JP6154135B2 - 外傷性神経障害治療剤 - Google Patents
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Description
1.抗HMGB1モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする、外傷性神経障害治療剤。
2.外傷性神経障害が、脳外傷、脳外科手術に伴う脳損傷及び/又は脊髄損傷である、前項1に記載の外傷性神経障害治療剤。
3.外傷性障害を受けた後に投与するものである前項1又は2に記載の外傷性神経障害治療剤。
4.抗HMGB1モノクローナル抗体を、1回当たり0.2〜5 mg/kg投与するものである前項1〜3のいずれか1に記載の外傷性神経障害治療剤。
5.前項1〜5のいずれか1に記載の外傷性神経障害治療剤を用いることを特徴とする、外傷性神経障害の治療方法。
特許文献4に記載の方法と同手法により、抗HMGB1モノクローナル抗体を調製した。具体的には、以下のとおりである。
市販のウシ胸腺由来HMGB1とHMGB2との混合物(和光純薬工業社製、コード番号:080-070741)1 mg/mLを2 mLガラス製注射筒にとり、別の2 mLガラス製注射筒にとった等容量のフロイント完全アジュバンドと連結管を通じて徐々に混和することによって、エマルションとした。セボフルレンにより麻酔したラットの後肢足蹠に、得られたエマルションを0.05 mLずつ、計0.1 mL注射投与した。2週間後、頚静脈から試験採血し、抗体価の上昇を確認した。次いで、腫大した腸骨リンパ節を前記注射投与から3週間後に無菌的に取り出した。得られた2個のリンパ節から、約6×107 個の細胞を回収することができた。
上記腸骨リンパ節細胞とマウスミエローマSP2/O-Ag14(SP2)細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を96穴マイクロプレートに蒔いた。1週間後、最初のELISAスクリーニングを行ない、陽性ウェルについて、ウェスタンブロットにより二次スクリーニングを行なった。陽性を示すウェル細胞を24穴マイクロプレートに移し、細胞をほぼコンフルエントな状態(約2×105)に殖やしてから、0.5 mLの凍結培地(GIT培地にウシ胎児血清を10%とジメチルスルホキシドを10%添加したもの)を用いて、液体窒素中で凍結保存した。この凍結保存細胞を解凍した後、96穴マイクロプレートでクローニングした。
回転培養装置(SARSTEDT社製)により上記陽性細胞を2週間大量培養し、濃度2〜3 mg/mLの抗体液を得た。この抗体液をアフィニティゲル(MEP-HyperCelTM、インビトロジェン社製)と中性pH下で混和し、抗HMGB1抗体をゲルへ特異的に結合させた。特異的にゲルに結合した抗体を、酢酸ナトリウムバッファー(pH 4)により溶出した。溶出液を限外濾過装置により濃縮した後、セファロースCL6Bゲル濾過カラム(直径2 cm×長さ97 cm)によって、さらに精製した。
1)外傷性神経障害モデルラットの作製
外傷性神経障害モデルラットとして、パーカッション傷害作製装置(Dragonfly HPD-1700:ドラゴンフライ社)を用いたパーカッション傷害ラットを作製した。ウィスター系雄性ラット(体重:約300 g)をバルビツレート(30 mg/kg)で麻酔し、ラットの頭蓋骨のブレグマ(Bregma:冠状縫合と矢状縫合の交点)から後方約3 mm、右側方約3 mmに専用の穿頭器を用いて穿頭孔 (burr-hole)を穿ち、筒型のプラスチックを瞬間接着剤・骨セメントを用いて装着した。皮膚を軽く縫合した。翌日、イソフルラン(導入2%、随時漸減)を用いて、麻酔導入し、動物用定位脳手術台に固定したうえで、脳圧測定した。その後、パーカッション傷害作製装置により、出力が2.2 atmとなるようにセットし、脳硬膜上から衝撃を加えて頭部外傷のパーカッション傷害ラットを作製した。以降、頭部外傷のパーカッション傷害を、単に「TBI」という場合がある。パーカッション傷害(TBI)の概要は、図1を参照されたい。
実施例2で作製したTBIラットについて、行動学的評価を行った。行動学的評価として、協調運動を観察するためにロータロッド(rotarod)テスト(0−10分間程)、及び上肢の自発運動を観察するためのシリンダーテスト(3分間)を、各々頭部外傷直前と外傷後24時間後に行った。
ロータロッドテストは、TBIによる脳外傷前及び脳外傷後について、ラットを回転するロッドに乗せ、当該ラットがロッドから転落するまでの時間を計測することにより実施した。その結果を表1及び図2に示した。
シリンダーテストは、パーカッション傷害により脳の右部位にTBIを与えた脳外傷モデルラットをシリンダー内(直径17.5cm)に入れ、健常側と患側について探索的に前肢を壁にかける動作の左右差を確認することにより行った。具体的には、左右の前肢をついた全回数を分母とし、患側肢(左)をつく回数を分子として計算し、前肢を壁にかける動作の左右差を確認した。TBI前の左右前肢を同等の頻度で壁にかける健常動物では、ほぼ0.5の値を示したが、TBI後24時間では、対照の抗KLH抗体(自家製)投与群では、患側肢をつく頻度に著明な低下がみられたが、抗HMGB1モノクローナル抗体投与群では低下が認められなかった(図3)。
実施例2で作製したTBIラットについて、TBI作製24時間後に脳圧測定の上で、バルビツレート(50 mg/kg)で麻酔し、パラホルムアルデヒドにて心還流固定を行い、脳組織を取り出した。パラフィン包埋脳組織から薄切切片を作製し、組織学的に脳障害を評価し、TBI時のHMGB1動態について評価した。
ラット脳組織のうち、受傷中心部分を含む冠状断切片について組織切片を作製し、ヘマトキシリン-エオシン染色により組織学的評価を行った。コントロール群(抗KLH抗体:自家製)に比べて、抗HMGB1モノクローナル抗体投与群では、傷害の広がりが明らかに抑制されていた(図4)。
ラット脳組織のうち、大脳皮質部分の組織切片を作製し、HMGB1を抗HMGB1モノクローナル抗体(赤)、神経細胞マーカーであるMAP-2を抗MAP-2ウサギポリクローナル抗体(緑)で染色し、細胞核をDAPI(青)で染色した。その結果、傷害を与えた部位(傷害部位)とは反対の部位(正常領域)では、HMGB1は神経細胞の核内に存在することが示された(図5)。一方、傷害部位では細胞核内にHMGB1は認められず、神経細胞外に分散していることが確認された(図6)。また、傷害部位よりやや内部の組織についても確認した結果、HMGB1は神経細胞質部分には認められるものの、核内にはとどまっていないことが観察された。HMGB1は、傷害により神経細胞核外に放出されることが確認された(図7)。
実施例2で作製したTBIラットについて、傷害作製3時間後に尾静脈よりエバンスブルー(EB)を投与し、その3時間後に脱血・灌流して、脳内に移行したエバンスブルーを定量した。その結果、対照群では、エバンスブルーの漏出が認められたが、抗HMGB1モノクローナル抗体投与群では、顕著に漏出量が低かった(図8)。
本実施例では、外傷性神経障害モデルラットとして実施例2と同手法により作製したTBIラットに対して、抗HMGB1モノクローナル抗体を投与したときの効果を、実験例2−1と同様に行動学的評価(ロータロッドテスト)により確認した。TBI後10分目に抗HMGB1モノクローナル抗体を尾静脈より200μg経静脈投与した。抗体の対照として抗KLH抗体(抗Keyhole Limpet hemocyanin(KLH) 抗体:自家製)を用いた。また、標準治療方法として10%グリセロールを含む0.9%生理食塩液を0.5ml経静脈投与した。対照として、sham群についても確認した。
その結果、抗HMGB1モノクローナル抗体投与群では、経時的に行動学的改善効果が認められ、24時間目ではsham群と同程度に伸びており、現行治療薬のグリセロール投与群と比べても有意に優れた運動能を示した(図12)。
本実施例では、外傷性神経障害モデルラットとして実施例2と同手法により作製したTBIラットに対して、抗HMGB1モノクローナル抗体を投与したときの効果を、実験例2−1と同様に行動学的評価(シリンダーテスト)により確認した。TBI後10分目に抗HMGB1モノクローナル抗体を尾静脈より200μg経静脈投与した。抗体の対照として抗KLH抗体(抗Keyhole Limpet hemocyanin (KLH) 抗体:自家製)を用いた。行動学的評価は、TBI後3、6及び24時間後について実験例2−1(B)と同手法でのシリンダーテストにより行った(図13−15)。その結果、抗HMGB1モノクローナル抗体投与群では、TBI後経時的に行動学的改善効果が認められた(図16)。
本実施例では、外傷性神経障害モデルラットとして実施例2と同手法により作製したTBIラットについて、抗HMGB1モノクローナル抗体を投与したときの組織中のHMGB1について、ウエスタンブロッティングにより評価した。実施例3と同手法により、TBI後10分目に抗HMGB1モノクローナル抗体を尾静脈より200μg経静脈投与した。抗体の対照として抗KLH抗体(抗Keyhole Limpet hemocyanin(KLH) 抗体:自家製)を用いた。また、標準治療方法として10%グリセロールを含む0.9%生理食塩液を0.5mL経静脈投与した。
受傷中心部から前側方の大脳皮質を受傷後24時間後に3mm×3mmの大きさでサンプリングした。非障害側についても対称の位置からサンプリングした。大脳皮質組織を1ml のRIPPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.15M NaCl, 0.1% SDS, 0.1% Triton X-100, 0.5% Sodium deoxycholate)でホモジナイズした。10,000×g 20分遠心後、上清を12% ポリアクリルアミドSDS-PAGEで泳動分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜上HMGB1をウエスタンブロッティング法によりHRP標識抗HMGB1ラット単クローン抗体を用いて化学発光法で検出した(図17)。
上記の結果、抗HMGB1モノクローナル抗体群及びグリセロール投与群ではTBI側及び非障害側で、組織中のHMGB1の存在について差を認めなかったが、抗KLH抗体投与群では非障害側に比べて、TBI側のほうがHMGB1のバンドが薄かった。このことより、大脳皮質中のHMGB1の存在については、抗HMGB1モノクローナル抗体は既存のグリセロールと同等の効果を示したことが確認された(図18、19)。
Claims (5)
- 抗HMGB1モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする、脳損傷及び/又は脊髄損傷からなる外傷性神経障害に伴う協調運動障害の改善剤。
- 脳損傷及び/又は脊髄損傷が、脳外傷、脳外科手術に伴う脳損傷及び/又は脊髄損傷である、請求項1に記載の外傷性神経障害に伴う協調運動障害の改善剤。
- 外傷性障害を受けた後に投与するものである請求項1又は2に記載の外傷性神経障害に伴う協調運動障害の改善剤。
- 抗HMGB1モノクローナル抗体を、1回当たり0.2〜5 mg/kg投与するものである請求項1〜3のいずれか1に記載の外傷性神経障害に伴う協調運動障害の改善剤。
- 外傷性神経障害に伴う協調運動障害の改善が、神経細胞核外に漏出したHMGB1を捕捉することによる、請求項1〜4のいずれか1に記載の外傷性神経障害に伴う協調運動障害の改善剤。
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