티드이다. Fv39B의 아미노산 서열 (서열 번호 48)은 도 39b에 예시되어 있다. 서열 번호 48은 미성숙 Fv39B의 서열이다. Fv39B는 서열 번호 48의 잔기 1 내지 18에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 39b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 48의 잔기 19 내지 456에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fv39B 폴리펩티드"는 서열 번호 48의 잔기 19 내지 456 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 또는 350개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 Fv39B 폴리펩티드는 도 39b에 예시된 성숙 Fv39B 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv39B 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Fv39B 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5.6. 서모언에어로박터 사카로라이티쿰 XynB 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 XynB 폴리펩티드이다. XynB의 아미노산 서열 (서열 번호 50)은 도 40b에 예시되어 있다. XynB는 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)으로부터의 예측 신호 서열을 갖지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "XynB 폴리펩티드"는 서열 번호 50의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 XynB 폴리펩티드는 도 40b에 예시된 XynB 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 XynB 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 XynB 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5.7. 제오바실루스 스테아로서모필루스 XylA 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 XylA 폴리펩티드이다. XylA의 아미노산 서열 (서열 번호 52)은 도 41b에 예시되어 있다. XylA는 SignalP 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk에서 이용가능함)으로부터의 예측 신호 서열을 갖지 않지만, Uniprot 알고리즘(http://www.uniprot.org/uniprot에서 이용가능함)으로부터 예측되는, 서열 번호 52의 잔기 1 내지 18에 상응하는 신호 서열을 가지며 (밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 52의 잔기 19 내지 705에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "XylA 폴리펩티드"는 서열 번호 52의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 또는 650개의 연접 아미노산 잔기에 대하여, 또는 서열 번호 52의 잔기 19 내지 705에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 XylA 폴리펩티드는 도 41b에 예시된 성숙 XylA 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 XylA 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 XylA 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.5.8. 트리코데르마 코닝기이 ( Hypocrea koningii ) Xyl1 폴리펩티드
소정의 실시 형태에서, 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는 효소는 Xyl1 폴리펩티드이다. Xyl1의 아미노산 서열 (서열 번호 54)은 도 42b에 예시되어 있다. 서열 번호 54는 미성숙 Xyl1의 서열이다. Xyl1은 서열 번호 54의 잔기 1 내지 21에 상응하는 예측 신호 서열을 가지며 (도 42b에서 밑줄로 나타냄); 신호 서열의 절단은 서열 번호 54의 잔기 22 내지 500에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성하는 것으로 예측된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Xyl1 폴리펩티드"는 서열 번호 54의 잔기 22 내지 500 사이의 적어도 50개, 예를 들어 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개의 연접 아미노산 잔기에 대하여 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 그의 변이체를 말한다. 본 발명의 예시적인 Xyl1 폴리펩티드는 도 42b에 예시된 성숙 Xyl1 서열에 대하여 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 본 발명의 Xyl1 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 본 발명의 Xyl1 폴리펩티드는 유지 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
6.6 SSF 에서 사용하기 위한 효소의 재조합적 제조 방법
6.6.1. 핵산 및 발현 벡터
전화 β-자일로시다아제 폴리펩티드 또는 기타 당화 효소(들)(예를 들어, 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제)를 포함하는, SSF에서 사용하기 위한 효소("SSF 효소")를 코딩하는 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드 단편이 비상동성 핵산 제작물 또는 벡터 내로 포함될 수 있다. 그 후 상기 벡터는 예를 들어 사상균, 효모 또는 박테리아 세포를 포함하는 적합한 숙주 세포 내로 도입되거나 또는 상기 숙주 세포에서 복제될 수 있다. 본 명세서에 개시된 벡터 및 방법을 이용하여 하나 이상의 SSF 효소(들)를 발현시킬 수 있다. 임의의 벡터가, 그가 도입되는 세포에서 복제가능하고 생육가능하기만 하다면 사용될 수 있다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되어 있으며, 이들 중 다수는 구매가능하다. 클로닝 및 발현 벡터는 문헌에, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (CSHL Press)] 및 문헌[Ausubel et al., 2002, Short Protocols in Molecular Biology (Current Protocols)]에 광범위하게 기재되어 있으며, 각각의 관련 발현 벡터에 대한 내용은 본 명세서에 명백히 참고로 포함된다. 진균류 숙주 세포에 적합한 다른 예시적인 발현 벡터가 문헌[van den Hondel et al.,1991, Bennett and Lasure (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428]에 기재되어 있다.
관심있는 다양한 DNA 서열은 다수의 표준 절차를 이용하여 플라스미드 또는 벡터 (본 명세서에서 "벡터"로 총칭됨) 내로 삽입될 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 예를 들어, 관심있는 DNA 서열은 표준 절차를 이용하여 그리고 표준 조건 하에 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위 내로 삽입된다. 그러한 절차 및 관련된 서브클로닝 절차는 당업자의 지식의 범주 이내이다.
SSF 효소의 코딩 서열을 포함하는 재조합 사상균은 SSF 효소 코딩 DNA 서열을 포함하는 비상동성 핵산 제작물을 사상균 숙주 세포의 유전 물질 내로 도입함으로써 생성될 수 있다.
일단 SSF 효소를 코딩하는 원하는 형태의 핵산 서열이 얻어지면, 이것은 다양한 방식으로 선택적으로 변경될 수 있다. 서열이 비코딩 측면 영역을 포함할 경우, 측면 영역은 절제, 돌연변이 유발 등에 처해질 수 있다. 따라서, 전위(transition), 전환(transversion), 결실 및/또는 삽입이 자연 발생 서열에서 수행될 수 있다.
선택된 SSF 효소 코딩 서열은 잘 알려진 재조합 기술에 따라 적합한 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 이것은 그 후 SSF 효소를 발현할 수 있는 사상균 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 유전자 코드의 내재적 축퇴성으로 인하여, 사실상 동일하거나 또는 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 코딩하는 다른 DNA 서열을 이용하여 SSF 효소를 클로닝하고 발현시킬 수 있다.
또한 본 발명은 상기에 기재된 바와 같이 SSF 효소-코딩 핵산 서열들 중 하나 이상을 포함하는 재조합 핵산 제작물을 포함한다. 적합하게는, 제작물 각각은 본 발명의 서열이 정방향으로 또는 역방향으로 삽입된 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함한다.
적합하게는, 비상동성 핵산 제작물은 (i) 홀로 있는 것인; (ii) 예를 들어 융합 단백질 또는 신호 펩티드 코딩 서열과 같은 추가의 코딩 서열과 조합된 - 여기서, 원하는 SSF 효소 코딩 서열은 우성 코딩 서열임 - ; (iii) 적합한 숙주에서 코딩 서열의 발현에 효과적인 하나 이상의 비코딩 서열, 예를 들어 인트론 및 제어 요소, 예를 들어 프로모터 및 종결 요소, 또는 5' 및/또는 3' 비번역 영역과 조합된; 및/또는 (iv) SSF 효소 코딩 서열이 숙주 세포에 대하여 비상동성인 벡터 또는 숙주 환경 내의 SSF 효소 코딩 서열을 포함할 수 있다.
소정의 태양에서, 비상동성 핵산 제작물은 시험관 내에서 SSF 효소-코딩 핵산 서열을 세포, 예를 들어 확립된 사상균 또는 효모 주의 세포 내로 전달하는 데 이용된다. SSF 효소의 장기간 생성에 있어서, 안정한 발현이 바람직하다. 적합하게는, 안정한 형질전환체를 생성하는 데 효과적인 임의의 방법이 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시에 사용될 수 있다는 결론이 나온다.
적절한 벡터는 전형적으로 선발가능한 마커-코딩 핵산 서열, 삽입 부위 및 적합한 제어 요소, 예를 들어 프로모터 및 종결 서열을 갖추고 있다. 벡터는 예를 들어 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 그리고 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현에 효과적인 인트론 및 제어 요소와 같은 비코딩 서열을 포함하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 적합한 제어 요소는 예를 들어 프로모터 및 종결 요소, 또는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 다수의 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있으며, 이들 중 다수는 구매가능하다. 적합한 벡터 및 프로모터가 문헌에, 예를 들어 문헌[Sambrook, et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (CSHL Press)]에 또한 기재되어 있다.
예를 들어, 예시적인 프로모터는, 제한 없이 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV 프로모터, EF-1α 프로모터, tet-온(on) 또는 tet-오프(off) 시스템 중 tet 응답성 요소(tet responsive element; TRE)를 함유하는 프로모터 (예를 들어, 클론테크(ClonTech)의 Tet-온(등록상표) 및 Tet-오프(등록상표) 고급 유도성 유전자 발현 시스템(Advanced Inducible Gene Expression System)에 대한 클론테크 설명을 참조), 또는 β 액틴 프로모터와 소정의 금속 염의 첨가에 의해 상향조절될 수 있는 메탈로티오닌 프로모터와 같은 구성적(constitutive) 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열은 발현 목적을 위하여 특정 사상균 숙주 세포에 의해 인식되는 DNA 서열이다. 이것은 관심있는 SSF 효소를 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 연결은 발현 벡터에서 관심있는 SSF 효소를 코딩하는 DNA 서열의 개시 코돈과 관련하여 프로모터를 위치화한다. 프로모터 서열은 관심있는 SSF 효소의 발현을 매개하는 전사 및/또는 번역 제어 서열을 함유한다. 예에는 아스페르길루스 니게르, 에이. 아와모리, 또는 에이. 오리자에의 글루코아밀라아제, α-아밀라아제 또는 α-글루코시다아제 코딩 유전자; 에이. 니둘란스의 gpdA 또는 trpC 유전자; 뉴로스포라 크라사의 cbh1 또는 trp1 유전자; 에이. 니게르 또는 리조무코르 미에헤이의 아스파르틱 프로테이나아제 코딩 유전자; 에이치. 제코리나(H. jecorina)의 cbh1, cbh2, egl1, egl2, 또는 다른 셀룰라아제 코딩 유전자 유래의 프로모터가 포함된다.
선발가능한 마커의 선택은 숙주 세포에 의존적일 것이며, 상이한 숙주 세포에서 사용하기에 적합한 적절한 선발가능 마커는 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 선발가능 마커 유전자에는 에이. 니둘란스 또는 에이치. 제코리나 유래의 argB, 에이. 니둘란스 유래의 amdS, 뉴로스포라 크라사 또는 에이치. 제코리나 유래의 pyr4, 아스페르길루스 니게르 또는 에이. 니둘란스 유래의 pyrG가 포함된다. 다른 적합한 선발가능 마커는 예를 들어 trpc, trp1, oliC31, niaD 또는 leu2를 포함하며, 이는 trp-, pyr-, 또는 leu- 돌연변이주 등과 같은 돌연변이주를 형질전환시키기 위하여 사용되는 비상동성 핵산 제작물 내에 포함된다.
이러한 선발가능 마커는 형질전환체에 대사산물을 이용하는 능력을 부여할 수 있는데, 상기 대사산물은 그렇지 않을 경우 숙주 세포에 의해서는 대사되지 않는다. 예를 들어, 아세트아미다아제 효소를 코딩하는 에이치. 제코리나 유래의 amdS 유전자는 형질전환 세포가 질소원으로서 아세트아미드 상에서 성장하게 한다. 추가의 예에서, 선발가능 마커 (예를 들어, pyrG)는 영양요구성 돌연변이주가 선발용 최소 배지 상에서 성장하는 능력을 복구시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 선발가능 마커 (예를 들어, olic31)는 저해 약물 또는 항생제의 존재 하에 성장하는 능력을 형질전환체에 부여할 수 있다.
적합하게는, 선발가능 마커 코딩 서열은 당업계에 공지된 방법 및 기술을 이용하여 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 예시적인 플라스미드에는 제한 없이 pUC18, pBR322, pRAX, 및 pUC100이 포함된다. 예를 들어, pRAX 플라스미드는 에이. 니둘란스 유래의 AMAL 서열을 함유하며, 이는 에이. 니게르에서의 복제를 가능하게 한다.
본 발명의 실행은, 달리 구체적으로 나타내지 않으면, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당업계의 통상적인 기술 이내이다. 이러한 기술은 문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001, Moecular Cloning: A Laboratory Manual (CSHL Press)]; 문헌[Ausubel et al., 2002, Short Protocols in Molecular Biology (Current Protocols)]; 문헌[Freshney, 2005, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss)]; 및 문헌[Dunn et al., 2003, Short Protocols in Protein Science (Wiley)]을 참조하라. 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 간행물은 본 명세서에 참고로 포함된다.
6.6.2. 숙주 유기체 및 단백질 발현
본 발명에 의해 제공되는 것은 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 위한 관심있는 SSF 단백질을 발현하도록 조작된 숙주 세포이다. 적합한 숙주 세포는 임의의 미생물(예를 들어, 박테리아, 원생 생물, 조류(alga), 진균류(예를 들어, 효모 또는 사상균), 또는 임의의 기타 미생물)을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 바람직하게는 박테리아, 효모 또는 사상균 세포이다.
적합한 박테리아 속은 에스케리키아, 바실루스, 락토바실루스(Lactobacillus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 적합한 박테리아 종은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실루스 섭틸리스, 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 리비단스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
적합한 효모 속은 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 피키아, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 및 파피아(Phaffia)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 효모 종은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris pastoris), 피. 카나덴시스(P. canadensis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
적합한 사상균은 모든 사상균 형태의 유마이코티나(Eumycotina) 아문을 포함한다. 적합한 사상균 속은 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스, 아우레오바시디움(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크라이소포륨, 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 코라이나스쿠스(Corynascus), 카에르토뮴(Chaertomium), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 필로바시디움(Filobasidium), 푸사륨, 지베렐라(Gibberella), 후미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르, 마이셀리오프토라, 무코르, 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라, 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실륨, 파네로카에테, 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 사이탈듐(Scytaldium), 쉬조필룸, 스포로트리쿰(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 서모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아, 톨리포클라듐, 트라메테스, 및 트리코데르마를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
적합한 사상균 종은 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 포에티두스, 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 크라이소스포륨 루크노웬세, 푸사륨 박트리디오이데스, 푸사륨 세레알리스, 푸사륨 크루크웰렌세, 푸사륨 쿨모룸, 푸사륨 그라미네아룸, 푸사륨 그라미눔, 푸사륨 헤테로스포룸, 푸사륨 네군디, 푸사륨 옥시스포룸, 푸사륨 레티쿨라툼, 푸사륨 로세움, 푸사륨 삼부시눔, 푸사륨 사르코크로움, 푸사륨 스포로트리키오이데스, 푸사륨 술푸레움, 푸사륨 토룰로숨, 푸사륨 트리코테시오이데스, 푸사륨 베네나툼, 브제르칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아(Ceriporiopsis caregiea,) 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 파노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 수브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 수브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 후미콜라 인솔렌스, 후미콜라 라누기노사, 무코르 미에헤이, 마이셀리오프토라 서모필라, 뉴로스포라 크라사, 뉴로스포라 인테르메디아(Neurospora intermedia), 페니실륨 푸르푸로게눔, 페니실륨 카네센스(Penicillium canescens), 페니실륨 솔리툼(Penicillium solitum), 페니실륨 푸니쿨로숨, 파네로카에테 크라이소스포륨, 플레비아 라디아테(Phlebia radiate), 플레우로투스 에린기이(Pleurotus eryngii), 탈라로마이세스 플라부스(Talaromyces flavus), 티엘라비아 테레스트리스, 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 트리코데르마 하르지아눔, 트리코데르마 코닝기이, 트리코데르마 롱기브라키아툼, 트리코데르마 레에세이, 및 트리코데르마 비리데를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어 본 명세서에 기재된 방법에 따라 일단 재조합 SSF 효소 발현 제작물이 생성되었으면, 일상적인 방법을 이용하여 적합한 숙주 세포를 상기 제작물로 형질전환시킬 수 있다.
6.6.3. 효소 단리 및/또는 정제 방법
소정의 태양에서, 재조합 SSF 효소를 신호 서열을 이용하여 조작하여 재조합 SSF 효소가 숙주 세포의 배양 배지 내로 분비되게 한다. 소정의 태양에서, 관심있는 SSF 효소는 발효 브로쓰의 형태로 회수된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발효 브로쓰"는 발효에 의해 생성되는 효소 제제를 말하며, 이어서 이것은 그 후 최소의 회수 및/또는 정제를 겪거나 회수 및/또는 정제를 겪지 않는다. 예를 들어, 미생물 배양물은 포화되도록 성장시키며, 탄소 제한 조건 하에 인큐베이션하여 단백질 합성(예를 들어, 효소의 발현)을 허용하고, 일단 효소가 세포 배양 배지 내로 분비되면, 발효 브로쓰는 관심있는 SSF 효소가 회수될 수 있는 것이다. 발효 브로쓰는 예를 들어 발효 마지막에 유래시킨 발효 물질의 비분획화 또는 분획화 내용물을 함유할 수 있다. 전형적으로, 발효 브로쓰는 비분획화되며, 예를 들어 원심분리에 의해 미생물 세포(예를 들어, 사상균 세포)를 제거한 후 존재하는 세포 잔사 및 소비된 배양 배지를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 발효 브로쓰는 소비된 세포 배양 배지, 세포외 효소, 및 살아있는 또는 사멸된 미생물 세포를 함유한다. 일부 실시 형태에서, 발효 브로쓰는 분획화하여 미생물 세포를 제거하고, 따라서 소비된 세포 배양 배지 및 세포외 효소를 포함한다.
일부 태양에서, SSF 효소의 부분 또는 완전 정제가 바람직할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, SSF 효소는 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 균질성으로 정제된다.
그러나, 소정의 다른 태양에서, 관심있는 SSF 효소는 세포 형태(즉, 부분적으로 또는 전적으로 분비되는 것이 아님)로 생성될 수 있으며, 이는 그 후 세포 용해물로부터의 회수를 필요로 할 수 있다. 이러한 경우, SSF 효소는 당업계에서 일상적으로 이용되는 기술을 이용하여 이것을 생산한 세포로부터 정제된다. 이러한 기술의 예에는 제한 없이 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 문헌[van Tilbeurgh et al., 1984, FEBS Lett. 169:215-218] 참조), 이온 교환 크로마토그래피법 (예를 들어, 문헌[Goyal et al., 1991, Bioresource Technol. 36:37-50]; 문헌[Fliess et al., 1983, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314-318]; 문헌[Bhikhabhai et al., 1984, J. Appl. Biochem. 6:336-345]; 문헌[Ellouz et al., 1987, J. Chromatography 396:307-317] 참조), 고해상력을 갖는 재료를 이용한 이온 교환 크로마토그래피법 (예를 들어, 문헌[Medve et al., 1998, J. Chromatography A 808:153-165] 참조), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (예를 들어, 문헌[Tomaz and Queiroz, 1999, J. Chromatography A 865:123-128] 참조), 및 2상 분배법 (예를 들어, 문헌[Brumbauer, et al., 1999, Bioseparation 7:287-295] 참조)이 포함된다.
적합하게는, SSF 효소는 사전 확인된 특성, 예를 들어 특정 결합 에이전트 또는 매체에의 결합 친화성을 갖는 단백질 - 예를 들어 항체 또는 수용체 - ; 특정 분자량 범위; 또는 등전점 범위를 갖는 단백질이 분리되도록 분획화된다.
주어진 SSF 효소의 발현이 일단 성취되면, 그에 의해 생성된 SSF 효소는 세포로부터 또는 세포 배양물로부터 정제될 수 있다. 이러한 정제에 적합한 예시적인 절차에는 제한 없이 항체-친화성 컬럼 크로마토그래피; 이온 교환 크로마토그래피; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상에서의 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱(chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 및 예를 들어 세파덱스(Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과가 포함된다. 다수의 단백질 정제 방법이 이용될 수 있으며, 이들 방법은 당업계에 공지되어 있고 문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단백질 정제 방법은 문헌[Deutscher, 1990, Methods in Enzymology, 182(57):779]; 및 문헌[Scopes, 1982, Methods in Enzymology 90: 479-91]에 기재되어 있다.
흔히, 정제 단계(들) 또는 방법의 선택은 예를 들어 생산 공정의 성질, 및 생산되는 특정 단백질에 따라 달라진다.
6.6.4. 발효 미생물
본 발명의 SSF법은 당해 당화 반응에서 생성된 및/또는 당해 시스템에 첨가된 당으로부터 발효 생성물(예를 들어, 에탄올)을 생성하기 위하여 "발효 미생물"을 이용한다. 에탄올을 생산할 수 있는 발효 미생물은 때로 에탄올로겐(ethanologen)으로 칭해진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발효 미생물"은 원하는 발효 공정에서 사용하기에 적합한 임의의 미생물을 말한다. 본 발명에 따른 적합한 발효 미생물은 당, 예를 들어 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 갈락토스 또는 올리고당류를 원하는 발효 생성물로 직접적으로 또는 간접적으로 발효시킬 수 있으며, 즉 전환시킬 수 있다.
적합한 발효 미생물의 예에는 제한 없이 진균류 유기체, 예를 들어 효모가 포함된다. 구체적으로, 적합한 효모는 사카로마이세스 spp.의 주로부터 선택되고, 특히 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 다양한 유형의 효모가 구매가능하며, 이들 중, 예를 들어 에탄올 레드(ETHANOL RED™) 효모 (미국 소재의 페르멘티스/레사프레(Fermentis/Lesaffre)로부터 입수가능), FALI (미국 소재의 플레이슈만즈 이스트(Fleischmann's Yeast)로부터 입수가능), 수퍼스타트(SUPERSTART™) 및 서모삭(THERMOSACC)(등록상표) 신선 효모 (미국 위스콘신주 소재의 에탄올 테크놀로지(Ethanol Technology)로부터 입수가능), 바이오펌(BIOFERM) AFT 및 XR (미국 조지아주 소재의 노스 아메리칸 바이오프로덕츠 코포레이션(NABC)로부터 입수가능), 게르트 스트랜드(GERT STRAND) (스웨덴 소재의 게르트 스트랜드 에이비(Gert Strand AB)), 또는 페르미올(FERMIOL) (디에스엠 스페셜티즈(DSM Specialties)로부터 입수가능)이 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법의 실시에 이용될 수 있다.
다른 태양에서, 효모는 사카로마이세스 디스타티쿠스(Saccharomyces distaticus) 또는 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)이다. 또 다른 태양에서, 효모는 클루이베로마이세스이다. 클루이베로마이세스의 비제한적 예에는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 또는 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis)가 포함된다. 또 다른 태양에서, 효모는 칸디다이다. 칸디다의 비제한적 예에는 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis) 및 칸디다 브라시캐(Candida brassicae)가 포함된다. 또 다른 태양에서, 효모는 클라비스포라(Clavispora)이다. 클라비스포라의 비제한적 예에는 클라비스포라 루시타니애(Clavispora lusitaniae) 및 클라비스포라 오푼티애(Clavispora opuntiae)가 포함된다. 다른 태양에서, 효모는 파카이솔렌, 예를 들어 파카이솔렌 탄노필루스(Pachysolen tannophilus)이다. 다른 태양에서, 효모는 브레탄노마이세스(Bretannomyces), 예를 들어, 브레탄노마이세스 클라우세니이(Bretannomyces clausenii)이다. 효모 발효는 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Philippidis, 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization (Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, D.C., 179-212]을 참조하라.
글루코스를 에탄올로 효율적으로 발효시킬 수 있는 박테리아는 예를 들어 자이모모나스 모빌리스 및 클로스트리듐 서모셀룸 (예를 들어, 문헌[Philippidis, 1996, 상기] 참조).
사카로마이세스 세레비지애 (예를 들어, 문헌[Chen and Ho, 1993, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40:135-147]; 문헌[Ho et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64:1852-1859] 참조), 또는 박테리아, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 (예를 들어, 문헌[Beall et al., 1991, Biotech. Bioeng. 38: 296-303] 참조), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) (예를 들어, 문헌[Ingram, et al., 1998, Biotechnol. Bioeng. 58:204-214] 참조), 또는 자이모모나스 모빌리스 (예를 들어, 문헌[Zhang et al., 1995, Science 267:240-243]; 문헌[Deanda et al., 1996, Appl. Environ. Microbiol. 62:4465-4470] 참조)에서의 비상동성 유전자의 클로닝에 의해 헥소스 및 펜토스를 에탄올로 전환시킬 수 있는(동시 발효(cofermentation)) 유기체를 제작하였다. 이러한 미생물은 유리하게는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
소정의 실시 형태에서, 발효 미생물은 아세테이트에 대하여 내성이 향상된 자이모모나스 모빌리스이다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2009/0221078호 참조).
소정의 실시 형태에서, 발효 미생물은 자일로스의 이용성이 향상된 자이모모나스 모빌리스이다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2009/0246846호 참조).
소정의 실시 형태에서, 발효 미생물은 펜토스를 에탄올로 발효시키는 능력을 갖는 자이모모나스 모빌리스이다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0162271호 참조).
6.6.5. 발효 배지
일부 태양에서, 본 발명의 SSF 반응 또는 방법은 발효 배지 또는 완전 발효 배지에서 실시된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발효 배지"는 SSF 반응이 일어나는 데 필요한 성분들 전부가 존재하기 전의 배지를 말한다. 따라서 발효 배지는 예를 들어 부분 당화 공정에서 생긴 배지일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 발효 배지는 SSF 반응이 일어나는 데 필요한 모든 성분을 함유하는 배지일 수 있다. 그 경우, 발효 배지는 "완전 발효 배지"로도 칭해진다. 게다가, 또 다른 실시 형태에서, 발효 배지가 배지일 수 있으며, 여기서 SSF 반응은 진행 중이거나 수행 중이고 따라서 소정의 당화 생성물을 함유할 수 있다.
완전 발효 배지는 탄수화물 기재의 셀룰로오스계 또는 기타 기질, 발효 유기체, 및 탄수화물 기재의 셀룰로오스계 또는 기타 기질을 가수분해시킬 수 있는 효소를 포함한다 (예를 들어 하기 섹션 6.7.2에 기재된 바와 같음). 완전 발효 배지의 배양 코스에 걸쳐, 발효성 당이 효소적 가수분해를 통하여 형성되며, 이는 다시 발효 유기체에 의해 대사되어 발효 생성물을 생성한다.
6.7. 동시 당화 발효 공정
소정의 태양에서, 본 발명의 SSF 반응은 25℃ 내지 50℃의 온도에서 실시된다. 예를 들어, SSF 반응은 25℃ 이상, 28℃ 이상, 30℃ 이상, 32℃ 이상, 35℃ 이상, 또는 38℃ 이상의 온도에서 일어난다. 예를 들어, SSF 반응은 50℃ 이하, 45℃ 이하, 40℃ 이하, 38℃ 이하, 35℃ 이하, 또는 30℃ 이하의 온도에서 일어난다. 예를 들어, SSF 반응은 28℃ 내지 45℃, 예를 들어 30℃ 내지 40℃, 32℃ 내지 38℃의 온도 범위에서 일어난다. 예시적인 실시 형태에서, SSF 반응은 32℃ 내지 35℃의 온도에서 수행된다. 다른 실시 형태에서, SSF 반응은 약 32℃의 온도에서 수행된다. SSF 반응이 수행되는 온도는 예를 들어 반응 동안 위 또는 아래로 조정될 수 있다.
SSF에서, 셀룰로오스의 효소적 가수분해 및 에탄올로의 글루코스의 발효는 1단계로 조합된다 (예를 들어, 문헌[Philippidis, 1996, Cellulose bioconversion technology, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, D.C., pp. 179-212] 참조).
SSF 공정은 일반적으로 배치식 발효 공정으로서 수행되며, 여기서 발효는 시작부터 끝까지 단일 탱크에서 행해진다. 대안적으로, SSF 공정은 중단 없이 작동하는 정상 상태 발효 시스템인 연속식 발효 공정으로서 수행될 수 있으며, 여기서 각각의 발효 단계는 주어진 발효 시스템의 별도의 섹션에서 일어나고, 유량은 필요한 체류시간에 상응하도록 설정된다. 환언하면, 본 발명의 발효 공정의 개별 단계는 배치식으로 또는 연속식으로 실시될 수 있다. 모든 단계가 배치식으로 실시되는 공정, 또는 모든 단계가 연속식으로 실시되는 공정, 또는 하나 이상의 단계가 배치식으로 실시되고 하나 이상의 단계가 연속식으로 실시되는 공정이 본 발명에서 고려된다.
소정의 실시 형태에서, 유가식 SSF 공정이 바람직할 수 있다. 유가식 공정은 배치 시기 및 공급 시기를 수반한다. 배치 시기의 배양 배지 및 공급 시기 동안 첨가되는 배양 배지는 화학적으로 규정되며, 공급 시기의 배양 배지는 적어도 공급 시기의 일부 동안, 사전 정의된 지수 함수를 따르는 공급 속도로 첨가되며, 이로써 특정 성장 속도를 사전 정의된 값으로 유지하게 된다.
본 발명의 SSF 반응은 적합하게는 3 내지 7 d의 기간 동안 진행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 SSF 반응은 최대 3 d, 4 d, 5 d, 6 d, 또는 7 d 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 SSF 발효 공정은 제한 없이 알코올(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 1,3-프로판다이올); 유기 산(예를 들어, 시트르산, 아세트산, 이타콘산, 락트산, 글루콘산, 글루코네이트, 락트산, 석신산, 2,5 다이케토-D-글루콘산); 케톤(예를 들어, 아세톤); 아미노산(예를 들어, 글루탐산); 가스(예를 들어, H2 및 CO2), 및 예를 들어, 항생제(예를 들어, 페니실린 및 테트라사이클린); 효소; 비타민(예를 들어, 리보플라빈, B12, β-카로틴); 호르몬 및 기타 화합물을 포함하는 더욱 복합적인 화합물을 포함하는 발효 생성물을 생성하기 위하여 사용되는 발효 공정을 포함한다.
소정의 태양에서, 본 발명은 재조합 발효 박테리아, 예를 들어 자이몬모나스(Zymonmonas)에서 사용하기에 특정적으로 적합한 SSF 조건(즉, 본 명세서에서 "재조합 자이모모나스 SSF 조건"으로도 칭해짐)의 세트를 제공한다. 예를 들어, 이들 조건은 예를 들어 옥수수 속대, 바가스, 크라프트(Kraft) 펄프 기질과 같은 전처리된 기질을 이용하여 적합한 재조합 자이모모나스 모빌리스 하에 SSF 플라스크 런(run)을 혐기적으로 수행하는 것, 및 특정 기질 및 전처리에 따라 약 33℃, pH 5.8, 및 약 10 wt.% 내지 25 wt.%의 고형물의 로딩에서 반응을 수행하는 것을 포함한다. 또한 이들 조건은 예를 들어 10%의 적합한 자이모모나스 모빌리스 주, 예를 들어 주 ZW705(재조합체) 또는 ZW1(야생형) 접종물 (5 g)을 임의의 추가의 영양제를 포함하지 않는 반응 혼합물 내에 첨가함으로써 발효를 시작하는 것을 포함한다.
소정의 태양에서, 본 발명은 진균류, 예를 들어 에스. 세레비지애 효모인 발효 미생물에서 사용하기에 특정적으로 적합한 SSF 조건(즉, 본 명세서에서 "효모 SSF 조건"으로도 칭해짐)의 세트를 제공한다. 예를 들어, 이들 조건은 적합한 효모 주, 예를 들어 서모사크(THERMOSACC)(등록상표) 드라이(DRY) 효모를 이용하여 38℃ 및 pH 5.0에서 반응을 수행하고, 임의의 추가의 영양제를 이용하지 않고서 0.1 wt%로 접종을 수행하고, 예를 들어 전처리된 기질, 물, 황산, 당화 효소(들) 및 효모 주를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 CO2 가스를 제거함으로써 혐기적으로 SSF 런을 수행하는 것, 및 반응 용기를 적절한 속도로, 예를 들어 100 RPM으로, 적합한 시간 동안, 예를 들어 3 d 동안 진탕시키는 것을 포함한다.
6.7.1. SSF 생성물의 회수
발효 생성물은 발효 유기체에 의해 생산되는 임의의 물질일 수 있다. 특정 태양에서, 상기 물질은 알코올이다. 용어 "알코올"은 하나 이상의 하이드록실 부분(moiety)을 함유하는 물질을 포함한다. 특정 태양에서, 알코올은 아라비니톨이다. 다른 태양에서, 알코올은 부탄올이다. 다른 태양에서, 알코올은 에탄올이다. 다른 태양에서, 알코올은 글리세롤이다. 다른 태양에서, 알코올은 메탄올이다. 다른 태양에서, 알코올은 1,3-프로판다이올이다. 또 다른 태양에서, 알코올은 소르비톨이다. 다른 추가의 태양에서, 알코올은 자일리톨이다. 예를 들어, 문헌[Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241]; 문헌[Silveira and Jonas 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408]; 문헌[Nigam, and Singh, 1995, Process Biochem. 30 (2): 117-124]; 문헌[Ezeji et al., 2003, World J. Microbiol. Biotechnol. 19 (6): 595-603]을 참조하라.
증류는 발효 단계로부터의 발효 브로쓰에서 실시하여 예를 들어 에탄올과 같은 발효 생성물을 회수할 수 있다. 발효 및 증류 단계는 동시에 또는 별도로/순차적으로 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 증류 후 두 생성물, 즉 알코올, 예를 들어 에탄올과 발효 잔여물 또는 잔존 생성물 (증류 잔재물(whole stillage))이 회수된다. 물과의 공비 혼합물인 알코올은 예를 들어 분자 체질과 같은 표준 과정에 의해 분리 단계에서 추가로 정제된다. 예를 들어, 순도가 최대 약 96 vol.%인 에탄올이 얻어질 수 있으며, 이는 예를 들어 연료 에탄올, 마시는 에탄올, 즉, 휴대용 뉴트랄 스피릿츠(neutral spirits), 또는 공업용 에탄올로서 사용될 수 있다.
다른 물질 또는 발효 생성물에 있어서, 당업계에 공지된 임의의 방법이 회수에 사용될 수 있으며, 이는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제 크로마토그래피), 전기 영동 절차(예를 들어, 예비 등전 집중), 차별적 용해성(예를 들어, 황산암모늄 침전법), SDS-PAGE, 증류 또는 추출을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
6.7.2. 공급재료 또는 탄수화물의 공급원
임의의 적합한 셀룰로오스계 기질 또는 원료가 본 발명의 SSF 공정의 실시에서 사용될 수 있다. 기질은 원하는 발효 생성물, 즉, 발효에서 얻어질 물질, 및 이용되는 공정을 기반으로 하여 선택될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 기질의 예에는 셀룰로오스-함유 물질, 예를 들어 목재 또는 식물 잔여물, 또는 발효 배지에의 직접적인 첨가에 의해 공급될 수 있고/있거나 발효 미생물에 의해 후에 대사될 수 있는 프로세싱된 셀룰로오스계 물질로부터 얻어지는 저분자량 당 DP1-3이 포함된다.
바이오매스는 셀룰로오스 및/또는 헤미셀룰로오스 (리그노셀룰로오스계 바이오매스는 리그닌을 또한 포함할 수 있음), 예를 들어 씨앗, 곡물, 괴경, 식물 폐기물 또는 식품 프로세싱 또는 공업적 프로세싱의 부산물 (예를 들어, 줄기), 옥수수 (속대, 줄기와 잎 등), 그래스 (예를 들어, 인디안 그래스(Indian grass), 예를 들어 소르가스트룸 누탄스(Sorghastrum nutans); 또는 스위치 그래스, 예를 들어 파니쿰(Panicum) 종, 예를 들어 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum)), 목재(나뭇조각, 프로세싱 폐기물을 포함함), 종이, 펄프, 재생지(예를 들어, 신문지)를 포함하는 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 다른 바이오매스 물질은 감자, 대두 (평지씨), 보리, 호밀, 귀리, 밀, 비트 또는 사탕수수 바가스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
6.8. 바이오매스의 전처리
SSF 반응 전에, 바이오매스(예를 들어, 리그노셀룰로오스계 물질)는 바람직하게는 자일란, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스 및/또는 리그닌 물질이 효소에 더욱 접근가능해지도록 하고 따라서 본 발명의 방법에 의한 당화 및 발효에 더욱 기꺼이 따르게 하기 위하여 전처리 단계에 처해진다.
일 태양에서, 전처리는 예를 들어 반응기와 같은 적합한 용기에서 건조 바이오매스 물질을 금속 염 및 강산의 묽은 용액으로 이루어진 촉매에 처하는 것을 수반하며; 이는 셀룰로오스 가수분해의 활성화 에너지 또는 온도를 저하시켜 더욱 높은 당 수율이 얻어지게 할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제6,660,506호; 미국 특허 제6,423,145호를 참조한다.
다른 예시적인 전처리 방법은 바이오매스의 가수분해를 수반하며, 이는 셀룰로오스를 글루코스로 주로 탈중합시키지 않고서 헤미셀룰로오스의 탈중합을 주로 유발하도록 선택된 온도 및 압력 수준에서 수성 배지에서 제1 단계의 가수분해 단계에 상기 물질을 처함에 의한 것이다. 이 단계는 슬러리로 이어지며, 여기서 액체 수성 상은 헤미셀룰로오스의 탈중합에서 생긴 용해 단당류를 함유하고, 고체상은 셀룰로오스 및 리그닌을 함유한다. 제2 가수분해 단계는 셀룰로오스의 적어도 대부분이 탈중합되어 셀룰로오스의 용해/용해성 탈중합 생성물을 함유하는 액체 수성 상으로 이어지는 조건을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,536,325호를 참조하라.
다른 예시적인 방법은 약 0.4% 내지 2%의 강산을 이용한, 하나 이상의 단계의 묽은 산 가수분해에 의해 바이오매스 물질을 프로세싱하는 단계; 및 산-가수분해된 바이오매스 물질의 미반응 고체 리그노셀룰로오스계 성분을 알칼리 탈리그닌화에 의해 처리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,409,841호를 참조하라.
다른 예시적인 전처리 방법은 사전 가수분해 용기, 예를 들어 반응기에서 바이오매스(예를 들어, 리그노셀룰로오스계 물질)를 사전 가수분해하는 단계; 산성 액체를 고체 리그노셀룰로오스계 물질에 첨가하여 혼합물을 만드는 단계; 혼합물을 적합한 반응 온도로 가열하는 단계; 리그노셀룰로오스계 물질을 리그노셀룰로오스계 물질로부터의 약 20% 이상의 리그닌을 함유하는 가용화 부분과 셀룰로오스를 함유하는 고체 분획물로 분획화하기에 충분한 시간 동안 상기 반응 온도를 유지하는 단계; 혼합물을 반응 온도에서 또는 그 근처에서 유지하면서 고체 분획물로부터 가용화 부분을 제거하는 단계 - 여기서, 고체 분획물 중 셀룰로오스는 효소적 소화에 대하여 더욱 기꺼이 따르게 됨 - ; 및 가용화 부분을 회수하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,705,369호를 참조하라.
다른 예시적인 방법에서, 전처리 방법은 과산화수소 H2O2를 이용한다. 예를 들어, 문헌[Gould, 1984, Biotech. Bioengr. 26:46-52]을 참조하라.
또 다른 예시적인 방법에서, 전처리는 매우 낮은 바이오매스 농도의 바이오매스를 화학량론적 양의 수산화나트륨 및 수산화암모늄과 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Teixeira et al., 1999, Appl. Biochem.Biotech. 77-79:19-34]을 참조하라.
다른 실시 형태에서, 전처리는 중간 정도의 온도, 압력 및 pH에서 약 9 내지 약 14의 pH에서 리그노셀룰로오스를 화학물질(예를 들어, 염기, 예를 들어 탄산나트륨 또는 수산화칼륨)과 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 국제특허 공개 WO2004/081185호를 참조하라.
다른 예시적인 방법에서, 전처리는 암모니아를 이용한다. 예를 들어, 전처리 방법은 바이오매스를 고 고형물의 조건 하에 저 암모니아 농도에 처하는 것을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20070031918호, 국제특허 공개 WO 2006/11901호를 참조하라.
본 발명은 하기 실시예로 추가로 예시된다. 실시예는 단지 예시 목적으로 제공된다. 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주 또는 내용을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: SSF 반응에서의 Exp 형성의 분석
7.1. 재료 및 방법
7.1.1. 기질
하기는 이 연구에 사용한 기질의 목록이다. 전처리 기질의 셀룰로오스, 자일란 및 리그닌 조성도 열거되어 있다. 조성 분석은 표준 바이오매스 분석 절차에 대한 NREL 프로토콜(NRE protocols for Standard Biomass Analytical Procedures; http://www.nrel.gov/biomass/pdfs /42618.pdf에서 이용가능)에 상술된 표준 분석법을 이용하여 실시하였다:
묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대. 옥수수 속대를 예를 들어 미국 특허 공개 제2007-0031918-A1호, 미국 특허 공개 제2007-0031919-A1호, 미국 특허 공개 제2007-0031953-A1호, 미국 특허 공개 제2007-0037259-A1호 및 국제특허 공개 WO06/110901 A2호 (달리 나타내지 않으면)에 설명된 방법 및 프로세싱 범위에 따라 효소적 가수분해 이전에 전처리하였다. 기질 조성물은 하기를 포함한다: 34.8%의 셀룰로오스, 29.2%의 자일란, 12.8%의 리그닌.
묽은 황산 전처리 사탕수수 바가스. 이 기질은 문헌[Schell et al, 2003, (App. Biochem. Biotechnol. Vol. 105-108, 69-85)]에 상술된 바와 같이 NREL에 의해 제조 및 제공되었다. 바가스를 20% (w/w)의 고형물 농도, 165℃의 온도, 1.44% (w/w)의 산 및 8 min의 대략적인 체류 시간에서 전처리하였다. 기질 조성물은 하기를 포함한다: 55.0%의 셀룰로오스, 3.1%의 자일란, 31.2%의 리그닌.
공업용의 비표백된 혼합형 활엽수 펄프 기질. 이 기질은 크라프트 공정 및 산소 탈리그닌화를 이용하여 제조하였다 (카파수(Kappa Number) = 13). (연구는 프랑스 환경 및 에너지 관리청(l'Agence de l'Environnement et de la Maitrise de l'Energie; ADEME 0501C0099)을 통하여 프랑스 국립 연구청(l'Agence Nationale de la Recherche; ANR-05-BIOE-007)에서 지원함). 기질 조성물은 하기를 포함한다: 74.6%의 셀룰로오스, 20.7%의 자일란, 2.6%의 리그닌.
공업용의 비표백된 침엽수 펄프 기질. 이 기질은 크라프트 공정 및 산소 탈리그닌화를 이용하여 제조하였다 (카파수(Kappa Number) = 14). (연구는 프랑스 환경 및 에너지 관리청(ADEME 0501C0099)을 통하여 프랑스 국립 연구청(ANR-05-BIOE-007)에서 지원함). 기질 조성물은 하기를 포함한다: 81.9%의 셀룰로오스, 8.0%의 자일란, 1.9%의 리그닌.
7.1.2. 효소
하기는 이 연구에서 사용한 효소 및 효소 혼합물의 목록이다.
액셀러라아제™ 1500 (다니스코 유.에스. 인크, 제넨코르)은 유전자 변형 트리코데르마 레에세이에 의해 생성된 고 β-글루코시다아제 활성 셀룰라아제 효소 복합물이다. 이것은 다수의 효소 활성을 포함하며, 그 중 대다수는 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제, β-글루코시다아제, 및 헤미셀룰라아제 활성이다.
트리코데르마 레에세이에 의해 또한 생성된 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 (다니스코 유.에스. 인크., 제넨코르)는 자일라나아제 활성을 갖는 전 셀룰라아제를 보충하기 위하여 보조 생성물로서 작용하도록, 그리고 리그노셀룰로오스계 바이오매스 프로세싱 산업에서 다양한 다당류 전환을 향상시키기 위하여 상승 작용에 의해 작용하도록 설계된 헤미셀룰라아제 효소 복합물이다. 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 중 우세한 자일라나아제 활성은 티. 레에세이 Xyn2의 것이다 (문헌[LaGrange et al., 1996, Appl. Environ. Microbiol. 62:1036-1044]).
Bxl1: 이는 트리코데르마 레에세이 유래의 β-자일로시다아제이다. Bxl1의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 4로 제공되어 있다. Bxl1은 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Xyn3: 이는 트리코데르마 레에세이 유래의 GH10 패밀리 자일라나아제이다. Xyn3의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 18로 제공되어 있다. Xyn3은 버치우드(birchwood) 아조-자일란 (아일랜드 위클로우 소재의 메가자임)을 이용하면, 그리고 간접적으로, 자일로바이오시다아제와 조합된 Xyn3이 전처리 바이오매스에 또는 단리된 헤미셀룰로오스에 작용할 때 자일로바이오시다아제의 존재 하에 자일로스 단량체 생성을 증가시키는 그의 능력에 의하면 엔도자일라나아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Fv3A: 이는 푸사륨 베르티실리오이데스 유래의 GH3 패밀리 효소이다. Fv3A의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 6으로 제공되어 있다. Fv3A는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머 (도 15 및 도 16) 및 분지형 아라비노자일란 올리고머 - 헤미셀룰로오스로부터의 것 - 를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Fv51A는 푸사륨 베르티실리오이데스 유래의 GH51 패밀리 효소이다. Fv51A의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 16으로 제공되어 있다. Fv51A는 p-니트로페닐-α-L-아라비노푸라노시드를 사용한 분석에서 그리고 엔도자일라나아제의 작용에 의해 헤미셀룰로오스로부터 방출된 올리고머 세트로부터의 아라비노스의 방출에 의해 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Fv43D: 이는 푸사륨 베르티실리오이데스 유래의 GH43 패밀리 효소이다. Fv43D의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 2로 제공되어 있다. Fv43D는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스, 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. (도 15 및 도 16).
Fv43B: 이는 푸사륨 베르티실리오이데스 유래의 GH43 패밀리 효소이다. Fv43B의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 12로 제공되어 있다. Fv43E는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Pf43A: 이는 페니실륨 푸니쿨로숨 유래의 GH43 패밀리 효소이다. Pf43A의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 8로 제공되어 있다. Pf43A는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Fv43E: 이는 푸사륨 베르티실리오이데스 유래의 GH43 패밀리 효소이다. Fv43E의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 10으로 제공되어 있다. Fv43E는 p-니트로페닐-β-자일로피라노사이드, 자일로바이오스 또는 혼합된 선형 자일로올리고머를 기질로서 사용한 분석에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Af43A: 이는 아스페르길루스 푸미가투스 유래의 GH43 패밀리 효소이다. Af43A의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 14로 제공되어 있다. Af43A는 p-니트로페닐-α-L-아라비노푸라노시드를 사용한 분석에서 그리고 엔도자일라나아제의 작용에 의해 헤미셀룰로오스로부터 방출된 올리고머 세트로부터의 아라비노스의 방출에 의해 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
XlnA: XlnA는 아스페르길루스 투벤겐시스(Aspergillus tubengensis) 유래의 자일라나아제이다. XlnA의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 20으로 제공되어 있다. 본 실시예에서 사용한 XlnA 단백질은 정제되지 않은 것으로서 주요 구성성분이 XlnA인 효소 제제의 형태였다.
Bgl1: Bgl1은 티. 레에세이 β-글루코시다아제 1 (서열 번호 26)이다. Bgl1 유전자는 예를 들어 문헌[Barnett et al., 1991, Bio-Technology 9(6):562-567]에 기재되었다.
7.1.3. 주
주 #229: 돌연변이 유발 및 고 셀룰라아제 생성 역가에 대한 선발을 통하여 RL-P37로부터 유래시킨 트리코데르마 레에세이 주 (문헌[Sheir-Neiss and Montenecourt, 1984, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53])를 β-글루코시다아제 발현 카세트 (이는 cbh1 프로모터, 티. 레에세이 β-글루코시다아제1 유전자, cbh1 종결자 및 amdS 마커 (에이. 니둘란스 아세트아미다아제)를 포함함), 및 엔도자일라나아제 발현 카세트 (이는 cbh1 프로모터, 티. 레에세이 xyn3, 및 cbh1 종결자를 포함함)와 함께, PEG 매개 형질전환 (예를 들어, 문헌[Penttila et al., 1987, Gene 61(2):155-64])을 이용하여 동시 형질전환시켰다. 다수의 형질전환체를 단리하였으며, β-글루코시다아제 및 엔도자일라나아제 생성에 대하여 조사하였다. 티. 레에세이 주 #229로 칭해지는 하나의 형질전환체를 본 명세서에 기재된 소정의 연구에서 사용하였다.
주 H3A: 티. 레에세이 주 #229를, 전기천공법 (예를 들어 국제특허 공개 WO2008/153712 A2호 참조)을 이용하여 β-자일로시다아제 Fv3A 발현 카세트 (이는 cbh1 프로모터, fv3A 유전자, cbh1 종결자, 및 alsR 마커 (천연 티. 레에세이 아세토락테이트 신타아제의 클로리뮤론 에틸 내성 돌연변이체)를 포함함), β-자일로시다아제 Fv43D 발현 카세트 (이는 egl1 프로모터, fv43D 유전자, 천연 fv43D 종결자를 포함함), 및 Fv51A α-아라비노푸라노시다아제 발현 카세트 (이는 egl1 프로모터, fv51A 유전자, 천연 fv51A 종결자를 포함함)로 동시 형질전환시켰다. 형질전환체를 클로리뮤론 에틸을 함유하는 보겔스(Vogels) 한천 플레이트에서 선발하였다. 다수의 형질전환체를 단리하고, β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 생성에 대하여 조사하였다. 티. 레에세이 β-글루코시다아제 1, 티. 레에세이 xyn3, Fv3A, Fv51A, 및 Fv43D,를 재조합적으로 발현하는 티. 레에세이 통합 발현 주를 단리하고, 본 명세서에 설명된 소정의 연구에서 사용하였다.
7.1.4. 유기체 및 접종물 준비
7.1.4.1. 자이모모나스 모빌리스
배경: 자이모모나스 모빌리스 주 ZW1은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC 31821, 미국 버지니아주 매너서스 소재)으로부터의 주 ZM4와 유사한 야생형 주이다. 재조합 자이모모나스 모빌리스 주 ZW705를 하기에 요약된 바와 같이 주 ZW801-4로부터 생성하였다. 제트. 모빌리스 주 ZW801-4의 배양물을 하기와 같이 스트레스 조건 하에 성장시켰다. ZW801-4는 미국 특허 공개 제2008/0286870호에 개시된 제트. 모빌리스의 재조합 자일로스-이용 주이다. 주 ZW801-4는 주 ZW800으로부터 유래되었고, 이는 다시 주 ZW658로부터 유래되었는데, 이들 모두는 미국 특허 공개 제2008/0286870호에 기재된 바와 같았다. ZW658은 자일로스 아이소머라아제, 자일룰로키나아제, 트랜스알돌라아제, 및 트랜스케톨라아제를 코딩하는 4개의 자일로스-이용 유전자를 함유하는 두 오페론, PgapxylAB 및 Pgaptaltkt를 순차적 전위 이벤트(event)를 통하여 ZW1 (ATCC #31821)의 게놈 내로 통합시키고, 이어서 자일로스를 함유하는 선발 배지에서 적응 단계를 행함으로써 제작하였다. ZW658을 ATCC #PTA-7858로 기탁하였다. ZW658에서, 글루코스-프룩토스 옥시도리덕타아제를 코딩하는 유전자는 숙주-매개된 이중 교차, 상동성 재조합 및 스펙티노마이신 내성을 선발가능 마커로서 이용하여 삽입에 의해 불활성화시켜 ZW800을 생성하였다. loxP 부위로 둘러싸인 스펙티노마이신 내성 마커는 Cre 리콤비나아제를 이용하여 부위 특이적 재조합에 의해 제거하여 ZW801-4를 생성하였다.
ZW801-4의 연속식 배양물을 250 ㎖의 교반, pH- 및 온도-제어 발효기 (식스포즈(Sixfors); 스위스 보트밍겐 소재)에서 성장시켰다. 발효용 기본 배지는 5 g/L의 효모 추출물, 15 mM의 인산암모늄, 1 g/L의 황산마그네슘, 10 mM의 소르비톨, 50 g/L의 자일로스, 및 50 g/L의 글루코스였다. 높은 농도의 아세테이트 및 암모니아의 존재 하에서의 성장에 대한 적응은 97 d의 기간에 걸쳐 특정 희석률로 측정할 때 확립된 성장 속도를 유지하면서 상기 연속식 배양 배지 중 아세트산암모늄의 농도를 160 mM이 되도록 점진적으로 증가시킴으로써 성취하였다. 암모늄 이온 농도의 추가의 증가는 139 d의 연속식 배양의 마지막까지 210 mM의 최종 전체 암모늄 이온 농도까지 인산암모늄을 증분식으로 첨가함으로써 성취하였다. 주 ZW705를 도말, PCR 증폭 및/또는 기타 통상적인 잘 알려진 방법에 의해 적응 집단으로부터 단리하였다.
7.1.4.2. SSF 를 위한 접종 배양물의 성장
자이모모나스 모빌리스 주 ZW705 및 ZW1을 -80℃에서 냉동시킨 20% 글리세롤 스톡으로서 유지하였다. 접종 배양물의 제조를 위하여, 이 냉동 스톡 2 ㎖을 해동시키고, 이를 이용하여 5 g/L의 효모 추출물, 4 g/L의 인산수소칼륨, 1 g/L의 황산마그네슘, 및 100 g/L의 글루코스를 함유하는 pH 5.8의 배지 45 ㎖에 접종하였다. 출발 OD 600 ㎚는 0.4였다. 배양물을 뚜껑을 닫은 50 ㎖ 튜브에서 32℃에서 약 2.5의 OD 600 ㎚까지 성장시키고, 그 후 이를 이용하여 200 g/L의 글루코스, 4 g/L의 인산수소칼륨, 2 g/L의 황산마그네슘, 및 20 g/L의 효모 추출물을 함유하는 pH 5.8의 최종 접종 배양물에 접종하였다. 이 배양물을 pH-제어된 교반 발효기에서 32℃에서 약 10의 OD 600 ㎚ 및 약 80 g/L의 남아있는 글루코스 농도까지 성장시켰다. SSF 발효 부피의 10%와 동등한 부피의 이 접종 배양물 (OD 600 ㎚는 약 10임)을 이용하여 SSF를 시작하였다.
7.1.4.3. 효모
사용한 효소 에탄올로겐은 서모삭(등록상표) 드라이 효모(미국 위스콘신주 밀워키 소재의 에탄올 테크놀로지)였으며, 이는 단지 C6 (즉, 글루코스) 탄소 당을 에탄올(EtOH)로 발효시킬 수 있다. 건조 효모는 접종 전 2 내지 3 hr 동안 살균 탈이온수로 수화시켰다.
7.1.5. 당을 이용한 발효
합성 당을 이용한 자이모모나스 모빌리스 발효를 배치식 및 유가식 공정을 이용하여 500 ㎖ 식스포즈 생물반응기에서 3 d 동안 수행하였다. 합성 당은 글루코스 및 자일로스로 이루어졌다. 배치식 공정에 있어서, 처음에 당을 약 80 g/L의 글루코스 및 70 g/L의 자일로스의 농도로 로딩하였다. 유가식 공정에 있어서, 진한 당 원액을 먼저 제조하고, 그 후 이것을 시린지 펌프 (PHD2000, 미국 매사추세츠주 홀리스톤 소재의 하바드 어패러터스(Harvard Apparatus))를 이용하여 생물반응기 내로 공급하였다. 유량을 설정 및 제어하여 이것이 3일에 약 80 g/L의 글루코스 및 70 g/L의 자일로스의 최종의 등가의 당 로딩을 제공하도록 하였다. 배치식 또는 유가식 공정에 있어서, 자이모모나스 접종물을 10 wt.%에서 시작하여 반응 혼합물 내로 로딩하고, 발효를 33℃ 및 pH 5.5에서 혐기적으로 수행하였다.
7.1.6. 동시 당화 발효( SSF )
SSF 플라스크 런을 적합한 재조합 자이모모나스 모빌리스 및 효모 발효 조건 하에 혐기적으로 수행하였다. 달리 기술하지 않으면, 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대, 바가스, 또는 크라프트 펄프 기질을 이용한 재조합 자이모모나스 SSF 실험을 각각 25 wt.%, 20 wt.%, 10 wt.%의 고형물 로딩, pH 5.8 및 33℃에서 수행하였다. 25 wt.% 고형물 (12.5 g의 건조 중량), 20 wt.%의 고형물 (10.0 g의 건조 중량), 또는 10 wt.%의 고형물 (5.0 g의 건조 중량)의 각각의 기질을 먼저 125 ㎖의 삼각 플라스크 내로 각각 로딩하고, 이어서 필요량의 6 N 황산과 사전 혼합한 탈이온수를 첨가하여 기질의 pH를 5.8로 적정하였다. 상기에 기재된 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 효소를 각각 바이오매스 기질 중 셀룰로오스 1 g 당 셀룰라아제 단백질의 ㎎ 및 자일란 1 g 당 헤미셀룰라아제 단백질의 ㎎을 기준으로 한 양으로 첨가하였다. 발효는 10 wt.% 자이모모나스 모빌리스 주 ZW705 (재조합체) 또는 ZW1 (야생형) 접종물 (5 g)을 임의의 추가의 영양제를 포함하지 않는 반응 혼합물 내로 첨가함으로써 개시하였다. 서모삭(등록상표) 드라이 효모 SSF에 있어서, 반응을 38℃ 및 pH 5.0에서 수행하였다. 효모 접종물의 수준은 임의의 추가의 영양제를 사용하지 않고서 0.1% (w/w)였다. 혐기적 환경 및 CO2 가스 제거는 플라스크의 뚜껑을 닫기 위하여 사용한 고무 뚜껑으로부터 돌출한 23 게이지 니들에 의해 유지하였다. 발효 시작시에, 모든 SSF 런은 전처리 기질, 물, 황산, 효소, 및 자이모모나스 또는 효모 세포 중 어느 하나로 이루어진 반응 혼합물 및 플라스크에서 초기 50 g의 총 반응물 중량을 가졌다. 플라스크를 100 RPM에서 3 d 동안 진탕 인큐베이터 (뉴 브룬스위크 사이언티픽(New Brunswick Scientific), 이노바(Innova) 44, 미국 뉴저지주 에디슨 소재) 내부에서 교반시켰다.
7.1.7. 분리 가수분해 발효( SHF )
SHF 런은 당화 단계, 이어서 발효 단계를 포함하였다. 당화 조건은, 효소 유형 및/또는 수준, 셀룰로오스 로딩, 및 pH의 소정의 변경을 제외하고는 NREL 실험실 분석 절차를 기반으로 하였다 (문헌[Selig et al., 2008, Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass Laboratory Analytical Procedure (LAP), Technical Report NREL/TP-510-42629] 참조). 25 wt.%의 고형물 (12.5 g의 건조 중량)의 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 또는 10 wt.%의 고형물 (5.0 g의 건조 중량)의 혼합형 활엽수 펄프를 125 ㎖ 삼각 플라스크 내로 로딩하였다. 그 후 이것에 이어서 기질 pH가 5.3으로 적정되도록 필요량의 6 N 황산과 사전 혼합한 탈이온수를 첨가하였다. 당화 단계는, 각각 바이오매스 기질 중 셀룰로오스 1 g 당 단백질의 총 ㎎ 및 자일란 1 g 중 단백질의 총 ㎎을 기준으로 한 양으로 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 효소의 첨가에 의해 시작하였다. 모든 자이모모나스 SHF 런에 있어서, SSF 공정(상기)에서 설명한 것과 유사한 조건을 이용하여 50℃의 온도 및 5.30의 pH를 3 d의 지속 기간의 당화, 이어서 발효 단계에 이용하였다. 수산화나트륨을 이용하여 pH를 5.3으로부터 5.8까지 상승시켰다. 이것에 이어서 10 wt.%의 자이모모나스 접종물을 첨가하여 발효를 시작하였다.
7.1.8. 유가식 SSF
묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 기질(최종 25 wt.%의 고형물의 성취에 필요)을 8개의 배치로 고르게 분할하고, 배치식으로 생물반응기 내에 공급하되, 최종 배치를 30번째 시간에 로딩한 것을 제외하고는 SSF 공정 (상기)에서 설명한 것과 유사한 조건 하에 유가식 SSF 연구를 수행하였다.
7.1.9. HPLC 분석 및 EXP 정량화
발효 샘플을 정해진 간격으로 취하고, 워터스(Waters) HPLC 시스템 (얼라이언스 시스템(Alliance system), 미국 매사추세츠주 밀포드 소재의 워터스 코포레이션(Waters Corp.))을 이용하여 에탄올, 잔여 당, 에틸-β-자일로피라노사이드(EXP), 및 기타 대사 산물, 예를 들어 아세트산 및 글리세롤에 대하여 분석하였다. HPLC 컬럼을 바이오라드(BioRad)로부터 구매하였다 (아미넥스(Aminex) HPX-87H, 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오라드 인크.(BioRad Inc.)). 굴절률 탐지 하에서의 EXP 정량화는 문헌[Zhang et al., 2009, Enzyme and Microbial Technology 44:196-202]에 설명된 것과 유사한 세트의 절차를 따랐다. 다른 대사적 동시 생성물인 석신산이 EXP와 함께 동시 용출되고 이는 EXP 정량화를 잠재적으로 인플레이션시킨 것으로 밝혀졌다. 효모 및 자이모모나스 발효에 있어서, 시험한 조건에서 생성된 석신산의 농도는 220 ㎚에서의 UV 검출기 및 효소적 분석 키트 (K-SUCC, 아일랜드 위클로우 소재의 메가자임, 컴퍼니) 둘 모두를 이용하여 측정할 때 1-2 g/L 이하인 것으로 결정되었다.
7.2. 결과
7.2.1. EXP 형성 및 확인
7.2.1.1. 재조합 자이모모나스 모빌리스를 이용한 SSF 에서의 EXP 형성
글루코스 및 자일로스를 에탄올로 동시 발효시킬 수 있는 재조합 자이모모나스 모빌리스를 이용하여 상기에 설명한 SSF 발효 조건 하에서 부산물 형성을 관찰하였다. 이 연구에서 사용한 기질은 자일란 함량이 높은 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대였으며, 이는 상업적 셀룰라아제/헤미셀룰라아제 효소 제제 (셀룰로오스 1 g 당 20 ㎎의 액셀러라아제™ 1500) 및 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 (자일란 1 g 당 5 ㎎))로 처리하였는데, 상기 제제 둘 모두는 트리코데르마 레에세이 (티. 레에세이)로부터 유래된 것이었다. 시험한 조건 하에서, 부산물의 형성의 최고의 양은 유가식 SSF 하에서 발견되었으며, 두 번째의 최고의 것은 SSF에서 발견되었다 (표 1). 당 (80 g/L의 글루코스 + 70 g/L 자일로스)을 이용한 배치식 및 유가식 배양 공정, 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대를 이용한 SHF에서는 이러한 부산물이 거의 형성되지 않았다.
상기에 설명한 바와 같이 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 및 자이모모나스 모빌리스 주를 이용하여 SSF 조건 하에서 생성된 부산물은 HPLC HPX-87H 컬럼 상에서 용출 시간이 대략 11.75 min (0.6 ㎖/min의 유량에서)이었으며, 이는 석신산의 것에 가까웠다. 도 1, 패널 2는 자일로스 및 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제를 에탄올과 함께 인큐베이션한 후 11.611 min에서 용출되는 피크를 나타낸다. 이 특정 피크는 알코올이 인큐베이션에 전혀 존재하지 않을 때에는 부재하였다. 인큐베이션 동안 알코올의 존재 하에 생성된 부산물의 위치는 첨가된 알코올을 추적하는 정도로 그리고 그 방향으로 이동함이 관찰되었다. 19.46 min에서의, 메탄올(MeOH)과 함께 인큐베이션한 후 생성된 부산물의 용출 시간과, 27.65 min에서의, n-PrOH과 함께 인큐베이션한 후 생성된 부산물의 용출 시간은 21.99 min에서의, 에탄올(EtOH)과 함께 인큐베이션한 후 생성된 부산물과 비교할 때 각각 더 짧거나 더 길었다. 자일로스를 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 및 0.72 M 알코올과 함께 인큐베이션함에 의해 생성된 생성물의 용출 시간은 에탄올-유도된 생성물 (11.61 min)에 비하여 MeOH (11.03 min)에서는 더 짧은 용출 시간으로 그리고 n-PrOH (13.60 min)에서는 더 긴 용출 시간으로 이동한다. 이들 결과는 당해 이동 피크가 자일로스 및 알코올로부터의 역 가수분해에 의해 형성된 자일로스-알코올 부가물 (알킬-자일로피라노사이드)이라는 결론과 일치하였으며, 이때 11.03, 11.61 및 13.60에서 용출되는 성분은 각각 메틸-, 에틸- 및 n-프로필-자일로피라노사이드에 상응하였다.
7.2.1.2. 시간 코스
메틸-, 에틸- 및 n-프로필 자일로피라노사이드의 출현에 있어서의 시간 코스가 도 2에 도시되어 있다. 100 hr 후 형성된 생성물의 상대적인 양은 하기: 메틸- 및 에틸- 및 n-프로필-자일로사이드 (도 2)와 같았으며, 이는 MeOH, EtOH 및 n-PrOH의 존재 하에서의 역 가수분해에 의한 알킬-β-D-자일로피라노사이드의 형성에 대하여 문헌[Drouet et al., 1994, Biotech. & Bioeng. 43:1075-1080]에 보고된 순서와 일치하였다. 에틸 자일로피라노사이드(EXP)의 용출 시간이 SSF 조건 하에 관찰된 것과 일치하는 것, 알코올의 존재 및 성질에 대한 용출 시간의 의존성, 및 이들 알코올의 상대적인 반응성 모두는 EXP가 SSF 조건 하에 생성된 부산물임을 시사하였다.
7.2.1.3. 1 H NMR 분석에 의한 EXP 샘플에서의 에틸-β-글리코시드의 확인
에틸 b-D-자일로피라노사이드 표준물의 제조 에틸 자일로사이드의 샘플은 50 ㎎의 D-자일로스를 3 ㎖의 에탄올에 용해시키고, 생성된 용액을 앰버라이스트(Amberlyst) 15 H+ 수지 (100 ㎎)의 존재 하에 70℃에서 3 hr 동안 가열함으로써 제조하였다. 수지를 여과시키고, 에탄올 용매를 감압 하에 제거하여 무색 오일을 생성하였다. 1H NMR에 의한 분석은 에틸 자일로사이드들의 혼합물을 나타냈으며, 이때 a-D-자일로피라노사이드가 우세하고, 상당한 양의 에틸 β-자일로피라노사이드 및 에틸 α/β-자일로푸라노사이드가 함께 있다.
EXP 샘플의 1H NMR: 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대의 SSF 발효 브로쓰 샘플로부터 정제 및 분획화 (HPLC를 이용함)한 동결건조 EXP 샘플을 750 ㎕의 D2O로 재구성하고, PP-528 유리 NMR 튜브로 옮겼다. 양성자 NMR 스펙트럼은 8개 초과의 펄스 동안 기본적인 s2pul 펄스 시퀀스를 이용하여 베리언(Varian) 500 MHz VNMRS NMR 시스템에서 획득하였다. d 4.80에서의 HOD 신호를 기준으로 한 1H NMR 스펙트럼(500 MHz, D2O)은 d 1.20-1.26 영역에서의 몇몇 삼중 피크 신호의 출현을 기반으로 하면 적어도 4가지의 특유한 에틸 글리코사이드의 존재를 나타냈다. 또한 상기 스펙트럼은 d 4.43, 4.49, 4.53, 및 4.66에서 5개의 특유한 이중 피크를 포함하였으며, 이때 커플링 상수는 b-글리코시딕 결합을 나타내는 7.8 Hz였다. 에틸-β-D-자일로피라노사이드에 있어서 d 4.43에서의 신호가 가장 강렬하였으며, 이는 문헌에 보고된 화학적 이동과 매칭된다 (문헌[Drouet et al., 1994, Biotech. & Bioeng. 43:1075-1080], 문헌[Zhang et al. (2009, Enzyme and Microbial Technology 44:196-202)]). 1H NMR 스펙트럼 (도 3)에서 관찰된 전체 신호는 3 내지 4가지의 추가의 에틸 β-글리코시드와 함께, β-아노머, β-D-에틸자일로피라노사이드의 존재를 나타냈다.
7.2.2. 효모 및 야생형 자이모모나스 모빌리스를 이용한 EXP 형성
묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 기질을 이용하여 SSF 및 유가식 SSF 조건 하에서 에탄올로겐 자이모모나스 모빌리스를 사용하여 C5/C6 당을 동시 발효시켜 높은 수준의 EXP를 생성하였다. 단지 C6 당을 발효시킬 수 있는 유기체인 야생형 효모 및 자이모모나스 모빌리스를 사용하여 SSF를 실시할 때 EXP가 형성되는지를 결정하기 위하여 새로운 실험을 설계하였다. 결과 (도 4)에 의하면, EXP가 SSF 반응에서 높은 수준으로 생성되었음이 나타났으며, 여기서 효모 (5.5 g/L) 또는 야생형 자이모모나스 모빌리스 (9.1 g/L)가 발효를 행하였다. 따라서, EXP 형성은 재조합 자이모모나스 모빌리스에 특이적인 것이 아니며, 그 이유는 이것이 사카로마이세스 세레비지애 효모 및 야생형 자이모모나스 모빌리스에 의한 SSF 동안 또한 검출되었기 때문이다.
7.2.3. 바이오매스의 다른 공급원으로부터의 EXP 형성
묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 이외의 기질을 이용하여 EXP를 형성시킬 수 있는지를 결정하기 위하여 추가의 실험을 설계하였다. 표 2에 나타낸 결과로부터, EXP의 형성은 티. 레에세이 셀룰라아제/헤미셀룰라아제 제제를 이용한 SSF 조건 하에서의 임의의 고 자일란-함유 기질의 발효에 연결되는 것으로 나타났다. 예를 들어, 자일란 함량이 높은 공업용의 혼합형 활엽수 크라프트 펄프를 이용한 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 16.1 g/L만큼 많은 EXP가 형성되었다. 반면, 더욱 적은 자일란을 함유하는 기질, 예를 들어 전처리 바가스 및 침엽수 펄프는 유사한 조건 하에 더욱 적은 양의 EXP (각각 0.91 및 4.75 g/L)를 생성하였다. 더욱이, 단지 본 명세서에 설명된 SSF 공정 하에서 다량의 EXP가 생성될 것임이 또한 입증되었다. EXP의 형성은 심지어 더욱 많은 자일란을 함유하는 기질을 사용했을 때에도 SHF 공정 조건 하에서 많이 감소하였다 (3.52 g/L).
7.2.4. SSF 에서 사용한 효소의 상이한 치환을 이용한 EXP 형성
7.2.4.1. Bxl1 을 이용한 EXP 형성
문헌[Drouet et al., 1994, Biotech. & Bioeng. 43:1075-1080]에 따르면, EXP 형성은 트랜스자일로실화 및 역 가수분해 반응 둘 모두를 통하여 티. 레에세이 Bxl1에 의해 촉매되었다. 도 5는 상기에 설명한 효모 SSF 조건 하에서의 EXP 형성이 티. 레에세이 Bxl1의 존재 하에서 향상되었음을 나타낸다. 5 ㎎/g의 Bxl1을 첨가하면, EXP 생성이 5.5 g/L로부터 18.8 g/L까지 증가하였다.
25 wt.%의 고형물의 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 기질을 이용한 재조합 자이모모나스 모빌리스 SSF 조건 하에서의 EXP 형성은 도 6에 나타낸 바와 같이 티. 레에세이 Bxl1의 존재 하에서 또한 향상되었다. EXP는 6 ㎎/g의 티. 레에세이 Bxl1을 첨가하면 25.6 g/L의 농도에서 평탄역이 되었다. 티. 레에세이 통합 주 #229 (이는 자일라나아제, 티. 레에세이 Xyn3을 과다발현함) 유래의 셀룰라아제/헤미셀룰라아제 효소 복합물을 액셀러라아제™ 1500 + 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 대신 이 실험에서 사용하였다. 티. 레에세이 Bxl1이 EXP 형성을 촉매하는 능력은 놀랍게도 강하며, 그 이유는 단지 1 ㎎/g의 이것을 첨가하였지만 대조 샘플 (티. 레에세이 통합 주 #229 유래의 효소 복합물 단독)과 비교하여 2배 초과의 EXP 증가가 명백하게 관찰되었기 때문이다.
EXP 형성에 대한 푸사륨 베르티실리오이데스 헤미셀룰라아제 첨가의 영향을 조사하였다. 액셀러라아제™ 1500 + 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제, 액셀러라아제™ 1500 + XlnA, 및
통합 티. 레에세이 주 #229 유래의 효소 복합물 - Bxl1, 및 푸사륨 베르티실리오이데스 헤미셀룰라아제 (Fv3A, 및 Fv51A L-α-아라비노푸라노시다아제)를 첨가함 - 을 이용하였다. 이 연구를 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에 행하였다. 사용한 기질은 25 wt.%의 고형물의 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대였다. 결과를 도 7에 도시하였으며, 이는 XlnA 및 액셀러라아제™ 1500의 첨가가 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 및 액셀러라아제™ 1500의 첨가보다 더 많은 EXP (31.5 대 19.5)를 생성함을 나타냈다. 통합 티. 레에세이 주 #229 유래의 효소 복합물 단독은 모든 3가지 효소 구성 중에서 가장 적은 양의 EXP (9.1 g/L)를 생성하였다. 이는 가능하게는 다른 두 효소 구성과 비교하여 상대적으로 다량의 축적된 자일로바이오스를 또한 생성하는 티. 레에세이 주 #229 효소 복합물 중 효소 복합물 중의 단백질의 더 적은 분율의 총량을 Bxl1이 나타냈다는 사실로 인한 것이다. 액셀러라아제™ 1500 + 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 및 액셀러라아제™ 1500 + XlnA의 경우, Fv3A 또는 Fv51A의 첨가는 EXP 형성의 상당한 증가로 이어지지 못하였다. 그러나, 통합 티. 레에세이 주 #229 유래의 효소 복합물을 이용하면, 티. 레에세이 Bxl1을 통합 티. 레에세이 주 #229로부터 생성된 효소 복합물에 첨가했을 때의 EXP의 3배 증가와 비교하여, Fv3A 단독의 첨가는 EXP 형성의 2배 증가를 제공하는 반면, Fv51A의 첨가는 EXP 형성을 1.4배만큼 증가시켰다.
7.2.4.2. 정제 효소를 이용한 EXP 형성
상기에서 논의된 결과는 EXP 형성이 티. 레에세이 Bxl1에 의해 효과적으로 촉매되고 강하게 영향을 받으며, 티. 레에세이 Bxl1은 소정의 고 자일란-함유 바이오매스 기질을 이용한 SSF 조건 하에서의 EXP 제조에서 두드러지게 그리고 특히 효과적임을 나타냈다. 그러나, 지금까지 시험한 (그리고 상기에 논의된) 모든 효소는 정제하지 않았으며, EXP를 제조할 수 있는, 티. 레에세이 Bxl1의 것과 유사한 배경 효소 활성을 포함할 수 있다. 배경 효소 활성의 효과를 조사하기 위하여, EXP 형성에 대한 정제된 효소의 영향을 또한 연구하였다. 정제 티. 레에세이 셀로바이오하이드라아제, CBH1 및 CBH2; 티. 레에세이 엔도글루카나아제, EG2; 및 티. 레에세이 β-글루코시다아제, Bgl1의 셀룰라아제 혼합물을 액셀러라아제™ 1500에 대한 대용물로 사용한 반면, 정제 티. 레에세이 Xyn3을 멀티펙트™ 자일라나아제에 대한 대안물로 사용하였다. 셀룰라아제 단독은 EXP를 생성하지 않음이 도 8에 도시된 결과로부터 명백하다. 비정제 티. 레에세이 Xyn3을 첨가하면 다량의 EXP, 예를 들어 약 13.1 g/L가 생성되었다. 이러한 큰 증가는 잠재적으로는 비정제 티. 레에세이 Xyn3 샘플 내에 존재하는 더욱 많은 배경 티. 레에세이 Bxl1로 인한 것이다.
7.2.4.3. GH43 클래스 Bxl 효소를 이용한 EXP 형성
GH3 패밀리 하이드롤라아제인 Bxl1은 SSF 조건 하에서 EXP 형성을 촉매하는 데 있어서 활성을 가지며 효과적인 것으로 밝혀지고 있다 (상기). 다른 GH 패밀리 β-자일로시다아제가 유사한 조건 하에서 EXP 형성을 또한 촉매할 수 있는지에 대한 의문이 남아있다. Fv43B, Pf43A, Fv43E, 및 Af43A,를 포함하는 GH43 패밀리로부터의 다수의 β-자일로시다아제를 25 wt.%의 고형물의 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 기질을 이용하여 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에 시험하였다. Pf43A, Fv43E, 및 Af43A는 주 #229의 단백질 제제로부터 만들어진 대조 샘플과 비교하여 EXP 형성을 약간 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 반면, Fv43B는 1.5배 만큼의 더욱 큰 EXP 형성 증가를 제공하였다 (도 9). 모든 이들 GH43 패밀리 효소를 티. 레에세이에서 발현시켰기 때문에, 그리고 이들은 모두 이 연구에서 비정제 단백질 제제였기 때문에, EXP 형성 증가는 단백질 제제 중 천연 Bxl1의 존재에 기인할 수 있다고 상정될 수 있었다.
실시예 2: 헤미셀룰라아제에 의한 EXP 감소
하기 실시예는 SSF 반응물에 소정의 헤미셀룰라아제를 첨가함으로써 EXP를 감소시킴을 나타낸다.
8.1. 자이모모나스에 의한 SSF 에서의 Fv43D 에 의한 EXP 감소
EXP 형성은 전형적으로 자일로스 (직접적인 것, 또는 자일로바이오스 또는 기타 자일로올리고머로부터의 것) 및 에탄올 둘 모두를 동일 몰 기준으로 소비한다. 이러한 소비 메커니즘은 직접적으로 에탄올 수율의 상당한 감소로 이어지며, 그 이유는 자이모모나스를 포함하는 많은 미생물이 EXP를 분해 및 발효시킬 수 없거나, 또는 달리 이용할 수 없기 때문이다. 일(1) g의 EXP는 (자일로스가 자일로스 1 g 당 0.51 g의 비율로 에탄올로 발효된다고 가정하면) 생성된 에탄올의 0.688 g의 손실과 동등한 것으로 계산된다. 따라서, EXP 형성의 방지는 에탄올 수율 증가를 수반할 수 있다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 푸사륨 베르티실리오이데스 β-자일로시다아제, Fv43D,를 자일란 1 g 당 단지 1 ㎎으로 첨가하면 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서의 EXP 형성량이 크게 감소됨 (대략 4배)이 밝혀졌다.
8.2 효모에 의한 SSF 에서의 Fv43D 에 의한 EXP 감소
C5/C6-발효 재조합 자이모모나스로부터 얻어진 결과와 유사하게, 효모를 C6-발효 미생물로서 사용한 SSF 반응에서 액셀러라아제™ 1500+멀티펙트(등록상표) 자일라나아제에 Fv43D를 보충하면 EXP 형성이 또한 감소되었다. 구체적으로, 자일란 1 g 당 1 ㎎의 Fv43D의 첨가는 EXP의 2배 내지 3배의 감소로 이어졌다 (도 11).
8.3 멀티펙트 자일라나아제를 이용한, XlnA 를 이용한 그리고 티. 레에세이 통합 주 #229 유래의 효소 복합물을 이용한 SSF 에서의 Fv43D 에 의한 EXP 감소
재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 Fv43D를 3가지 효소 구성, 액셀러라아제™ 1500+멀티펙트(등록상표) 자일라나아제, 액셀러라아제™ 1500+에이. 니게르 자일라나아제, 및 통합 티. 레에세이 주 #229로부터 생성한 효소 복합물에 첨가함에 의한 EXP 감소를 조사하였다. 사용한 기질은 25 wt.%의 고형물의 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대였다.
도 12는 자일란 1 g 당 단지 1 ㎎의 Fv43D를 액셀러라아제™ 1500+멀티펙트(등록상표) 자일라나아제에 그리고 액셀러라아제™ 1500+XlnA에 첨가하면 EXP 형성이 4배 초과로 감소되었으며, 통합 티. 레에세이 주 #229로부터 생성한 효소 복합물에의 동일한 첨가는 EXP 형성을 1.36배 감소시켰음을 나타낸다. 이와 동시에, 에탄올의 상응하는 증가가 모든 3가지 효소 구성에서 관찰되었으며, 이는 EXP 형성 감소 및 에탄올 수율 손실 방지의 견지에서 Fv43D의 효과를 확증하는 것이었다.
8.4 정제 효소를 이용한 SSF 에서의 EXP 형성의 감소
Fv43D에 의한 EXP 감소는 배경 효소 활성으로 인한 것이 아님을 보증하기 위하여, 정제 Fv43D를 포함하는 정제 효소를 사용하여 EXP 형성 감소에 대하여 시험하였다. 정제 CBH1, CBH2, EG2 및 Bgl1의 티. 레에세이 셀룰라아제 혼합물을 액셀러라아제™ 1500 대신 사용하였으며, 정제 티. 레에세이 Xyn3을 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제에 대한 대용물로서 사용하였다. 도 13에 도시된 결과는, 정제 및 비정제 Fv43D를 첨가했을 때 EXP 형성의 약간의 감소 및 수반되는 에탄올 역가의 약간의 증가를 나타냈다. EXP 형성의 상대적으로 적은 감소는 정제 효소 (예를 들어, 셀룰라아제 및 Xyn3) 중 배경 티. 레에세이 Bxl1의 결여로 인한 것일 가능성이 있다. 티. 레에세이 Xyn3의 작용으로 인하여 대조 샘플에 의해서는 단지 소량의 EXP (5.7 g/L)가 형성되었음을 또한 주목한다. 따라서 Fv43D의 추가의 첨가는 EXP 형성을 사실상 감소시키지 않는다. 이를 추가로 조사하기 위하여, 도 14a에 나타낸 결과를 이용한 다른 연구를 수행하여 다량의 Bxl1의 존재 하에서의 Fv43D 첨가에 의한 EXP 감소의 효과를 조사하였다.
8.5 Fv43D 를 SSF 에 첨가함에 의한 EXP 감소의 용량 응답
Bxl1의 존재 하에서의 EXP 형성은 상당하였으며, 여기서 정확한 양이 사용한 SSF 조건에 의해 변하기는 하지만, 20 g/L 초과의 EXP가 일관적으로 검출되었다. 용량 응답 연구를 실시하여 Fv43D 첨가량과 관련된 EXP 형성 감소를 평가하였다. 도 14a는 티. 레에세이 통합 주 #229로부터 생성된 효소 복합물 및 티. 레에세이 Bxl1에 증가하는 양의 Fv43D를 첨가하는 것에 의한 EXP 감소에 대한 결과를 나타낸다. 이전에 나타낸 결과와 유사하게, 1 ㎎/g의 Fv43D는 EXP 형성을 거의 3배만큼 감소시키는 데 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 이와 동시에 에탄올 역가를 증가시켰다. 그러나, 3, 6, 및 9 ㎎/g의 증가하는 양의 Fv43D의 첨가는, 에탄올 역가의 유의한 증가가 관찰되기는 하였지만, EXP 형성을 크게 감소시키지 않았다. 심지어 다량의 Fv43D (9 ㎎/g)의 첨가에 의해서도, EXP 농도는 6.6 g/L - EXP의 양이 시험에 사용한 특정 조건에 있어서 평형에 도달했을 수 있는 수준 - 미만으로 감소할 수 없는 것으로 나타났다. 이들 특정 실험 조건 하에서, 예를 들어 자일란 1 g 당 1 ㎎ 초과의 Fv43D의 추가의 첨가는 EXP 형성 감소에 더 이상 영향을 주지 못하였다.
잠재적으로, 이들 관찰은 SSF 조건 하에서의 EXP 형성 및 감소의 메커니즘에 의해 설명될 수 있다.
이 연구로부터 이루어진 관찰을 기반으로 하고 문헌 (예를 들어, 문헌[Drouet et al., 1994, Biotech. & Bioeng. 43:1075-1080] 및 문헌[Zhang et al., 2009, Enzyme and Microbial Technology 44:196-202] 참조)에 보고된 데이터와 일치하는 제안된 메커니즘이 하기 실시예 3에 상세하게 설명되어 있다.
8.6 Fo43A 및 Gz43A 를 SSF 에 첨가함에 의한 EXP 감소
전화 GH43 패밀리 β-자일로시다아제인 Fo43A 및 Gz43A,를 본 명세서에 설명한 SSF 조건 하에 EXP 형성 감소에서의 효능에 대하여 또한 시험하였다. 도 14b에 나타낸 결과를 기반으로 하면, 이들 두 효소 각각은, 재조합 자이모모나스, 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 기질, 티. 레에세이 Bxl1 및 티. 레에세이 통합 주 #229로부터 생성한 단백질 복합물을 포함하는 효소 블렌드에 이들을 자일란 1 g 당 3 ㎎으로 첨가할 때 EXP 형성을 거의 4배만큼 감소시킬 수 있었다. Fv43D의 첨가에서 관찰된 것 (상기)과 유사하게, EXP 형성 감소 및 에탄올 역가의 상응하는 증가 (약 10 g/L만큼)가 관찰되었다.
실시예 3: EXP 형성 메커니즘
푸사륨 베르티실리오이데스 β-자일로시다아제 Fv43D의 존재 하에서의 EXP 수율과 비교하여 푸사륨 베르티실리오이데스 β-자일로시다아제 Fv3A의 존재 하에서의 SSF 조건 하에서의 EXP 수율이 대략 4배 더 높다는 관찰에 의해 EXP 형성 메커니즘을 이해하려고 노력하게 되었다.
잠재적으로 EXP 형성에 대한 2가지 가능한 경로, 즉 (1) 트랜스글리코실화에 의한 것; 또는 (2) 역 가수분해에 의한 것이 있다. 이들 경로 각각은 하기와 같이 묘사된다:
1) 트랜스글리코실화: X-O-X + EtOH
Figure pct00001
X-O-Et + X
2) 역 가수분해: X + EtOH ↔ X-O-Et + H2O
문헌[Drouet et al., 1994, Biotech. & Bioeng. 43:1075-1080]에 따르면, 트랜스글리코실화 메커니즘은 상기 둘 중 더욱 빠른 것이다. 단지 β 아노머 (도 29 참조)가 트랜스글리코실화 반응에서 형성된다는 사실은 이 반응이 아노머 배위의 유지에 의해 기질에 작동하는 효소에 의해 촉매됨을 내포하며, 여기서 당은 β-글리코실 결합에 의해 연결된다. 반면, 역 가수분해에 의한 EXP의 β 아노머의 형성은 각각 아노머 배위의 전화 또는 유지에 의해 EXP가 형성되는지에 따라 출발 기질이 α- 또는 β-자일로스 중 어느 하나임을 시사할 것이다.
β-자일로시다아제, Fv3A (GH3 패밀리의 구성원) 및 Fv43D (GH43 패밀리의 구성원)는 각각 배위의 유지 및 전화에 의해 작동한다. 상기에 설명된 2가지의 잠재적인 메커니즘 중 어느 것이 실제 메커니즘인지를 구별 및 확인하기 위하여 실험을 수행하였으며, 여기서 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 (이는 티. 레에세이 Xyn2의 유지 활성을 특징으로 하는 효소 제제임) 및 정제 Fv43D 및 Fv3A를 46℃에서 자일로바이오스 및 에탄올과 함께 인큐베이션하였다. 이들 샘플에서의 EXP 형성의 동력학적 특성을 HPLC로 조사하였다.
도 15 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 짧은 시간 후 Fv3A를 포함하는 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제는 상당한 양의 EXP를 생성하였으며, 이는 자일로스 형성과 부합되는 것으로 나타났다 (예를 들어, 시간이 지남에 따른 자일로스 형성에 대한 EXP 형성의 일정한 비를 가짐). 반면, Fv43D를 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제와 함께 사용할 때, EXP는 자일로스 형성에 비하여 상당히 지연되어 나타났다. 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 및 Fv3A는 트랜스글리코실화를 통하여 EXP를 빠르게 생성하였다고 상정될 수 있다. 자일로스-효소 에스테르 부가물은 처음에 C1 아노머 전화, 이어서 에탄올에 의한 제2 전화 - 이는 부착 자일로스의 C1 탄소에서의, 활성 부위 카르복실기의 SN2 치환을 행함 - 에 의해 형성되었을 것이다. 이중 전화는 생성물 중 배위의 유지를 제공한다. 반면, Fv43D는 트랜스글리코실화 반응을 촉매하는 것으로 보이지 않았으며, 대신 이것은 역 가수분해를 통하여 훨씬 더 느리게 EXP를 생성하였다. Fv43D는 아노머 배위의 전화에 의해 작동하기 때문에, EXP는 α-D-자일로스 - 이는 다시 Fv43D,에 의해 자일로바이오스로부터 형성됨 - 로부터 형성될 가능성이 있지만 수성 용액 중 β-D-자일로스의 C1에서의 전화에 의해 또한 형성될 가능성이 있었다. 도 15는 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제에 의해 촉매되는 자일로스로부터의 역 가수분해에 의해 EXP가 또한 형성될 수 있음을 나타낸다. 이 경우 β-자일로시다아제 메커니즘이 유지 메커니즘이기 때문에, 이 반응의 가능한 기질은 β-D-자일로스였다.
9.1 EXP 형성에 있어서의 평형식
SSF 조건 하에서, 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 및 Fv3A는 자일로바이오스뿐만 아니라 더 큰 자일로스 올리고머와도 마주칠 것이다. 이러한 올리고머의 가수분해는 EXP 형성을 증가시킬 수 있으며, 만일 절단되면, 올리고머 생성물 중 하나는 트랜스글리코실화되어 에틸 글리코실 부가물을 생성한다. 추가의 절단은, 트랜스글리코실화에 의해, 그 후 추가의 에틸 부가물을 형성하여, EXP 형성 대 자일로스 형성의 비가 자일로바이오스만이 트랜스글리코실화될 때 관찰되는 것보다 커지도록 할 수 있다. 예를 들어:
3) X4 + EtOH → X2-Et + X2
4) X2-Et + EtOH → 2EXP
5) X2 + EtOH → EXP + X
자일로바이오스만이 트랜스글리코실화되면, 유일한 EXP 형성은 라인 5)의 반응에 의한 것임을 주목한다.
이들 가능성은 자일로스 올리고머(평균 분자량 = 539)의 가수분해를 동일한 3가지 효소인 Fv3A, Fv43D, 및 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 각각을 이용하여 자일로바이오스의 가수분해와 비교함으로써 조사하였다. 결과가 도 16에 도시되어 있다.
도 16 (좌측 패널) 및 도 16 (우측 패널)에는 서로의 2배 이내인 자일로스 형성 속도를 제공할 농도의 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 (560 ㎍/㎖), Fv43D (36 ㎍/㎖), 또는 Fv3A (54 ㎍/㎖)의 존재 하에서 46℃에서 0.9 M EtOH의 존재 하에서 자일로바이오스 (20 ㎎/㎖) (도 16 (좌측)) 또는 자일로스 올리고머 (20 ㎎/㎖) (도 16 (우측))를 인큐베이션한 후 생성된 EXP 대 자일로스 RI 피크 면적의 비가 도시되어 있다. EXP 형성 속도는 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 및 Fv43D의 존재 하에서 자일로바이오스 및 자일로스 올리고머에 대해 거의 동일하였다. 그러나, Fv3A,의 경우, EXP 수율은 자일로바이오스의 존재 하에서와 비교할 때 자일로스 올리고머의 존재 하에서 약 1/3 더 높았다. 상기에 약술된 바와 같이, 이러한 관찰은 적어도 Fv3A,의 경우, 트랜스글리코실화가 자일로바이오스보다 더 큰 올리고머의 절단시에 에탄올을 이용하여 일어날 수 있음을 시사한다. ≥dp3 올리고머의 이러한 트랜스글리코실화는 일반적으로 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제의 경우에서와 같이 일어나는 것으로는 보이지 않지만, EXP 수율은 자일로바이오스 및 자일로스 올리고머 둘 모두의 경우에서 Fv3A에 대해 관찰된 것보다 높은 것으로 나타났다. 이러한 더욱 높은 수율은 Fv3A에 있어서보다 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제에 있어서 에탄올을 이용한 트랜스글리코실화의 더욱 높은 속도를 나타낼 가능성이 있다. H2O에 있어서의 55 M과 비교하여 에탄올의 몰농도가 0.9 M임을 고려하면, 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제와 Fv3A, 둘 모두에 있어서 EXP가 2.5 내지 3.5 절단 반응마다 형성된다는 사실은 주목할 만하다. 에탄올에 대한 선택성은 특정 효소의 활성 부위 또는 그 근처에서의 물에 비하여 에탄올에 대한 더 큰 친화성을 표시할 가능성이 있으며, 이때 그 친화성은 Fv3A에 대한 것에 비하여 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제에 대해 더 높다. EXP 대 자일로스의 비는 기질로서 자일로바이오스 또는 자일로스 올리고머를 이용하는 Fv43D에 있어서 동일하며, 이것은 Fv43D,의 경우에 EXP가 자일로스로부터 역 가수분해에 의해 형성되며, 자일로스는 자일로바이오스 및 자일로스 올리고머 기질 둘 모두로부터의 가수분해 생성물이라는 사실에 의해 설명될 수 있다.
멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 및 Fv3A,의 경우, EXP의 최대 수율은 3.5시간의 인큐베이션 후 얻어진다. 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제를 이용한 인큐베이션의 이 시점에서 EXP 수율은 Fv43D를 이용하여 얻은 EXP 수율의 약 7 내지 8배였다. 3.5시간 후, EXP의 수율은 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제 반응 및 Fv3A 반응에서 감소하였으며, 이때 t1 /2은 40 내지 60시간이었다. Fv3A를 포함하는 반응은 트랜스글리코실화 반응에서 형성된 높은 값으로부터 역 가수분해시에 형성된 EXP/자일로스의 평형 값 쪽으로의 EXP의 효소-촉매 가수분해일 가능성이 있었다. SSF 반응에서, EXP 형성의 신속함 및 유지 활성을 갖는 β-자일로시다아제의 존재 하에서의 후속 EXP 가수분해의 느림은 EXP의 농도가 전화 β-자일로시다아제가 존재할 때보다 유지 β-자일로시다아제가 존재할 때 SSF 반응 지속 기간 전체에 걸쳐 사실상 더 높게 남아 있을 가능성이 있음을 시사한다. 이것은 추가로 SSF 반응에서 유지 β-자일로시다아제를 전화 β-자일로시다아제로 대체하는 것이 생성물 수율에 유익할 것임을 시사한다. 상기에 언급된 모든 반응이 효소 촉매됨을 주목한다. 효소의 부재 하에서, 대조 샘플/반응물은 46℃에서 0.9 M 에탄올의 존재 하에서 자일로바이오스, 자일로스 올리고머, 또는 자일로스의 인큐베이션시에 EXP의 형성을 전혀 나타내지 않았다.
9.2 평형 상수의 계산
문헌[Drouet et al., 1994, Biotech. & Bioeng. 43:1075-1080]에서 역 가수분해시에 알킬-자일로피라노사이드(AXP), 예를 들어, EXP의 형성 정도가 알코올, 자일로스 및 알킬-자일로피라노사이드 생성물 사이에 확립된 평형에 의해 결정될 수 있음이 제안되었다.
에틸-자일로피라노사이드(EXP)의 해리 상수는 다음과 같을 것이다:
Kd = [자일로스][EtOH]
[EXP]
이 식을 이용하여, 멀티펙트(등록상표) 자일라나아제가 SSF 반응물에 존재할 때 평형 상수로서 도 2의 데이터로부터 27 M의 Kd가 계산될 수 있다. 또한 이 식을 이용하여, Fv43D가 SSF 반응물에 존재할 때 평형 상수로서 도 16의 데이터로부터 약 9.4 M의 Kd가 계산될 수 있다. v43D 문헌[Drouet et al., 1994, Biotech. Bioeng. 43:1075-1080]으로부터, 티. 레에세이 β-자일로시다아제를 이용하였으며 40 M의 Kd를 계산하였지만, EXP 농도가 160 시간의 인큐베이션 후에도 평형 상수에 도달한 것으로 보이지는 않았다. 상기의 평형 상수 계산은 모두 자일로스와 에탄올을 이용하여 시작한 SSF 반응으로부터 이루어졌으며, 이때 명세서의 도 16에 도시된 결과는 예외였고, 여기서 자일로바이오스와 자일로스 올리고머는 20시간 내에 Fv43D에 의해 완전히 가수분해되었으나 SSF 반응은 총 145시간 동안 진행시켰다. 따라서, Kd는 약 10 내지 약 40 M의 범위에 해당하며 가능하게는 낮은 값에 더 가까울 것으로 상정되며, 그 이유는 전화 β-자일로시다아제 Fv43D가 평형에서 역반응에 의해 상당량의 EXP를 생성하기 때문이다.
실시예 4: 티. 레에세이로부터의 BXL1 유전자의 결실
10.1 bxl1 결실 카세트의 제작
bxl1 결실 카세트를 제작하기 위하여, 트리코데르마 레에세이 게놈-DNA로부터의 bxl1 유전자의 5' 및 3' 측면 서열 (문헌[Margolles-Clark et al., 1996, App. Environ. Microbiol. 62(10):3840-6])을, PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라아제(스트라타젠 (Stratagene))를 이용하여, 프라이머 쌍 MH375/MH376과 MH377/MH378(표 4에 나타남)을 각각 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 3'-측면 서열은 근처의 bgl1 유전자를 피하기 위하여 Bxl1 코딩 서열의 일부를 함유하였다. 프라이머 MH376은 5'-말단에서 인산화시켰다. 5 U/㎕ (로슈 어플라이드 바이오사이언스(Roche Applied Bioscience))의 농도의 T4 DNA 리가아제(Ligase) 1 ㎕, 1 ㎕의 10X 라이게이션(ligation) 완충액 로슈) 및 대략 20 ng의 PCR 단편을 10 ㎕의 총 부피로 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션 반응 혼합물을, 프라이머 쌍 MH379/MH380 및 PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라아제(스트라타젠)을 이용한 PCR 반응을 위한 주형으로 이용하였다.
생성된 4.0 kb 단편을 제조업자의 설명서(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 pCR-Blunt II-TOPO 로 클로닝하였다. 플라스미드로 이. 콜라이(E. coli) 원샷(One Shot)(등록상표) TOP10 화학적 적격 세포 (인비트로겐)를 형질전환시켰다. TOPO 벡터 내로 클로닝된 4.0 kb bxl1 5'+3' PCR 융합 생성물을 함유한 콜로니를 단리하였다. 퀴아프렙(QiaPrep) 플라스미드 정제(퀴아젠 (Qiagen))에 의해 플라스미드를 추출하고 그 서열을 확인하였다 (미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재의 시쿼텍(Sequetech)). 생성된 플라스미드를 AclI 및 AscI (엔이비(NEB))로 절단하여 하이그로마이신-내성 유전자를 함유한 단편을 이용한 후속 클로닝을 허용하였다.
하이그로마이신 내성 유전자를, 아스페르길루스 니둘란스 oliC 프로모터, 하이그로마이신 내성 유전자 (이. 콜라이, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제, hph), 및 아스페르길루스 니둘란스 trpC 종결자를 함유한 벡터로부터의 프라이머 MH292/MH290을 이용하여, PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라아제 (스트라타젠)를 이용하여, 증폭시켰다. PCR-증폭된 단편을 pCR-blunt II-TOPO (인비트로겐) 내로 클로닝하고 이. 콜라이 원샷(등록상표) 화학적 적격 세포 (인비트로겐)를 형질전환시켰다. 콜로니를 단리하였으며, 서열결정에 의하면, 추출된 플라스미드가 돌연변이된 5'AscI 제한 부위를 나타냈으며, 이 부위는 NarI 부위 (GGCGCGCC→GGCGCCC)로 대체되었음이 확인되었다. 그 후 제작물을 NarI (로슈), AscI (엔이비) 및 DraI (로슈)로 절단하였으며, 생성된 2.5 kb 단편을, Bxl1-결실 플라스미드 내로의 후속적 클로닝을 위한 제조에서 제조업자의 프로토콜 (퀴아젠)에 따라 퀴아퀵(QiaQuick) 겔 추출 키트를 이용하여 단리하였다.
상기에 개시한 2개의 단리된 단편의 라이게이션은 1 ㎕의 10X 라이게이션 완충액 (로슈), 1 ㎕의 5 U/㎖ T4 DNA 리가아제 (로슈), 및 50 ng의 각 단편을 10 ㎕의 반응 부피로 이용하여 실시하였다. 라이게이션 혼합물을 이. 콜라이 원샷(등록상표) TOP10 화학적 적격 세포 내로 클로닝하고 단일 콜로니를 단리하였다. IoxP-측면 하이그로마이신 내성 유전자를 함유한 bxl1- 결실 벡터 (도 17, pCR-BluntII-TOPO, bxl1 결실, hph-loxP)를 이. 콜라이로부터 추출하였으며, 4754, 2195, 1899, 및 1182 염기쌍의 4개 단편이 생성되는 Bmt1을 이용한 제한효소 절단에 의해 적절한 라이게이션을 확인하였다.
bxl1-결실 카세트는, 플라스미드 pCR-BluntII-TOPO, bxl1 결실, hph-loxP로부터의 단편을, 10 ㎖의 총 부피의 프라이머 MH379/ MH380 및 PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라아제 (스트라타젠)를 이용하여 증폭시켜 생성하였다. PCR 생성물을 세정하였으며 퀴아엑스(Qiaex)II 키트 (퀴아젠)를 이용하여 농축하였다. DNA를 추가로 약 1.5 ㎎/㎖의 농도로 스피드백(SpeedVac)에 의해 농축하였다.
10.2 티. 레에세이 내로의 bxl1 결실 플라스미드의 형질전환
bxl1-결실 카세트로부터의 DNA로 티. 레에세이 주 #229를 형질전환시켰으며, 이는 본 명세서에서 이전에 개시한 바와 같이 티. 레에세이 Bgl1 및 티. 레에세이 Xyn3을 과다발현하였다. 100 ppm 하이그로마이신 B (인비트로겐)를 함유한 배지에서 형질전환체를 선발하였다. bxl1 결실을 함유한 형질전환체를 PCR에 의해 선발하였다. bxl1-결핍 티. 레에세이 주는 본 명세서에서 "bxl1-" 주로 칭해진다.
실시예 5: 티. 레에세이 주에 의한 fv43D의 발현
하기 실시예는 어떻게 트리코데르마 레에세이가 Fv43D를 발현하도록 조작되었는지를 보여준다. Fv43D를 발현하도록 조작된 티. 레에세이 주는 본 명세서에서 "Fv43D+" 주로 칭해진다.
11.1 발현 카세트의 제작
에프. 베르티실리오이데스 β-자일로시다아제 Fv43D 발현 카세트는 프라이머 SK1322/SK1297 (표 5)을 이용하여 에프. 베르티실리오이데스 게놈 DNA 샘플로부터 Fv43D 유전자를 PCR 증폭하여 제작하였다. 엔도글루카나아제 유전자 egl1의 프로모터의 영역은 프라이머 SK1236/SK1321을 이용하여, 조작된 티. 레에세이 주 RL-P37 (예를 들어, 문헌[Sheir-Neiss G. and B.S. Montenecourt, Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) pp. 46-53] 참조)로부터 추출된 티. 레에세이 게놈 DNA 샘플로부터의 PCR에 의해 증폭시켰다. 이들 2개의 증폭된 단편을 후속적으로 프라이머 SK1236/SK1297을 이용하여 융합 PCR 반응에서 함께 융합시켰다. 생성된 융합 PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO 벡터 (인비트로겐) 내로 클로닝하여 플라스미드 TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D (도 18)를 생성하였으며, 이것을 다시 이용하여 이. 콜라이 원샷(등록상표) TOP10 화학적 적격 세포 (인비트로겐)를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 몇몇 이. 콜라이 클론으로부터 추출하여 제한효소 절단에 의해 확인하였다.
TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D로부터의 발현 카세트를 프라이머 SK1236/SK1297 (표 5)을 이용한 PCR에 의해 증폭하여 티. 레에세이의 형질전환을 위한 DNA 생성물을 생성하였다. 발현 카세트를 als 유전자(아세토락테이트 신타아제)를 함유한 기존의 선발 마커 카세트와 함께 동시 형질전환시켰다.
11.2 Fv43D 발현 카세트를 이용한 bxl1 -결핍 티. 레에세이의 형질전환
bxl1-결핍 티. 레에세이 숙주 주를 예를 들어, 전기천공 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 08/153712호 참조)과 같은 표준 형질전환법을 이용하여, Fv43D 발현 카세트(eg1 프로모터, Fv43D 개방 판독 프레임, 및 Fv43D의 천연 종결자를 포함함) 및 천연 als 유전자를 함유하는 기존의 선발 마커 카세트로 형질전환시킨다. 형질전환체를 클로리뮤론 에틸을 함유한 최소 배지 한천 플레이트에서 선발한다. 이들 형질전환체는 bxl1-Fv43D+ 티. 레에세이다.
11.3 Fv43D 발현 카세트를 이용한 bxl1 -발현 티. 레에세이의 형질전환
야생형 bxl1 유전자 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 2005/001036 A2호 참조)를 가진 티. 레에세이 숙주 주를 예를 들어, 전기천공 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 08/153712호 참조)과 같은 표준 형질전환법을 이용하여, Fv43D 발현 카세트(eg1 프로모터, Fv43D 개방 판독 프레임, 및 Fv43D의 천연 종결자를 포함함) 및 천연 als 유전자를 함유하는 기존의 선발 마커 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환체를 클로리뮤론 에틸을 함유한 최소 배지 한천 플레이트에서 선발하였다. 이들 형질전환체는 Fv43D+ 티. 레에세이다.
실시예 6: ssf 에서 조작된 티. 레에세이 주에서 생성된 셀룰라아제의 이용
형질전환체 bxl1-Fv43D+ 티. 레에세이, 및 Fv43D+ 티. 레에세이를 이용하여 셀룰라아제-함유 배양 브로쓰를 생성한다. 그 후 이들 배양 브로쓰를 본 명세서에 개시된 바와 같이 연속식, 배치식, 또는 유가식 구성의 SSf 반응에서 이용하여 AXP의 생성을 감소시키고 역 가수분해 생성물의 트랜스-자일로스화(trans-xylosication)의 생성에 의한 당 수율 손실을 감소시킨다.
특정한 실시예에서, bxl1- 티. 레에세이 주 #229 ("229 Bxl del")의 형질전환체를 배양하여 셀룰라아제-함유 배양 브로쓰를 생성하였으며, 이를 그 후 정제된 티. 레에세이 Bxl1 (자일란 1 g 당 0.5 ㎎ 또는 1 ㎎) 또는 자일란 1 g 당 1 ㎎의 정제된 FV43D,로 보충하였다. 1일 및 3일에서의 EXP와 에탄올의 농도를 각각 도 43a (1일) 및 도 43b (3일)에 도시하였다. 반응은 묽은 암모니아 전처리 옥수수 속대 기질의 25 wt% 고형물 로딩을 이용하여 재조합 자이모모나스 SSF 조건 하에서 실시하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Danisco US Inc. Gutierrez, Christina Mitchinson, Colin Huang, Tom T. Diner, Bruce A. Fagan, Paul Joseph Hitz, William D. <120> Methods for Improving the Efficiency of Simultaneous Saccharification and Fermentation Reactions <130> 31433WO-2 <140> PCT/US10/61082 <141> 2010-12-17 <150> US 61/289,917 <151> 2009-12-23 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1053 <212> DNA <213> Fusarium verticillioides <400> 1 atgcagctca agtttctgtc ttcagcattg ttgctgtctt tgaccggcaa ttgcgctgcg 60 caagacacta atgatatccc tcctctgatc accgacctct ggtctgcgga tccctcggct 120 catgttttcg agggcaaact ctgggtttac ccatctcacg acatcgaagc caatgtcgtc 180 aacggcaccg gaggcgctca gtacgccatg agagattatc acacctattc catgaagacc 240 atctatggaa aagatcccgt tatcgaccat ggcgtcgctc tgtcagtcga tgatgtccca 300 tgggccaagc agcaaatgtg ggctcctgac gcagcttaca agaacggcaa atattatctc 360 tacttccccg ccaaggataa agatgagatc ttcagaattg gagttgctgt ctccaacaag 420 cccagcggtc ctttcaaggc cgacaagagc tggatccccg gtacttacag tatcgatcct 480 gctagctatg tcgacactaa tggcgaggca tacctcatct ggggcggtat ctggggcggc 540 cagcttcagg cctggcagga tcacaagacc 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Gln Gly Lys Ile Leu Asp Pro Val Asp Gly Trp Thr Thr His Gly Ser 290 295 300 Ile Val Glu Tyr Lys Gly Gln Trp Trp Leu Phe Phe Ala Asp Ala His 305 310 315 320 Thr Ser Gly Lys Asp Tyr Leu Arg Gln Val Lys Ala Arg Lys Ile Trp 325 330 335 Tyr Asp Lys Asp Gly Lys Ile Leu Leu Thr Arg Pro Lys Ile 340 345 350 <210> 3 <211> 2394 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 3 atggtgaata acgcagctct tctcgccgcc ctgtcggctc tcctgcccac ggccctggcg 60 cagaacaatc aaacatacgc caactactct gctcagggcc agcctgatct ctaccccgag 120 acacttgcca cgctcacact ctcgttcccc gactgcgaac atggccccct caagaacaat 180 ctcgtctgtg actcatcggc cggctatgta gagcgagccc aggccctcat ctcgctcttc 240 accctcgagg agctcattct caacacgcaa aactcgggcc ccggcgtgcc tcgcctgggt 300 cttccgaact accaagtctg gaatgaggct ctgcacggct tggaccgcgc caacttcgcc 360 accaagggcg gccagttcga atgggcgacc tcgttcccca tgcccatcct cactacggcg 420 gccctcaacc gcacattgat ccaccagatt gccgacatca tctcgaccca agctcgagca 480 ttcagcaaca gcggccgtta cggtctcgac gtctatgcgc caaacgtcaa tggcttccga 540 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agaaggccgg ctatcacgtc aactttgaac tcggcacaga gatcgccggc 1440 aacagcacca ctggctttgc caaggccatt gctgccgcca agaagtcgga tgccatcatc 1500 tacctcggtg gaattgacaa caccattgaa caggagggcg ctgaccgcac ggacattgct 1560 tggcccggta atcagctgga tctcatcaag cagctcagcg aggtcggcaa accccttgtc 1620 gtcctgcaaa tgggcggtgg tcaggtagac tcatcctcgc tcaagagcaa caagaaggtc 1680 aactccctcg tctggggcgg atatcccggc cagtcgggag gcgttgccct cttcgacatt 1740 ctctctggca agcgtgctcc tgccggccga ctggtcacca ctcagtaccc ggctgagtat 1800 gttcaccaat tcccccagaa tgacatgaac ctccgacccg atggaaagtc aaaccctgga 1860 cagacttaca tctggtacac cggcaaaccc gtctacgagt ttggcagtgg tctcttctac 1920 accaccttca aggagactct cgccagccac cccaagagcc tcaagttcaa cacctcatcg 1980 atcctctctg ctcctcaccc cggatacact tacagcgagc agattcccgt cttcaccttc 2040 gaggccaaca tcaagaactc gggcaagacg gagtccccat atacggccat gctgtttgtt 2100 cgcacaagca acgctggccc agccccgtac ccgaacaagt ggctcgtcgg attcgaccga 2160 cttgccgaca tcaagcctgg tcactcttcc aagctcagca tccccatccc tgtcagtgct 2220 ctcgcccgtg 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155 160 Phe Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Val 165 170 175 Asn Gly Phe Arg Ser Pro Leu Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly 180 185 190 Glu Asp Ala Phe Phe Leu Ser Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Tyr Ile Thr 195 200 205 Gly Ile Gln Gly Gly Val Asp Pro Glu His Leu Lys Val Ala Ala Thr 210 215 220 Val Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp Leu Glu Asn Trp Asn Asn Gln Ser 225 230 235 240 Arg Leu Gly Phe Asp Ala Ile Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ser Glu Tyr 245 250 255 Tyr Thr Pro Gln Phe Leu Ala Ala Ala Arg Tyr Ala Lys Ser Arg Ser 260 265 270 Leu Met Cys Ala Tyr Asn Ser Val Asn Gly Val Pro Ser Cys Ala Asn 275 280 285 Ser Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu Arg Glu Ser Trp Gly Phe Pro Glu 290 295 300 Trp Gly Tyr Val Ser Ser Asp Cys Asp Ala Val Tyr Asn Val Phe Asn 305 310 315 320 Pro His Asp Tyr Ala Ser Asn Gln Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Leu 325 330 335 Arg Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys Gly Gln Thr Tyr Pro Trp His Leu 340 345 350 Asn Glu Ser Phe Val Ala Gly Glu Val Ser Arg Gly Glu Ile Glu Arg 355 360 365 Ser Val Thr Arg Leu Tyr Ala Asn Leu Val Arg Leu Gly Tyr Phe Asp 370 375 380 Lys Lys Asn Gln Tyr Arg Ser Leu Gly Trp Lys Asp Val Val Lys Thr 385 390 395 400 Asp Ala Trp Asn Ile Ser Tyr Glu Ala Ala Val Glu Gly Ile Val Leu 405 410 415 Leu Lys Asn Asp Gly Thr Leu Pro Leu Ser Lys Lys Val Arg Ser Ile 420 425 430 Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Met Gln Gly Asn 435 440 445 Tyr Tyr Gly Pro Ala Pro Tyr Leu Ile Ser Pro Leu Glu Ala Ala Lys 450 455 460 Lys Ala Gly Tyr His Val Asn Phe Glu Leu Gly Thr Glu Ile Ala Gly 465 470 475 480 Asn Ser Thr Thr Gly Phe Ala Lys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ser 485 490 495 Asp Ala Ile Ile Tyr Leu Gly Gly Ile Asp Asn Thr Ile Glu Gln Glu 500 505 510 Gly Ala Asp Arg Thr Asp Ile Ala Trp Pro Gly Asn Gln Leu Asp Leu 515 520 525 Ile Lys Gln Leu Ser Glu Val Gly Lys Pro Leu Val Val Leu Gln Met 530 535 540 Gly Gly Gly Gln Val Asp Ser Ser Ser Leu Lys Ser Asn Lys Lys Val 545 550 555 560 Asn Ser Leu Val Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Val Ala 565 570 575 Leu Phe Asp Ile Leu Ser Gly Lys Arg Ala Pro Ala Gly Arg Leu Val 580 585 590 Thr Thr Gln Tyr Pro Ala Glu Tyr Val His Gln Phe Pro Gln Asn Asp 595 600 605 Met Asn Leu Arg Pro Asp Gly Lys Ser Asn Pro Gly Gln Thr Tyr Ile 610 615 620 Trp Tyr Thr Gly Lys Pro Val Tyr Glu Phe Gly Ser Gly Leu Phe Tyr 625 630 635 640 Thr Thr Phe Lys Glu Thr Leu Ala Ser His Pro Lys Ser Leu Lys Phe 645 650 655 Asn Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ala Pro His Pro Gly Tyr Thr Tyr Ser 660 665 670 Glu Gln Ile Pro Val Phe Thr Phe Glu Ala Asn Ile Lys Asn Ser Gly 675 680 685 Lys Thr Glu Ser Pro Tyr Thr Ala Met Leu Phe Val Arg Thr Ser Asn 690 695 700 Ala Gly Pro Ala Pro Tyr Pro Asn Lys Trp Leu Val Gly Phe Asp Arg 705 710 715 720 Leu Ala Asp Ile Lys Pro Gly His Ser Ser Lys Leu Ser Ile Pro Ile 725 730 735 Pro Val Ser Ala Leu Ala Arg Val Asp Ser His Gly Asn Arg Ile Val 740 745 750 Tyr Pro Gly Lys Tyr Glu Leu Ala Leu Asn Thr Asp Glu Ser Val Lys 755 760 765 Leu Glu Phe Glu Leu Val Gly Glu Glu Val Thr Ile Glu Asn Trp Pro 770 775 780 Leu Glu Glu Gln Gln Ile Lys Asp Ala Thr Pro Asp Ala 785 790 795 <210> 5 <211> 2358 <212> DNA <213> Fusarium verticillioides <400> 5 atgctgctca atcttcaggt cgctgccagc gctttgtcgc tttctctttt aggtggattg 60 gctgaggctg ctacgccata tacccttccg gactgtacca aaggaccttt gagcaagaat 120 ggaatctgcg atacttcgtt atctccagct aaaagagcgg ctgctctagt tgctgctctg 180 acgcccgaag agaaggtggg caatctggtc aggtaaaata tacccccccc cataatcact 240 attcggagat tggagctgac ttaacgcagc aatgcaactg gtgcaccaag aatcggactt 300 ccaaggtaca actggtggaa cgaagccctt catggcctcg ctggatctcc aggtggtcgc 360 tttgccgaca ctcctcccta cgacgcggcc acatcatttc ccatgcctct tctcatggcc 420 gctgctttcg acgatgatct gatccacgat atcggcaacg tcgtcggcac cgaagcgcgt 480 gcgttcacta acggcggttg gcgcggagtc gacttctgga cacccaacgt caaccctttt 540 aaagatcctc gctggggtcg tggctccgaa actccaggtg aagatgccct tcatgtcagc 600 cggtatgctc gctatatcgt caggggtctc gaaggcgata aggagcaacg acgtattgtt 660 gctacctgca agcactatgc tggaaacgac tttgaggact ggggaggctt cacgcgtcac 720 gactttgatg ccaagattac tcctcaggac ttggctgagt actacgtcag gcctttccag 780 gagtgcaccc gtgatgcaaa ggttggttcc atcatgtgcg cctacaatgc cgtgaacggc 840 attcccgcat gcgcaaactc gtatctgcag gagacgatcc tcagagggca ctggaactgg 900 acgcgcgata acaactggat cactagtgat tgtggcgcca tgcaggatat ctggcagaat 960 cacaagtatg tcaagaccaa cgctgaaggt gcccaggtag cttttgagaa cggcatggat 1020 tctagctgcg agtatactac taccagcgat gtctccgatt cgtacaagca aggcctcttg 1080 actgagaagc tcatggatcg ttcgttgaag cgccttttcg aagggcttgt tcatactggt 1140 ttctttgacg gtgccaaagc gcaatggaac tcgctcagtt ttgcggatgt caacaccaag 1200 gaagctcagg atcttgcact cagatctgct gtggagggtg ctgttcttct taagaatgac 1260 ggcactttgc ctctgaagct caagaagaag gatagtgttg caatgatcgg attctgggcc 1320 aacgatactt ccaagctgca gggtggttac agtggacgtg ctccgttcct ccacagcccg 1380 ctttatgcag ctgagaagct tggtcttgac accaacgtgg cttggggtcc gacactgcag 1440 aacagctcat ctcatgataa ctggaccacc aatgctgttg ctgcggcgaa gaagtctgat 1500 tacattctct actttggtgg tcttgacgcc tctgctgctg gcgaggacag agatcgtgag 1560 aaccttgact ggcctgagag ccagctgacc 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tcacctgggc caacgcgaat gcgtgggccc cgcaagtcat ccctcgcaac 300 ggccaattct acttttatgc tcctgtccga cacaacgatg gttctatggc tatcggtgtg 360 ggagtgagca gcaccatcac aggtccatac catgatgcta tcggcaaacc gctagtagag 420 aacaacgaga ttgatcccac cgtgttcatc gacgatgacg gtcaggcata cctgtactgg 480 ggaaatccag acctgtggta cgtcaaattg aaccaagata tgatatcgta cagcgggagc 540 cctactcaga ttccactcac cacggctgga tttggtactc gaacgggcaa tgctcaacgg 600 ccgaccactt ttgaagaagc tccatgggta tacaaacgca acggcatcta ctatatcgcc 660 tatgcagccg attgttgttc tgaggatatt cgctactcca cgggaaccag tgccactggt 720 ccgtggactt atcgaggcgt catcatgccg acccaaggta gcagcttcac caatcacgag 780 ggtattatcg acttccagaa caactcctac tttttctatc acaacggcgc tcttcccggc 840 ggaggcggct accaacgatc tgtatgtgtg gagcaattca aatacaatgc agatggaacc 900 attccgacga tcgaaatgac caccgccggt ccagctcaaa ttgggactct caacccttac 960 gtgcgacagg aagccgaaac ggcggcatgg tcttcaggca tcactacgga ggtttgtagc 1020 gaaggcggaa ttgacgtcgg gtttatcaac aatggcgatt acatcaaagt taaaggcgta 1080 gctttcggtt caggagccca 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acatcggtat tcatcgagat 1260 aacggaaagt tcacaatcgc tacgaagcat gggatgaata tggatgagtg gaacggaaca 1320 acaacagacc tgggacaaat aaaagccaca gctaatgtgc cttctggaag gaccaagatc 1380 tggctgagac ttcaacttga taccaaccca gcaggaactg gcaacactat cttttcttac 1440 agttgggatg gagtcaagta tgaaacactg ggtcccaact tcaaactgta caatggttgg 1500 gcattcttta ttgcttaccg attcggcatc ttcaacttcg ccgagacggc tttaggaggc 1560 tcgatcaagg ttgagtcttt cacagctgca tag 1593 <210> 10 <211> 530 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 10 Met Lys Val Tyr Trp Leu Val Ala Trp Ala Thr Ser Leu Thr Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Gly Leu Ile Gly His Arg Arg Ala Thr Thr Phe Asn Asn Pro 20 25 30 Ile Ile Tyr Ser Asp Phe Pro Asp Asn Asp Val Phe Leu Gly Pro Asp 35 40 45 Asn Tyr Tyr Tyr Phe Ser Ala Ser Asn Phe His Phe Ser Pro Gly Ala 50 55 60 Pro Val Leu Lys Ser Lys Asp Leu Leu Asn Trp Asp Leu Ile Gly His 65 70 75 80 Ser Ile Pro Arg Leu Asn Phe Gly Asp Gly Tyr Asp Leu Pro Pro Gly 85 90 95 Ser Arg Tyr Tyr Arg Gly Gly Thr Trp Ala Ser Ser Leu Arg Tyr Arg 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ctgttccaag ataccaaggg caactggtgg ggtctttgtc ttgctactcg catcacagca 840 cagggagttt cacccatggg ccgtgaagct gttttgttca atggcacatg gaacaagggc 900 gaatggccca agttgcaacc agtacgaggt cgcatgcctg gaaacctcct cccaaagccg 960 acgcgaaacg ttcccggaga tgggcccttc aacgctgacc cagacaacta caacttgaag 1020 aagactaaga agatccctcc tcactttgtg caccatagag tcccaagaga cggtgccttc 1080 tctttgtctt ccaagggtct gcacatcgtg cctagtcgaa acaacgttac cggtagtgtg 1140 ttgccaggag atgagattga gctatcagga cagcgaggtc tagctttcat cggacgccgc 1200 caaactcaca ctctgttcaa atatagtgtt gatatcgact tcaagcccaa gtccgatgat 1260 caggaagctg gaatcaccgt tttccgcacg cagttcgacc atatcgatct tggcattgtt 1320 cgtcttccta caaaccaagg cagcaacaag aaatctaagc ttgccttccg attccgggcc 1380 acaggagctc agaatgttcc tgcaccgaag gtagtaccgg tccccgatgg ctgggagaag 1440 ggcgtaatca gtctacatat cgaggcagcc aacgcgacgc actacaacct tggagcttcg 1500 agccacagag gcaagactct cgacatcgcg acagcatcag caagtcttgt gagtggaggc 1560 acgggttcat ttgttggtag tttgcttgga ccttatgcta cctgcaacgg caaaggatct 1620 ggagtggaat gtcccaaggg aggtgatgtc tatgtgaccc aatggactta taagcccgtg 1680 gcacaagaga ttgatcatgg tgtttttgtg aaatcagaat tgtag 1725 <210> 12 <211> 574 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 12 Met Arg Phe Ser Trp Leu Leu Cys Pro Leu Leu Ala Met Gly Ser Ala 1 5 10 15 Leu Pro Glu Thr Lys Thr Asp Val Ser Thr Tyr Thr Asn Pro Val Leu 20 25 30 Pro Gly Trp His Ser Asp Pro Ser Cys Ile Gln Lys Asp Gly Leu Phe 35 40 45 Leu Cys Val Thr Ser Thr Phe Ile Ser Phe Pro Gly Leu Pro Val Tyr 50 55 60 Ala Ser Arg Asp Leu Val Asn Trp Arg Leu Ile Ser His Val Trp Asn 65 70 75 80 Arg Glu Lys Gln Leu Pro Gly Ile Ser Trp Lys Thr Ala Gly Gln Gln 85 90 95 Gln Gly Met Tyr Ala Pro Thr Ile Arg Tyr His Lys Gly Thr Tyr Tyr 100 105 110 Val Ile Cys Glu Tyr Leu Gly Val Gly Asp Ile Ile Gly Val Ile Phe 115 120 125 Lys Thr Thr Asn Pro Trp Asp Glu Ser Ser Trp Ser Asp Pro Val Thr 130 135 140 Phe Lys Pro Asn His Ile Asp Pro Asp Leu Phe Trp Asp Asp Asp Gly 145 150 155 160 Lys Val Tyr Cys Ala Thr His Gly Ile Thr Leu Gln Glu Ile 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atggcagctc caagtttatc ctaccccaca ggtatccaat cgtataccaa tcctctcttc 60 cctggttggc actccgatcc cagctgtgcc tacgtagcgg agcaagacac ctttttctgc 120 gtgacgtcca ctttcattgc cttccccggt cttcctcttt atgcaagccg agatctgcag 180 aactggaaac tggcaagcaa tattttcaat cggcccagcc agatccctga tcttcgcgtc 240 acggatggac agcagtcggg tatctatgcg cccactctgc gctatcatga gggccagttc 300 tacttgatcg tttcgtacct gggcccgcag actaagggct tgctgttcac ctcgtctgat 360 ccgtacgacg atgccgcgtg gagcgatccg ctcgaattcg cggtacatgg catcgacccg 420 gatatcttct gggatcacga cgggacggtc tatgtcacgt ccgccgagga ccagatgatt 480 aagcagtaca cactcgatct gaagacgggg gcgattggcc cggttgacta cctctggaac 540 ggcaccggag gagtctggcc cgagggcccg cacatttaca agagagacgg atactactac 600 ctcatgatcg cagagggagg taccgagctc ggccactcgg agaccatggc gcgatctaga 660 acccggacag gtccctggga gccatacccg cacaatccgc tcttgtcgaa caagggcacc 720 tcggagtact tccagactgt gggccatgcg gacttgttcc aggatgggaa cggcaactgg 780 tgggccgtgg cgttgagcac ccgatcaggg cctgcatgga agaactatcc catgggtcgg 840 gagacggtgc tcgcccccgc cgcttgggag aagggtgagt ggcctgtcat tcagcctgtg 900 agaggccaaa tgcaggggcc gtttccacca ccaaataagc gagttcctcg cggcgagggc 960 ggatggatca agcaacccga caaagtggat ttcaggcccg gatcgaagat accggcgcac 1020 ttccagtact ggcgatatcc caagacagag gattttaccg tctcccctcg gggccacccg 1080 aatactcttc ggctcacacc ctccttttac aacctcaccg gaactgcgga cttcaagccg 1140 gatgatggcc tgtcgcttgt tatgcgcaaa cagaccgaca ccttgttcac gtacactgtg 1200 gacgtgtctt ttgaccccaa ggttgccgat gaagaggcgg gtgtgactgt tttccttacc 1260 cagcagcagc acatcgatct tggtattgtc cttctccaga caaccgaggg gctgtcgttg 1320 tccttccggt tccgcgtgga aggccgcggt aactacgaag gtcctcttcc agaagccacc 1380 gtgcctgttc ccaaggaatg gtgtggacag accatccggc ttgagattca ggccgtgagt 1440 gacaccgagt atgtctttgc ggctgccccg gctcggcacc ctgcacagag gcaaatcatc 1500 agccgcgcca actcgttgat tgtcagtggt gatacgggac ggtttactgg ctcgcttgtt 1560 ggcgtgtatg ccacgtcgaa cgggggtgcc ggatccacgc ccgcatatat cagcagatgg 1620 agatacgaag gacggggcca gatgattgat tttggtcgag tggtcccgag ctactga 1677 <210> 14 <211> 558 <212> PRT <213> Aspergillus fumigatus <400> 14 Met Ala Ala Pro Ser Leu Ser Tyr Pro Thr Gly Ile Gln Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Asn Pro Leu Phe Pro Gly Trp His Ser Asp Pro Ser Cys Ala Tyr Val 20 25 30 Ala Glu Gln Asp Thr Phe Phe Cys Val Thr Ser Thr Phe Ile Ala Phe 35 40 45 Pro Gly Leu Pro Leu Tyr Ala Ser Arg Asp Leu Gln Asn Trp Lys Leu 50 55 60 Ala Ser Asn Ile Phe Asn Arg Pro Ser Gln Ile Pro Asp Leu Arg Val 65 70 75 80 Thr Asp Gly Gln Gln Ser Gly Ile Tyr Ala Pro Thr Leu Arg Tyr His 85 90 95 Glu Gly Gln Phe Tyr Leu Ile Val Ser Tyr Leu Gly Pro Gln Thr Lys 100 105 110 Gly Leu Leu Phe Thr Ser Ser Asp Pro Tyr Asp Asp Ala Ala Trp Ser 115 120 125 Asp Pro Leu Glu Phe Ala Val His Gly Ile Asp Pro Asp Ile Phe Trp 130 135 140 Asp His Asp Gly Thr Val Tyr Val Thr Ser Ala Glu Asp Gln Met Ile 145 150 155 160 Lys Gln Tyr Thr Leu Asp Leu Lys Thr Gly Ala Ile Gly Pro Val Asp 165 170 175 Tyr Leu Trp Asn Gly Thr Gly Gly Val Trp Pro Glu Gly Pro His Ile 180 185 190 Tyr Lys Arg Asp Gly Tyr Tyr Tyr Leu Met Ile Ala Glu Gly Gly 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gccagctgaa ctggggagac gccgactatc tcgtcaactt tgcccagcaa 360 aacggcaagt cgatacgcgg ccacactctg atctggcact cgcagctgcc tgcgtgggtg 420 aacaatatca acaacgcgga tactctgcgg caagtcatcc gcacccatgt ctctactgtg 480 gttgggcggt acaagggcaa gattcgtgct tgggtgagtt ttgaacacca catgcccctt 540 ttcttagtcc gctcctcctc ctcttggaac ttctcacagt tatagccgta tacaacattc 600 gacaggaaat ttaggatgac aactactgac tgacttgtgt gtgtgatggc gataggacgt 660 ggtcaatgaa atcttcaacg aggatggaac gctgcgctct tcagtctttt ccaggctcct 720 cggcgaggag tttgtctcga ttgcctttcg tgctgctcga gatgctgacc cttctgcccg 780 tctttacatc aacgactaca atctcgaccg cgccaactat ggcaaggtca acgggttgaa 840 gacttacgtc tccaagtgga tctctcaagg agttcccatt gacggtattg gtgagccacg 900 acccctaaat gtcccccatt agagtctctt tctagagcca aggcttgaag ccattcaggg 960 actgacacga gagccttctc tacaggaagc cagtcccatc tcagcggcgg cggaggctct 1020 ggtacgctgg gtgcgctcca gcagctggca acggtacccg tcaccgagct ggccattacc 1080 gagctggaca ttcagggggc accgacgacg gattacaccc aagttgttca agcatgcctg 1140 agcgtctcca agtgcgtcgg catcaccgtg tggggcatca gtgacaaggt aagttgcttc 1200 ccctgtctgt gcttatcaac tgtaagcagc aacaactgat gctgtctgtc tttacctagg 1260 actcgtggcg tgccagcacc aaccctcttc tgtttgacgc aaacttcaac cccaagccgg 1320 catataacag cattgttggc atcttacaat ag 1352 <210> 18 <211> 347 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 18 Met Lys Ala Asn Val Ile Leu Cys Leu Leu Ala Pro Leu Val Ala Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Glu Thr Ile His Leu Asp Pro Glu Leu Ala Ala Leu Arg 20 25 30 Ala Asn Leu Thr Glu Arg Thr Ala Asp Leu Trp Asp Arg Gln Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Asp Gln Leu Ile Lys Arg Lys Gly Lys Leu Tyr Phe Gly 50 55 60 Thr Ala Thr Asp Arg Gly Leu Leu Gln Arg Glu Lys Asn Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Gln Ala Asp Leu Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp 85 90 95 Gln Ser Leu Glu Asn Asn Gln Gly Gln Leu Asn Trp Gly Asp Ala Asp 100 105 110 Tyr Leu Val Asn Phe Ala Gln Gln Asn Gly Lys Ser Ile Arg Gly His 115 120 125 Thr Leu Ile Trp His Ser Gln Leu Pro Ala Trp Val Asn Asn Ile Asn 130 135 140 Asn Ala Asp Thr Leu Arg Gln Val Ile 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<400> 19 aacgtctgca gtcccgtact gtttaccaaa atgccaggcc actggtggat atacaacttt 60 gtaatacgtt gccggagtca gcccctactc cctgatgggt tcccactccc tagttacttc 120 ctactgggta gtaggctcct agagtggggt aaagtttgcc aagggtttag ccccagtctt 180 gtttatgctt ggctaggcag gacctgggta agttgatggc tcctgcattc ctacctgagt 240 atttccagct ataagcgaga tttgccatac tcttcagcga gtccggatgg tccgcgccga 300 ggttgaccct gccttcatca cctacacaaa gaactcctcg gccaactccc ggtggccttc 360 gagctccaaa gtaccttcgc gacctttggc cagtgtttct cgcagcgttt actgagccta 420 aggcttgcta caataaataa agagacataa ccttgcagta catacgtctt gtatgagcga 480 ggaactgtgt tcagtagtag atcagtgggt acataatcat gaacatgact tctgagccag 540 aaaaccttct gcagggaacc ggtgaagaaa ccccacttcc ccgcctccac taactgcagc 600 ccctttatcc gcctgccgtc catttagcca aatgtagtcc atttagccaa gtgcggtcca 660 tttagccaag tccagtgctt aggttggtgg ctacacagga aacggccatg aatgtagaca 720 caactataga actgtcccta gaaataggct cgaggttgtt agagcgttta aggtgatgcg 780 gcaaaatgca tatgactgag ttgcttcaac gtgcagggga aagggataaa tagtcttttt 840 cgcagaatat aaatagaggt agagcgggct cgcagcaata ttgaccagga cagggcttct 900 tttccagttg catacatcca ttcacagcat tcagctttct tcaatcatca tgaaggtcac 960 tgcggctttt gcaggtcttt tggtcacggc attcgccgct cctgccccag aacctgatct 1020 ggtgtcgcga agtgccggta tcaactacgt gcaaaactac aacggcaacc ttggtgattt 1080 cacctacgac gagagtgccg gaacattttc catgtactgg gaagatggag tgagctccga 1140 ctttgtcgtt ggtctgggct ggaccactgg ttcttctaag tgagtgactg tattctttaa 1200 ccaaggtcta ggatctaacg tctttcagcg ctatcaccta ctctgccgaa tacagcgctt 1260 ctggctccgc ttcctacctc gctgtgtacg gctgggtcaa ctatcctcaa gctgagtact 1320 acatcgtcga ggattacggt gattataacc cttgcagttc ggccacaagc cttggtaccg 1380 tgtactctga tggaagcacc taccaagtct gcaccgacac tcgaacaaac gaaccgtcca 1440 tcacgggaac aagcacgttc acgcagtact tctccgttcg agagagcacg cgcacatctg 1500 gaacggtgac tgttgccaac catttcaact tctgggcgca ccatgggttc ggcaatagcg 1560 acttcaatta tcaggtcgtg gcggtggaag catggagcgg tgctggcagc gctagtgtca 1620 caatctcttc ttgagagatt agtgccctag tagtcggaag atatcaacgc ggcagtttgc 1680 tctcaggtgg tgtgatgatc ggatccggtc tctggggtta cattgaggct gtataagttg 1740 ttgtggggcc gagctgtcag cggctgcgtt ttcagcttgc acagataatc aactctcgtt 1800 ttctatctct tgcgtttcct cgctgcttat cctatccata gataattatt ttgcccacta 1860 ccacaacttg ttcggtcgca gtagtcactc cgagcaaggc attgggaaat gggggatgcg 1920 gggtgctgcg taccctctaa cctagggcat tttaaaggat atttaccctc cagatattct 1980 atagatacag acttcttagg actgcgggta atatagagag cgaaatttct acagttcgat 2040 gcagttcaat gcga 2054 <210> 20 <211> 211 <212> PRT <213> Aspergillus tubingensis <400> 20 Met Lys Val Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Val Thr Ala Phe Ala 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Glu Pro Asp Leu Val Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe Thr Tyr Asp Glu 35 40 45 Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp Gly Val Ser Ser Asp 50 55 60 Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ile Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Leu Ala Val 85 90 95 Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gln Ala Glu Tyr Tyr Ile 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acagtgagct gactggtcga attagaaaaa cacttcccaa aactcttctc 660 agtggcccag ccatggcaca ttctcccatt ctgtccgatg ataaatggca tacctggctt 720 caatcagtag cgggtaacaa gacagtccct gatatttact cctggcatca gattggcgct 780 tgggaacgtg agccggacag cactatcccc gactttacca ccttgcgggc gcaatatggc 840 gttcccgaga agccaattga cgtcaatgag tacgctgcac gcgatgagca aaatccagcc 900 aactccgtct actacctctc tcaactagag cgtcataacc ttagaggtct tcgcgcaaac 960 tggggtagcg gatctgacct ccacaactgg atgggcaact tgatttacag cactaccggt 1020 acctcggagg ggacttacta ccctaatggt gaatggcagg cttacaagta ctatgcggcc 1080 atggcagggc agagacttgt gaccaaagca tcgtcggact tgaagtttga tgtctttgcc 1140 actaagcaag gccgtaagat taagattata gccggcacga ggaccgttca agcaaagtat 1200 aacatcaaaa tcagcggttt ggaagtagca ggacttccta agatgggtac ggtaaaggtc 1260 cggacttatc ggttcgactg ggctgggccg aatggaaagg ttgacgggcc tgttgatttg 1320 ggggagaaga agtatactta ttcggccaat acggtgagca gcccctctac ttga 1374 <210> 46 <211> 439 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 46 Met His Tyr Ala Thr Leu Thr Thr 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cggcggctta cgatcttgga acaatgtctc 1380 gaaagcatgg tgcgtcgtga tcatccggat ccagaaaagc ggaacggcgt gatggggctt 1440 gacagcaccc gcaccatggg tggagcggaa atcacaacgt atgatagttt ggatgtttcc 1500 ctcggccagg cgcgcaacaa tttatatttg gcaggaaaat gttgggctgc ctatgtggcg 1560 ctcgaaaagt tgttccgcga tgtcggcaaa gaagaactgg ctgcattggc aagggagcag 1620 gcggaaaaat gcgccgcgac gattgtcagt cacgtgacgg aggacgggta tatcccagcc 1680 gtgatgggag aaggaaatga ctcgaaaatc attccggcta ttgaggggct tgtgtttcct 1740 tactttacga actgccatga ggcgttaaga gaagacggac gttttggaga ctatattcgt 1800 gcactgcgac aacatttgca atatgtgttg cgggaaggaa tttgcctatt cccggacggg 1860 ggatggaaaa tttcctcgac aagcaacaac tcgtggttga gcaaaattta cttatgccag 1920 tttattgccc gccgcatttt agggtgggaa tgggatgaac aaggaaaacg agctgatgcg 1980 gctcatgttg cgtggctcac gcatccgacg ctctccattt ggagttggag cgaccaaatt 2040 atcgctggcg aaatcagcgg cagcaaatac tacccgcgcg gcgtgacgag cattttatgg 2100 ttggaggagg gggaatga 2118 <210> 52 <211> 705 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 52 Met Pro 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Met Thr His Glu Gln Leu Val Asn Trp 420 425 430 Val Leu Cys Ala Ala Val Tyr Ile Glu Gln Thr Lys Asp Trp Ala Trp 435 440 445 Arg Asp Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Gln Cys Leu Glu Ser Met Val 450 455 460 Arg Arg Asp His Pro Asp Pro Glu Gln Arg Asn Gly Val Met Gly Leu 465 470 475 480 Asp Ser Thr Arg Thr Met Gly Gly Ala Glu Ile Thr Thr Tyr Asp Ser 485 490 495 Leu Asp Val Ser Leu Gly Gln Ala Arg Asn Asn Leu Tyr Leu Ala Gly 500 505 510 Lys Cys Trp Ala Ala Tyr Val Ala Leu Glu Lys Leu Phe Arg Asp Val 515 520 525 Gly Lys Glu Glu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Glu Gln Ala Glu Lys Cys 530 535 540 Ala Ala Thr Ile Val Ser His Val Thr Asp Asp Gly Tyr Ile Pro Ala 545 550 555 560 Ile Met Gly Glu Gly Asn Asp Ser Lys Ile Ile Pro Ala Ile Glu Gly 565 570 575 Leu Val Phe Pro Tyr Phe Thr Asn Cys His Glu Ala Leu Asp Glu Asn 580 585 590 Gly Arg Phe Gly Ala Tyr Ile Gln Ala Leu Arg Asn His Leu Gln Tyr 595 600 605 Val Leu Arg Glu Gly Ile Cys Leu Phe Pro Asp Gly Gly Trp Lys Ile 610 615 620 Ser Ser Thr Ser Asn Asn Ser Trp Leu Ser Lys Ile Tyr Leu Cys Gln 625 630 635 640 Phe Ile Ala Arg His Ile Leu Gly Trp Glu Trp Asp Glu Gln Gly Lys 645 650 655 Arg Ala Asp Ala Ala His Val Ala Trp Leu Thr His Pro Thr Leu Ser 660 665 670 Ile Trp Ser Trp Ser Asp Gln Ile Ile Ala Gly Glu Ile Thr Gly Ser 675 680 685 Lys Tyr Tyr Pro Arg Gly Val Thr Ser Ile Leu Trp Leu Glu Glu Gly 690 695 700 Glu 705 <210> 53 <211> 1000 <212> DNA <213> Trichomonas koningii <400> 53 atgctctcca acgctcgtat catcgcagcg ggctgtattg ctgcaggctc tctcgttgct 60 gctgggcctt gtgacatcta ctcctcgggc ggaacgcctt gcgttgccgc ccacagcacc 120 actcgagctc tgttcagcgc ttataccggc ccgttatacc aggtaaagcg cggctccgat 180 ggtgccacaa ccgccatatc gcccctctca agtggtgtgg ccaacgctgc cgctcaagat 240 gctttctgtg cgggaactac atgcctcatt accatcatat acgaccagtc gggtcgcggc 300 aaccatctca gggaggcccc gccgggcggc ttcagcggcc cggaatccaa cggctatgac 360 aacctggcta gtgcaattgg ggcgccggta acactcaacg gccagaaggc gtatggagtt 420 ttcgtgtctc caggaacggg gtatcggaat aacgctgcca gcggcacagc caaaggagat 480 gccgcggagg gcatgtatgc ggttctcgat ggtacacact acaacggcgc ctgctgcttt 540 gactatggca acgccgagac caacagccgc gatacaggca acggtcatat ggaggccatc 600 tattttggcg acagcactgt ctggggtact ggctcaggca agggtccgtg gatcatggct 660 gatctcgaga acggcttgtt ctcaggctcc agtcccggca acaatgccgg tgatccgtcc 720 atctcgtacc ggttcgtcac tgcagcgatc aaggggcagc caaaccaatg ggcaatccgt 780 ggcggcaatg ctgcgtctgg ctcgctgtca actttctaca gcggcgctcg cccacaagtc 840 tccggataca atccgatgag caaagagggc gccatcattc tcggcattgg cggcgacaac 900 agcaacggcg gccagggcac attctatgag ggcgtcatga cctctggata tccttccgat 960 gcaacagaga attcagtgca agccaacatc gtagctgcca 1000 <210> 54 <211> 500 <212> PRT <213> Trichomonas koningii <400> 54 Met Leu Ser Asn Ala Arg Ile Ile Ala Ala Gly Cys Ile Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Val Ala Ala Gly Pro Cys Asp Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Thr 20 25 30 Pro Cys Val Ala Ala His Ser Thr Thr Arg Ala Leu Phe Ser Ala Tyr 35 40 45 Thr Gly Pro Leu Tyr Gln Val Lys Arg Gly Ser Asp Gly Ala Thr Thr 50 55 60 Ala Ile Ser Pro Leu Ser Ser Gly Val Ala Asn Ala Ala Ala Gln Asp 65 70 75 80 Ala Phe Cys Ala Gly Thr Thr Cys Leu Ile Thr Ile Ile Tyr Asp Gln 85 90 95 Ser Gly Arg Gly Asn His Leu Arg Glu Ala Pro Pro Gly Gly Phe Ser 100 105 110 Gly Pro Glu Ser Asn Gly Tyr Asp Asn Leu Ala Ser Ala Ile Gly Ala 115 120 125 Pro Val Thr Leu Asn Gly Gln Lys Ala Tyr Gly Val Phe Val Ser Pro 130 135 140 Gly Thr Gly Tyr Arg Asn Asn Ala Ala Ser Gly Thr Ala Lys Gly Asp 145 150 155 160 Ala Ala Glu Gly Met Tyr Ala Val Leu Asp Gly Thr His Tyr Asn Gly 165 170 175 Ala Cys Cys Phe Asp Tyr Gly Asn Ala Glu Thr Asn Ser Arg Asp Thr 180 185 190 Gly Asn Gly His Met Glu Ala Ile Tyr Phe Gly Asp Ser Thr Val Trp 195 200 205 Gly Thr Gly Ser Gly Lys Gly Pro Trp Ile Met Ala Asp Leu Glu Asn 210 215 220 Gly Leu Phe Ser Gly Ser Ser Pro Gly Asn Asn Ala Gly Asp Pro Ser 225 230 235 240 Ile Ser Tyr Arg Phe Val Thr Ala Ala Ile Lys Gly Gln Pro Asn Gln 245 250 255 Trp Ala Ile Arg Gly Gly Asn Ala Ala Ser Gly Ser Leu Ser Thr Phe 260 265 270 Tyr Ser Gly Ala Arg Pro Gln Val Ser Gly Tyr Asn Pro Met Ser Lys 275 280 285 Glu Gly Ala Ile Ile Leu Gly Ile Gly Gly Asp Asn Ser Asn Gly Gly 290 295 300 Gln Gly Thr Phe Tyr Glu Gly Val Met Thr Ser Gly Tyr Pro Ser Asp 305 310 315 320 Ala Thr Glu Asn Ser Val Gln Ala Asn Ile Val Ala Ala Arg Tyr Ala 325 330 335 Val Ala Pro Leu Thr Ser Gly Pro Ala Leu Thr Val Gly Ser Ser Ile 340 345 350 Ser Leu Arg Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Arg Tyr Ile Ala His 355 360 365 Ser Gly Ser Thr Val Asn Thr Gln Val Val Ser Ser Ser Ser Ala Thr 370 375 380 Ala Leu Lys Gln Gln Ala Ser Trp Thr Val Arg Ala Gly Leu Ala Asn 385 390 395 400 Asn Ala Cys Phe Ser Phe Glu Ser Gln Asp Thr Ser Gly Ser Tyr Ile 405 410 415 Arg His Ser Asn Phe Gly Leu Val Leu Asn Ala Asn Asp Gly Ser Lys 420 425 430 Leu Phe Ala Glu Asp Ala Thr Phe Cys Thr Gln Ala Gly Ile Asn Gly 435 440 445 Gln Gly Ser Ser Ile Arg Ser Trp Ser Tyr Pro Thr Arg Tyr Phe Arg 450 455 460 His Tyr Asn Asn Thr Leu Tyr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Val His Val 465 470 475 480 Phe Asp Ala Thr Ala Ala Phe Asn Asp Asp Val Ser Phe Val Val Ser 485 490 495 Gly Gly Phe Ala 500 <210> 55 <211> 449 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 55 Met Trp Leu Thr Ser Pro Leu Leu Phe Ala Ser Thr Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Thr Gly Val Ala Leu Ala Asp Asn Pro Ile Val Gln Asp Ile Tyr Thr 20 25 30 Ala Asp Pro Ala Pro Met Val Tyr Asn Gly Arg Val Tyr Leu Phe Thr 35 40 45 Gly His Asp Asn Asp Gly Ser Thr Asp Phe Asn Met Thr Asp Trp Arg 50 55 60 Leu Phe Ser Ser Ala Asp Met Val Asn Trp Gln His His Gly Val Pro 65 70 75 80 Met Ser Leu Lys Thr Phe Ser Trp Ala Asn Ser Arg Ala Trp Ala Gly 85 90 95 Gln Val Val Ala Arg Asn Gly Lys Phe Tyr Phe Tyr Val Pro Val Arg 100 105 110 Asn Ala Lys Thr Gly Gly Met Ala Ile Gly Val Gly Val Ser Thr Asn 115 120 125 Ile Leu Gly Pro Tyr Thr Asp Ala Leu Gly Lys Pro Leu Val Glu Asn 130 135 140 Asn Glu Ile Asp Pro Thr Val Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Gln Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Tyr Trp Gly Asn Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Leu Asn Gln Asp 165 170 175 Met Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Lys Val Ser Leu Thr Thr Ala 180 185 190 Gly Phe Gly Ser Arg Pro Asn Asn Ala Gln Arg Pro Thr Thr Phe Glu 195 200 205 Glu Gly Pro Trp Leu Tyr Lys Arg Gly Asn Leu Tyr Tyr Met Ile Tyr 210 215 220 Ala Ala Asn Cys Cys Ser Glu Asp Ile Arg Tyr Ser Thr Gly Pro Ser 225 230 235 240 Ala Thr Gly Pro Trp Thr Tyr Arg Gly Val Val Met Asn Lys Ala Gly 245 250 255 Arg Ser Phe Thr Asn His Pro Gly Ile Ile Asp Phe Glu Asn Asn Ser 260 265 270 Tyr Phe Phe Tyr His Asn Gly Ala Leu Asp Gly Gly Ser Gly Tyr Thr 275 280 285 Arg Ser Val Ala Val Glu Ser Phe Lys Tyr Gly Ser Asp Gly Leu Ile 290 295 300 Pro Glu Ile Lys Met Thr Thr Gln Gly Pro Ala Gln Leu Lys Ser Leu 305 310 315 320 Asn Pro Tyr Val Lys Gln Glu Ala Glu Thr Ile Ala Trp Ser Glu Gly 325 330 335 Ile Glu Thr Glu Val Cys Ser Glu Gly Gly Leu Asn Val Ala Phe Ile 340 345 350 Asp Asn Gly Asp Tyr Ile Lys Val Lys Gly Val Asp Phe Gly Ser Thr 355 360 365 Gly Ala Lys Thr Phe Ser Ala Arg Val Ala Ser Asn Ser Ser Gly Gly 370 375 380 Lys Ile Glu Leu Arg Leu Gly Ser Lys Thr Gly Lys Leu Val Gly Thr 385 390 395 400 Cys Thr Val Thr Thr Thr Gly Asn Trp Gln Thr Tyr Lys Thr Val Asp 405 410 415 Cys Pro Val Ser Gly Ala Thr Gly Thr Ser Asp Leu Phe Phe Val Phe 420 425 430 Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asn Phe Asn Trp Trp Gln Phe 435 440 445 Ser <210> 56 <211> 321 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 56 Met Ser Arg Ser Ile Leu Pro Tyr Ala Ser Val Phe Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Glu Pro Phe Leu Val Leu Asn Ser Asp Phe Pro Asp 20 25 30 Pro Ser Leu Ile Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Phe Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Asn Gly Val Asn Ala Gln Val Ala Ser Ser Pro Asp Phe Asn Thr 50 55 60 Trp Thr Leu Leu Ser Gly Thr Asp Ala Leu Pro Gly Pro Phe Pro Ser 65 70 75 80 Trp Val Ala Ser Ser Pro Gln Ile Trp Ala Pro Asp Val Leu Val Lys 85 90 95 Ala Asp Gly Thr Tyr Val Met Tyr Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp 100 105 110 Ser Gly Lys His Cys Val Gly Ala Ala Thr Ala Thr Ser Pro Glu Gly 115 120 125 Pro Tyr Thr Pro Val Asp Ser Ala Val Ala Cys Pro Leu Asp Gln Gly 130 135 140 Gly Ala Ile Asp Ala Asn Gly Phe Ile Asp Thr Asp Gly Thr Ile Tyr 145 150 155 160 Val Val Tyr Lys Ile Asp Gly Asn Ser Leu Asp Gly Asp Gly Thr Thr 165 170 175 His Pro Thr Pro Ile Met Leu Gln Gln Met Glu Ala Asp Gly Thr Thr 180 185 190 Pro Thr Gly Ser Pro Ile Gln Leu Ile Asp Arg Ser Asp Leu Asp Gly 195 200 205 Pro Leu Ile Glu Ala Pro Ser Leu Leu Leu Ser Asn Gly Ile Tyr Tyr 210 215 220 Leu Ser Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Asn Thr Asn Tyr Tyr Asp Thr Ser 225 230 235 240 Tyr Ala Tyr Ala Ser Ser Ile Thr Gly Pro Trp Thr Lys Gln Ser Ala 245 250 255 Pro Tyr Ala Pro Leu Leu Val Thr Gly Thr Glu Thr Ser Asn Asp Gly 260 265 270 Ala Leu Ser Ala Pro Gly Gly Ala Asp Phe Ser Val Asp Gly Thr Lys 275 280 285 Met Leu Phe His Ala Asn Leu Asn Gly Gln Asp Ile Ser Gly Gly Arg 290 295 300 Ala Leu Phe Ala Ala Ser Ile Thr Glu Ala Ser Asp Val Val Thr Leu 305 310 315 320 Gln

Claims (129)

  1. 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스(biomass), 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제 및 적어도 하나의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 완전 발효 배지를 발효 생성물의 생성에 적합한 기간 동안 그리고 그러한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 동시 당화 발효(simultaneous saccharification and fermentation; SSF) 방법.
  2. 제1항에 있어서, 완전 발효 배지는 완전 발효 배지가 전화 β-자일로시다아제가 결여된 대조 발효 배지가 생성하는 것보다 더 적은 단쇄 알킬-β-자일로피라노사이드("AXP")를 생성하도록 하기에 유효한 양의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 완전 발효 배지는 완전 발효 배지가 전화 β-자일로시다아제가 결여된 대조 발효 배지가 생성하는 것보다 40% 이상 더 적은 AXP를 생성하도록 하기에 유효한 양의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 완전 발효 배지는 완전 발효 배지가 전화 β-자일로시다아제가 결여된 대조 발효 배지가 생성하는 것보다 50% 이상 더 적은 AXP를 생성하도록 하기에 유효한 양의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 완전 발효 배지는 완전 발효 배지가 전화 β-자일로시다아제가 결여된 대조 발효 배지가 생성하는 것보다 60% 이상 더 적은 AXP를 생성하도록 하기에 유효한 양의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 완전 발효 배지는 완전 발효 배지가 전화 β-자일로시다아제가 결여된 대조 발효 배지가 생성하는 것보다 70% 이상 더 적은 AXP를 생성하도록 하기에 유효한 양의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, AXP는 메틸-β-자일로피라노사이드(MXP), 에틸-β-자일로피라노사이드(EXP), 프로필-β-자일로피라노사이드(PXP), 또는 부틸-β-자일로피라노사이드(BXP)인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 발효 배지는 전화 β-자일로시다아제가 결여된 대조 발효 배지의 배양으로부터의 발효 생성물의 수율과 비교하여 발효 생성물의 수율을 증가시키기에 유효한 양의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 발효 생성물의 수율을 1% 이상만큼 증가시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 발효 생성물의 수율을 2% 이상만큼 증가시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 발효 생성물의 수율을 3% 이상만큼 증가시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 발효 생성물의 수율을 5% 이상만큼 증가시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 발효 생성물의 수율을 7.5% 이상만큼 증가시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 발효 생성물의 수율을 10% 이상만큼 증가시키는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 생성물은 알코올인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 프로판-1,3-다이올 또는 부탄올인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 GH43 패밀리 효소인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A, 또는 XynB3 폴리펩티드인 방법.
  19. 제18항에 있어서, Fv43D 폴리펩티드는 서열 번호 2에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  20. 제18항에 있어서, Pf43A 폴리펩티드는 서열 번호 8에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  21. 제18항에 있어서, Fv43E 폴리펩티드는 서열 번호 10에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  22. 제18항에 있어서, Fv43B 폴리펩티드는 서열 번호 12에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 12의 잔기 17 내지 574에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  23. 제18항에 있어서, Af43A 폴리펩티드는 서열 번호 14에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 14의 잔기 15 내지 558에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  24. 제18항에 있어서, Fo43A 폴리펩티드는 서열 번호 24에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  25. 제18항에 있어서, Gz43A 폴리펩티드는 서열 번호 22에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  26. 제18항에 있어서, XynB3 폴리펩티드는 서열 번호 25에 상응하는 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 0.3 ㎎ 내지 10 ㎎의 농도로 완전 발효 배지에 존재하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 0.4 ㎎ 내지 10 ㎎의 농도로 존재하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 자일란-함유 바이오매스 중 자일란 1 g 당 0.3 ㎎ 내지 3 ㎎의 농도로 존재하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 연속식, 배치식(batch) 또는 유가식(fed-batch) SSF 공정으로 실시되는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 발효 배지를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 완전 발효 배지를 형성하는 단계는 (a) 발효 미생물, (b) 자일란-함유 바이오매스, (c) 셀룰라아제, (d) 헤미셀룰라아제, (e) 전화 β-자일로시다아제, 및 (f) (a)-(e) 중 하나 이상 또는 이들 전부가 결여된 배지를 조합하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 셀룰라아제는 전 셀룰라아제 제제의 형태로 존재하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 전 셀룰라아제 제제는 헤미셀룰라아제를 포함하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 전 셀룰라아제 제제는 사상균의 배양으로부터 얻어진 배양 브로쓰(broth)인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 사상균은 티. 레에세이(T. reesei)인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 티. 레에세이는 천연 β-자일로시다아제 유전자가 결실되거나 또는 불활성화되도록 조작된 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 미생물은 진균류인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 진균류는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 효모인 방법.
  40. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 미생물은 박테리아인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 박테리아는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 자일란-함유 바이오매스는 옥수수의 줄기와 잎, 바가스(bagass), 수수류, 물대, 코끼리풀, 억새, 삼나무, 밀짚, 스위치그래스(switchgrass), 활엽수 펄프 또는 침엽수 펄프인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 자일란-함유 바이오매스는 슬러리 형태로 존재하는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 자일란-함유 바이오매스는 전처리된 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 발효 배지는 몰 기준으로, 분자량 기준으로, 또는 몰 및 분자량 둘 모두를 기준으로 유지 β-자일로시다아제의 양보다 더 많은 양의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 완전 발효 배지 중 유지 β-자일로시다아제에 대한 전화 β-자일로시다아제의 비는 몰 기준으로, 분자량 기준으로, 또는 몰 및 분자량 둘 모두를 기준으로 2:1 이상인 방법.
  48. 천연 β-자일로시다아제 유전자가 결실되거나 또는 검출가능한 β-자일로시다아제 활성이 없도록 조작된 티. 레에세이 세포.
  49. 제48항에 있어서, GH43 패밀리 효소를 재조합적으로 발현하도록 조작된 티. 레에세이 세포.
  50. 제48항에 있어서, Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A, 또는 XynB3 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하도록 조작된 티. 레에세이 세포.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, Fv43D 폴리펩티드는 서열 번호 2에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  52. 제51항에 있어서, Pf43A 폴리펩티드는 서열 번호 8에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  53. 제51항에 있어서, Fv43E 폴리펩티드는 서열 번호 10에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  54. 제51항에 있어서, Fv43B 폴리펩티드는 서열 번호 12에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 12의 잔기 17 내지 574에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  55. 제51항에 있어서, Af43A 폴리펩티드는 서열 번호 14에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 14의 잔기 15 내지 558에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  56. 제51항에 있어서, Fo43A 폴리펩티드는 서열 번호 24에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  57. 제51항에 있어서, Gz43A 폴리펩티드는 서열 번호 22에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  58. 제51항에 있어서, XynB3 폴리펩티드는 서열 번호 25에 상응하는 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 티. 레에세이 세포.
  59. 셀룰라아제 제제를 생성하는 조건 하에 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항의 티. 레에세이 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 셀룰라아제 제제를 생성하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 셀룰라아제 제제를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  61. 제59항 또는 제60항의 방법의 실시에 의해 얻어진 셀룰라아제 제제.
  62. 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항의 티. 레에세이 세포의 배양에 의해 생성된 배양 브로쓰.
  63. 바이오매스를 제61항의 셀룰라아제 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오매스 당화 방법.
  64. 바이오매스를 제62항의 배양 브로쓰와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오매스 당화 방법.
  65. 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제 및 적어도 하나의 전화 β-자일로시다아제를 포함하는 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 GH43 패밀리 효소인 조성물.
  67. 제65항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A, 또는 XynB3 폴리펩티드인 조성물.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 Fv43D 폴리펩티드는 서열 번호 2에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 잔기 21 내지 350에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  69. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 Pf43A 폴리펩티드는 서열 번호 8에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 잔기 21 내지 445에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  70. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 Fv43E 폴리펩티드는 서열 번호 10에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 10의 잔기 19 내지 530에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  71. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 Fv43B 폴리펩티드는 서열 번호 12에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 12의 잔기 17 내지 574에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  72. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 Af43A 폴리펩티드는 서열 번호 14에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 14의 잔기 15 내지 558에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  73. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 Fo43A 폴리펩티드는 서열 번호 24에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 24의 잔기 21 내지 348에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  74. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 Gz43A 폴리펩티드는 서열 번호 22에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 22의 잔기 19 내지 340에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  75. 제66항 또는 제67항에 있어서, 존재할 경우 XynB3 폴리펩티드는 서열 번호 25에 상응하는 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 조성물.
  76. 제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 자일란-함유 바이오매스는 옥수수의 줄기와 잎, 바가스, 수수류, 물대, 코끼리풀, 억새, 삼나무, 밀짚, 스위치그래스, 활엽수 펄프 또는 침엽수 펄프인 조성물.
  77. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 미생물은 진균류 또는 박테리아인 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 진균류는 사카로마이세스 세레비지애 효모인 조성물.
  79. 제77항에 있어서, 박테리아는 자이모모나스 모빌리스인 조성물.
  80. 제65항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라아제는 전 셀룰라아제 제제의 형태로 존재하는 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 셀룰라아제 제제는 헤미셀룰라아제를 포함하는 조성물.
  82. 제65항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 유지 β-자일로시다아제가 사실상 없거나 또는 검출가능한 유지 β-자일로시다아제 활성이 없는 조성물.
  83. 소정의 시간 동안 제65항 내지 제82항 중 어느 한 항의 조성물을 배양하는 단계를 포함하는, 발효 생성물을 생성하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 발효 생성물은 알코올인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 프로판-1,3-다이올 또는 부탄올인 방법.
  86. 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제 및 적어도 하나의 유지 β-자일로시다아제를 포함하는 완전 발효 배지를 알킬-β-자일로피라노사이드("AXP")의 생성에 적합한 기간 동안 그리고 그러한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 동시 당화 발효(SSF) 방법.
  87. 제86항에 있어서, 완전 발효 배지는 완전 발효 배지가 유지 β-자일로시다아제가 결여된 또는 더 적은 양의 유지 β-자일로시다아제를 갖는 대조 발효 배지가 생성하는 것보다 더 많은 AXP를 생성하도록 하기에 유효한 양의 유지 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, AXP는 메틸-β-자일로피라노사이드(MXP), 에틸-β-자일로피라노사이드(EXP), 프로필-β-자일로피라노사이드(PXP) 또는 부틸-β-자일로피라노사이드(BXP)인 방법.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 유지 β-자일로시다아제는 GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 또는 GH116 패밀리 효소인 방법.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 유지 β-자일로시다아제는 XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, 또는 XynB 폴리펩티드인 방법.
  91. 제90항에 있어서, XlnD 폴리펩티드는 서열 번호 40에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 40의 잔기 18 내지 804에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  92. 제90항에 있어서, Fv30A 폴리펩티드는 서열 번호 42에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 42의 잔기 20 내지 537에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  93. 제90항에 있어서, Fv30B 폴리펩티드는 서열 번호 44에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 44의 잔기 25 내지 485에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  94. 제90항에 있어서, Fv39A 폴리펩티드는 서열 번호 46에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 46의 잔기 20 내지 439에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  95. 제90항에 있어서, Fv39B 폴리펩티드는 서열 번호 48에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 48의 잔기 19 내지 456에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  96. 제90항에 있어서, XynB 폴리펩티드는 서열 번호 50에 상응하는 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  97. 제90항에 있어서, XylA 폴리펩티드는 서열 번호 52에 상응하는 아미노산 서열 또는 서열 번호 52의 잔기 19 내지 705에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  98. 제90항에 있어서, Xyl1 폴리펩티드는 서열 번호 54에 상응하는 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 방법.
  99. 제86항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 연속식, 배치식 또는 유가식 SSF 공정으로 실시되는 방법.
  100. 제86항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 발효 배지를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 완전 발효 배지를 형성하는 단계는 (a) 발효 미생물, (b) 자일란-함유 바이오매스, (c) 셀룰라아제, (d) 헤미셀룰라아제, (e) 유지 β-자일로시다아제, 및 (f) (a)-(e) 중 하나 이상 또는 이들 전부가 결여된 배지를 조합하는 것을 포함하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 셀룰라아제는 전 셀룰라아제 제제의 형태로 존재하는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 전 셀룰라아제 제제는 헤미셀룰라아제를 포함하는 방법.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 전 셀룰라아제 제제는 사상균의 배양으로부터 얻어진 배양 브로쓰인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 사상균은 티. 레에세이인 방법.
  106. 제105항에 있어서, 티. 레에세이는 천연 유지 β-자일로시다아제 유전자를 과다발현하거나 또는 외래 유지 β-자일로시다아제 유전자를 발현하도록 조작된 것인 방법.
  107. 제86항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 미생물은 진균류 또는 박테리아인 방법.
  108. 제86항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 자일란-함유 바이오매스는 옥수수의 줄기와 잎, 바가스, 수수류, 물대, 코끼리풀, 억새, 삼나무, 밀짚, 스위치그래스, 활엽수 펄프 또는 침엽수 펄프인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 자일란-함유 바이오매스는 전처리된 것인 방법.
  110. 제86항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, AXP 화합물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  111. 제86항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 발효 배지는 몰 기준으로, 분자량 기준으로, 또는 몰 및 분자량 둘 모두를 기준으로 전화 β-자일로시다아제보다 더 많은 양의 유지 β-자일로시다아제를 포함하는 방법.
  112. 천연 β-자일로시다아제 유전자가 과다발현되었거나 외래 β-자일로시다아제 유전자를 발현하도록 조작된 티. 레에세이 세포.
  113. 제112항에 있어서, GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 또는 GH116 패밀리 효소를 재조합적으로 발현하도록 조작된 티. 레에세이 세포.
  114. 제112항에 있어서, XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA 또는 Xyl1 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하도록 조작된 티. 레에세이 세포.
  115. 셀룰라아제 제제를 생성하는 조건 하에 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항의 티. 레에세이 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 셀룰라아제 제제를 생성하는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 셀룰라아제 제제를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  117. 제115항 또는 제116항의 방법의 실시에 의해 얻어진 셀룰라아제 제제.
  118. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항의 티. 레에세이 세포의 배양에 의해 생성된 배양 브로쓰.
  119. 바이오매스를 제117항의 셀룰라아제 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오매스 당화 방법.
  120. 바이오매스를 제118항의 배양 브로쓰와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오매스 당화 방법.
  121. 적어도 하나의 발효 미생물, 적어도 하나의 자일란-함유 바이오매스, 적어도 하나의 셀룰라아제, 적어도 하나의 헤미셀룰라아제 및 적어도 하나의 유지 β-자일로시다아제를 포함하는 조성물.
  122. 제121항에 있어서, 유지 β-자일로시다아제는 GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 또는 GH116 패밀리 효소인 조성물.
  123. 제121항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제는 XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA 또는 Xyl1 폴리펩티드인 조성물.
  124. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 자일란-함유 바이오매스는 옥수수의 줄기와 잎, 바가스, 수수류, 물대, 코끼리풀, 억새, 삼나무, 밀짚, 스위치그래스, 활엽수 펄프 또는 침엽수 펄프인 조성물.
  125. 제121항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 미생물은 진균류 또는 박테리아인 조성물.
  126. 제121항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라아제는 전 셀룰라아제 제제의 형태로 존재하는 조성물.
  127. 제126항에 있어서, 셀룰라아제 제제는 헤미셀룰라아제를 포함하는 조성물.
  128. 제121항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 전화 β-자일로시다아제가 사실상 없거나 또는 검출가능한 전화 β-자일로시다아제 활성이 없는 조성물.
  129. 소정의 시간 동안 제121항 내지 제128항 중 어느 한 항의 조성물을 배양하는 단계를 포함하는, AXP 화합물을 생성하는 방법.
    [표 1]
    Figure pct00002

    [표 2]
    Figure pct00003

    [표 3]
    Figure pct00004

    [표 4]
    Figure pct00005

    [표 5]
    Figure pct00006

    [표 6]
    Figure pct00007

    Figure pct00008
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