CN104955846A - 人源化抗hmgb1抗体或其抗原结合性片段 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与由HMGB1蛋白的C末端的8个氨基酸残基(EEEDDDDE)构成的序列特异性结合、对与该蛋白质具有相关性的各种炎症性疾病的治疗或预防有效的人源化抗HMGB1抗体及其抗原结合性片段，并且提供含有该抗体或其抗原结合性片段的药物组合物。

Description

人源化抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段
技术领域
本发明涉及与HMGB1蛋白特异性结合、对HMGB1相关疾病的治疗、预防有效的人源化抗HMGB1抗体及其抗原结合性片段。
背景技术
HMGB1(High Mobility Group Box 1，高迁移率族蛋白1)是作为与在尚未确立充分的治疗法的脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、动脉粥样硬化、外伤性脑损伤、败血症、神经源性疼痛及各种关节炎等中迄今为止发现的肿瘤坏死因子和各种白介素等炎症性细胞因子不同的早期炎症介质或迟发型炎症介质被重新发现并作为可能成为这些疾病的治疗法、预防法的标靶而受到广泛关注的蛋白质(非专利文献1)。
HMGB1是在约40年前作为普遍存在于真核生物的细胞核内且与染色质结合的非组蛋白蛋白质的一种、在电泳中显示出高迁移率的蛋白质被发现的。最初，作为属于高迁移率族(HMG)蛋白质家族的一种被称为HMG1(High Mobility Group 1)，认为其对染色质结构的维持、转录活性调节和DNA修复等发挥重要的功能。之后，作为膜结合性蛋白质(amphoterin)被重新发现，进而作为与各种炎症性疾病相关的炎症介质被屡次发现，2001年修订了高迁移率蛋白质家族的命名法，将HMG1更名为HMGB1。
HMGB1蛋白为由富含赖氨酸残基的215个氨基酸构成的25kDa的蛋白质，具有在哺乳动物间非常高度保守的氨基酸序列。其结构由3个结构域构成，这3个结构域由被称为A-box(或box-A)和B-box(或box-B)的2个DNA结合结构域、以及仅由天冬氨酸和谷氨酸构成的羧基末端结构域(也称为C末端结构域或酸性尾部)构成。A-box和B-box分别由高度保守的约80个氨基酸残基构成，带有强正电。B-box中存在TLR4(toll-like receptor 4，Toll样受体4)结合结构域和RAGE(receptorfor advanced glycation end products，晚期糖基化终产物受体)结合结构域。通过HMGB1与TLR4的结合，诱导炎症性细胞因子从巨噬细胞/单核细胞的分泌。通过HMGB1与RAGE的结合，诱导内皮细胞和其他体细胞(包括肿瘤细胞)的增殖、分化、游走、细胞表面蛋白质的表达。第三结构域、羧基末端具有由仅含天冬氨酸和谷氨酸残基的30个氨基酸序列构成的结构，极端地带有负电。关于该C末端部分的氨基酸序列，已知在哺乳动物间也仅存在2-3个位置的差异，是高度保守的。
作为HMGB1蛋白的功能，最初认为有染色质结构的维持功能、转录活性调节功能、DNA修复功能等，特别是在1999年由Tracey等人的研究小组作为败血症中的迟发型炎症介质被重新发现之后，陆续发现其在各种疾病的炎症性细胞因子级联反应中担负重要的作用。已经阐明，HMGB1不仅局限于细胞的核内，而且伴随巨噬细胞、各种免疫***细胞的活化从核内向细胞质转移并向细胞外分泌(主动分泌)。或者，伴随由缺血、损伤引起的细胞的坏死或凋亡，局限于核内的HMGB1被迅速释放(被动释放)。近年来，HMGB1、热休克蛋白(HSP)等被认为是内源性损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns：DAMPs)之一，这些分子释放自由于非微生物性的原因(例如，缺血、外伤等)而产生的损伤细胞。另一方面，来源于细菌的脂多糖(LPS)等被称为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns：PAMPs)，包括微生物来源的各种各样的产物(product)。在细胞表面和细胞质内这两者中对后者进行识别、应答的受体被称为模式识别受体(pattern recognition receptors：PRRs)，作为其代表性家族，有Toll样受体(TLRs)。但是，TLR家族的一部分特别是TLR2、TLR4和TLR9识别、活化上述的DAMPs。特别是已知HMGB1活化TLR4信号转导等，诱导炎症反应，产生例如TNFα的分泌亢进等。另外，关于作为HMGB1的受体之一的RAGE，在使用RAGE敲除动物的研究、使用抑制RAGE与HMGB1的结合的肽或特异性抗体的研究中显示，在由缺血引起的脑损伤(非专利文献2)和细菌感染所伴随的败血症(非专利文献3)等疾病中，RAGE介导的炎症信息的传输对该HMGB1的炎症反应的增强发挥重要的作用。即，这些释放到细胞外的HMGB1经由TLR4、RAGE等作为强力的炎症介质起作用，进一步促进目前已知的炎症性免疫应答，由此导致各种严重疾病。
这些HMGB1相关的疾病(HMGB1相关疾病；HMGB1-relateddisease)大致分为两类。一类为败血症休克这样的可观察到来源于由微生物感染引起的免疫应答的HMGB1的细胞外分泌的疾病组，另一类为脑梗塞这样的可观察到起因于由非微生物性原因引起的细胞损伤的HMGB1的细胞外释放的疾病组。前者的情况下，例如，由感染产生的细菌来源成分(细菌性脂多糖(LPS)等)诱导TLR4的活化。与此相应，由单核细胞、巨噬细胞等产生主动的HMGB1的分泌，作为后期的炎症介质起作用。作为HMGB1相关疾病，可以列举败血症、关节炎、动脉粥样硬化、各种感染症和各种免疫疾病等。后者属于如下情况：伴随着由缺血、外伤引起的细胞坏死，在此之前存在于核中的HMGB1在数小时以内被迅速释放到细胞外(被动释放)，作为早期的炎症介质诱导各种炎症性细胞因子的产生，作为相关疾病，可以列举脑梗塞、外伤性脑损伤、由器官移植时的缺血引起的疾病、心肌梗塞等。
近年来，作为针对HMGB1相关疾病的治疗法或预防法，报道了关于使用HMGB1的抗体的方法(专利文献1、2、4、5)、使用HMGB1蛋白的一部分片段作为拮抗剂的方法(专利文献2和3)、使用抑制HMGB1的分泌的化合物的方法(非专利文献4)等的探索研究等。特别是作为在使用抗HMGB1的抗体的动物模型中的治疗法，报道了在败血症(专利文献1、4和5)、急性肺损伤(非专利文献5)、由烧伤引起的***的损伤(专利文献2)、关节炎(专利文献4、5和非专利文献6)、脑缺血(非专利文献7)、淀粉样变性(专利文献6)、门静脉内胰岛移植时的肝损伤(非专利文献8)和神经源性疼痛(非专利文献9)等中应用的可能性，但可以说这些研究作为治疗药、预防药的研究都只是刚刚开始。
其中，我们揭示了大鼠来源的抗HMGB1单克隆抗体在脑梗塞(专利文献8、非专利文献10和11)、脑血管痉挛(专利文献9)、动脉粥样硬化(专利文献10和非专利文献12)、外伤性脑损伤(专利文献11和非专利文献13)和神经源性疼痛(非专利文献9)的动物模型中是有效的。但是，大鼠来源的抗体存在免疫原性的问题，难以在人体中使用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2000/047104
专利文献2：WO2002/074337
专利文献3：WO2004/046345
专利文献4：WO2005/026209
专利文献5：WO2007/001422
专利文献6：WO2008/075788
专利文献7：WO2012/136250
专利文献8：WO2007/049468
专利文献9：WO2007/135992
专利文献10：WO2011/037227
专利文献11：WO2012/074043
非专利文献
非专利文献1：Annu.Rev.Immunol.,2011.(vol.29)p139
非专利文献2：J.Neuros.,2008(vol.28)p12023
非专利文献3：Crit.Care,2007(vol.11)pR122
非专利文献4：Biochem Pharmacol.2012p1492
非专利文献5：J.Immunol.,2000(165)p2950
非专利文献6：Mol.Med.,2011(vol.17)p1039
非专利文献7：J.Neurosci.,2006(vol.26)p6413
非专利文献8：Am.J.Transplant.,2010(vol.10)p1588
非专利文献9：PLoS One.2013(vol.8)e73640
非专利文献10：FASEB J.,2007(vol.21)p3904
非专利文献11：Stroke.,2011(vol.42)p1420
非专利文献12：Arterioscler Thromb Vasc Biol.,2011(vol.31)p313
非专利文献13：Ann Neurol.,2012(72)p373
发明内容
发明所要解决的问题
抗HMGB1抗体作为针对成为在尚未确立充分的治疗法的缺血/再灌注损伤、外伤性脑损伤、神经源性疼痛和败血症等中观察到的致死性炎症反应的根源的炎症介质的拮抗剂，潜在有可能成为解开这些疾病的治疗法、预防法上的问题的药剂的可能性，从而受到广泛的关注。其中，我们揭示了大鼠来源的抗HMGB1单克隆抗体(#10-22)在脑梗塞(专利文献8)、脑血管痉挛(专利文献9)、动脉粥样硬化(专利文献10)、外伤性脑损伤(专利文献11)和神经源性疼痛(非专利文献9)的动物模型中是有效的。但是，大鼠来源的抗体难以在临床中使用，为了将该大鼠抗体用于人，需要将抗体的大鼠部分尽可能地与人抗体进行取代(人源化)以减弱抗体的免疫原性，并且需要维持或提高抗原特异性、亲和性、中和活性。
用于解决问题的方法
其中，获取存在于产生大鼠抗体#10-22的杂交瘤中的该大鼠抗体基因，对大鼠抗体#10-22的H链、L链、它们的可变区及它们的CDR的氨基酸序列进行分析，选出同源性高的人来源的框架，反复进行了多次尝试，结果，成功地制作了抗原特异性、亲和性、体外中和活性与大鼠抗体同等或更高的人源化抗体。
已报道了多种人来源的抗HMBG1单克隆抗体作为现有技术，作为对HMBG1与RAGE的结合的抑制活性最高且与HMGB1的C末端区域结合的人抗体，公开了G4(WO2007/076200)。另外，作为最强力地抑制HMGB1与TLR4的结合介导的TNFα从巨噬细胞/单核细胞的的分泌诱导的人抗体，公开了S6(WO2007/001422)。但是，确认了本发明的人源化抗体在HMGB1与RAGE的结合抑制活性方面显著高于上述人抗体G4，在体外对HMGB1的TLR4介导的TNFα分泌诱导的抑制活性方面也显著优于上述人抗体S6，此外，在败血症模型小鼠中也具有高的致死防御效果，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下[1]～[16]所述的与HMGB1蛋白特异性结合的人源化抗HMGB1抗体及其抗原结合性片段、含有该抗体或其抗原结合性片段的药物组合物等。
[1]一种人源化抗体或其抗原结合性片段，其与存在于HMGB1蛋白的C末端结构域的氨基酸序列(EEEDDDDE(序列号60))特异性结合，所述人源化抗体或其抗原结合性片段中，
(i)重链可变区(VH)含有：
(a)包含序列号7的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号8的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号9的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链可变区(VL)含有：
(a)包含序列号10的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号11的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号12的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[2]如[1]所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链可变区(VH)含有：
(a)包含序列号7的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号8的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号9的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链可变区(VL)含有：
(a)包含序列号10的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号11的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号12的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[3]如[1]或[2]所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链可变区(VH)含有序列号43、44、45和46的氨基酸序列分别作为FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号43、44、45和46的氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变，
(ii)轻链可变区(VL)含有序列号47、48、49和50的氨基酸序列分别作为FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号47、48、49和50的氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(i)在重链可变区(VH)中至少49位和94位这两个位置的氨基酸残基为来源于大鼠抗体#10-22的H的氨基酸残基(均为丙氨酸)的氨基酸序列、
(ii)在轻链可变区(VL)中至少44位和46位这两个位置的氨基酸残基为来源于大鼠抗体#10-22的L链的氨基酸残基(分别为异亮氨酸和精氨酸)的氨基酸序列。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(i)包含与序列号41的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(ii)包含与序列号42的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(i)包含序列号41的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(ii)包含序列号42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，上述人源化抗体的类别(亚类)为IgG1(λ)或IgG2(λ)。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，在250ng/ml下比较对人HMGB1蛋白的结合活性(ELISA法)时，所述的人源化抗体或其抗原结合性片段所具有的高活性为#10-22嵌合抗体的2倍以上。
[9]如[1]～[7]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人HMGB1蛋白与RAGE的结合抑制50％时的活性(IC50)为5μg/mL(约33nM)以下。
[10]如[1]～[7]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人PBMC的由HMGB1蛋白刺激引起的TNF-α释放抑制50％时的活性(IC50)为0.02μg/mL(约0.13nM)以下。
[11]一种药物组合物，其含有[1]～[10]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段以及药学上可容许的载体。
[12]如[11]所述的药物组合物，其用于由从细胞游离出的HMGB1诱发的各种HMGB1相关疾病的治疗或预防。
[13]如[11]所述的药物组合物，其用于疾病的治疗或预防，上述HMGB1相关疾病为脑梗塞、脑水肿、脑血管痉挛、外伤性脑损伤、动脉粥样硬化、神经源性疼痛、败血症、关节炎、急性肺外伤、脑缺血、肾缺血和肝缺血等中的任意一种。
[14]编码[1]～[10]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段的氨基酸序列的分离的核酸、或者在高严格条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。
[15]一种重组表达载体，其整合有[14]所述的分离的核酸。
[16]一种宿主细胞，其导入有[15]所述的重组表达载体。
发明效果
本发明中使用的抗HMGB1的大鼠抗体在尚未确立充分的治疗法的脑梗塞、脑血管痉挛、外伤性脑损伤、动脉粥样硬化和神经源性疼痛等的动物模型中，显示出可成为解开针对这些相关疾病的治疗法、预防法上的问题的药剂的可能性，但由于为大鼠来源的抗体，因此难以在临床中使用。通过在使该大鼠抗体维持抗原特异性的同时维持或提高亲和性、中和活性而制成人源化抗体，使大鼠抗体的免疫原性减弱，由此，能够针对上述多种严重的HMGB1相关疾病提供新的治疗法、预防法。
附图说明
图1示出由#10-22杂交瘤克隆的抗体基因产物的与HMGB1的反应性。
图2示出#10-22嵌合抗体的与HMGB1的反应性。
图3分别示出大鼠抗体#10-22的L链可变区、其人源化抗体(VLhum10-22)和人FR(Human_VL)的氨基酸序列、以及与#10-22的L链FR序列的同源性高的8种人来源抗体或种系(GenBank登记号：Z73666、X97474、X97464、BAA20889、Z73647、AY701728、hLV3_cons(人IGLV3家族的共有序列：WO2011/080350)和JL2-germ(来源于人λ链JL2种系的序列))的L链可变区的氨基酸序列。本图中，对于作为#10-22的FR序列中在上述8种人来源序列中未观察到的氨基酸残基“大鼠氨基酸残基”的14个位置(图中，在Human_VL序列下用“H:human”或“R:rat”的记号表示)，将它们全部取代为上述8种人FR序列的共有序列而得到的FR序列为Human_VL。本图中，VLhum10-22表示人源化抗体(EV007156)的L链可变区，44位和46位以外的FR氨基酸残基与上述Human_VL的序列相同。关于L链可变区的1位(1S)，已知根据人抗体中使用的信号序列的种类在S1-Y2之间被切断，在本发明的人FR(Human_VL)和人源化抗体(VLhum10-22)中，选择与大鼠抗体#10-20的L链可变区的N末端同样地将“1S”切断的序列。需要说明的是，本图中的氨基酸残基的位置按照Kabat的编号法(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)来表示。
图4示出#10-22嵌合抗体L链部位取代后的对HMGB1的结合性评价。使用固相化有HMGB1的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体，算出将其OD值设为100％时#10-22嵌合抗体L链部位取代体(14种)对HMGB1的结合率。
图5示出#10-22嵌合抗体L链人源化后的抗体对HMGB1的结合性评价。使用固相化有HMGB1的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体，算出将其OD值设为100％时#10-22(L链)人源化抗体(EV007156L)与#10-22嵌合抗体(H链)共表达而得到的抗体对HMGB1的结合率。
图6分别示出大鼠抗体#10-22的H链可变区、其人源化抗体(VHhum10-22)和人FR(Human_VH)的氨基酸序列、以及与#10-22的H链FR序列的同源性高的6种人来源抗体或种系(GenBank登记号：AM940224、DQ926386、FJ488688、HM855402、DQ840895和Z12332)的H链可变区的氨基酸序列。本图中，对于作为大鼠抗体#10-22的FR序列中在上述6种人来源序列中未观察到的氨基酸残基“大鼠氨基酸残基”的15个位置(图中，在Human_VL序列下用“H:human”或“R:rat”的记号表示)，将它们全部取代为上述6种人FR序列的共有序列而得到的FR序列为Human_VH。本图中，VHhum10-22表示人源化抗体(EV007156)的L链可变区，49位和94位以外的FR氨基酸残基与上述Human_VH的序列相同。需要说明的是，本图中的氨基酸残基的位置按照Kabat的编号法(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)来表示。
图7示出#10-22嵌合抗体H链部位取代后的对HMGB1的结合性评价。使用固相化有HMGB1的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体的H链，算出将其OD值设为100％时#10-22嵌合抗体H链部位取代体(15种)对HMGB1的结合率。
图8示出#10-22嵌合抗体人源化后的对HMGB1的结合性评价。使用固相化有HMGB1的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体的H链，算出将其OD值设为100％时#10-22人源化抗体(EV007156)对HMGB1的结合率。
图9示出抗HMGB1抗体(#10-22嵌合抗体、EV007156、S6、G4)对重组HMGB1(Sf9细胞来源)的结合性评价。使用固相化有HMGB1的酶标板，通过ELISA法来实施(A)。对于各HMGB1(牛胸腺来源和Sf9细胞来源)，以EV007156的OD值为基准，算出抗体浓度250ng/ml下的各HMGB1抗体的结合性(B)。○：#10-22嵌合体、■：EV007156、▲：S6、□：G4
图10示出抑制抗HMGB1抗体与RAGE的结合的效果。根据由ELISA得到的OD值对HMGB1量进行定量后，将结合抑制分析中使用的HMGB1量(2μg/ml)设为100％，算出HMGB1与RAGE的结合率。○：#10-22嵌合体、■：EV007156、□：G4、●：对照Ig
图11示出抗HMGB1抗体对PBMC的由HMGB1引起的TNF-α释放诱导活性的抑制效果。将由外周血得到的PBMC用HMGB1进行刺激，对24小时后得到的培养上清中含有的TNF-α的量进行定量(eBioscience、Human TNF-αReady-Set-Go！)。●：阴性对照(EV2001)、▲：EV007156、*：S6、○：G4
图12示出使用EV007156的小鼠体内的药物动态试验的结果。将EV007156以10mg/kg腹腔内给药于C57BL/6N，利用ELISA对在给药后0.25天、给药后3天、7天、14天、24天采集的血液中含有的EV007156进行定量。○：利用抗人IgG固相的EV007156的定量、●：利用HMGB1固相的EV007156的定量
图13示出HMGB1的结构域和制成的缺失构建体。各结构域的氨基酸范围为-30～0：His标签和接头、1～88：A-Box、89～185：B-Box、186～125：C-tail：186～125(数字为自蛋氨酸起的氨基酸数)。分别示出附加有His标签的全长HMGB1和6种缺失构建体的构成结构域。
图14示出制成的缺失构建体的利用抗His抗体的表达确认试验的结果。将附加有His标签的全长HMGB1和6种缺失构建体转染到CHO-K1中，使用抗His抗体进行染色，确认各缺失构建体的表达。A～H分别表示A：CHO-K1、B：His-HMGB1(全长)、C：A-Box+B-Box、D：A-Box+C-tail、E：B-Box+C-tail、F：A-Box、G：B-Box、H：+C-tail。
图15示出制成的缺失构建体的利用CBB染色的表达确认试验的结果。将附加有His标签的全长HMGB1和6种缺失构建体转染到CHO-K1中，制备细胞裂解液后，使用Ni-琼脂糖对表达的蛋白质进行纯化。将各蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用CBB进行染色。
图16-a示出利用免疫荧光染色法得到的EV007156的表位作图。将全长HMGB1和6种缺失构建体转染到CHO-K1中，使用EV007156进行染色，考察EV007156识别何种缺失构建体。A～H分别表示A：CHO-K1、B：His-HMGB1(全长)、C：A-Box+B-Box、D：A-Box+C-tail、E：B-Box+C-tail、F：A-Box、G：B-Box、H：+C-tail。
图16-b示出利用免疫荧光染色法得到的S6的表位作图。将全长HMGB1和6种缺失构建体转染到CHO-K1中之后，使用S6进行染色，考察其识别何种缺失构建体。A～H分别表示A：CHO-K1、B：His-HMGB1(全长)、C：A-Box+B-Box、D：A-Box+C-tail、E：B-Box+C-tail、F：A-Box、G：B-Box、H：+C-tail。
图16-c示出利用免疫荧光染色法得到的G4的表位作图。将全长HMGB1和6种缺失构建体转染到CHO-K1中之后，使用G4进行染色，考察其识别何种缺失构建体。A～H分别表示A：CHO-K1、B：His-HMGB1(全长)、C：A-Box+B-Box、D：A-Box+C-tail、E：B-Box+C-tail、F：A-Box、G：B-Box、H：+C-tail。
图17-a示出利用蛋白免疫印迹得到的EV007156的表位作图。将全长HMGB1和各缺失构建体在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用EV007156进行检测。
图17-b示出利用蛋白免疫印迹得到的S6的表位作图。将全长HMGB1和各缺失构建体在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用S6进行检测。与EV007156不同，识别到含有B-Box的区域。
图17-c示出利用蛋白免疫印迹得到的G4的表位作图。将全长HMGB1和各缺失构建体在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用G4进行检测。与EV007156不同，识别到含有B-Box的区域。
图18示出利用HMGB1的C末端区域的合成肽得到的EV007156的表位作图。合成#1～#10这10种肽，通过斑点印迹法检测EV007156识别何种肽。形成斑点的肽量一律为4μg/斑点。
图19示出使用败血症模型小鼠的通过给药EV007156得到的致死防御效果。对实施了CLP的小鼠以10mg/kg给药EV007156，算出至术后6天为止的存活率。●：阴性对照组、▲：EV007156给药组
具体实施方式
1.术语的说明
本说明书中，与本发明相关地使用的科学术语和专业术语具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，若非在根据上下文判断为特别必要的情况下，则单数术语包含复数，复数术语包含单数。一般而言，本说明书中记载的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质与核酸化学以及杂交的技术相关地使用的命名法为该领域中公知且通常使用的命名法。
本发明涉及与HMGB1蛋白特异性结合、对HMGB1相关疾病的治疗、预防有效的人源化抗HMGB1抗体及其抗原结合性片段。以下，通过明确本发明中使用的语句的含义来详细地对本发明的具体实施方式进行说明。
1)HMGB1蛋白
HMGB1蛋白(或者，有时称为“HMGB1多肽”)被认为具有染色质结构的维持功能、转录活性调节功能等，但在作为败血症中的迟发型炎症介质被重新发现之后，陆续发现其在各种疾病的炎症性细胞因子级联反应中担负重要的作用。HMGB1的结构为由富含赖氨酸残基的215个氨基酸构成的25kDa的蛋白质，具有在哺乳动物间非常高度地保守的氨基酸序列。其结构由3个结构域构成，这3个结构域由被称为A-box和B-box的2个DNA结合结构域、以及仅由天冬氨酸和谷氨酸构成的羧基末端结构域(也称为C末端结构域或酸性尾部)构成。A-box和B-box分别由彼此高度保守的约80个氨基酸残基构成，带有强正电。B-box中存在TLR4(toll-like receptor 4)结合结构域、RAGE(receptor foradvanced glycation end products)结合结构域。通过HMGB1与TLR4的结合，诱导炎症性细胞因子从巨噬细胞/单核细胞的分泌。需要说明的是，在最近的研究中表明，关于由HMGB1在体外引起的TNF-α等细胞因子的分泌诱导，作为HMGB1的受体，有TLR4/MD2(髓样分化蛋白2)复合体以及CD14的参与(Mol.Med.,2013(vol.19)p88)。另一方面，通过HMGB1与RAGE的结合，诱导内皮细胞和其他体细胞(包括肿瘤细胞)的增殖、分化、游走、细胞表面蛋白质的表达。第三结构域、羧基末端具有由仅含天冬氨酸和谷氨酸残基的30个氨基酸序列构成的结构，极端地带有负电。关于该C末端部分的氨基酸序列，已知在哺乳动物间也仅存在2-3个位置的差异，是高度保守的。特别是关于HMGB1的RAGE结合结构域已揭示，在由缺血引起的脑损伤(非专利文献2)和细菌感染所伴随的败血症(非专利文献3)等疾病中，通过抑制HMGB1与RAGE受体的结合，能够抑制HMGB1-RAGE介导的HMGB1相关疾病中的炎症反应的增强。
本说明书中使用的HMGB1为哺乳动物来源的HMGB1(例如，人HMGB1、牛胸腺HMGB1和啮齿类来源的HMGB1等)，关于它们的氨基酸序列，公开在GenBank登记号CAG33144、GenBank登记号CAE48262、GenBank登记号CAI15600、NCBI参考序列登记号NP_002119和UniProtKB/Swiss-Prot登记号P09429(以上为人来源)、GenBank登记号BC102929(牛胸腺来源)、GenBank登记号EGV93351(CHO-K1细胞来源)和UniProtKB/Swiss-Prot登记号P63159(大鼠来源)等中。本发明的抗体与存在于HMGB1蛋白的C末端结构域的氨基酸序列((EEEDDDDE(序列号60))特异性结合。不仅在人来源HMGB1中，而且在上述牛胸腺来源、CHO来源和大鼠来源HMGB1的C末端，也存在与序列号60完全相同的氨基酸序列。
2)HMGB1相关疾病
HMGB1最初被认为具有染色质结构的维持功能、转录活性调节功能、DNA修复功能等，但特别是在1999年以后作为败血症中的迟发型炎症介质被重新发现之后，陆续发现其在各种疾病的炎症性细胞因子级联反应中担负重要的作用。HMGB1参与的炎症性细胞因子级联反应成为包括炎症和凋亡在内的多种障碍的有害特性的原因之一，认为其参与如下所述的HMGB1相关疾病(HMGB1-related disease)。虽然并非全部，但例如特别为：(i)在属于炎症性疾病和自身免疫疾病的病症中，有风湿性关节炎/血清反应阴性关节症、变形性关节炎、炎症性肠疾病、克罗恩病、肠梗阻、***性红斑狼疮、虹膜炎/葡萄膜炎、视神经炎、特发性肺纤维化、全身性血管炎/韦格纳肉芽肿、结节病、***/输精管切除术、全身性硬化症和硬皮病。(ii)在全身性炎症反应综合征中，有败血症综合征(包括革兰氏阳性菌败血症、革兰氏阴性菌败血症、培养阴性败血症、真菌性败血症、发热性中性粒细胞减少、尿路败血症、败血症结膜炎)、脑膜炎菌血症、外伤性出血、口吃、电离放射线暴露、急性和慢性***炎、急性和慢性胰腺炎、阑尾炎、消化道、胃和十二指肠溃疡、腹膜炎、溃疡性、伪膜性、急性和缺血性结肠炎、憩室炎、弛缓不能、胆管炎、胆囊炎、肠炎、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。(iii)在再灌注损伤中，有泵衰竭后综合征和缺血再灌注损伤。在心血管疾病中，有心源性晕厥综合征、心肌梗塞和缺血、动脉粥样硬化、静脉血栓症、心内膜炎、心膜炎、充血性心力衰竭和再狭窄。(iv)在产科和妇科疾病中，有早产、子宫内膜异位症、流产、***炎和***症。(v)在感染性疾病中，有HIV感染/HIV周围神经病变、脑膜炎、乙型和丙型肝炎、单纯疱疹病毒感染、败血症性关节炎、腹膜炎、大肠杆菌0157:H7、肺炎会厌炎、溶血性***综合征/血栓性血小板减少性紫癜、念珠菌病、丝虫病、阿米巴病、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、毒素性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、人型结核杆菌、细胞内鸟型结核杆菌、卡氏肺孢子虫肺炎、骨盆内炎症性疾病、***/***、军团菌病、莱姆病、甲型流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、病毒相关性噬血细胞综合征、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎。(vi)在过敏性和特应性疾病中，有哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、花粉症、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性肺炎。(vii)在恶性肿瘤(液态和固体肿瘤的病症)中，有ALL、AML、CML、CLL、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、卡波氏肉瘤、结直肠癌、鼻咽癌、恶性组织细胞病和副肿瘤综合征/恶性高钙血症。(viii)在移植病中，有器官移植排斥反应和移植物抗宿主病。(ix)在先天性疾病中，有囊性纤维化、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和镰刀形红细胞贫血。(x)在皮肤疾病中，有银屑病、银屑病关节炎和脱发。在神经疾病中，有神经变性疾病(多发性硬化症、偏头痛、头痛、淀粉样蛋白相关病症、朊病毒病/克雅氏病、阿尔海默茨病和帕金森病、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症)和周围神经病、偏头痛、头痛。(xi)在肾疾病中，有肾病综合征、血液透析和***。(xii)在医源性中毒状态中，有OKT3疗法、抗CD3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射线疗法和慢性水杨酸盐中毒。(xiii)在代谢性或突发性疾病中，有威尔逊氏病、血色素沉积症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病和糖尿病并发症、体重下降、食欲不振、恶病质、肥胖、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺系的评价和原发性胆汁性肝硬化。(xiv)在眼科疾病中，有青光眼、视网膜病和干眼症。(xv)在其他病症的杂集中，有多器官衰竭综合征、肌营养不良症、败血症性脑膜炎、动脉粥样硬化、会厌炎、惠普尔病、哮喘、过敏、过敏性鼻炎、器官坏死、发热、败血症、内毒素休克、高热症、嗜酸性粒细胞肉芽肿、肉芽肿病、结节病、感染流产、尿道炎、肺气肿、鼻炎、肺泡炎、支气管炎、咽炎、上皮屏障功能障碍、尘肺、胸膜炎、鼻窦炎、流感、呼吸道合胞病毒感染、播散性菌血症、包虫病、皮肌炎、烧伤、晒伤、荨麻疹、疣(warst)、风团、血管炎、脉管炎、心肌炎、动脉炎、结节性动脉周围炎、风湿热、脂泻病、脑炎、脑塞栓、格林-巴利综合征、神经炎、神经痛、医源性并发症/末梢神经病变、脊髓损伤、麻痹、葡萄膜炎、关节炎、关节痛、骨髓炎、肌膜炎、佩吉特氏病、痛风、牙周病、滑膜炎、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、白塞氏综合征、强直性脊椎炎、伯格氏病、莱特尔综合征、大疱性皮炎(大疱性类天疱疮)、类天疱疮和寻常性天疱疮和脱发。
近年来已阐明，HMGB1不仅局限于细胞的核内，而且伴随巨噬细胞、各种免疫***细胞的活化从核内向细胞质转移并向HMGB1细胞外释放(主动释放)，或者，伴随由缺血、损伤引起的细胞的坏死，局限于核内的HMGB1被迅速释放(被动释放)。即，认为这些HMGB1参与的疾病(HMGB1相关疾病：HMGB1-related disease)大致分为两类。一类为败血症休克这样与由微生物感染引起的免疫应答类似的疾病组，此时，伴随免疫细胞的活化，在炎症反应的后期观察到HMGB1的细胞外分泌。另一类为脑梗塞这样起因于由非微生物性原因(例如，缺血、外伤等)引起的细胞损伤等的疾病组，伴随细胞损伤，观察到迅速的HMGB1的细胞外释放，由此产生各种细胞因子类。在前者的情况下，例如为从因感染而活化的单核细胞、巨噬细胞等的主动的HMGB1的分泌，作为后期的炎症介质起作用。作为相关疾病，可以列举败血症、关节炎、动脉粥样硬化、各种感染症和各种免疫疾病等。后者为如下情况：伴有由缺血、外伤引起的细胞坏死，在此之前存在于核中的HMGB1在数小时以内被迅速释放到细胞外(被动释放)，作为早期的炎症介质诱导各种炎症性细胞因子的产生，作为相关疾病，可以列举脑梗塞、外伤性脑损伤、由器官移植时的缺血引起的疾病、心肌梗塞等。
3)抗体
本说明书中使用的“抗体”这一术语是指，由4条多肽链、即2条重(H)链和2条轻(L)链通过二硫键相互结合而成的分子构成的免疫球蛋白分子。本发明中的单克隆抗体也由包含重链(H链)和轻链(L链)各2条的免疫球蛋白分子构成。各H链由H链可变区(有时称为“HCVR”或“VH”)和H链恒定区(H链恒定区由3个结构域构成，有时将其分别称为“CH1”、“CH2”、“CH3”(统称为CH))构成。各L链由L链可变区(有时称为“LCVR”或“VL”)和L链恒定区(L链恒定区由1个结构域构成，有时称为“CL”)构成，将到各恒定区(也称为不变区)起始之前的部分称为可变区(或者可变区)。
重链根据恒定区的差异分为γ链、μ链、α链、δ链、ε链，根据该差异分别形成IgG、IgM、IgA、IgD、IgE这5个种类的类别(同种型)的免疫球蛋白。此外，在人的情况下，IgG存在IgG1～IgG4这4个亚类。另一方面，根据轻链恒定区的的差异，分为κ链、λ链。
另一方面，VH和VL在与抗体的结合特异性相关的方面是重要的。抗体主要通过VH和VL的氨基酸残基与靶抗原相互作用，因此，与位于可变区外的序列相比，可变区内的氨基酸序列在各抗体间的差异更大。此外，VH和VL也可以进一步细分为在各种抗体间保持更为恒定的被称为框架区(FR：framework region)的区域和被称为互补决定区(CDR：complementarity determining region)的超可变性区域。VH和VL各自由3个CDR和4个FR构成，它们按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序从氨基末端排列至羧基末端(参考图3和6)。
另外，FR4在H链可变区的情况下也称为D/J区，在L链可变区的情况下也称为J区。氨基酸在各区域的分配原则上按照Kabat的定义(参考http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)来进行。
另外，虽然也有本说明书中关于这些抗体的生殖细胞系列(种系)来源的序列的记载，但这些生殖细胞系列来源序列的区分(家族：family)和基因编号的表示主要以VBASE2(http://www.vbase2.org/vbase2.php)中记载的“VBASE2ID”的表示为基准。具体而言，例如，关于轻链中的λ(lambda)链的可变区序列的家族，以IGLV1、IGLV2或IGLV3等来表示，关于这些基因的“VBASE2ID”编号，以humIGLV104(＝IGLV3-1*01)和humIGLV079(＝IGLV3-25*02)来表示。另外，关于λ链的J片段(segment)的家族，以JL1、JL2或JL3等来表示。另外，关于重链的可变区的家族，以IGHV1、IGHV2、IGHV3或IGHV4等来表示，它们的基因编号的表示原则上以VBASE2(http://www.vbase2.org/vbase2.php)中记载的“VBASE2ID”的表示为基准，以humIGVH048(＝IGHV3-73*01)、humIGHV240(＝IGHV3-72)和humIGHV025(＝IGHVH-15)来表示。另外，关于H链的J片段的家族，以JH1、JH2、JH3或JH4等来表示。
4)抗体的“抗原结合性片段”(或者仅称为“抗体片段”)
本说明书中使用的抗体的“抗原结合性片段”(或者仅称为“抗体片段”)这一术语是指，具有与抗原(HMGB1蛋白)特异性结合的能力的1个或多个抗体的片段(例如VH)。需要说明的是，该片段也包括具有与抗原特异性结合的最低限度的氨基酸序列的肽。作为抗体的“抗原结合性片段”这一术语中包含的结合部分的例子，可以列举(i)Fab片段、(ii)F(ab’)2片段、(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段、(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段、(v)由VH结构域构成的dAb片段(Nature 341:544-546,1989)、(vi)具有足以进行特异性结合的框架的分离的互补决定区、(vii)双特异性抗体、以及(viii)多特异性抗体等。需要说明的是，本说明书中，在未特别区分而称为“抗体”的情况下，不仅包含全长的抗体，也包含这些“抗原结合性片段”。
这些抗体为与哺乳类HMGB1特异性结合的抗体，能够与该HMGB1的表位部位或HMGB1片段等结合。本说明书中，“抗HMGB1抗体”、“能够中和HMGB1的抗体”、“抗HMGB1蛋白抗体”、“与HMGB1的片段特异性结合的抗体”或“能够中和HMGB1的生物活性的抗体”都是指通过与HMGB1结合而抑制HMGB1的生物活性的抗体。
5)与HMGB1蛋白结合的抗体或其人源化抗体
本发明的抗体为与哺乳类HMGB1特异性结合的抗体，特别地，与存在于该HMGB1蛋白的C末端结构域的氨基酸序列(EEEDDDDE(序列号60))特异性结合。本说明书中，“抗HMGB1抗体”、“能够中和HMGB1的抗体”、“抗HMGB1蛋白抗体”、“与HMGB1的片段特异性结合的抗体”或“能够中和HMGB1的生物活性的抗体”都是指通过与HMGB1的上述表位部位结合而抑制HMGB1的生物活性的抗体。如前所述，HMGB1的C末端氨基酸序列(序列号60)在哺乳动物间也非常高度地保守，在获取针对人HMGB1的上述表位的抗体时，不一定要使用人来源的HMGB1，也可以使用大鼠来源、CHO来源或牛胸腺来源的HMGB1蛋白。
需要说明的是，本发明中的抗HMGB1的人源化抗体为以上述啮齿类来源抗HMGB1抗体为供体、原则上将CDR移植到人来源FR中而得到的抗体，是指在FR序列的一部分中含有啮齿类来源的氨基酸残基，具有与原来的啮齿类来源抗体或其嵌合抗体同等以上的HMGB1结合活性或中和活性的全长抗体或其抗原结合性片段。基于本专利申请中公开的表示可变区的氨基酸序列、互补决定区(CDR)的氨基酸序列，利用本技术领域中公知的技术，容易得到与HMGB1蛋白特异性结合且具有更高的结合活性的人源化抗体、或者免疫原性更低的人源化抗体、或其抗原结合性片段，这些人源化抗体包括在本发明的技术范围内。
6)嵌合抗体和人源化抗体
“嵌合抗体”这一术语是指，其L和H链基因典型地由属于不同种属的免疫球蛋白基因通过基因工程方法构建而成的抗体。典型地为将小鼠单克隆抗体来源的可变区部位与人来源的IgG1或IgG4的恒定区部位结合而成的抗体。通过基因工程的方法进行改造来获取嵌合抗体的典型方法的详细内容公开在US483457(Genentech专利)等中。“人源化抗体”这一术语是指，含有包含实质上来自人抗体链(称为受体免疫球蛋白或抗体)的可变区框架残基和实质上来自小鼠抗体(也称为供体免疫球蛋白或抗体)的最少1个互补决定区的最少1条链的抗体。典型地为将嵌合抗体进一步改造成包含FR序列在内接近人序列的结构从而使非人来源抗体在人体内的免疫原性降低的方法，代表性的改造方法公开在EP0239400；MRC专利、WO90/07861；Protein Design Labs专利或EP0626390；Celltech专利)等中。在进行人源化、即向人可变区的FR中***小鼠CDR时，需要提高保持正确的空间定位(spacialorientation)的可能性。为了实现这一点，所使用的人抗体的可变区的FR的序列通过如下方法获得：从与供体可变区的FR序列具有高度的序列同一性的人抗体获得FR序列。此时，作为所使用的人抗体序列，有使用天然存在的人抗体的序列的情况、或者使用人抗体的共有序列或生殖细胞系列(种系)来源序列等的情况等。
7)等效物
在本发明的抗体的氨基酸序列中缺失、取代、***、添加1个或数个氨基酸残基、或者发生了上述任意2种以上的组合的突变、且保持了原抗体的活性(例如：对抗原的结合能力)的物质与本发明为等效物。这种情况下，可以在同一序列中的任意的1个或多个氨基酸序列中的位置具有1个或数个氨基酸残基的缺失、取代、***或添加，也可以同时发生缺失、取代、***和添加中的2种以上突变。
构成自然界的蛋白质的氨基酸可以根据其侧链的特性来分组，例如，作为具有同样特性的氨基酸组，可以分类为：芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、中性氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有烃链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)、以及其他氨基酸(甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)的组等。
作为将非天然型氨基酸也包括在内的可相互取代的氨基酸残基的例子，还有如下所述的分组法，同一组中所含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
本说明书中，在对抗体序列的某一部位的氨基酸残基进行取代的情况下，例如使用“ANB”的文字来表示。此时，“N”为该取代部位的编号(用Kabat编号法来表示)，“A”为将取代前的氨基酸残基用1个字母来表示，“B”为将取代后的氨基酸残基用1个字母来表示。
氨基酸序列、碱基序列的同一性可以使用Karlin和Altschul的算法BLAST(PNAS,1990(vol.87)p2264；PNAS,1993(vol.90)p5873)来确定。已开发了基于BLAST算法的称为BLASTN、BLASTX的程序(J MolBiol,1990(vol.215)p403)。在使用BLASTN对碱基序列进行分析的情况下，参数例如设定为分数(score)＝100、字长(wordlength)＝12。另外，在使用BLASTX对氨基酸序列进行分析的情况下，参数例如设定为分数(score)＝50、字长(wordlength)＝3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。或者，在求取蛋白质的氨基酸序列的同一性时，也可以将所比较的2种蛋白质的氨基酸序列并排，通过目视计数作为相同的氨基酸残基的部分的数量，通过“(相同的氨基酸残基数/蛋白质全长的氨基酸残基数)×100(％)”求出蛋白质的氨基酸序列的同一性。
2.本发明中抗体产生杂交瘤的制作方法
为了使用上述HMGB1抗原蛋白质来制作本发明中使用的大鼠来源的单克隆抗体产生杂交瘤，使用该抗原对大鼠进行免疫，从该动物采集淋巴细胞，按照常规方法使其与骨髓瘤细胞融合而获取杂交瘤，由此能够得到产生大鼠抗HMGB1单克隆抗体的杂交瘤。
即，首先，例如，使用牛胸腺来源HMGB1与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂的混合物作为免疫原对大鼠进行免疫。免疫时的免疫原的给药方法可以为皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌肉内注射中的任意一种，但优选皮下注射或腹腔内注射。免疫可以进行1次或者以适当的间隔进行多次，优选以1周至5周的间隔进行多次。接着，按照常规方法从免疫后的动物采集***，使从其中以无菌方式得到的***细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过ELISA法等确认对HMGB1的结合性，反复进行目标抗体产生杂交瘤的克隆操作，由此能够得到单克隆的抗体产生细胞。
3.获取本发明的大鼠抗体的基因的步骤
按照常规方法从产生大鼠抗体的杂交瘤细胞中纯化总RNA，接着合成cDNA。由所得到的cDNA使用各自的引物进行PCR来扩增全长的H链和L链的抗体基因，由此获取各自的基因片段。将这些基因片段连接到真核细胞表达用载体中，由此能够克隆该抗体的基因。对于这些抗体的H链和L链的氨基酸序列，利用ABI测序仪确认编码上述氨基酸序列的质粒载体的碱基序列，基于此，能够确定该抗体的氨基酸序列。
4.人源化抗体的获取方法
以下，记述从啮齿类抗体制作人源化抗体的情况的一例。以下记载的方法为人源化的原则上的方法，当然也可以为该方法的变法。例如，首先，按照“Kabat等的定义”和/或“Chothia的定义”确定大鼠抗体的可变区中的互补决定区(CDR)的氨基酸。将该大鼠抗体的CDR序列移植到作为受体的人抗体FR中，设计具有大鼠抗体的CDR和人抗体的FR的可变区氨基酸序列。设计编码该可变区氨基酸序列的DNA的碱基序列，利用PCR法和基因重组技术制作具有所设计的核酸序列的可变基因片段。然后，将该可变区基因与人抗体的适当类别的恒定区基因、优选IgG类的抗体的恒定区基因连接，制作人源化抗体基因。接着，将该人源化抗体基因连接到适当的表达载体中，并导入培养细胞中。最后，对该培养细胞进行培养，从培养上清中能够得到人源化抗体。
上述人源化抗体的制作方法中，大鼠抗体的可变区基因中的互补决定区基因可以从基于上述的“Kabat的定义”的互补决定区的范围内确定。但是，本说明书中，仅对于H链的CDR1，将同时符合“Kabat的定义”和“Chothia的定义”这两种定义的区域作为CDR1来处理。另外，可变区的氨基酸残基的位置表示按照Kabat的编号法(参考http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum和http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)来表示。
另一方面，作为成为模板的人抗体的框架区基因，例如从人抗体或人抗体的种系、人抗体种系的共有序列等中选择与上述大鼠抗体的框架区的氨基酸序列的同源性高的序列，通过常规方法制作编码该氨基酸序列的碱基序列，并使用该碱基序列即可。
将上述的大鼠抗体的互补决定区基因与作为模板的人抗体的框架区基因连接，进而，将该基因片段与人抗体的恒定区基因连接，制作人源化抗体基因(以下仅称为“人源化抗体基因”)。
需要说明的是，一般而言，在仅取代了互补决定区的氨基酸而得到的人源化抗体的情况下，抗原结合活性大多比原来的大鼠抗体大幅降低。因此，多采用将供体的大鼠的抗体和互补决定区周围的若干个氨基酸合并移植等方法。上述的人源化抗体具有与原大鼠抗体同等或更高的抗原结合活性，并且与大鼠抗体相比消除了引起抗原性、半衰期缩短等问题。但是，关于用于获取具有与原来的大鼠抗体同等以上的结合活性或中和活性等的人源化抗体的氨基酸取代，没有定律，要求进行多次的反复尝试。
5.本发明的人源化抗体或其抗原结合性片段
本发明在一个实施方式中提供与HMGB1特异性结合且能够中和HMGB1的生物活性的人源化抗体或其抗原结合性片段(以下称为本发明的抗体)。如本发明中所示，示出了大鼠抗HMGB1抗体(#10-22)、其嵌合抗体及其人源化抗体的氨基酸序列的序列号、以及作为人FR序列的参考的人抗体序列或者人生殖细胞系列(种系)来源氨基酸序列的序列号(表1、2和3)。
作为本发明的人源化抗体或其抗原结合性片段，包括包含表3中序列号所示的EV007156的全长、可变区或框架区的氨基酸序列的人源化抗体及其抗原结合性片段、以及包含与这些氨基酸序列等效的氨基酸序列的人源化抗体及其抗原结合性片段。
[表1]
(表1)大鼠#10-22抗体相关的氨基酸序列的序列编号
[表2]
(表2)人来源可变区的氨基酸序列等的序列编号
[表3]
(表3)嵌合抗体、Human_VH、VL和人源化抗体(EV007156)的氨基酸序列编号
考察GenGank等中登记的IGLV3-家族的L链可变区时，可以发现多数情况下报道了其N末端以“S”起始，但在IGLV3-家族的序列中，在选择3j的氨基酸序列(MAWTALLLSLLAHFTGSVA)或3r的氨基酸序列(MAWIPLFLGVLAYCTGSVA)作为信号序列的情况下，有时也在2位的“Y”的前面被切断，因此，本发明中，作为人源化的模板的人FR序列(序列号25～28；图3中表示为Human_VL)，选择了1位的“Y”被切断后的序列。
本发明的优选的抗体或抗原结合性片段例如为如下的人源化抗体或其抗原结合性片段的情况：轻链的可变区含有(a)包含序列号7的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、(b)包含序列号8的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列和(c)包含序列号9的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列、以及轻链的可变区含有(a)包含序列号10的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、(b)包含序列号11的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列和(c)包含序列号12的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。但是，只要是与存在于HMGB1的C末端结构域的序列号60所示的氨基酸序列(EEEDDDDE)特异性结合且能够中和其生物活性的单克隆抗体，则不需要仅限定于上述CDR序列的组合，可以是在序列号7～12这6个CDR序列中具有1个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、***、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列。如果考虑到本发明为人源化抗体，则作为本发明的更优选的方式，当然优选6个CDR序列以及至少H链的49位和94位及L链的44位和46位这4个位置的氨基酸残基为大鼠来源，但除此以外的部分的FR的氨基酸序列为人来源序列。
将本申请发明中L链可变区的人FR序列(human_VL；序列号25～28(依次为FR1、FR2、FR3和FR4的序列))部分与人λ(lamda)链生殖细胞系列的LV3家族来源的序列进行比较时，相当于FR1、2和3的部分与人λ(lamda)链IGHLV3家族生殖细胞系列的humIGLV104(＝IGLV3-1*01)、humIGLV034(＝IGLV3-25*03)、humIGLV079(＝IGLV3-25*02)、humIGLV135、humIGLV094(＝IGLV3-10*01)和humIGLV077(＝IGLV3-27*01)(基因编号由“VBASE2ID”表示)的同一性高，仅有几个残基(少于10个)的差异。另外，IGLV3的共有序列(例如，参考WO2011/080350)中，与上述Human_VL也仅有几个氨基酸残基的差异。另一方面，相当于人FR序列的FR4的部分(序列号28)的氨基酸序列与人λ(lamda)链生殖细胞系列J片段的JL2(序列号22；GenBank登记号M15641)、JL3(VVFGGGTKLTVL)和JL7(AVFGGGTQLTVL)的氨基酸序列一致。关于本申请说明书中的H链可变区的人FR序列(序列号35～38；图6中表示为Human_VH)，与人H链生殖细胞系列的IGHV3家族来源的序列进行比较时，相当于FR1、2和3的部分的序列与humIGHV048(＝HV3-73*1；GenBank登记号L15467)和IGHV3-73*2(GenBank登记号AM940224)100％一致。此外，在IGHV3家族内考察与humIGHV048的同一性高的序列时，可以列举humIGHV025、humIGHV178、humIGHV215和humIGHV240(均为VBASE2ID)，与humIGHV048所编码的氨基酸序列仅在5个位置以下的氨基酸残基观察到差异，在IGHV3家族内存在多个具有高同一性的生殖细胞系列的序列。IGHV3的共有序列(例如，参考WO2011/080350)与上述Human_VH也仅有几个氨基酸残基的差异。另外，关于Human_VL中的FR4部分的序列(WGQGTLVTVSS)，与人H链生殖细胞系列J片段的JH1、JH4和JH5一致(参考GenBank登记号J00256)。
鉴于上述情况，作为本发明的更优选的方式，只要是与存在于HMGB1、优选存在于HMGB1的C末端结构域的序列号60所示的氨基酸序列(EEEDDDDE)特异性结合且能够中和其生物活性的单克隆抗体或其抗原结合性片段，则下述的人源化抗体或其抗原结合性片段也包含在本发明中：(i)在重链可变区(VH)中，含有序列号7、8和9的氨基酸序列作为CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，含有序列号43、44、45和46的氨基酸序列作为FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号43、44、45和46的氨基酸序列中具有1个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变；
(ii)在轻链可变区(VL)中，含有序列号10、11和12的氨基酸序列作为CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列，含有序列号47、48、49和50的氨基酸序列作为FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号47、48、49和50的氨基酸序列中具有1个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变。上述的FR序列中，在H链的情况下，进一步优选至少49位和94位这2个位置的氨基酸残基为大鼠抗体#10-22来源的氨基酸残基的序列，在L链的情况下，进一步优选至少44位和46位这2个位置的氨基酸残基为大鼠抗体#10-22来源的序列的序列。进而，最优选为分别含有包含序列号33的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含序列号34的氨基酸序列的轻链可变区(VL)中所含的FR序列的人源化抗体或其抗原结合性片段。这种情况下，只要是与存在于HMGB1的C末端结构域的序列号60所示的氨基酸序列(EEEDDDDE)特异性结合且能够中和其生物活性的单克隆抗体，则含有包含与序列号33的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与序列号34的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的人源化抗体或其抗原结合性片段也包含在本发明中。
另外，作为本申请发明的人源化抗体，优选的类别(亚类)为IgG1(λ)和IgG2(λ)等，但IgG3(λ)和IgG4(λ)也包含在本发明中。
6.编码本发明的抗体等的核酸
根据本发明的另一个实施方式，下述核酸以及与该核酸具有高同一性的分离的核酸也包含在本发明中：该核酸为编码与存在于HMGB1、优选存在于HMGB1的C末端结构域的序列号60所示的氨基酸序列(EEEDDDDE)特异性结合且能够中和其生物活性的人源化抗体或其抗原结合性片段的核酸(核苷酸)，其编码序列号7～9的组、10～12的组、39、40、41或42中的任意一个氨基酸序列。在此，“具有高同一性”是指能够在高严格条件下与预定的核酸序列杂交的程度的序列同一性，例如是指具有60％、70％、80％、90％、或95％或更高的同一性。提供从在高严格条件下杂交的核酸中选择出来的分离的核酸。上述核酸优选为DNA或RNA，更优选为DNA。
“在高严格条件下”例如为5×SSC、5×邓哈特(Denhardt’s)溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件(例如，参考J.Sambrook等的Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南),第二版,冷泉港实验室出版社(1989),特别是11.45节“Conditions forHybridization of Oligonucleotide Probes(寡核苷酸探针的杂交条件)”)。在这些条件下，越提高温度，越可以期待高效地得到具有高同一性的多核苷酸(例如，DNA)。其中，作为影响杂交的严格度的要素，考虑有温度、探针浓度、探针的长度、离子强度、时间、盐浓度等多个要素，本领域技术人员可以通过对这些要素进行适当选择来实现同样的严格度。
作为上述在高严格条件下杂交的核酸，包含与编码氨基酸序列的核酸具有例如70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或者99％以上的同一性的核酸。
碱基序列的同一性可以利用上述的同一性检索算法等来确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)。
需要说明的是，本发明中，作为人源化抗HMGB1抗体，优选的核酸为编码序列号39或41的氨基酸序列中的任意一个序列的分离出的基因、或者编码序列号40或42的氨基酸序列中的任意一个序列的分离出的基因、或者在高严格条件下与这些核酸(DNA)中的任意一种杂交的分离的核酸。进而，作为更优选的核酸，为同时编码序列号41和42的氨基酸序列的分离的核酸(DNA)，作为最优选的核酸之一，为同时编码序列号39和序列号40的氨基酸序列的分离的核酸。
7.本发明的载体、宿主细胞和抗体的制作方法
本发明还涉及整合有上述核酸的载体和导入有该载体的宿主细胞、以及使用该载体和该宿主细胞的抗体的制作方法。
本发明的抗体也可以作为使用公知的方法得到的重组人抗体来制作(参考Nature,312:643,1984、Nature,321:522,1986等)。例如，本发明的抗体可以通过如下方法来制作：对导入有本发明的载体的宿主细胞进行培养，从培养上清等中纯化所产生的抗体。更具体而言，可以通过如下方法来制作：将编码VH和VL的cDNA分别***到含有由同一细胞或不同的人细胞制作的编码人抗体CH和/或人抗体CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人抗体表达载体，导入动物细胞中使其进行表达。
作为用于整合编码本发明的抗体的VH或VL的核酸的载体，不一定是限定的，优选在蛋白质基因等的表达中通用、特别适合于抗体基因的表达的载体或高表达用载体。作为优选的例子，可以列举含有EF启动子和/或CMV增强子的载体。另外，通常分别制作整合有编码VH或VL的核酸的表达载体并将其共转染到宿主细胞中，但也可以整合到单一的表达载体中。
作为用于导入表达载体的宿主细胞，不一定是限定的，优选在蛋白质基因等的表达中通用、特别适合于抗体基因的表达的细胞。例如，可以列举细菌(大肠杆菌等)、放线菌、酵母、昆虫细胞(SF9等)、哺乳类细胞(COS-1、CHO、骨髓瘤细胞、YB2/0细胞等)。
为了在工业上生产重组抗体，一般利用稳定地高产该抗体的重组动物细胞株、例如CHO细胞株。这种重组细胞株的制作、克隆化、用于高表达的基因扩增和筛选可以使用公知的方法(例如，参考Omasa T.:J.Biosci.Bioeng.,94,600-605,2002等)。
本发明除了包含由2条重链和2条轻链构成的抗体以外，还包含本发明的抗体的抗原结合性片段。作为抗原结合性片段，例如有Fab(fragment of antigen binding，抗体结合片段)、Fab’、F(ab’)2，作为将抗体的活性片段用接头等结合而成的片段，例如有单链抗体(single chainFv：scFv)、二硫键稳定化抗体(disulfide stabilized Fv：dsFv)，作为含有抗体的活性片段的肽，例如可以列举含有CDR的肽。这些片段可以通过将本发明的抗体用适当的蛋白分解酶进行处理的方法或者基因重组技术等公知的方法来制造。
抗体的纯化可以使用盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法或亲和层析法等公知的纯化手段来进行。具体而言，为了纯化抗HMGB1抗体，可以使筛选出的细胞在培养皿、转瓶、2升的旋转烧瓶或其他培养体系中增殖。将所得到的培养上清过滤、浓缩后，供于利用蛋白A或蛋白G-琼脂糖(GE Healthcare公司)等的亲和层析，能够对该蛋白质进行纯化。将缓冲液更换为PBS，通过OD280或优选通过浊度仪分析，能够判定浓度。同种型可以通过对同种型抗原具有特异性的方法来考察。这样得到的人源化抗HMGB1抗体与大鼠抗体相比，可以期待对抗体的免疫原性低。
可以通过近年来开发的抗体的糖链部分的修饰、恒定区的修饰、取代来获得对效应活性进行了修饰的抗体等，这样得到的人源化抗体也属于本发明的技术范围。另外，若是应用为了对该抗体附加耐蛋白酶能力、使抗体能够口服给药而进行的Fc片段的部分取代技术(参考WO2006/071877)而得到的抗体或其抗原结合性片段，则也属于本发明的技术范围内。
8.含有本发明的抗体的药物组合物
接下来，本发明提供含有上述抗体或其抗原结合部分以及药学上可容许的载体的、用于治疗或预防HMGB1相关疾病的药物组合物。
特别地，本发明的人源化抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段与HMGB1特异性结合且具有中和HMGB1的生物活性的高活性，因此，作为HMGB1相关的疾病的预防或治疗药有用。本说明书中使用的“作为药品可容许的载体”包括生理学上可适合的任意的或全部的溶剂、分散介质、包衣剂、等渗剂和吸收延缓剂等。作为药品可容许的载体的例子包括水、盐类溶液、磷酸缓冲生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的1种或多种、以及它们的组合。在以注射剂等的形式使用的情况下，优选在组合物中含有pH调节剂、等渗剂，例如糖、甘露醇、山梨醇等多元醇或氯化钠。作为药品可容许的载体中可以进一步含有润湿剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂等增强抗体或抗体部分的保存性或有效性的少量的辅助物质。
本发明的组合物可以制成各种剂型。这样的组合物包括例如溶液(例如可注射、可输液的溶液)或分散液、悬浊液、片剂、胶囊、含片、丸剂、粉末、脂质体、栓剂等液体、半固体、固体的剂型。优选的形式根据所需的给药方式和治疗的适用例而不同。一般而言，优选的组合物为与用于使用其他抗体对人进行被动免疫的组合物同样的组合物等可注射或可输液的溶液的形式的组合物。优选的给药方式为非口服方式(例如经由静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内)。在优选的实施方式中，抗体通过静脉输液或静脉注射来给药。在另一优选的实施方式中，抗体通过肌肉内注射或皮下注射来给药。
本发明的抗体和抗体片段可以掺入到适合于非口服给药的药品组合物中。抗体或抗体部分在使用单一种类的情况下，优选制备成含有0.1～250mg/mL的抗体的可注射的制剂。另一方面，在混合使用多个种类的抗体的情况下，优选制备成含有0.001～100mg/mL的抗体的可注射的制剂。需要说明的是，该多个种类的抗体的混合比例可以适当设定。
可注射的制剂可以通过将有效成分溶解于液体而成的制剂或者将有效成分冷冻干燥而成的制剂装入透明玻璃瓶、棕色玻璃瓶、安瓿瓶或预充式注射器而构成。缓冲剂可以使用pH5.0～7.0(最佳的情况下为pH6.0)的L-组氨酸(1～50mM)、最佳的情况下为5～10mM的L-组氨酸。其他适当的缓冲剂包括琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾，但不限于这些。为了改变浓度为0～300mM的溶液(就液体剂型而言，最佳的情况下为150mM)的渗透压，可以使用氯化钠。冷冻干燥的剂型中可以含有冷冻保护物质，主要为0～10％(最佳的情况下为0.5～5.0％)的蔗糖。其他适当的冷冻保护物质包括甘露醇、海藻糖和乳糖。冷冻干燥的剂型中可以含有增量剂，主要为1～10％的甘露醇(最佳的情况下为2～4％)。液体和冷冻干燥的剂型这两者中可以使用稳定剂，主要为1～50mM(最佳的情况下为5～10mM)的L-蛋氨酸。其他适当的稳定剂包括甘氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80等，在聚山梨醇酯80的情况下，可以含有0～0.05％(最佳的情况下为0.005～0.01％)。其他表面活性剂包括聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂，但不限于这些。
本药物组合物通常在制造和储存的条件下必须无菌或稳定。该组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌的可注射的溶液可以通过将所需量的活性化合物(即，抗体或抗体部分)根据需要与上述成分中的1种或组合一同混合到适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备。通常，将活性化合物混合到含有基本的分散介质和选自上述列举的成分中的必要的其他成分的无菌载体(vehicle)中，由此制备分散液。在用于制备无菌的可注射的溶液的无菌粉末制剂的情况下，优选的制备方法为如前所述的该灭菌过滤溶液的冷冻真空干燥和喷雾干燥，由此，得到除了活性成分的粉末以外还含有任意的其他期望成分的组合物。溶液的适当的流动性例如可以通过如下方法来维持：使用卵磷脂等的包衣；另外，在分散液的情况下，维持所需的粒度；另外，使用表面活性剂。可注射的组合物的长时间的吸收可以通过在该组合物中含有延缓吸收的药剂例如单硬脂酸盐、明胶来进行。
9.评价在体外的活性的步骤
抗体或抗体组合物的生物学特性可以通过试验该抗体在体外抑制HMGB1的生物活性的能力来评价。抗体的体外评价包括ELISA等结合分析法和中和分析法等。
1)结合活性
在此，“特异性结合”或“特异性的结合”是指识别预定的抗原并与其结合。测定抗体与HMGB1的结合亲和性可以使用公知的方法。例如，可以使用固定化于芯片上的F蛋白，通过Biacore T200(注册商标)这样的蛋白质相互作用分析装置来测定。结合亲和性(KD值)用该测定法中得到的Kd(解离常数)与Ka(结合常数)之比(KD＝Kd/Ka)来表示。制作固相化有人来源HMGB1抗原的酶标板，通过ELISA法，也可以考察抗原结合活性的差异。
作为本发明的人源化抗体或其抗原结合性片段的、在250ng/ml下比较对人来源HMGB1蛋白(重组)的结合活性(ELISA法)时具有#10-22嵌合抗体的1.5倍以上、优选2倍以上、最优选2.5倍以上的高活性的人源化抗体或其抗原结合性片段也包含在本发明中。另外，在通过相同的方法与人抗HMBG1抗体G4(WO2007/001422)进行比较时具有G4的5倍以上、优选10倍以上、更优选20倍以上的高活性的人源化抗体或其抗原结合性片段也包含在本发明中。
2)RAGE结合抑制活性
抗HMGB1抗体的RAGE结合抑制活性例如可以使用RAGE-Fc来评价。制作固相化有RAGE-Fc的酶标板，将一定量的HMGB1与各种浓度的抗HMGB1抗体(#10-22、EV007156、G4)混合、孵育，检测与RAGE结合的HMGB1量，由此，可以考察各种抗体抑制HMGB1与RAGE的结合的活性。需要说明的是，在迄今为止报道的人单克隆抗体中，显示G4具有最高的RAGE结合抑制活性(WO2007/001422)。
3)人PBMC中的TNF-α释放抑制活性
抗HMGB1抗体的TNF-α释放抑制活性可以使用人的外周血单个核细胞(PBMC)来评价。从正常人分离PBMC，考察抗HMGB1抗体的添加能否抑制用HMGB1刺激时观察到的TNF-α的释放量。如果考虑到在体外由HMGB1引起的TLR4信号转导***的活化时共存有MD2、CD14等，则可以说该使用人PBMC的体外评价法与单纯地评价抗HMGB1抗体对TLR4分子与HMGB1的结合的抑制效果的方法相比是更有意义的评价***。
10.评价在体内的活性的***
抗HMGB1抗体的体内活性可以使用各种动物模型来评价，作为其1例，有通过计算抗体给药后的存活率来评价对由败血症引起的致死的防御效果的方法。作为小鼠的败血症模型，有CLP法(Cecal ligationand puncture、Lutterloh et.al.)，详见实施例。
本说明书中使用的“中和”、“抑制效果”、“抑制”、“阻抑”、“能够抑制”等术语是指，使由抗原(HMGB1)引起的生物活性降低约5～100％，优选降低10～100％，更优选降低20～100％，更优选降低30～100％，更优选降低40～100％，更优选降低50～100％，更优选降低60～100％，更优选降低70～100％，进一步优选降低80～100％。
将HMGB1蛋白与RAGE的结合抑制50％的活性(IC50)分别为20μg/mL(约0.13μM)以下、优选为10μg/mL(约67nM)以下、更优选为5μg/mL(约33nM)、最优选为4.05μg/mL(约27nM)以下的人源化抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。另外，抗体在2μg/ml的浓度下对HMGB1蛋白与RAGE的结合的抑制率(％)为40％以上的人源化抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。
将人PBMC中的由HMGB1蛋白引起的TNF-α释放抑制50％的活性(IC50)为0.05μg/mL(约0.33nM)以下、优选为0.02μg/mL(约0.13nM)以下、最优选为0.016μg/mL(约0.11nM)以下的人源化抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。另外，添加0.01μg/ml的抗体时TNF-α释放抑制效果为30％以上、优选为40％以上、最优选为42.0％以上的人源化抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。
以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的任何限制。本实施例中使用的程序若非特别提及，则可以参考Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)(Sambrook等,冷泉港实验室出版社,2001)。
实施例
实施例1抗HMGB1大鼠单克隆抗体的制备
本专利申请中使用的产生抗HMGB1抗原的大鼠抗体#10-22的杂交瘤细胞的获取方法，公开在(WO2007/049468、US2009/0252739和FASEB J,2007(21)p3904等)中，以下记述其要点。
(a)大鼠的免疫
将市售的牛胸腺来源HMGB1与HMGB2的混合物(和光纯药工业公司制造，编号：080-070741)与完全弗氏佐剂一同给药于大鼠的后肢足底，在2周后确认抗体效价的升高，接着，在5周后从肿大的髂骨***在无菌条件下取出***细胞。
(b)细胞融合和抗HMGB1抗体产生细胞的克隆
使用聚乙二醇使上述髂骨***细胞与小鼠骨髓瘤SP2/O-Ag14(SP2)细胞融合，将所得到的融合细胞在96孔微孔板中培养，经过利用ELISA的一次筛选和利用蛋白免疫印迹的二次筛选，克隆出抗HMGB1抗体产生细胞。
实施例2抗体基因的克隆
(a)抗体基因克隆
使用QIAamp RNA血液小量提取试剂盒(QIAGEN)从产生#10-22的杂交瘤细胞中纯化总RNA，接着，使用Cells-to-cDNA II(Ambion)合成cDNA。进而，使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，cDNA末端快速扩增)-PCR法，由所得到的cDNA使用各自的引物进行PCR来扩增全长的H链和L链的抗体基因。将扩增得到的#10-22抗体的H链、L链的基因片段克隆到真核细胞表达用载体中。
(b)克隆得到的#10-22的抗原结合性确认
将编码H链、L链的质粒同时导入CHO-K1细胞中。基因导入使用Lipofectamine LTX和plus试剂(Invitrogen)。2天后回收培养上清，与固相化于酶标板(Nunc，Maxisorp)上的牛胸腺来源的HMGB1(Shino-Test，#326059683，100ng/孔)在室温下反应1小时。接着，与HRP标记抗大鼠IgG抗体(DAKO，P0450)在室温下反应1小时。添加TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺；SureBlue，KPL，#52-00-03)，通过450nm的吸光度确认了培养上清中的抗体与HMGB1结合(图1)。
(c)基于碱基序列的#10-22的氨基酸序列的确定
利用ABI测序仪确认#10-22的H链、L链的碱基序列。通过所得到的碱基序列，确定#10-22的H链、L链的氨基酸序列。将包含信号序列的H链、L链的氨基酸序列示于序列号1和2，将不含信号序列的H链、L链的氨基酸序列示于序列号3和4，将可变区(VH和VL)的氨基酸序列示于序列号5和6。
另外，抗体的互补决定区(CDR)的分析使用“Kabat的定义”(www.bioinf.org.uk:Dr.Andrew C.R.Martin’s Group,Antibodies:GeneralInformation)。其中，关于H链CDR1，设定为由“Kabat的定义”和“Chothia的定义”(http://www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)这两个定义覆盖的序列。将#10-22的H链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列示于序列号7、8和9，将L链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列示于序列号10、11和12。
实施例3嵌合抗体和人源化抗体的制作
(a)#10-22嵌合抗体的制作
为了使大鼠抗体能够作为抗体药物使用，以保持抗体的抗原结合性且减轻免疫原性为目的，利用抗体基因工程制作嵌合抗体和人源化抗体。首先，制作将大鼠抗体的恒定区取代为人来源的氨基酸序列(IgG1(λ))的嵌合抗体。所制作的嵌合抗体的抗原结合性通过与大鼠抗体同样的方法来检测，确认维持了抗原结合性(图2)。将嵌合抗体的H链和L链的氨基酸序列示于序列号13和14。
(b)#10-22嵌合抗体L链的人源化
为了实现人源化，需要保留#10-22嵌合抗体的6个CDR区域(#10-22VL-CDR1/2/3和#10-22VH-CDR1/2/3)，并将大鼠抗体#10-22来源的框架区(FR)重组为人FR(FR1、FR2、FR3和FR4)。首先，使用V-BASE(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)和Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行与#10-22嵌合抗体L链的FR序列的同源性高的候补人FR序列的检索，选择出8种人来源的L链可变区序列(序列号15～24)。使用这些可变区的氨基酸序列和#10-22嵌合抗体的氨基酸序列进行比对，选出未见于人FR序列中的“大鼠氨基酸残基”，确定将这14个位置(5位、11位、14位、15位、17位、19位、41位、42位、44位、46位、59位、60位、76位和77位)全部取代为上述8种人FR序列的共有序列的L链FR的人氨基酸序列(Human_VL；序列号25～28)(图3)。接着，分别制作对大鼠氨基酸残基部位的14个位置逐个进行1个氨基酸残基取代的部位取代嵌合抗体(L链)(I5T、A11V、T14S、L15P、N17Q、V19A、D41G、K42Q、I44P、R46L、S59P、D60E、R76S和D77G)的基因。将所得到的14种#10-22嵌合抗体(L链)的部位取代体基因分别与#10-22嵌合抗体(H链)基因同时导入CHO-K1细胞中。通过使用固相化有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的14种抗体进行定量，使抗体浓度一致后，对抗原结合性进行考察。这些部位取代体中，L链可变区内的I44P和R46L这2种部位取代体的抗原结合性均比嵌合抗体显著降低(图4)。需要说明的是，取代部位的位置表示按照Kabat编号法。
制作编码如下L链的人源化抗体(L链)基因：#10-11嵌合抗体L链中44位、46位和3个CDR序列原样保留大鼠抗体L链可变区来源的氨基酸序列，除此以外的可变区的氨基酸序列全部重组为上述Human_VL的氨基酸序列。将所得到的#10-22人源化抗体(L链)(以下称为EV007156L)基因和#10-22嵌合抗体(H链)基因同时导入CHO-K1细胞中。通过使用固相化有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的抗体进行定量，使抗体浓度一致后，对抗原结合性进行考察。该抗体的抗原结合性与嵌合抗体相比为同等水平或稍见提高(图5)。
(c)#10-22嵌合抗体H链的人源化
与L链同样地进行与#10-22嵌合抗体的H链FR序列的同源性高的候补人FR序列的检索，选择6种人来源的H链序列(序列号29～34)，使用它们的可变区和大鼠抗体#10-22来源H链可变区的氨基酸序列进行比对(图6)。选出未见于人FR序列中的“大鼠氨基酸残基”的15个位置(1位、15位、16位、20位、41位、49位、76位、77位、78位、82a位、82b位、89位、94位、107位和108位)，确定将它们全部取代为上述6种人FR序列的共有序列的H链FR的人氨基酸序列(Human_VH；序列号35～38)(图6)。接着，分别制作对上述嵌合抗体H链将位于FR序列上的非人氨基酸残基部位的15个位置逐个进行1个氨基酸残基取代的部位取代嵌合抗体(H链)(A1E、K15G、E16G、I20L、P41S、A49G、S76N、M77T、V78A、D82aN、N82bS、M89V、A94R、V107T和M108L)的基因。将所得到的15种#10-22嵌合抗体(H链)的部位取代体基因分别与EV007156L基因同时导入CHO-K1细胞中。通过使用固相化有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的15种抗体进行定量，使抗体浓度一致后，对抗原结合性进行考察。这些部位取代抗体中，H链可变区内的A49G和A94R这2种部位取代体的抗原结合性与由嵌合抗体(H链)基因和EV007156L基因的共表达得到的抗体相比均显著降低(图7)。
制作编码如下H链的人源化抗体(H链)基因：#10-11嵌合抗体H链中49位、94位和3个CDR序列原样保留大鼠抗体H链可变区来源的氨基酸序列，除此以外的H可变区的氨基酸序列全部重组为上述Human_VH的氨基酸序列。将所得到的#10-22人源化抗体(H链)(以下称为EV007156H)基因和EV007156L基因同时导入CHO-K1细胞中。通过使用固相化有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的抗体进行定量，使抗体浓度一致后，对抗原结合性进行考察。该抗体的抗原结合性与由#10-22嵌合抗体(H链)基因和EV007156L基因的共表达得到的抗体相比，观察到显著的提高(图8)。将#10-22人源化抗体(以下称为EV007156)的H链和L链的全长氨基酸序列示于序列号39和40，将可变区的氨基酸序列示于序列号41和42。另外，将H链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列示于序列号43、44、45和46，将L链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列示于序列号47、48、49和50。
需要说明的是，为了评价#10-22嵌合抗体和EV007156对HMGB1的结合活性(ELISA法)，在将牛胸腺来源的HMGB1以25ng/孔的浓度在4℃下固相化过夜的酶标板(Nunc、Maxisorp)中加入N101(日本油脂)，将板封闭2小时后，以将#10-22嵌合抗体和EV007156分别从4μg/ml起稀释4倍后得到的样品(7个浓度)作为一次抗体，在室温下反应1小时。接着，使HRP标记抗人IgGγ抗体(MBL，#208)在室温下反应1小时。加入TMB后，通过450nm的吸光进行检测。其结果，使抗体浓度为250ng/ml时的人源化抗体EV007156显示出比#10-22嵌合抗体高约5倍的抗原结合性。
实施例4与各种HMGB1的结合性
(a)各种HMGB1的制备
(a-1)牛胸腺来源的HMGB1
牛胸腺来源的HMGB1从Shino-Test公司或Chondrex公司获得。
(a-2)人来源的重组HMGB1(Sf9表达)
人来源的重组HMGB1以N末端结合有His标签的形式从感染了杆状病毒的Sf9细胞中纯化。即，使Sf9细胞感染表达HMGB1的杆状病毒后，旋转培养72小时，通过离心得到细胞团块。然后，将细胞悬浊于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中，进行超声(1分钟×4次)，将细胞破碎。接着，以15000rpm离心15分钟，回收含有HMGB1的上清。使用QIAGEN Ni-NTA吸附、纯化上清中含有的HMGB1，使用100mM咪唑洗脱，在磷酸缓冲液(PBS(-))中进行透析。
(a-3)核HMGB1
核HMGB1由在10％FCS-DMEM中培养的CHO-K1细胞制作。即，在10％FCS-DMEM、5％CO2、37℃的条件下培养CHO-K1，在细胞密度达到铺满时将CHO细胞用PBS(-)清洗2次，使用细胞刮(Nunc，#179693)刮取后，回收至离心沉淀管中。在细胞溶液中以达到0.2％的方式加入TritonX-100，通过超声进行细胞破坏。将溶液作为核型抗原。
(a-4)坏死HMGB1
坏死HMGB1由在10％FCS-DMEM中培养的CHO-K1细胞制作。即，在10％FCS-DMEM、5％CO2、37℃的条件下培养CHO-K1，在细胞密度达到铺满时加入PBS(-)清洗2次。然后，加入适量超纯水后，使用细胞刮刮取细胞。使用恒温槽和干冰，反复进行5次冷冻融化，将细胞破坏，以12000rpm离心10分钟，将细胞屑除去。将上清作为坏死HMGB1，在-80℃保存。
(a-5)凋亡HMGB1
凋亡HMGB1由在10％FCS-DMEM中培养的CHO-K1细胞制作。在10％FCS-DMEM、5％CO2、37℃的条件下培养CHO-K1，在细胞密度达到铺满时对CHO细胞照射2分钟UV，置换为无血清DMEM培养基后，回收培养16小时后的培养基。将通过离心除去细胞后的上清作为凋亡HMGB1。
(a-6)继发坏死HMGB1
继发坏死HMGB1由在10％FCS-DMEM中培养的CHO-K1细胞制作。在10％FCS-DMEM、5％CO2、37℃的条件下培养CHO-K1，在细胞密度达到铺满时对CHO细胞照射2分钟UV，置换为无血清DMEM培养基。培养48小时后回收培养基，将通过离心除去细胞后的上清作为继发坏死HMGB1。
(a-7)活化HMGB1
活化HMGB1由在10％FCS-RPMI中培养的RAW细胞(理研)制作。在10％FCS-RPMI、5％CO2、37℃的条件下培养RAW细胞，在细胞密度达到铺满时将RAW细胞用PBS(-)清洗2次，置换为无血清RPMI培养基后，用1μg/ml的PolyIC进行刺激。回收刺激后24小时的培养上清，将通过离心除去细胞后的上清作为活化HMGB1。
(b)利用蛋白免疫印迹得到的EV007156与各种HMGB1的结合性
通过蛋白免疫印迹考察#10-22、其人源化抗体(EV007156)、S6(MedImmune公司)和G4(MedImmune公司)的抗体对上述中制作的各种HMGB1的结合性。即，分别在牛胸腺来源的HMGB1、Sf6表达重组人HMGB1、核HMGB1、坏死HMGB1、凋亡HMGB1、继发坏死HMGB1、活化HMGB1中加入5×SDS样品缓冲液，在95℃下煮沸5分钟。将HMGB1样品的梯度稀释物在12％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳后，将蛋白质转印到PVDF膜上。使用5％脱脂奶粉-TBST封闭2小时后，使#10-22、EV007156、S6和G4(各自为2μg/ml)在室温下反应1小时。接着，使HRP标记的二次抗体在室温下反应1小时，使用ECLprime(GE Healthcare，RPN2232)进行检测(表4)。需要说明的是，作为阳性对照抗体，对于WO2007/001422记载的人抗HMGB1抗体(S6和G4)，合成编码该专利中公开的氨基酸序列的基因，进行抗体产生、纯化，供于试验。
[表4]
表4.抗体对各种抗原的结合性评价(蛋白免疫印迹)
HMGB1抗体(#10-22、EV007156、S6、G4)对各种HMGB1(牛胸腺、重组、核、坏死、凋亡、继发坏死和活化HMGB1)的结合性评价。
-：未观察到结合、+：观察到弱结合、++：观察到强结合
(c)#10-22嵌合抗体、EV007156的抗原结合ELISA
在将上述人来源的重组HMGB1以25ng/孔的浓度在4℃下固相化过夜的酶标板(Nunc，Maxisorp)中加入N101(日本油脂)，将板封闭2小时后，以将#10-22嵌合抗体、EV007156、S6和G4分别从4μg/ml起稀释4倍后得到的样品(7个浓度)作为一次抗体，在室温下反应1小时。接着，使HRP标记抗人IgGγ抗体(MBL，#208)在室温下反应1小时。加入TMB后，通过450nm的吸光进行检测(图9的(A))。另外，将使抗体浓度为250ng/ml时的各HMGB1抗体对各HMGB1(重组)的结合率示于图9的(B)。人源化抗体EV007156对重组HMGB1显示出比#10-22嵌合抗体高约2.5倍的抗原结合性。另外，EV007156对重组HMGB1显示出比S6高45倍、比G4高22倍的结合性。
实施例5结合抑制分析
RAGE结合抑制分析
在将RAGE-Fc(R&D，250ng/孔)在4℃下固相化过夜的酶标板(Nunc，Maxisorp)中加入5％的BSA(Bovine Serum Albmin，牛血清白蛋白)，将板封闭2小时后，加入人单克隆抗体(Control Ig，对照Ig)，将板封闭2小时。在HMGB1(Sf6来源重组HMGB1，终浓度2μg/ml)中，以使终浓度为(0μg/ml、0.02μg/ml、0.2μg/ml、2μg/ml、20μg/ml)的方式混合抗HMGB1抗体(#10-22嵌合体、EV007156、G4)和作为阴性对照抗体的对HMGB1不具有特异性的人单克隆抗体(Control Ig)，孵育60分钟。接着，将反应溶液加到酶标板中，反应2小时。然后，使利用生物素标记试剂盒(Dojindo，LK03)进行了生物素化的抗HMGB1抗体(Abnova，#H00003146-M08，1μg/ml)在室温下反应1小时。最后，使HRP标记链亲合素在室温下反应1小时。加入TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺；SureBlue，KPL，#52-00-03)，通过450nm的吸光检测与RAGE结合的HMGB1(图10)。#10-22嵌合体、EV007156、G4均以依赖于所添加的抗体浓度的方式抑制HMGB1与RAGE的结合。另外，该抑制效果在添加2μg/ml的抗体时#10-22嵌合体为44.0％、EV007156为46.2％，与此相对，G4为1.4％。另外，在添加20μg/ml的抗体的情况下，#10-22嵌合体为77.0％、EV007156为58.6％，与此相对，G4为36.9％。另外，50％抑制浓度(IC50)在#10-22嵌合体为3.04μg/ml(20.3nM)，在EV007156为4.05μg/ml(27nM)，在G4为20μg/ml(130nM)以上。因此可知，#10-22嵌合体、EV007156对HMGB1与RAGE的结合的抑制效果显著强于G4。
实施例6TNF-α释放抑制分析
从正常人分离外周血单个核细胞(PBMC)，考察EV007156的添加是否抑制用HMGB1刺激时观察到的TNF-α的释放量。首先，使用Histopaque(SIGMA，#10771)对人外周血进行离心(1400rpm，30分钟)，分离、回收PBMC。接着，将所得到的PBMC使用Opti-MEM(Gibco)以达到2×105个细胞/孔的方式接种到96孔多孔板(BD，#353072)中。其中预先加入有在37℃下预孵育了30分钟的牛胸腺来源HMGB1(Chondrex，终浓度1μg/ml)和抗HMGB1抗体(EV007156、S6、G4)或作为阴性对照抗体的对HMGB1不具有特异性的人单克隆抗体(从终浓度10μg/ml开始梯度稀释)的混合液。将添加培养后24小时的培养上清回收，使用人TNF-αELISA Ready-SET-Go！(eBioscience，#88-7346)进行TNF-α的定量(图11)。另外，该抑制效果在添加0.01μg/ml的抗体时，EV007156为42.0％，与此相对，S6为21.3％，G4为25.5％。另外，在添加0.1μg/ml的抗体的情况下，EV007156为75.9％，与此相对，S6为49.4％，G4为68.5％。另外，50％抑制浓度(IC50)在EV007156为0.016μg/ml(0.106nM)，与此相对，在S6为0.106μg/ml(0.706nM)，在G4为0.026μg/ml(0.173nM)以上。由此表明，EV007156的TNF-α释放抑制效果显著强于S6和G4。
由此显示，本发明的人源化抗体EV007156对巨噬细胞和单核细胞细胞中的由HMGB1引起的TLR-4受体介导的信号传导活化的抑制效果实质上很高。
实施例7亲和性测定
使用通过表面等离子共振检测生物体分子的结合相互作用的Biacore T200装置，测定抗体对HMGB1的亲和性。首先，使EV007156、S6或G4以0.5μg/ml的浓度吸附到传感芯片(CM5)上作为配体。接着，使从10nM起以2倍稀释系列制备的重组HMGB1流到传感芯片上作为分析物，测量结合亲和性。由所得到的结果可知，各抗体的KD(M)值如下：EV007156为3.29×10-10M，S6和G4分别为2.67×10-10、6.79×10-10M(表5)。
[表5]
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
EV007156 7.11×106 2.34×10-3 3.29×10-10
S6 4.11×106 1.18×10-3 2.67×10-10
G4 3.32×106 2.26×10-3 6.79×10-10
实施例8药物动态试验
将EV007156以10mg/kg腹腔内给药于8周龄的C57BL/6N(雌性)，在给药后6小时(0.25天)、3天、7天、14天、24天采血。通过3500rpm、10分钟的离心分离血清，使所得到的血清在预先将抗人IgG抗体以250ng/孔的浓度固相化过夜的酶标板(Nunc，Maxisorp)中反应1小时。接着，使HRP标记的抗人IgG抗体(MBL，#208)反应1小时。加入TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺；SureBlue，KPL，#52-00-03)后，通过450nm的吸光进行抗体浓度的定量。另外，为了确认EV007156对抗原的结合性，使用将重组HMGB1以25ng/孔的浓度固相化过夜的酶标板(Nunc，Maxisorp)，按照与抗体定量同样的程序进行检测。将结果示于图12中。从抗体给药6小时开始，血中抗体浓度已升高，在给药后3天血中抗体浓度稳定于80μg/ml。然后，在给药后24天逐渐减少，最终达到40μg/ml。所给药的EV007156在小鼠体内的半衰期计算为22.8天。关于每单位抗体的抗原结合性，由于从给药后3天至24天相对于抗体量的抗原结合性不降低，因此可知，EV007156即使在小鼠体内经过24天，也具有与抗体量相符的抗原结合性，保持了作为抗体的稳定性。
实施例9表位作图
(a)缺失构建体的制作
在缺失构建体的制作之前，从HEK293克隆人来源的HMGB1基因。即，使用Cells to cDNA II(ambion，#AM1723)对HEK293进行RT-PCR，在N末端附加组氨酸标签，将扩增的PCR片段克隆到pcDNA3.1(+)载体中。利用测序仪(ABI，3130Genetic Analyzer)确认所得到的基因序列与人HMGB1的基因没有差异。
接着，为了确定EV007156的表位，将HMGB1分类为A-BOX、B-BOX、C-tail这3个区域，制作总计6个种类的缺失构建体(全长HMGB1、A-Box+B-Box、A-Box+C-tail、B-Box+C-tail、A-Box、B-Box和C-tail)(图13)。各缺失构建体的表达通过免疫荧光染色和CBB染色法来确认。作为利用免疫荧光染色的确认，将表达各片段(包括全长在内的总计7个种类)的质粒使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)转染到CHO-K1细胞中。24小时后将细胞用4％多聚甲醛固定，然后，使抗His抗体(MBL，PM032)以1μg/ml的浓度反应1小时。接着，使Alexa488抗兔IgG抗体(Invitrogen，A11070)以1μg/ml的浓度反应1小时，使用落射型荧光显微镜观察荧光信号(图14)。另一方面，作为利用CBB法的确认，在转染后24小时的细胞中加入裂解缓冲液(PBS，0.2％TritonX-100，1mM EDTA)，将细胞溶解。使用Ni-琼脂糖6B(GEHealthcare)对细胞裂解液中含有的缺失构建体进行纯化。在利用洗脱液(50mMTris-HCl(pH8.0)、500mM NaCl、500mM咪唑)洗脱出来的样品中加入5×SDS样品缓冲液，在95℃下煮沸5分钟。将各样品在12％聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，使用CBB进行染色，确认了缺失构建体的表达(图15)。由结果可知，免疫荧光染色、CBB染色法均确认到C-tail以外的缺失构建体的表达。
(b)利用免疫荧光染色法的表位区域的检测
使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)将表达各片段(包括全长在内的总计7个种类)的质粒转染到CHO-K1细胞中。24小时后将细胞用4％多聚甲醛固定，然后，使EV007156(1μg/ml)反应1小时。接着，使Alexa488抗人IgG抗体以1μg/ml的浓度反应1小时，使用落射型荧光显微镜观察荧光信号(图16)。可知EV007156除了与全长HMGB1反应以外，还与A-Box+C-tail和B-Box+C-tail、即包含C末端的构建体反应。由此判断，EV007156的表位存在于HMGB1的C末端区域的可能性高。接着，对S6和G4也进行同样的实验。由结果可知，S6(图16-b)和G4(图16-c)均与包含B-Box的构建体反应。得到了与EV007156的染色图案不同的结果。
(c)利用蛋白免疫印迹法的表位区域的检测
使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)将表达各片段的质粒转染到CHO-K1细胞中。24小时后在细胞中加入裂解缓冲液(PBS，0.2％TritonX-100，1mM EDTA)，将细胞溶解。接着，加入5×SDS样品缓冲液，在95℃下煮沸5分钟。将各样品在12％聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，以100mA、1小时的条件将蛋白质转印到PVDF膜上。将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉-TBST封闭2小时后，使EV007156(1μg/ml)在室温下反应1小时。接着，使作为二次抗体的HRP标记抗人IgG(MBL，#208)在室温下反应1小时。使用ECL prime(GE Healthcare，RPN2232)检测EV007156(图17)。由结果可知，与免疫荧光染色的结果同样，EV007156除了与全长HMGB1反应以外，还与包含C末端的构建体(A-Box+C-tail和B-Box+C-tail)反应。因此判断，EV007156的表位存在于C末端区域。接着，对S6和G4也进行同样的实验。可知S6和G4也与免疫荧光染色的结果同样地与包含B-Box的构建体(A-Box+B-Box、B-Box+C-tail、仅B-Box)反应。因此判断，S6和G4的表位存在于B-Box。由此表明，EV007156具有与S6和G4不同的表位。
(d)肽作图(斑点印迹)
为了确定EV007156对HMGB1的表位位于构成HMGB1的C末端的哪个氨基酸，实施了肽作图。即，设计了包括9种间隔3个残基的长度为12个残基的氨基酸和最靠C末端的8个残基的1条肽在内的总计10种肽(#1.EEEEDEEDEEDE(序列号51)、#2.EDEEDEEDEEEE(序列号52)、#3.EDEEDEEEEEDE(序列号53)、#4.EEDEEEEEDEED(序列号54)、#5.DEEEEEDEEDED(序列号55)、#6.EEEEDEEDEDEE(序列号56)、#7.EEDEEDEDEEED(序列号57)、#8.DEEDEDEEEDDD(序列号58)、#9.EDEDEEEDDDDE(序列号59)、#10.EEEDDDDE(序列号60))，囊括了构成HMGB1的C末端区域的氨基酸。将合成的肽(SIGMA-ALDRICH，PEPScreen)用0.1M乙酸铵溶液以达到4mg/ml的方式溶解，以4μg/斑点滴加到硝酸纤维素膜上。干燥后，用5％脱脂奶粉-TBST封闭90分钟。接着，使EV007156以1μg/ml的浓度反应1小时。接着，使HRP标记的抗人IgG抗体(MBL，#208)反应1小时后，使用ECL prime(GE Healthcare，RPN2232)进行检测(图18)。由结果可知，EV007156强烈识别HMGB1的最靠C末端的区域即#9.EDEDEEEDDDDE，更详细而言，识别最靠C末端的8个残基(#10.EEEDDDDE(序列号60))。
实施例10EV007156对败血症模型小鼠的效果
通过计算抗体给药后的存活率来考察EV007156能否防御由败血症引起的致死。小鼠的败血症模型基于CLP法(Cecal ligation andpuncture(盲肠结扎穿孔)，Lutterloh et.al.)来制作。即，以达到80mg/kg的方式对BALB/c(日本SLC，雌性，8周龄，16只)腹腔内给药***钠(Nacalai Tesque，#26427-14)将其麻醉。从正中切开约1cm后，取出盲肠，将其约90％用缝合线结扎。接着，使用23G的注射器针头(Terumo，#NN-2332S)将盲肠壁在上下各贯通1次(总计2次)。将盲肠放回至腹腔的预定部位，用缝合线缝合切开部。在切开部涂抹终浓度为1％的赛罗卡因(AstraZeneca)和125U/g的バラマイシン(baramycin)(小野药品)。进而，以达到25mg/kg的方式肌肉内给药组胺(日医工)。次日，在术后24小时，作为抗体给药组，以达到10mg/kg的方式腹腔内给药EV007156。另外，在对照组中，仅腹腔内给药生理盐水。然后，实施状态观察直至抗体给药后6天为止，算出各组的存活率(图19)。结果，在术后48小时对照组中存活率减少至50％，但在给药EV007156的抗体给药组中存活率维持100％。该存活率的维持持续至术后5天。另外，术后6天的存活率在对照组中为37.5％，与此相对，在抗体给药组中高达87.5％。由该结果表明，EV007156的给药在基于CLP法的败血症模型小鼠中显著提高了小鼠的存活率，该抗体的给药对败血症带来的致死为极其有效的手段。
产业上的可利用性
本发明的人源化抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段与迄今为止的人来源抗HMGB1抗体相比，对哺乳动物来源的HMGB1具有高的亲和性、中和活性，并且通过人源化减弱了大鼠抗体的免疫原性，因此，在对人应用的方面有利，作为能够对多种严重的HMGB1相关疾病提供新的治疗法、预防法的抗体是有用的。

Claims (16)

1.一种人源化抗体或其抗原结合性片段，其与存在于HMGB1蛋白的C末端结构域的氨基酸序列(EEEDDDDE(序列号60))特异性结合，所述人源化抗体或其抗原结合性片段中，
(i)重链可变区(VH)含有：
(a)包含序列号7的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号8的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号9的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链可变区(VL)含有：
(a)包含序列号10的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列，
(b)包含序列号11的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号12的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链可变区(VH)含有：
(a)包含序列号7的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号8的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号9的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链可变区(VL)含有：
(a)包含序列号10的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号11的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号12的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链可变区(VH)含有序列号43、44、45和46的氨基酸序列分别作为FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号43、44、45和46的氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变，
(ii)轻链可变区(VL)含有序列号47、48、49和50的氨基酸序列分别作为FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号47、48、49和50的氨基酸序列中具有1个～数个氨基酸残基的缺失、取代、***和/或添加的突变。
4.如权利要求1～3中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(i)在重链可变区(VH)中至少49位和94位这两个位置的氨基酸残基为来源于大鼠抗体#10-22的H的氨基酸残基(均为丙氨酸)的氨基酸序列、
(ii)在轻链可变区(VL)中至少44位和46位这两个位置的氨基酸残基为来源于大鼠抗体#10-22的L链的氨基酸残基(分别为异亮氨酸和精氨酸)的氨基酸序列。
5.如权利要求1～4中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(i)包含与序列号41的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(ii)包含与序列号42的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
6.如权利要求1～5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(i)包含序列号41的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(ii)包含序列号42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
7.如权利要求1～6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，所述人源化抗体的类别(亚类)为IgG1(λ)或IgG2(λ)。
8.如权利要求1～7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，在250ng/ml下比较对人HMGB1蛋白的结合活性(ELISA法)时，所述的人源化抗体或其抗原结合性片段所具有的高活性是#10-22嵌合抗体的2倍以上。
9.如权利要求1～7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人HMGB1蛋白与RAGE的结合抑制50％的活性(IC50)为5μg/mL(约33nM)以下。
10.如权利要求1～7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人PBMC中由HMGB1蛋白刺激引起的TNF-α释放抑制50％的活性(IC50)为0.02μg/mL(约0.13nM)以下。
11.一种药物组合物，其含有权利要求1～7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段以及药学上可容许的载体。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其用于由从细胞游离出的HMGB1诱发的各种HMGB1相关疾病的治疗或预防。
13.如权利要求10所述的药物组合物，其用于疾病的治疗或预防，所述HMGB 1相关疾病为脑梗塞、脑水肿、脑血管痉挛、外伤性脑损伤、动脉粥样硬化、神经源性疼痛、败血症、关节炎、急性肺外伤、脑缺血、肾缺血和肝缺血等中的任意一种。
14.编码权利要求1～10中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段的氨基酸序列的分离的核酸、或者在高严格条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。
15.一种重组表达载体，其整合有权利要求14所述的分离的核酸。
16.一种宿主细胞，其导入有权利要求15所述的重组表达载体。
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