CN110229795B

CN110229795B - 具有增强纤维素分解活性的多肽及其编码基因与应用

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Publication number: CN110229795B
Application number: CN201910386596.6A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 侯少莉
Original assignee: Rongcheng Huihai Chuangda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Rongcheng Huihai Chuangda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110229795A

Abstract

本发明公开了一种具有增强纤维素分解活性的多肽及其编码基因与应用；本发明的多肽来源于Neosartorya fischeri，该多肽自身具有降解可溶性多糖的活性；当它添加到其他微生物分泌的糖苷酶中或者在其他分泌糖苷酶的微生物中表达后，能帮助提高了原有微生物酶系降解纤维素等多糖的效率。特别是该多肽的N端的247个氨基酸部分，能显著提高原有微生物酶系中的LPMO酶活活性，从而进一步提高了原有微生物酶系降解纤维素等多糖的效率降解纤维素等多糖的效率。

Description

具有增强纤维素分解活性的多肽及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种具有增强纤维素分解活性的多肽及其编码基因与应用。

背景技术

木质纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种复杂多糖，由吡喃型D-葡萄糖残基通过β-1,4-糖苷键相连接组成不分支的纤维素链，链与链之间再通过氢键相互缔合，平行排列形成纤维素(Schwarz，2001)。将木质纤维素转化为人类亟需的食物、能源和化工原料，对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要的意义。

目前，木质纤维素的降解主要有酸水解和酶水解两种途径，其中，酸水解的转化率一般低于60％，并且会生成大量发酵抑制物；而纤维素酶法的转化率可以超过90％，不仅产物专一，副产物少，而且具有反应条件温和、对环境污染小等优点。传统的纤维素酶主要是在外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶等一系列糖苷水解酶的作用下，通过打断β-1,4-糖苷键的方式来降解纤维素以及多糖。但由于木质纤维素是植物细胞及组织的主要成分，天然具有抵御纤维素酶降解的能力，组分间通过氢键形成十分牢固的纤维素微纤丝结晶结构，继而与半纤维素、木质纤维素形成高聚复合物，这就使得木质纤维素难以被纤维素酶水解，成为有效利用木质纤维素制备生物燃料及生物工业炼制的主要障碍。

近年来溶解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)成为了木质纤维素资源开发研究的新热点。与传统糖苷水解酶水解多糖的方式不同，LPMO是一种全新的生物质降解酶，是通过氧化作用断裂糖苷键产生寡糖链，暴露更多糖苷水解酶结合的位点，从而加快反应进程，提高寡糖或单糖的生成量。真菌中的LPMO属于GH61家族糖苷酶，又被命名为Auxiliary Activity family 9(AA9)，LPMO_AA9也被称为可溶性多糖单加氧酶。近期研究发现(孙小宝,万嘉欣,曹佳雯,斯越秀,王谦.溶解性多糖单加氧酶的研究进展[J].生物工程学报,2018,34(2):177～187)，LPMO_AA9可有效协同纤维素酶的作用，在氧化和水解断裂两种方式的协同作用下，加快纤维素以及多糖的降解。

尽管过去几年对于LPMO的研究取得了很多成果，但仍存在很多问题需要解决，如LPMO_AA9的来源相对较少，外源表达水平相对较低，不利于后续的研究应用。因此，丰富AA9蛋白的来源是应用于纤维素酶解方面的关键。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种新的具有增强纤维素分解活性的多肽(AA9)及其编码基因与应用。本发明的多肽来源于Neosartorya fischeri，该多肽自身具有降解可溶性多糖的活性；当它添加到其他微生物分泌的糖苷酶中或者在其他分泌糖苷酶的微生物中表达后，能帮助提高了原有微生物酶系降解纤维素等多糖的效率。特别是该多肽的N端的247个氨基酸部分，能显著提高原有微生物酶系中的LPMO酶活活性，从而进一步提高了原有微生物酶系降解纤维素等多糖的效率降解纤维素等多糖的效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供具有增强纤维素分解活性的多肽在如下1)-4)至少一项中的应用；

1)降解可溶性多糖；

2)提高纤维素酶降解纤维素的效率；

3)提高微生物酶系中LPMO酶活活性；

4)作为或制备具有增强纤维素分解活性的辅助活性酶；

所述具有增强纤维素分解活性的多肽选自如下a)-g)中的任一项：

a)多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示；

c)多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示；

e)多肽，其包含与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列；

f)多肽，其在功能上与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示的多肽等价，但在氨基酸序列上存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或***；

g)多肽，其由包含与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。

本发明的第二方面，提供用于产生本发明的具有增强纤维素分解活性的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养Neosartorya fischeri NRRL 181菌株，所述Neosartorya fischeri NRRL 181菌株以其野生形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

或者，提供用于产生本发明的具有增强纤维素分解活性的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞中包含SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明的第三方面，提供一种组合物，其包含：(a)本发明的具有增强纤维素分解活性的多肽；(b)纤维素分解酶。

优选的，所述纤维素分解酶选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶中的一种或多种。

本发明的第四方面，提供上述具有增强纤维素分解活性的多肽或组合物在处理纤维素材料和/或生物质中的应用。

本发明的第五方面，提供一种降解或转化含纤维素材料的方法，其包括用上述的组合物处理所述含纤维素材料的步骤。

进一步的，所述方法还包括：对含纤维素材料进行前处理的步骤；所述前处理为酸处理、碱处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、干燥处理、亚硫酸盐处理或水热处理；优选的，所述前处理为亚硫酸盐处理、水热处理、碱处理或稀硫酸处理。

优选的，所述组合物按每克绝干含纤维素材料添加5-15mg组合物的比例加入。

优选的，所述处理条件为：调节pH值范围至5.0-6.0，在45-50℃下振荡反应32-40h。

本发明的第六方面，提供一种用于产生发酵产物的方法，其包括：

(1)用本发明的组合物糖化含纤维素材料；

(2)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(1)的经糖化的含纤维素材料以产生发酵产物；

(3)从发酵液中回收所述发酵产物。

优选的，步骤(2)中，所述发酵的条件为：28-32℃进行厌氧发酵培养45-50h。

本发明的有益效果：

本发明首次公开了来源于Neosartorya fischeri，特别是来源于Neosartoryafischeri NRRL 181的具有纤维素分解增强活性的多肽(AA9，XP_001264507)，从而获得含有可溶性多糖单加氧酶的新型酶，该酶能够有效提高含有纤维素原料的糖化效率，可应用于纤维素工业化生产酒精的步骤中，达到提高酒精产率的目的。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

多肽：是指由通过肽键连接的氨基酸残基的单链组成的化合物。

表达盒、表达载体：是通过重组或合成方式产生的核酸构建体，其具有一系列能让特定核酸在靶细胞内转录的指定核酸元件。可将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子等序列。

表达：是指基于基因的核酸序列而产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译二者。

丝状真菌：是指本领域技术人员所了解的任何和所有丝状真菌。优选的真菌选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、镰孢属(Fusarium)、金孢属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)或其可选择的有性形式，诸如裸胞壳属(Emericella)、肉座菌属(Hypocrea)。现在已证明，无性工业真菌里氏木霉是子囊菌红褐肉座菌的克隆衍生物(参见Kuhls等人，PNAS，93：7755-7760，1996)。

纤维低聚糖：是指包含2至8个葡萄糖单位并且具有β-1,4键的低聚糖类，例如，纤维二糖。

纤维素酶、纤维素分解酶：是指一类能够将纤维素聚合物水解成较短的纤维低聚糖低聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的酶。纤维素酶的许多实例，诸如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶已经从纤维素分解生物中获得，尤其包括真菌、植物和细菌。由这些微生物产生的酶是蛋白质的混合物，其具有三类用于将纤维素转化成葡萄糖的作用：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用以将纤维素及其衍生物转化成葡萄糖。

LPMO活性：是指可溶性多糖单加氧酶活力单位；一个单位的LPMO活性被定义为每分钟转换2微摩尔的2,6-dimethoxyphenol或者生成1微摩尔的Coerulignone(木醋醌)所用的酶量。参照以下文献(Breslmayr et al.A fast and sensitive activity assay forlytic polysaccharide monooxygenase.Biotechnol Biofuels 2018,11:79)进行测定。

准备116mM琥珀酸缓冲液/磷酸缓冲液，调pH至6.0，终浓度调至100mM；配制10mM2,6-二甲氧基苯酚(DMP,dimethoxyphenol)，pH6.0；5mM H₂O₂；(均超纯水配制，配制12h内使用)。LPMO酶液离心(6000g，3min)，取上清放置冰上备用，860μl琥珀酸缓冲液/磷酸缓冲液，100μl 2,6-DMP，20μl H₂O₂充分混匀，30℃孵育15min后加入20μl处理好的LPMO酶液，分光光度计测定，469nm，300s。

FPU：是指滤纸酶活力单位；向试管中加入50mg滤纸(用葡萄糖制作标准曲线)，1.5ml醋酸缓冲液(50mM，pH4.8)，加入0.5ml酶液，50℃水浴60min，后加入2.5ml DNS终止反应，煮沸10分钟后，定容到25ml，摇匀后OD₅₄₀测定吸光度值。截取在60min释放2.0mg葡萄糖当量的还原糖(转化率4％)计算滤纸酶活力(Filter Paperase Activity)，单位以FPU表示。

增强纤维素分解活性：本文中是指增强具有纤维素分解活性的蛋白质对含纤维素材料的水解的生物活性。

含纤维素材料：纤维素通常存在于例如植物的茎、叶、果壳、种皮中，含纤维素材料可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸及造纸厂残余物等。

同一性：描述两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性。氨基酸或核苷酸序列的同一性可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal ofMolecular Biology215:403-410；Karlin and Altschul.1993.Proceedings of theNational Academy of Sciences90:5873-5877)。

正如背景技术部分所介绍的，LPMO_AA9的来源相对较少，目前报道的AA9家族主要有：Aspergillus fumigatus、Aspergillus nidulans、Aspergillus oryzae、Myceliophthora、thermophila、Neurospora crassa和Trichoderma reesei；外源表达水平相对较低，不利于纤维素酶解的研究应用。

基于此，本发明的目的是提供一种新的具有增强纤维素分解活性的多肽(AA9)。Neosartorya fischeri NRRL 181是一种生长迅速的曲霉属真菌，目前已完成全基因测序，其一共有八条染色体，32.55Mb遗传物质，10406个编码蛋白质的基因。通过生物信息学分析，发现N.fischeri NRRL 181菌株能产的化合物主要有以下几种类型：pyripyropenes、fumiquinazolines、aszonalenins、fumitremorgins、fumagillins、混源类二萜、4-Hydroxy-2-pyridone类生物碱、gliotoxins、neosartoricins、脂肽类、烟曲霉酸类等类型的化合物。但还未见有关于Neosartorya fischeri NRRL 181能够产生具有增强纤维素分解活性的多肽的报道。

本发明首次从Neosartorya fischeri NRRL 181分离得到一种具有增强纤维素分解活性的多肽，该多肽共367个氨基酸(SEQ ID NO.1所示)，自身具有降解可溶性多糖的活性。当它添加到其他微生物分泌的糖苷酶中或者在其他分泌糖苷酶的微生物中表达后，能帮助提高了原有微生物酶系降解纤维素等多糖的效率。特别是该多肽的N端的247个氨基酸部分(SEQ ID NO.4所示)，能显著提高原有微生物酶系中的LPMO酶活活性和降解纤维素24小时后葡萄糖的得率；从而进一步提高了原有微生物酶系降解纤维素等多糖的效率降解纤维素等多糖的效率。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

微生物来源

实施例中的里氏木霉(Trichoderma reesei)来源于美国模式培养物集存库，菌种保藏编号ATCC 26921。

培养基

麸皮培养基组分如下，均为重量百分比：10wt％麸皮浸出液，2wt％琼脂，余量水。

基本培养基组分如下，每升组分如下：

葡萄糖20g，(NH₄)SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，胰蛋白胨10g，pH5.5。

微晶纤维素培养基：微晶纤维素20g，(NH₄)SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，pH5.5。

下层培养基组分如下,每升组分如下：

葡萄糖20g，KH₂PO₄ 15g，琼脂糖10g，0.2μg/ml的抗硫胺素，1.5％琼脂糖。

上层培养基组分如下,每升组分如下：

葡萄糖20g，(NH₄)SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，胰蛋白胨10g，0.2μg/ml的抗硫胺素，1.5％琼脂糖。

选择培养基组分如下，每升组分如下：

生理盐水组分如下，均为重量百分比：0.9wt％NaCl，0.5wt％吐温80。

抽提缓冲液组分如下：200mM Tris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，2％十二烷基硫酸钠，pH8.5。

pME2892质粒采用如下论文中记载的方法制备：

Kubodera T,Yamashita N,Nishimura A.Pyrithiamine resistance gene(ptrA)of Aspergillus oryzae:cloning,characterization and application as a dominantselectable marker for transformation.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry.64(7):1416-21,2000.

pSilent-1质粒采用如下论文中记载的方法制备：

Nakayashiki H,Hanada S,Nguyen BQ,Kadotani N,Tosa Y,Mayama S.RNAsilencing as a tool for exploring gene function in ascomycete fungi.FungalGenetics and Biology.42(4):275-83,2005.

以下实施例中，大肠杆菌和表达载体为市售常用。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序。

实施例1：里氏木霉基因组的获得

(1)将里氏木霉在麸皮培养基上培养三天，然后用生理盐水将孢子洗脱下来，按照1×10⁸比例接入基本培养基中，200rpm，30℃生长两天，4000rpm离心，收集菌体，收集于1.5ml离心管中；

(2)向离心管中加入500μl抽提缓冲液和0.1g石英砂，漩涡剧烈振荡1min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃，放置20min；加入500μl苯酚/氯仿(混合比例1：1)，漩涡剧烈振荡30s，12000rpm室温离心10min，收集上清；

(3)将上清液转至另一无菌的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的3M NaAc溶液(pH4.8)和0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15min；12000rpm，4℃，10min，弃上清，加浓度为0.1μg/μl RNAase的ddH₂O 200μl，37℃，静置1h；加入200μl苯酚/氯仿(混合比例1：1)抽提一次，12000rpm，10min；上清转移至另一1.5ml离心管中，加0.1倍体积3M NaAc(pH4.8)和0.6倍体积异丙醇，-20℃放置20min，12000rpm，4℃，10min，收集沉淀；加700μl70％乙醇(v/v)，洗涤一次(12000rpm，2min)；待乙醇挥发完全，用50μl ddH₂O溶解基因组DNA，制得里氏木霉基因组DNA。

实施例2：大肠杆菌中的成熟多肽AA9表达与纯化

(1)将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列根据宿主大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，获得SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4对应的优化后核苷酸序列SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.5后，进行基因合成。选用引物对E.coli-NfAA9A-F/E.coli-NfAA9A-R和E.coli-truncated-NfAA9A-F/E.coli-truncated-NfAA9A-R，采用常规分子生物学方法，用TOYOBO公司的KOD FXDN聚合酶扩增获得目标基因。

E.coli-NfAA9A-F:

TCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG CTCGAG TCAGTGATGATGATGATGAT；(SEQ ID NO.7)

E.coli-NfAA9A-R:

TATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCCATGGCTTTGTTAGCGGCGC；(SEQ ID NO.8)

E.coli-truncated-NfAA9A-F:

TCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCTGAATATAACGCCGGGCCAGGA；(SEQ ID NO.9)

E.coli-truncated-NfAA9A-R:

TATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCCATGGCTTTGTTAGCGGCGC；(SEQ ID NO.10)

(2)以EMD Biosciences(Novagen)公司的pet21a质粒作为表达载体，采用常规分子生物学方法，构建含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5的核苷酸序列的表达载体，然后将该表达载体转化大肠杆菌表达型载体BL21，以氨苄为筛选标记，获得单克隆BL21-pEThpaBC。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5的核苷酸序列的表达菌株，分别命名为E.coli_NfAA9和E.coli_truncated-NfAA9。

(3)大肠杆菌中成熟多肽AA9的表达和多肽的纯化：

将(2)获得的菌株在37℃，条件下100μg/ml氨苄抗性的液体LB培养基中培养，并加入IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)作为诱导剂，然后将培养温度降低至16℃诱导培养。

将上述步骤中诱导好的大肠杆菌进行超声破碎，将获得含有多肽的上清利用镍柱进行亲和色谱层析，收集目标蛋白。

将上述收集到的目标蛋白利用Econo-Pac脱盐柱(购自BIO-RAD公司)进行脱盐，获得SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的氨基酸序列的多肽，分别命名为NfAA9_Ecoli和truncated-NfAA9_Ecoli。

实施例3：磷酸溶胀纤维素降解实验

根据根据公布的方法从Avicel制备磷酸溶胀纤维素(PASC)(参见Quinlan RJ,etal.Insights into the oxidative degradation of cellulose by a coppermetalloenzyme that exploits biomass components,Proc Natl Acad Sci USA,2011,vol.108(pg.15079-84).

在100mM的甲酸铵缓冲液中进行反应，pH 6.0，反应体系中包含：4mM的抗坏血酸，0.5％(w/v)PASC，混入实施例2中纯化后NfAA9_Ecoli和truncated-NfAA9_Ecoli多肽，20℃温浴16小时后，终止水解反应。在室温下离心，通过MALDI-TOF/TOF MS检测分析来分析上清液中的水解反应产物。产物中含有糖醛酸(aldonic acid)，偕二醇(gem-diol),内酯(1,5δ-lactone)和酮醛糖(4-ketoaldose)。可见，NfAA9_Ecoli和truncated-NfAA9_Ecoli发生了酶的***编号EC 1.14.99.54和EC 1.14.99.56中的反应。

表1：

“纤维糊精的聚合度”表示降解磷酸溶胀纤维素(PASC)后产物的聚合度，产物的聚合度小说明酶活性高，效果好。

实施例4：里氏木霉酶液的制备

取里氏木霉(Trichoderma reesei)，接种于麸皮培养基中，在30℃的条件下培养3天，然后各取同等大小琼脂块转接于下述种子培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养2.5天，制得微生物培养液，再将培养液转接到下述产酶培养基中，在30℃、200rpm的条件下发酵培养5天，制得微生物培养液。将培养液14000r/min离心10min，得粗酶液，将粗酶液34000r/min，4℃离心40min得酶液。

上述的种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖1％，蛋白胨1％，麸皮1％，玉米芯1％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.5％，余量水。自然pH，115℃灭菌30min。

上述的产酶培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉3％，蛋白胨0.5％，麸皮3％，微晶纤维素0.6％，硝酸钠0.2％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.05％，尿素0.1％，吐温80 0.3％，碳酸钙0.5％，余量水。自然pH，121℃灭菌30min。

实施例5：

将实施例2中纯化后的NfAA9_Ecoli和truncated-NfAA9_Ecoli多肽和实施例4获得的里氏木霉培养液混合后的糖化实验：

预处理后的玉米秸秆的制备方法：将玉米秸秆浸渍在1wt％的硫酸溶液中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理。

降解含纤维素原料的方法如下：分别以微晶纤维素和预处理后的玉米秸秆为底物，以对每克底物5mg蛋白的比例进行实施例4获得的里氏木霉酶液的添加，然后在体系中按照对每克底物加入0.1mg实施例2中纯化后的NfAA9_Ecoli和truncated-NfAA9_Ecoli多肽(对照组用牛血清蛋白代替)，加入6.25mM的没食子酸，45℃，pH4.8进行糖化，反应七天后分别取样，HPLC测定其葡萄糖产量。结果见表2。

表2：降解后7天纤维素二糖和葡萄糖的得率(mM)

酶液	微晶纤维素	预处理后的玉米秸秆
			里氏木霉+牛血清蛋白	11.3	15.8
里氏木霉+NfAA9<sub>Ecoli</sub>	12.6	16.7
			里氏木霉+truncated-NfAA9<sub>Ecoli</sub>	13.5	18.9

实施例6：里氏木霉中的NfAA9和truncated-NfAA9基因表达盒的获得

(1)将Neosartorya fischeri NRRL 181菌株在基本培养基中培养两天，将菌体转移至微晶纤维素培养基中培养两天，抽滤菌丝。

RNA提取主要是利用Omega真菌RNA提取试剂盒完成的。实验步骤如下：

液氮研磨抽滤获得的菌丝体，将粉末加入1.5ml离心管中，立即加入1ml RNAisoPlus，震荡混匀，冰上放置5分钟，12000rpm离心10分钟，取上清加入0.5倍体积无水乙醇，混匀后加入到柱子中，离心，加入RNA washing buffer I洗一次，buffer II洗两次，50ul去离子水洗脱。测定浓度和OD260/280。

1)gDNA去除，反应体系如下：

反应条件为42℃，2分钟。

2)cDNA合成，反应体系为：

反应条件为37℃15分钟，85℃5秒，42℃保存。获得cDNA。

以Neosartorya fischeri cDNA为模板，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物T.reesei-NfAA9A-F:CAAATAATCATCATGTCTGTCTCTAAGATTGCAG CT；(SEQID NO.11)

下游引物T.reesei-NfAA9A-R:TCGGCATCTACTCTAGGCAGAGAGATCACGAGC GTG；(SEQID NO.12)

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃2min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得片段3(里氏木霉的NfAA9A)。

上游引物T.reesei-truncated-NfAA9A-F:CAAATAATCATCATGTCTGTCTCTAAGATTGCAGCT；(SEQ ID NO.13)

下游引物T.reesei-truncated-NfAA9A-R:TCGGCATCTACTCTAGCCAGAGTAGAGAGCGGGACC；(SEQ ID NO.14)

PCR条件同上，制得片段3’(里氏木霉的NfAA9A截断型)。

(2)以实施例1中获得的里氏木霉基因组为模板，利用引物进行PCR扩增

引物序列如下：

xyn1up-F：GCATATTTCGTTGGCTGGCAGATTGAAG；(SEQ ID NO.15)

NfAA9A-xyn1up-R：AGAGACAGACATGATGATTATTTGTGCGTGTTTTCC；(SEQ ID NO.16)

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃2min，30个循环；60℃，10min，4℃保存，制得片段4(里氏木霉的NfAA9A/NfAA9A截断型的上游同源臂)。

(3)以pME2892质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增硫胺嘧啶基因，引物序列如下：

trpC terminator-ptrA-F:AAAAAAAGAGGAAAAGACCGTCCGTAACGAAATGTAAAAGCTAGGAGA；(SEQ ID NO.17)

xyn1down-ptrA-R:ACTCCAAGTCAACATCAACAGAACTTACTCAGCACACTCGC GCTGACG；(SEQ ID NO.18)

PCR条件同上，制得片段5(里氏木霉的NfAA9A/NfAA9A截断型的抗性)。

(4)以pSilent-1质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增trpC terminator，引物序列如下：

NfAA9A-trpC terminator-F:CTCTCTGCCTAGAGTAGATGCCGACCGGATCGATCC；(SEQ IDNO.19)

PtrA-trpC terminator-R:TCTCCTAGCTTTTACATTTCGTTACGGACGGTCTTTTCCTCTTTTTTT；(SEQ ID NO.20)

PCR条件同上，制得片段6(里氏木霉的NfAA9A的终止子)。

以pSilent-1质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增trpC terminator，引物序列如下：

truncated-NfAA9A-trpC terminator-F:TACTCTGGCTAGAGTAGATGCCGACCGGATCGATCC；(SEQ ID NO.21)

PCR条件同上，制得片段6’(里氏木霉的NfAA9A截断型的终止子)。

(5)以实施例1中获得的里氏木霉基因组为模板，利用引物进行PCR扩增，

引物序列如下：

PtrA-xyn1down-F：CGTCAGCGCGAGTGTGCTGAGTAAGTTCTGTTGATGTTGACT TGGAGT；(SEQ ID NO.22)

xyn1down-R：CCTCGCGGAAGTGAAGAAAGAGTGTAA；(SEQ ID NO.23)

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃2min，30个循环；60℃，10min，4℃保存，制得片段7(里氏木霉的NfAA9A/NfAA9A截断型的下游同源臂)。

(6)将片段3或者3’、片段5、片段6或者6’以摩尔比1：1：2混合，进行PCR扩增，采用的PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃10min，68℃3.5min，13个循环；68℃终延伸10min，4℃保存。制得大片段8或者8’。

(7)将大片段8稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

T.reesei-NfAA9A-F:CAAATAATCATCATGTCTGTCTCTAAGATTGCAGCT；(SEQ ID NO.11)

进行PCR扩增，PCR条件：94℃5min；98℃10s，58℃60s，68℃4min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得用于下一轮融合PCR的大片段8。

将大片段8’稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

T.reesei-truncated-NfAA9A-F:CAAATAATCATCATGTCTGTCTCTAAGATTGCA GCT；(SEQ ID NO.13)

进行PCR扩增，PCR条件：94℃5min；98℃10s，58℃60s，68℃4min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得用于下一轮融合PCR的大片段8’。

(8)将片段4、片段7、大片段8以摩尔比1：1：2混合，进行PCR扩增，采用的PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃10min，68℃7min，13个循环；68℃终延伸10min，4℃保存。制得大片段9。

将片段4、片段7、大片段8’以摩尔比1：1：2混合，进行PCR扩增，采用的PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃10min，68℃7min，13个循环；68℃终延伸10min，4℃保存。制得大片段9’。

(9)里氏木霉中NfAA9A基因表达盒的获得：将大片段9稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

xyn1up-F：GCATATTTCGTTGGCTGGCAGATTGAAG；(SEQ ID NO.15)

xyn1down-R：CCTCGCGGAAGTGAAGAAAGAGTGTAA；(SEQ ID NO.23)

进行PCR扩增，PCR条件：94℃5min；98℃10s，58℃60s，68℃10min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得里氏木霉中的NfAA9A基因表达盒。

里氏木霉中NfAA9A截断型基因表达盒的获得：将大片段9’稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

xyn1up-F：GCATATTTCGTTGGCTGGCAGATTGAAG；(SEQ ID NO.15)

xyn1down-R：CCTCGCGGAAGTGAAGAAAGAGTGTAA；(SEQ ID NO.23)

进行PCR扩增，PCR条件：94℃5min；98℃10s，58℃60s，68℃10min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得里氏木霉中的truncated-NfAA9A基因表达盒。

实施例7：里氏木霉中蛋白表达

构建好的NfAA9A和truncated-NfAA9A基因表达盒导入里氏木霉中

(1)将里氏木霉菌株在麸皮培养基上培养三天，利用生理盐水，洗脱下孢子，在麸皮培养基上盖一玻璃纸，并在其上面加入100μl孢子悬液，涂布均匀，30℃培养约16h，制得带有萌发孢子的玻璃纸。

(2)加0.1g裂解酶(购自sigma公司，商品名称sigma#L-1412)到20ml溶液1(1.2M山梨醇，0.1M KH₂PO₄)中，轻轻摇均；吸取2～3ml酶液到无菌培养皿中，加一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加2～3ml酶液，依次叠放10层。放置培养皿于30℃培养箱中。酶解约90min后，用镊子(无菌)挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50ml离心管中，然后用数毫升溶液1冲洗玻璃棉，然后2000rpm，4℃离心10min，去除上清液并用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/LTrisHCl)重悬原生质体，2000rpm，4℃离心10min，去除上清液，用0.5～1.0ml溶液2(4℃)重悬原生质体，放置原生质体在冰上，制得原生质体悬液。

(3)将转化体系(200μl原生质体悬液，10μl纯化pE，50μl聚乙二醇分子量(5000-7000))在冰上放置20min，后加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，加入4ml溶液2，混匀；吸取0.2～1ml到4ml预保温的上层培养基中，轻轻混匀，倒在下铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养。在筛选培养基上培养3～4d后，用接种针挑取转化子到选择培养基，培养生孢。

(4)传两代后(培养3天)，将孢子转入基本培养基中，提取染色体进行验证后，获得基因工程菌Tr-NfAA9和Tr-truncated-Nf AA9。

实施例8：里氏木霉ATCC 26921和变异菌株Tr-NfAA9以及Tr-truncated-Nf AA9培养液糖化实验

(1)取里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC 26921和变异菌株Tr-NfAA9以及Tr-truncated-Nf AA9，接种于麸皮培养基中，在30℃的条件下培养3天，然后各取同等大小琼脂块转接于下述产酶培养基中，在30℃、180rpm的条件下发酵培养8天，制得微生物培养液。将培养液14000r/min离心10min，得粗酶液，将粗酶液34000r/min，4℃离心40min得酶液。

上述的产酶培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉3％，蛋白胨1％，麸皮3％，微晶纤维素0.4％，硝酸钠0.1％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.04％，尿素0.15％，吐温80 0.2％，余量水。

里氏木霉和变异菌株Tr-NfAA9以及Tr-truncated-Nf AA9酶液FPU和LPMO酶活结果如表3所示：

(2)预处理后的玉米秸秆的制备方法：将玉米秸秆浸渍在1wt％的硫酸溶液中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理。

(3)降解含纤维素原料的方法如下：分别以微晶纤维素和预处理后的玉米秸秆为底物，以5μg蛋白/mg底物的比例进行等蛋白添加，体系中加入6.25mM的没食子酸，45℃，pH4.8进行糖化，24小时后取样，HPLC测定其葡萄糖产量。

里氏木霉和变异菌株Tr-NfAA9以及Tr-truncated-Nf AA9酶液降解含纤维素原料的结果如表4所示：

表3：酶液FPU和LPMO酶活结果

表4：降解纤维素24小时后葡萄糖的得率(mM)

菌株	微晶纤维素	预处理后的玉米秸秆
			ATCC 26921	4.17	6.62
Tr-NfAA9	4.31	7.13
			Tr-truncated-Nf AA9	6.93	11.73

由此可见，通过将来源于Neosartorya fischeri的多肽(AA9)或者多肽片段和来源于里氏木霉的木质纤维素降解酶混合，或者将多肽(AA9)的基因或者基因片段在里氏木霉中表达，提高了里氏木霉中LPMO的酶活水平，改善了里氏木霉的酶系组成，在它们的协同作用下，通过水解和氧化两种方式断裂木质纤维素中的糖苷键，更为高效地降解了微晶纤维素和预处理后的玉米秸秆。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 荣成市慧海创达生物科技有限公司

<120> 具有增强纤维素分解活性的多肽及其编码基因与应用

<130> 2019

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 367

<212> PRT

<213> NfAA9全长氨基酸序列

<400> 1

Met Ser Val Ser Lys Ile Ala Ala Val Leu Leu Ser Ser Ala Ala Leu

1 5 10 15

Val Ala Gly His Gly Phe Val Ser Gly Ala Val Val Asp Gly Lys Tyr

20 25 30

Tyr Thr Gly Tyr Leu Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser Ser Pro Pro

35 40 45

Glu Ser Ile Gly Trp Ser Glu Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe Val Asp

50 55 60

Gly Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Asp Ile Ile Cys His Lys Ser Ala Lys

65 70 75 80

Asn Gly Ala Ile Ser Ala Glu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Val Glu Phe

85 90 95

Gln Trp Thr Glu Trp Pro Glu Ser His His Gly Pro Val Ile Thr Tyr

100 105 110

Met Ala Asn Cys Asn Gly Asp Cys Ala Ser Val Asp Lys Thr Ser Leu

115 120 125

Glu Phe Phe Lys Ile Asp Glu Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Asn Val

130 135 140

Pro Gly Thr Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Asn Asn Asn Ser Trp

145 150 155 160

Thr Val Thr Val Pro Ser Ser Ile Ala Ala Gly Asn Tyr Val Met Arg

165 170 175

His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gly Asn Gln Asn Gly Ala Gln

180 185 190

Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Leu Lys Val Thr Gly Gly Gly Ser Asp

195 200 205

Lys Pro Ala Gly Thr Leu Gly Thr Ala Leu Tyr Lys Asn Thr Asp Ala

210 215 220

Gly Ile Leu Val Asn Ile Tyr Gln Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Ile Pro

225 230 235 240

Gly Pro Ala Leu Tyr Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ser Gly

245 250 255

Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ile Thr Gln

260 265 270

Thr Ser Thr Ala Val Gln Thr Ser Ser Ala Thr Val Tyr Gln Pro Ser

275 280 285

Thr Thr Thr Glu Ala Val Thr Val Thr Ser Thr Pro Ala Gln Gln Ser

290 295 300

Tyr Val Gln Ala Pro Thr Ala Thr Pro Ser Ser Thr Ala Gly Ser Ser

305 310 315 320

Ser Ser Ser Gly Thr Leu Pro Ser Gly Ser Ser Leu Thr Glu Tyr Phe

325 330 335

Asn Ser Leu Ser Ala Glu Glu Phe Leu Lys Val Leu Lys Glu Thr Phe

340 345 350

Ser Trp Leu Val Thr Glu Lys Val His Ala Arg Asp Leu Ser Ala

355 360 365

<210> 2

<211> 1122

<212> DNA

<213> NfAA9A全长大肠杆菌表达基因序列

<400> 2

atgagcgtga gcaaaattgc ggcggtgtta ttaagcagcg cggcgttagt tgcgggtcat 60

ggctttgtta gcggcgcagt tgtggatggc aaatattata ccggctatct ggtgaaccag 120

tatccgtata tgagcagccc gccggaatca attggttgga gcgaaaccgc aaccgatctg 180

ggctttgttg atggcagcgg ctatagcagc ggcgatatca tttgccataa gagcgcgaaa 240

aacggcgcga ttagcgcgga aattaaagcg ggcggcaaag tggaatttca gtggaccgaa 300

tggccggaaa gccatcatgg cccggtgatt acctatatgg cgaactgcaa cggtgattgc 360

gcgagcgtgg ataaaaccag cctggagttc tttaagattg atgagagcgg cctgattagc 420

gatagcaacg tgcctggcac ttgggcaagc gataacctga ttgcgaacaa caacagctgg 480

accgtgaccg ttcctagctc aattgcggcg ggcaactatg tgatgcgcca tgaaattatt 540

gcgctgcata gcgcgggtaa ccaaaatggc gcgcagaact atcctcagtg cattaacctg 600

aaagtgaccg gcggcggtag cgataaaccg gcgggtacct taggtaccgc gctgtataaa 660

aacaccgatg cgggcattct ggtgaacatt tatcagagcc tgagcagcta tgatattcct 720

ggcccggcgt tatattcagg tgcgagcagc ggtagcagca attcaggtgg tagcgcgtca 780

tcatcagcgg cggcgccttc agcgaccatt acccaaacca gcaccgcggt tcaaactagc 840

agcgcgaccg tttatcagcc tagcaccacc actgaagcgg ttaccgttac cagcacccct 900

gcgcaacaga gctatgttca ggcgcctacc gcaaccccta gctcaactgc gggtagcagc 960

tcatcaagcg gtaccttacc tagcggtagc agcctgaccg aatattttaa cagcctgagc 1020

gcggaagaat ttctgaaagt gctgaaggaa acctttagct ggctggtgac cgaaaaagtg 1080

catgcgcgcg atttaagcgc gcatcatcat catcatcact ga 1122

<210> 3

<211> 1104

<212> DNA

<213> NfAA9A全长里氏木霉表达基因序列

<400> 3

atgtctgtct ctaagattgc agctgttctt ctcagctcgg ccgctctggt tgctggtcac 60

ggattcgtgt cgggtgccgt tgttgatggc aaatactaca ctggatacct cgtcaaccaa 120

tacccttaca tgagcagccc tcctgagagc atcggttggt ctgaaaccgc taccgatctg 180

ggtttcgtcg acggtagcgg ctactctagc ggcgacatca tctgccacaa gagtgctaag 240

aatggtgcca tctctgccga gatcaaggcc ggtggaaagg ttgaattcca atggactgaa 300

tggcctgaat ctcaccacgg accggtcatt acctacatgg ccaactgcaa tggtgattgc 360

gcctcagttg acaagaccag tctggaattc ttcaagattg atgagagtgg tctgatcagt 420

gactctaatg ttcctggcac ctgggcctcc gacaacctaa tcgccaacaa caacagctgg 480

acggtgactg ttcccagctc catcgccgct ggtaactatg tcatgcgtca cgaaatcatt 540

gccctccact ccgctggaaa ccagaacggt gcccagaact accctcagtg catcaacctt 600

aaggtcaccg gtggtggcag cgacaagcct gcaggtaccc tcggcactgc gctctacaag 660

aacactgacg ccggcatcct tgtcaatatc taccagagcc tgagctccta tgacattcct 720

ggtcccgctc tctactctgg cgcttcttct ggcagctcca acagcggtgg ttccgcctcg 780

tctagcgccg ctgctccttc tgccaccatc actcagacct ctactgcagt ccagactagc 840

tctgcgactg tttaccagcc ctccactacc accgaggctg tcaccgtcac cagcactcct 900

gcccagcaga gctacgtcca ggctcctacc gccaccccta gctccactgc cggcagctcc 960

agctccagcg gcactcttcc cagcggcagc agcctcaccg agtacttcaa ctccctcagc 1020

gccgaggagt tcctgaaggt ccttaaggag accttctctt ggctggttac ggagaaggtg 1080

cacgctcgtg atctctctgc ctag 1104

<210> 4

<211> 247

<212> PRT

<213> NfAA9截断性氨基酸序列

<400> 4

Met Ser Val Ser Lys Ile Ala Ala Val Leu Leu Ser Ser Ala Ala Leu

1 5 10 15

Val Ala Gly His Gly Phe Val Ser Gly Ala Val Val Asp Gly Lys Tyr

20 25 30

Tyr Thr Gly Tyr Leu Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser Ser Pro Pro

35 40 45

Glu Ser Ile Gly Trp Ser Glu Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe Val Asp

50 55 60

Gly Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Asp Ile Ile Cys His Lys Ser Ala Lys

65 70 75 80

Asn Gly Ala Ile Ser Ala Glu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Val Glu Phe

85 90 95

Gln Trp Thr Glu Trp Pro Glu Ser His His Gly Pro Val Ile Thr Tyr

100 105 110

Met Ala Asn Cys Asn Gly Asp Cys Ala Ser Val Asp Lys Thr Ser Leu

115 120 125

Glu Phe Phe Lys Ile Asp Glu Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Asn Val

130 135 140

Pro Gly Thr Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Asn Asn Asn Ser Trp

145 150 155 160

Thr Val Thr Val Pro Ser Ser Ile Ala Ala Gly Asn Tyr Val Met Arg

165 170 175

His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gly Asn Gln Asn Gly Ala Gln

180 185 190

Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Leu Lys Val Thr Gly Gly Gly Ser Asp

195 200 205

Lys Pro Ala Gly Thr Leu Gly Thr Ala Leu Tyr Lys Asn Thr Asp Ala

210 215 220

Gly Ile Leu Val Asn Ile Tyr Gln Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Ile Pro

225 230 235 240

Gly Pro Ala Leu Tyr Ser Gly

245

<210> 5

<211> 762

<212> DNA

<213> NfAA9A截断性大肠杆菌表达基因序列

<400> 5

atgagcgtga gcaaaattgc ggcggtgtta ttaagcagcg cggcgttagt tgcgggtcat 60

ggctttgtta gcggcgcagt tgtggatggc aaatattata ccggctatct ggtgaaccag 120

tatccgtata tgagcagccc gccggaatca attggttgga gcgaaaccgc aaccgatctg 180

ggctttgttg atggcagcgg ctatagcagc ggcgatatca tttgccataa gagcgcgaaa 240

aacggcgcga ttagcgcgga aattaaagcg ggcggcaaag tggaatttca gtggaccgaa 300

tggccggaaa gccatcatgg cccggtgatt acctatatgg cgaactgcaa cggtgattgc 360

gcgagcgtgg ataaaaccag cctggagttc tttaagattg atgagagcgg cctgattagc 420

gatagcaacg tgcctggcac ttgggcaagc gataacctga ttgcgaacaa caacagctgg 480

accgtgaccg ttcctagctc aattgcggcg ggcaactatg tgatgcgcca tgaaattatt 540

gcgctgcata gcgcgggtaa ccaaaatggc gcgcagaact atcctcagtg cattaacctg 600

aaagtgaccg gcggcggtag cgataaaccg gcgggtacct taggtaccgc gctgtataaa 660

aacaccgatg cgggcattct ggtgaacatt tatcagagcc tgagcagcta tgatattcct 720

ggcccggcgt tatattcagg tcatcatcat catcatcact ga 762

<210> 6

<211> 744

<212> DNA

<213> NfAA9A截断性里氏木霉表达基因序列

<400> 6

atgtctgtct ctaagattgc agctgttctt ctcagctcgg ccgctctggt tgctggtcac 60

ggattcgtgt cgggtgccgt tgttgatggc aaatactaca ctggatacct cgtcaaccaa 120

tacccttaca tgagcagccc tcctgagagc atcggttggt ctgaaaccgc taccgatctg 180

ggtttcgtcg acggtagcgg ctactctagc ggcgacatca tctgccacaa gagtgctaag 240

aatggtgcca tctctgccga gatcaaggcc ggtggaaagg ttgaattcca atggactgaa 300

tggcctgaat ctcaccacgg accggtcatt acctacatgg ccaactgcaa tggtgattgc 360

gcctcagttg acaagaccag tctggaattc ttcaagattg atgagagtgg tctgatcagt 420

gactctaatg ttcctggcac ctgggcctcc gacaacctaa tcgccaacaa caacagctgg 480

acggtgactg ttcccagctc catcgccgct ggtaactatg tcatgcgtca cgaaatcatt 540

gccctccact ccgctggaaa ccagaacggt gcccagaact accctcagtg catcaacctt 600

aaggtcaccg gtggtggcag cgacaagcct gcaggtaccc tcggcactgc gctctacaag 660

aacactgacg ccggcatcct tgtcaatatc taccagagcc tgagctccta tgacattcct 720

ggtcccgctc tctactctgg ctag 744

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcctttcggg ctttgttagc agccggatct cagtggtggt ggtggtggtg ctcgagtcag 60

tgatgatgat gatgat 76

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tatacatatg gctagcatga ctggtggaca gcaaatgggt cgcggatccg aattccatgg 60

ctttgttagc ggcgc 75

<210> 9

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcctttcggg ctttgttagc agccggatct cagtggtggt ggtggtggtg acctgaatat 60

aacgccgggc cagga 75

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tatacatatg gctagcatga ctggtggaca gcaaatgggt cgcggatccg aattccatgg 60

ctttgttagc ggcgc 75

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caaataatca tcatgtctgt ctctaagatt gcagct 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcggcatcta ctctaggcag agagatcacg agcgtg 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caaataatca tcatgtctgt ctctaagatt gcagct 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcggcatcta ctctagccag agtagagagc gggacc 36

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcatatttcg ttggctggca gattgaag 28

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agagacagac atgatgatta tttgtgcgtg ttttcc 36

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaaaaaagag gaaaagaccg tccgtaacga aatgtaaaag ctaggaga 48

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

actccaagtc aacatcaaca gaacttactc agcacactcg cgctgacg 48

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctctctgcct agagtagatg ccgaccggat cgatcc 36

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tctcctagct tttacatttc gttacggacg gtcttttcct cttttttt 48

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tactctggct agagtagatg ccgaccggat cgatcc 36

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cgtcagcgcg agtgtgctga gtaagttctg ttgatgttga cttggagt 48

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cctcgcggaa gtgaagaaag agtgtaa 27

Claims

1.具有增强纤维素分解活性的多肽在如下1）-4）至少一项中的应用；

1）降解可溶性多糖；

2）提高纤维素酶降解纤维素的效率；

3）提高微生物酶系中LPMO酶活活性；

4）作为或制备具有增强纤维素分解活性的辅助活性酶；

所述具有增强纤维素分解活性的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2. 用于产生权利要求1所述的具有增强纤维素分解活性的多肽的方法，其特征在于，包括：（a）在有益于产生所述多肽的条件下培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞中包含SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的多核苷酸；和（b）回收所述多肽。

3.一种组合物，其包含：(a)权利要求1所述的具有增强纤维素分解活性的多肽；（b）纤维素分解酶。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述纤维素分解酶选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶中的一种或多种。

5.权利要求1所述的具有增强纤维素分解活性的多肽、权利要求3或权利要求4所述的组合物在处理纤维素材料和/或生物质中的应用。

6.一种降解或转化含纤维素材料的方法，其包括用权利要求3或权利要求4所述的组合物处理所述含纤维素材料的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对含纤维素材料进行前处理的步骤；所述前处理为酸处理、碱处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、干燥处理、亚硫酸盐处理或水热处理。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组合物按每克绝干含纤维素材料添加5-15mg组合物的比例加入；

所述处理条件为：调节pH值范围至5.0-6.0，在45-50℃下振荡反应32-40h。

9.一种用于产生发酵产物的方法，其特征在于，包括：

（1）用权利要求3或权利要求4所述的组合物糖化含纤维素材料；

（2）用一种或多种发酵微生物发酵步骤（1）的经糖化的含纤维素材料以产生发酵产物；

（3）从发酵液中回收所述发酵产物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵的条件为：28-32℃进行厌氧发酵培养45-50h。