CN104945414A

CN104945414A - 苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用

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Publication number: CN104945414A
Application number: CN201510310623.3A
Authority: CN
Inventors: 张文; 吴艳玲; 陈敏
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2015-06-08
Filing date: 2015-06-08
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明提供苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用。本发明提供的六种含有不同边链的苯并硫杂蒽类衍生物都具有大的共轭平面以及含有三个亚甲基的可以质子化的边链，对G-四链体具有一定的亲和性和选择性，可以诱导富含鸟嘌呤的序列形成G-四链体结构，所述六种苯并硫杂蒽类衍生物都能够在不同程度上抑制A549细胞与SGC-7901细胞端粒酶活性；而且，能够通过下调的PD-1基因在JF305细胞和Bel-7402细胞中的表达能力，而达到抑制肿瘤细胞生长、促使其凋亡的作用，因此可以用于制备肿瘤治疗的基因靶向药物。

Description

苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

DNA是主要的遗传物质，其大部分结构是以两条互补链通过A:T和G:C碱基配对形成典型的Watson-Crick双螺旋形式存在。然而，人们发现DNA序列不仅可以形成传统的双螺旋结构(B-DNA)，在特定的条件下也可以折叠形成其他的非B-DNA结构。这些非典型的结构有左手螺旋结构(Z-DNA)、发卡结构(hairpin)、三链结构(triplex)以及四链结构(G-quadruplex和i-motif)等。在这些结构当中，G-quadruplex(G-四链体)引起了许多来自不同领域中的研究人员的广泛兴趣和研究热情。这是因为在端粒末端、原癌基因启动子区域和RNA序列5’非翻译区的富鸟嘌呤(G)序列可以形成G-四链体结构，这一结构的形成可以影响包括诸如DNA的复制与转录之类的基因代谢过程。具体而言，G-四链体的形成和拆散可能涉及到体内的一些重要生理过程，如信号转导、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤的形成和发展等。此外，G-四链体的结构与人体内双螺旋DNA结构存在着显著差异性，使其成为抗肿瘤药物的重要潜在靶点。近年来，通过小分子化合物诱导端粒末端及相关癌基因(c-myc、c-kit、bcl-2…)启动子区域的富G序列形成G-四链体结构，从而达到抑制癌细胞的增殖和促进其凋亡的研究备受关注。

以B-DNA为靶点的抗肿瘤药物由于缺乏选择性，因而会和正常DNA作用，产生毒副作用。因此，开发具有高度选择性、高亲和力的靶向基因药物具有重要的意义。G-四链体结构和B-DNA结构有着显著的差异性，正是这些差异性为许多小分子化合物提供了特异性识别位点，使其能够选择性的结合G-四链体。小分子化合物和G-四链体的结合位点有G-四分体(G-tetrad)，沟槽、连接环、磷酸骨架和中央离子通道。根据已有的报道，小分子配体和G-四链体的作用的模式主要有：端部堆垛模式；嵌插到两个G-四分体平面之间；通过氢键和静电作用结合到沟槽、磷酸骨架和连接环上；***到中央离子通道中。

端粒，位于真核线性染色体的末端，主要作用为维护染色体及基因组的稳定，防止染色体末端降解和粘连。端粒的DNA结构由端粒相关序列、端粒重复序列和单链DNA三部分构成，前两段序列为传统的DNA双螺旋结构d(TTAGGG)/d(CCCTAA)，后一序列为超出双螺旋结构的一段单链结构d(TTAGGG)，富含鸟嘌呤碱基(G)，称之为G悬突，或3’悬突。据研究报道，端粒长度是细胞衰老的标志。在整个生命历程中扮演着重要的角色，与各种细胞老化的疾病密切相关，比如高血压，阿尔茨海默病，癌症等其他相关疾病。

DNA复制时不能连续合成端粒的重复序列，人干细胞在***过程中，每周期端粒缩短60-300bp。而在端粒酶激活的细胞中，端粒可以以端粒酶自身RNA为模板通过逆转录合成后添加到染色体的末端，然后再以延长的亲链为模板，由DNA聚合酶合成子链。端粒酶是特殊的核糖核蛋白逆转录酶，由蛋白质亚基(人体内的hTERT催化亚基)和一种作为染色体 3’端重复序列扩增的RNA(人体内的hTR)组成。研究报道，可以通过调控其自身RNA和蛋白质成分来调节端粒酶的活性。

研究表明，正常体细胞中检测不到端粒酶的活性。因此，人类体细胞经过100余次的分化，端粒会不断缩短。当其长度缩短到一定长度时，细胞不能再进行***而进入凋亡。然而，在80-90％的癌细胞中端粒酶是高表达的，持续合成端粒重复序列，补偿正常端粒序列的丢失，使得恶性肿瘤细胞能在体内或体外无限***增殖。实验证明端粒酶的活性对于癌症的发生和发展具有重要意义。所以，寻找端粒酶的抑制剂靶向端粒和端粒酶是这一领域的研究热点。

另一方面，程序性死亡受体-1(programmed death receptor-1,PD-1)是在凋亡的小鼠T细胞杂交瘤中克隆出来的分子量为55KD的单体I型跨膜蛋白，属于CD28/CTLA-4免疫球蛋白超家族的免疫抑制性受体。PD-1在HIV、HBV、HCV感染的细胞及一些肿瘤细胞中高表达，与其配体的结合具有削弱、限制或终止T细胞发挥功能的作用,及抑制T细胞的活化和诱导活化的T细胞凋亡的功能，在机体免疫应答后期的负性调节中发挥了至关重要的作用。

近年来，关于PD-1免疫治疗药物的报道越来越多，百时美施贵宝(BMYUS)的PD-1肿瘤免疫治疗药物Opdivo(nivolumad)已获得美国FDA审批通过，用于治疗化疗后持续性的转移性鳞状非小细胞肺癌；除此之外，FDA将罗氏公司PD-L1抑制剂疗法中用于转移性膀胱癌的实验性药物MPDL3280A认定为“突破性疗法”。新的疗法已大幅度改善了之前存在的严重或危机生命的风险，这进一步说明免疫疗法治疗癌症定将拥有市场的广阔前景。

有研究报道称，对肿瘤患者使用PD-1抗体的治疗方法，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，可以使得多种肿瘤产生免疫反应。此外，通过阻断PD-1/PD-L1的共刺激信号通路，还可以恢复CTL细胞应答途径上逆转录病毒持续以及慢性感染。免疫检查点可以控制共刺激和共抑制信号的平衡，而共刺激和共抑制信号在维持自身耐受和调节T细胞应答方面具有重要作用。目前，免疫检查点抑制剂主要分为抗PD-1和抗PD-L1抗体两大类。

(1)抗PD-1抗体

文献报道的抗PD-1抗体主要分为两大类，包括Nivolumab(ONO-4538)和Lambrolizumab(MK-3475)。Nivolumab是全人源化免疫球蛋白G4、抗PD-1抗体，它的出现一定程度上改变了肺癌对于免疫治疗不敏感、疗效差的观念。MK-3475也是人源化IgG4、抗PD-1抗体，目前MK-3475联合化疗或比对化疗运用于特定人群的相关实验也正在积极开展。

(2)抗PD-L1抗体

抗PD-L1抗体包括BMS-936559和MPDL3280A，BMS-936559是高亲和力、全人源化IgG4抗体，Ⅰ期临床试验表明：对NSCLC、黑色素瘤、肾细胞癌、***均有明显治疗效果；MPDL3280A是人源化IgG4抗体，Ⅰ期临床试验结果显示，MPDL3280A具有良好的耐受性及安全性。

理论上抗PD-1、抗PD-L1抗体均可作用于阻断PD-1/PD-L1信号通路，但两者的作用靶点是不同的，抗PD-1抗体虽然能阻断PD-1与PD-L1、PD-L2的结合，却不能阻断PD-L1与CD80相互作用；相反的，抗PD-L1抗体能阻断PD-L1与PD-1、CD-80结合，却不能阻断PD-1与PD-L2的结合，这导致了抗PD-1、抗PD-L1抗体疗效及毒性的差异。所以，抗PD-1、抗PD-L1抗体适用的人群需继续研究。而探寻靶向PD-1或PD-1/PD-L信号通路的小分子药物具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明目的在于提供六种苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

本发明提供一种苯并硫杂蒽类衍生物，该化合物选自：

化合物2a：N-(N’，N’-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物3a：N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物4a：N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物5a：N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物6a：N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺。

本发明还提供一种苯并硫杂蒽类衍生物，其特征在于，该化合物选自：

化合物1：N-(N，-N，-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

化合物2：N-(N，-N，-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

化合物3：N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

化合物4：N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

化合物5：N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸；

化合物6：N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐。

本发明提供所述化合物1～6的制备方法，其特征在于，将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐溶入无水乙醇中，氮气保护下，加入边链胺，加热搅拌回流；苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱纯化得到固体；用最少量的二氯甲烷溶解纯化后的所述固体，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时，然后抽滤得目标产物。

进一步的，所述制备方法具体包括如下步骤：

加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐溶入无水乙醇当中,氮气保护下，加入1.5倍当量的边链胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱纯化得到所述固体；

盐酸化：称取适量上述步骤制得的所述固体，用二氯甲烷溶解所述固体，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时，在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑浊，析出目标产物。

进一步的，所述边链胺为N’，N’–二甲基丙二胺，所述固体为N-(N’，N’-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(N’-N’-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

或者所述边链胺为N’，N’–二乙基基丙二胺，所述固体为N-(N’，N’-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(N’-N’-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

或者所述边链胺为N’，N’–二乙醇基丙二胺，所述固体为N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

或者所述边链胺为3-(1-吡咯烷基)丙胺，所述固体为N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

或者所述边链胺为3-(1-哌啶基)丙胺，所述固体为N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

或者所述边链胺为3-(1-吗啉基)丙胺，所述固体为N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐。

所述化合物2a～6a以及所述化合物1～6适于做抗癌药物或抗癌药物组合物的有效成分。

本发明的有益效果在于：本发明提供的六种含有不同边链的苯并硫杂蒽类衍生物都具有大的共轭平面以及含有三个亚甲基的可以质子化的边链，对G-四链体具有一定的亲和性和选择性，可以诱导富鸟嘌呤(G)序列形成G-四链体结构，这六个化合物都能够在不同程度上抑制A549细胞与SGC-7901细胞端粒酶活性；而且，能够通过调节癌细胞中高表达的PD-1基因下调抑制肿瘤细胞JF305细胞和Bel-7402细胞生长、促使其凋亡，因此可以作为基因靶向药物用于肿瘤治疗。

附图说明

图1所示为制备本发明六种苯并硫杂蒽类衍生物的反应方程式。

图2a所示为化合物1与人端粒26nt G链DNA在10mM K⁺作用下孵育24h后的CD图谱；图2b所示为化合物3与人端粒26nt G链DNA在10mM K⁺作用下孵育24h后的CD图谱；图2c所示为化合物4与人端粒26nt G链DNA在10mM K⁺作用下孵育24h后的CD图谱。

图3所示为反应本发明的化合物1～6对A549细胞端粒酶活性抑制作用的电泳图。

图4所示为反应本发明的化合物1～6对SGC-7901细胞端粒酶活性抑制作用的电泳图。

图5所示为本发明化合物1～6对A549细胞的迁移抑制率。

图6所示为本发明化合物1～6对SGC-7901细胞的迁移抑制率。

图7所示为本发明化合物1～6对A549细胞的迁移抑制作用。

图8所示为本发明化合物1～6对SGC-7901细胞的迁移抑制作用。

图9所示为RT-CA***检测的化合物1～6在不同浓度下的JF305细胞的生长CI曲线。

图10示出RT-CA***检测的化合物1～6在不同浓度下的Bel-7402细胞的生长CI曲线。

图11所示为化合物1～6对JF305细胞PD-1mRNA表达的抑制。

图12所示为化合物1～6对JF305细胞PD-1蛋白的抑制作用。

图13所示为化合物1～6对Bel-7401细胞PD-1mRNA表达的抑制。

图14所示为化合物1～6对Bel-7401细胞PD-1蛋白的抑制作用。

具体实施方式

下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

首先参照图1描述本发明苯并硫杂蒽类衍生物(化合物1～6)的制备方法。

实施例1：

化合物1(N-(N’-N’-二甲胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐)的制备方法：

1)加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐(b3)2.81g,9.23mmol溶入200mL无水乙醇当中，氮气保护下，加入1.5倍当量的N’，N’-二甲基丙二胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝8:1)纯化，得到化合物1a：N-(N’，N’-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，产物颜色黄色偏红，产率95％以上。

2)盐酸化：称取适量N-(N’，N’-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，用最少量的二氯甲烷溶解N-(N’，N’-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时。在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑浊，析出大量固体颗粒，这些固体颗粒就是盐酸化的产物。反应完全后抽滤，并用二氯甲烷洗涤后于室温条件下真空干燥得到化合物1的纯品，化合物1颜色为黄红色，化合物1的产率为93％。氯化氢气体的制备为浓硫酸加入到氯化钠固体中，并用无水氯化钙干燥。

化合物1：

Rf:0.14(二氯甲烷/甲醇12/1,v/v),产率93.0％,mp:>300℃.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ2.04-2.07(m,2H,NCH2CH2CH2N),2.76(s,6H,2×+NCH3),3.01(t,3JH,H＝7.20Hz,2H,CH2N+),4.17(t,3JH,H＝7.35Hz,2H,CONCH2),δ7.40-7.43(m,3H,9-,10-,11-H),7.53(d,3JH,H＝7.70Hz,1H,6-H),8.21-8.24(m,2H,1-,8-H),8.44(d,3JH,H＝7.75Hz,1H,5-H),8.63(d,3JH,H＝8.15Hz,1H,2-H).ESI-Mass:calcd m/z for C23H21ClN2O2S:424.10；found:389.1[M-Cl]+.Anal.Calcd for C23H21ClN2O2S:C,65.01；H,4.98；N,6.59；S,7.55.Found:C,64.85；H,4.75；N,6.89；S,7.95.

实施例2：

化合物2(N-(N’-N’-二乙胺基丙基)苯并噻吨硫杂蒽-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐)的制备：

1)加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐(2.81g,9.23mmol)溶入200mL无水乙醇当中，氮气保护下，加入1.5倍当量的N’，N’–二乙基基丙二胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝8:1)纯化，得到化合物2a：N-(N’，N，-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，产物颜色黄色偏红，产率95％以上。

2)盐酸化：称取适量N-(N’，N，-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，用最少量的二氯甲烷溶解N-(N’，N，-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时。在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑浊，析出大量固体颗粒，这些固体颗粒就是盐酸化的产物。反应完全后抽滤，并用二氯甲烷洗涤后于室温条件下真空干燥得到化合物2的纯品，化合物2颜色为黄红色，化合物2的产率在94％。氯化氢气体的制备为浓硫酸加入到氯化钠固体中，并用无水氯化钙干燥。

化合物2：

产率94.0％,mp 188.4–190.5℃.Then S2a produces S2in the presence ofdry hydrogen chloride according to the general procedure(d)as a yellow solid.Rf:0.17(二氯甲烷/甲醇12/1,v/v),yield 92.6％,mp:>300℃.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ1.33(t,3JH,H＝7.3Hz,6H,2×CH3),2.21(m,2H,NCH2CH2CH2N),3.02-3.08(m,6H,2×+NCH2+CH2N+),4.20(t,3JH,H＝7.05Hz,2H,CONCH2),7.29-7.38(m,4H,6-H,9-H,10-H,11-H),7.99(d,3JH,H＝8.15Hz,1H,5-H),8.06(m,1H,8-H),8.23(d,3JH,H＝8.10Hz,1H,1-H),8.41(d,3JH,H＝8.10Hz,1H,2-H).ESI-Mass:Calcd m/z for C25H25ClN2O2S:452.13；found:417.2[M-Cl]+.Anal.Calcd for C25H25ClN2O2S:C,66.28；H,5.56；N,6.18；S,7.08.Found:C,66.08；H,5.70；N,6.39；S,6.82.

实施例3

化合物3(N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐)的制备：

1)加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐(2.81g,9.23mmol)溶入200mL无水乙醇当中，氮气保护下，加入1.5倍当量的N’，N’–二乙醇基丙二胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝8:1)纯化，得到化合物3a：N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，产物颜色黄色偏红，产率95％以上。

2)盐酸化：称取适量N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，用最少量的二氯甲烷溶解N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时。在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑浊，析出大量固体颗粒，这些固体颗粒就是盐酸化的产物。反应完全后抽滤，并用二氯甲烷洗涤后于室温条件下真空干燥得到化合物3的纯品，化合物3颜色为黄红色，化合物3的产率在90.2％。氯化氢气体的制备为浓硫酸加入到氯化钠固体中，并用无水氯化钙干燥。

化合物3：

Rf:0.13(二氯甲烷/甲醇/醋酸12/1/0.2,v/v),产率90.2％,mp:>300℃.1H-NMR(500 MHz,CD3OD):δ2.26(m,2H,NCH2CH2CH2N),3.03(t,3JH,H＝7.25Hz,2H,CH2N+),3.15(t,3JH,H＝5.20Hz,4H,2×+NCH2),3.94(m,4H,2×CH2OH),4.17(t,3JH,H＝7.5Hz,2H,CONCH2),δ7.26-7.41(m,4H,9-,10-,11-H),7.51(d,3JH,H＝7.95Hz,1H,6-H),8.20-8.23(m,2H,5-,8-H),8.42(d,3JH,H＝8.10Hz,1H,1-H),8.62(d,3JH,H＝8.10Hz,1H,2-H).ESI-Mass:Calcd m/z for C25H25ClN2O4S:484.12；found:449.2[M-Cl]+.Anal.Calcd for C25H25ClN2O4S:C,61.91；H,5.20；N,5.78；S,6.61.Found:C,61.50；H,5.00；N,6.98；S,6.90.

实施例4

化合物4(N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐)的制备：

1)加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐-(1-吡咯烷基)丙胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝8:1)纯化得到化合物4a：N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，产物颜色黄色偏红，产率95％以上。

2)盐酸化：称取适量N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，用最少量的二氯甲烷溶解N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时。在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑浊，析出大量固体颗粒，这些固体颗粒就是盐酸化的产物。反应完全后抽滤，并用二氯甲烷洗涤后于室温条件下真空干燥得到化合物4的纯品，化合物4颜色为黄红色，化合物4的产率在92.7％。氯化氢气体的制备为浓硫酸加入到氯化钠固体中，并用无水氯化钙干燥。

化合物4：

Rf:0.16(二氯甲烷/甲醇12/1,v/v),产率92.7％,mp:>300℃.1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.59(m,4H,CH2CH2CH2CH2),1.80(t,3JH,H＝7.20Hz,2H,NCH2CH2CH2N),2.42-2.44(m,4H,2×+NCH2),2.65(t,3JH,H＝7.30Hz,2H,CH2+N),4.12(t,3JH,H＝7.40Hz,2H,CONCH2),7.48-7.54(m,2H,9-,10-H),7.59-7.61(m,1H,11-H),7.75(d,3JH,H＝8.10Hz,1H,6-H),8.33(d,3JH,H＝8.10Hz,1H,5-H),8.45-8.51(m,3H,1-,2-,8-H).ESI-Mass:Calcd m/z for C25H23ClN2O2S:450.12；found:415.3[M-Cl]+,344.3[M-NC4H9Cl]+.ESI-Mass:Calcd m/z for C25H23ClN2O2S:450.12；found:431.1[M-Cl]+.Anal.Calcd for C25H23ClN2O2S:C,66.58；H,5.14；N,6.21；S,7.11.Found:C,66.34；H,5.30；N,6.20；S,7.26.

实施例5

化合物5(N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐)的制备：

1)加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐(2.81g,9.23mmol)溶入200mL无水乙醇当中，氮气保护下，加入1.5倍当量的5对应：3-(1-哌啶基)丙胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝8:1)纯化，得到化合物5a：N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，产物颜色黄色偏红，产率95％以上。

2)盐酸化：称取适量N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，用最少量的二氯甲烷溶解N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时。在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑浊，析出大量固体颗粒，这些固体颗粒就是盐酸化的产物。反应完全后抽滤，并用二氯甲烷洗涤后于室温条件下真空干燥得到化合物5的纯品，化合物5颜色为黄红色，化合物5的产率在91.5％。氯化氢气体的制备为浓硫酸加入到氯化钠固体中，并用无水氯化钙干燥。

Rf:0.18(二氯甲烷/甲醇12/1,v/v),产率91.5％,mp:>300℃.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ1.53-2.21(m,8H,CH2CH2CH2CH2CH2+NCH2CH2CH2N),2.98(t,3JH,H＝10Hz,2H,CH2N+),3.23-3.25&3.59-3.62(m,4H,2×+NCH2),4.22(t,3JH,H＝7.50Hz,2H,CONCH2),7.39-7.47(m,4H,6-,9-,10-,11-H),8.17(d,3JH,H＝7.5Hz,1H,5-H),8.21-8.24(m,2H,1-,8-H),8.40(d,3JH,H＝8.00Hz,1H,2-H).ESI-Mass:Calcd m/z for C25H25ClN2O2S:464.13；found:429.[M-Cl]+.Anal.Calcd for C25H25ClN2O2S:C,67.16；H,5.42；N,6.02；S,6.90.Found:C,67.34；H,5.21；N,5.87；S,7.21.

化合物5：

实施例6

化合物6(N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐)的制备：

1)加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐(2.81g,9.23mmol)溶入200mL无水乙醇当中，氮气保护下，加入1.5倍当量的3-(1-吗啉基)丙胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱(二氯甲烷：甲醇＝8:1)纯化，得到化合物6a：N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，产物颜色黄色偏红，产率95％以上。

2)盐酸化：称取适量N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，用最少量的二氯甲烷溶解N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时。在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑浊，析出大量固体颗粒，这些固体颗粒就是盐酸化的产物。反应完全后抽滤，并用二氯甲烷洗涤后于室温条件下真空干燥得到化合物6的纯品，化合物6颜色为黄色，化合物6的产率在92.8％。氯化氢气体的制备为浓硫酸加入到氯化钠固体中，并用无水氯化钙干燥。

化合物6：

Rf:0.15(二氯甲烷/甲醇12/1,v/v),产率92.8％,mp:>300℃.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ1.94-1.97(m,2H,NCH2CH2CH2N),2.46(m,4H,2×+NCH2),2.53(t,3JH,H＝7.05Hz,2H,CH2N+),3.64(t,3JH,H＝4.50Hz,4H,2×CH2O),4.27(t,3JH,H＝7.35Hz,2H,CONCH2),δ7.40-7.44(m,3H,9-,10-,11-H),7.52(d,1H,3JH,H＝8.00Hz,6-H),8.20-8.23(m,2H,5-,8-H),8.43(d,3JH,H＝8.00Hz,1H,1-H),8.62(d,3JH,H＝8.10Hz,1H,2-H).ESI-Mass:Calcd m/z for C25H23ClN2O3S:466.11；found:431.1[M-Cl]+.Anal.Calcd for C25H23ClN2O3S:C,64.30；H,4.96；N,6.00；S,6.87.Found:C,64.60；H,5.20；N,6.32；S,6.43.

以下将采用圆二色谱证明由上述方法制得的化合物与G-四链体的作用模式，并采用端粒重复序列扩增实验(Trap assay)和细胞划痕实验(wound healing)鉴定上述苯并硫杂蒽类衍生物的生物活性，此外还采用实时细胞分析技术和TR-PCR、蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定化合物通过调控PD-1基因促进肿瘤细胞凋亡的能力。

实施例1：由前述方法制得的化合物1、3、4(苯并硫杂蒽类衍生物)与端粒DNA富含鸟嘌呤碱基序列的相互作用

(1)样品体系的配制

样本终体积为1.5mL，样品中富含鸟嘌呤碱基的单链DNA的终浓度为4μM，含10mM Tris，0.1mM EDTA，10mM KCl，0.5％DMSO。样品体系于95℃金属浴中变性5min，自然冷却至室温后，于4℃冰箱孵育24h。

上述DNA选自人类端粒26个碱基(26nt)富含鸟嘌呤(富G)的DNA单链：5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3’(由上海生工生物工程有限公司合成、提供)。

(2)实验方法

将样品转入比色皿中，置于J-815圆二色谱仪(JASCO)中测量，设置扫描波长范围为550nm～220nm，扫描速度为100nm/min，取值间隔为1.0nm，狭缝宽度为5.0nm。在测试过程中每隔固定时间分别滴加配好的化合物1、3、4溶液，每5min用移液枪吹搅一次，15min后放入仪器测量。每个样品扫描三次取平均值。

圆二色谱(CD)技术是研究G-四链体多态性的一种较为精确灵敏的技术，不同G-四链体DNA在不同波长范围内有特征性的吸收峰，典型的平行型G-四链体DNA的特征吸收峰为：260nm波长附近有一正的最大CD峰，240nm左右波长处有一负的最大CD值；反平行型G-四链体DNA结构在260nm附近有一负的最大CD峰，在290～295nm波长处有一正的最大CD峰；而混合式(‘3+1’)的G-四链体DNA结构则具有相对较复杂的CD峰值，一般在295nm处有一正的最大CD值，在270nm左右还有一肩峰，260nm处有一负的最大CD值。而双链DNA结构的特征CD峰为：270-280nm左右有一正的最大CD峰，250-260nm左右出现一负的最大CD值。单链且未形成任何二级结构的DNA，其CD峰同于双螺旋的特征CD峰。

图2为化合物1、化合物3和化合物4与富GDNA单链作用的CD图谱。如图所示单独富G DNA单链(短画线)，292.5nm波长处出现一强正CD峰，275nm波长附近有一肩峰，243nm处有一相对较弱的负峰，这是典型混合式(‘3+1’)G-四链体DNA的特征CD峰，也可能包含少量的反平行式的G-四链体。其中化合物单独存在下并未出现CD峰(点画线)，说明化合物是非光学活性的。最重要的是，富G DNA在加入化合物1、化合物3和化合物4后，峰值强度、诱导圆二色谱(简称：ICD)峰及作用比例产生明显的差异性变化。

图2a是化合物1与富G DNA作用的CD图谱，如图所示，随着滴加化合物浓度的增加(化合物/DNA,0.25:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2.0:1、2.5:1、3.0:1、4.0:1)，292.5nm波长下的正CD峰的强度逐渐增强且在2:1时达到饱和，负CD峰逐渐红移到260nm，240nm波长处出现正吸收峰，这是反平行式G-四链体的特征CD峰，且在560nm～425nm处及410nm-335nm处出现ICD峰。此外，在275nm和244nm处CD峰有两个等色点，说明加入化合物1后富G DNA单链存在两种G-四链体构象的转变。由图可知，化合物1与DNA作用比例为2:1。以上结果表明，化合物1作用于富G DNA单链后诱导G-四链体构象由混合式转变为反平行式结构，且化合物1与反平行式G-四链体的作用比例为2:1。同样的，化合物4与富G DNA单链作用的CD图谱表明(图2c)，除了在555nm-425nm处及410nm-335nm处出现的ICD峰，化合物4与化合物1具有相似的作用模式。

如图2b所示，化合物3与富G DNA单链的亲和力、ICD峰及作用比例均与化合物1和4存在一定的差异，随着化合物3滴加浓度的增加(化合物3/DNA＝0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10)，292.5nm波长下的正CD峰逐渐增强，且在作用比例为4∶1时达到饱和。此外，240nm波长下出现特征CD峰且在500nm～435nm处出现较强的ICD峰。图2c中的插图说明化合物3与DNA的作用比例为2∶1和4∶1，表明在化合物3诱导‘3+1’式G-四链体构象向反平行式G-四链体构象转变的过程中存在两种不同的作用模式。

综上，CD实验结果表明，化合物1，3，4可以诱导并稳定端粒26nt富G DNA单链反平行式G-四链体结构的形成，并且具有较强的亲和力和选择性，其中化合物3的作用最明显，由于化合物1～6的核心基团相同，故估计化合物2、5、6也可以诱导并稳定端粒26nt富G DNA单链反平行式G-四链体结构的形成。

实施例2：苯并硫杂蒽类衍生物抑制端粒酶活性

本发明通过端粒重复序列扩增实验，鉴定六种不同侧链苯并硫杂蒽类衍生物对两种肿瘤细胞A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)和SGC-7901细胞(人胃癌细胞)中端粒酶的活性抑制能力。

实验方法

1)细胞前处理：

细胞孵化与培养：冰箱中取出细胞，快速放在37℃水浴锅中振摇，在细胞融化一半时，用电动移液枪将刚好完全融化的细胞转移至预先已加入4mL培养液的15mL的离心管中，再取用培养液洗涤两次，每次需将洗涤后的培养液转移至上述装有细胞的离心管，混匀后离心，取底部细胞，另取新鲜的培养液重悬细胞，洗涤，并且离心。移去上清，重悬沉淀细胞，并按细胞密度将其移植入培养瓶中，放在恒温培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养。

细胞传代：待孵化细胞长满瓶底，弃除原培养液，5mL PBS洗涤贴壁细胞，再次弃除洗涤液，加入1mL 0.25％的胰酶，细胞消化脱离瓶壁后，用电动移液枪吸取5mL培养液吹落瓶壁上的细胞，并将所有的细胞液按照细胞密度平均植入新的培养瓶中，再将补足培养液至10mL，置于恒温培养箱。

(2)收集细胞并充***解。

裂解后的细胞液12000×g，4℃，离心20min。小心吸取上清液(取用80％上清液)置于新的1.5mL离心管中，测量其蛋白浓度，记录数据，再将总提取液进行分装，标上标签，-80℃冷冻保存待用。

(3)PCR扩增

按照(试剂盒)反应体系准备反应所需试剂，并将提取的蛋白按照试剂盒所需浓度进行稀释后待用。根据实验计划配制PCR样本，在200μL离心管中配制上述体系，充分混匀，离心后分装5份，每份体系体积为23.5μL，然后每份体系分别加入1μL的蛋白提取物，再加上0.5μL相应的化合物，充分混匀，离心，置于PCR仪中，按照设置好的程序进行PCR反应。反应结束后样本放置冰箱4℃保存。

(4)凝胶电泳

配制凝胶体系，将胶液注入预先装好的模具玻璃板中，插上梳子待其凝固。凝固完毕后拔出梳子，预电泳30min，上样电泳。电泳条件为恒压模式U＝90V，T＝4h。电泳结束后，取出玻璃板，剥胶，洗涤，染色，暗室处理30分钟后拍照，保存实验结果。

图3、4分别示出化合物1～6对A549细胞和SGC-7901细胞端粒酶活性的影响。在图3与图4中，a、b、c、d、e、f电泳图分别为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6的电泳图，箭头表示36bp内参的位置。

如图所示，加入化合物后，A549细胞和SGC-7901细胞端粒酶活性在一定程度上受到抑制，且化合物1，3，4的抑制作用最为明显，在化合物浓度为1μM时即显现出一定的抑制作用，在化合物浓度增大到4μM时，其扩增程度明显降低，化合物2，5，6抑制端粒酶活性的作用较弱。基于前述CD实验的实施例，端粒酶的活性抑制可能是由于化合物与端粒G-四链体作用并在一定程度上诱导反平行式G-四链体结构的形成所导致，从而促进肿瘤细胞迁移的抑制。

实施例3：苯并硫杂蒽类衍生物对两种肿瘤细胞迁移的影响

通过细胞划痕实验考查苯并硫杂蒽类衍生物(化合物1～6)对A549细胞和SGC-7901细胞迁移的影响。

(1)细胞培养：按上述实施例2中方法培养A549细胞和SGC-7901细胞。

(2)种板：待细胞铺满培养瓶瓶底，且细胞状态饱满，形态良好时，将细胞收集起来，取一滴细胞液进行细胞计数，按照20万/mL的细胞密度稀释细胞液，将稀释后的细胞液混匀后转移种植到12孔板中，每孔mL细胞液，再补加1mL培养液，充分摇匀后放入恒温培养箱中培养24h。

(3)细胞划痕：将培养24h后的细胞用细枪头划线，使铺满培养板底部的细胞中间呈现均匀笔直的痕条，移去原培养液，加入1mL PBS洗涤细胞，重复洗涤2～3次，再向孔板中每孔加入1mL培养液(不加FBS)，置于显微镜下拍片并保存。

(4)加化合物：将拍照完毕的细胞板按每孔设计的化合物浓度加入相应的化合物，补足体积至每孔2mL，充分摇匀后，放置恒温培养箱中培养24h。

(5)拍照获取实验结果：将加入化合物后继续培养24h的细胞放置电子显微镜下，拍出同一位置加入化合物之后的划痕及划痕周围的细胞图片保存。根据原始细胞划痕致伤区距离计算出细胞实际的转移距离。

抑制率(％)＝(对照组平均转移距离-药物组平均转移距离)/对照组平均转移距离

在图7与图8中，a、b、c、d、e、f分别表示化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6对应的图。如图5至图8所示，细胞进行划痕处理及加药24h拍照，加化合物组与对照组相比，加入化合物以后，细胞的迁移明显受到抑制，且细胞迁移抑制率随着化合物浓度增大而增大。当化合物浓度为0.1μM时，细胞的迁移抑制作用并不明显，当化合物浓度增加到0.2μM时，表现出明显的抑制肿瘤细胞迁移的作用，抑制率均在60％以上，其中化合物1、3、4的作用最为明显。此外，当化合物浓度增加到0.4μM时，对SGC-7901细胞的抑制率均高于对A549细胞，但是化合物5除外。并且，化合物3表现出最为明显的抑制作用，对A549细胞和SGC-7901细胞的抑制率分别高达94.1％和97.2％，这与前述实验面结果一致。结果说明苯并硫杂蒽类衍生物1～6能抑制肿瘤细胞的迁移，具有一定的生物活性，且化合物3作用最为明显。

实施例4：苯并硫杂蒽类衍生物对PD-1基因高表达的JF305细胞和Bel-7402细胞的生长抑制作用

本发明使用由Roche公司开发的先进的实时细胞检测分析技术(Real Time Cellular Analysis，RTCA)，精确地检测苯并硫杂蒽类衍生物1～6对JF305细胞(人胰腺癌细胞)和Bel-7401细胞(人肝癌细胞)两种肿瘤细胞的细胞毒性，并给出IC50值。

使用的肿瘤细胞株：

JF305细胞(人胰腺癌细胞)在RPMI 1640培养基中(含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，37℃、5％的CO₂、饱和湿度下进行培养。

Bel-7401细胞(人肝癌细胞)在RPMI 1640培养基中(含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，37℃、5％的CO₂、饱和湿度下进行培养。

RTCA实验：

(1)首先通过正常的细胞培养方法经过细胞的复苏、细胞的传代、细胞的冻存在细胞培养瓶培养目的肿瘤细胞，待其进入对数期并生长状态良好时，用以实时细胞分析实验。

(2)取E-Plate 96孔板，每孔加入95L RPMI 1640培养液，孔间隙中加入100L PBS用于保持湿度。将细胞分析板置于37℃下孵育30min，随后放入仪器内，扫描背景值。

(3)将培养瓶内肿瘤细胞消化、重悬、计数，用培养液调节细胞浓度为1×10⁴左右的细胞悬液。从仪器中取下E-Plate 96孔板每孔中加入100L细胞悬液，将其置于37℃下孵育30min。之后放回恒温培养箱内的细胞分析仪上，连接运行仪器，设置每15min扫描一次细胞指数，即可得到连续的细胞指数曲线。

(4)配置化合物：设置化合物1～6的浓度梯度为0.2M、0.4M、0.8M、1.6M、2.0M。

(5)通过观察细胞曲线，肿瘤细胞约在20小时后进入对数生长期，此时暂停扫描，取下E-Plate 96孔板，在实验组的各孔内加入不同浓度的5L化合物。对照组加入5L含有0.5％DMSO的RPMI 1640培养液，空白组加入5L无血清RPMI 1640培养液。

(6)将E-Plate 96孔板置于培养箱37℃下孵育10min后，放回细胞分析仪中，继续扫描细胞指数，持续观察。实验结束，使用软件分析细胞指数曲线和数据。

图9示出RT-CA***检测的六种化合物在不同浓度下的JF305细胞的生长CI曲线，其中，DMSO：二甲基亚砜，这里应用0.5％溶液作为参比样品，(a)为化合物1；(b)为化合物2；(c)为化合物3；(d)为化合物4；(e)为化合物5；(f)为化合物6。如图所示，在药物浓度为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、2.0μM时，化合物1～6对细胞均有一定的抑制，且基本呈现剂量依赖的关系。化合物1～5在最大浓度2.0μM时对细胞生长基本完全抑制。IC₅₀值(表1所示)的结果说明化合物1的活性最好，化合物3与4的值基本接近。

表1.化合物1～6对JF305细胞的IC₅₀值

化合物	1	2	3	4	5	6
							IC₅₀(μM)	0.22	0.50	0.45	0.23	0.26	29.2

图10示出RT-CA***检测的六种化合物在不同浓度下的Bel-7402细胞的生长CI曲线，其中，DMSO：二甲基亚砜，这里应用0.5％溶液作为参比样品，(a)为化合物1；(b)为化合物2；(c)为化合物3；(d)为化合物4；(e)为化合物5；(f)为化合物6。如图所示，化合物1对Bel-7402细胞呈现良好的细胞毒性，在0.8μM时，细胞指数曲线基本持平，说明Bel-7402细胞的生长受到完全的抑制。化合物28对Bel-7402细胞的抑制效果与化合物1相似，但在1.6μM时细胞指数不再增长，说明化合物2抑制细胞生长的效果不如化合物1。观察其他几个化合物作用于细胞的生长CI曲线，发现作用效果最好的是化合物1。此外，如图所示，相比于JF305细胞和化合物作用的CI曲线，Bel-7402细胞和化合物1、3和4作用的生长CI曲线随化合物浓度增加而下降的幅度没有JF305细胞的明显，说明化合物1、3和4对Bel-7402细胞的生长抑制能力较JF305细胞弱。表2列出的IC₅₀值同样说明，化合物1的活性最好，化合物3和4次之，化合物6的IC₅₀值最大，活性最小。

表2.化合物1～6对Bel-7402细胞的IC₅₀值

化合物	1	2	3	4	5	6
							IC₅₀(μM)	0.32	0.59	0.51	0.37	0.30	18.3

实施例5：苯并硫杂蒽类衍生物对JF305细胞和Bel-7401细胞中PD-1基因表达的影响

(1)肿瘤细胞RNA的提取：实验中，首先在体外培养目的肿瘤细胞JF305和Bel-7401细胞，待观察其生长状态良好时，经过消化、重悬、计数，以2×10⁵cell/孔接种于12孔板，设置化合物的使用浓度为：0μM、1μM、5μM、10μM。加入药物24h后，收集化合物作用后的肿瘤细胞，使用RNeasy mini kit试剂盒提取肿瘤细胞总RNA。

(2)RT-PCR实验：首先进行反转录反应(Fermentas)，然后进行PCR反应，反应条件为：①变性：95℃，2min；②循环：94℃，15sec；62℃，30sec；72℃，1min；30cycles；③延伸：72℃，10min；④保存：4℃。PCR反应结束后，各取5μL的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶紫外成像***拍照保存。

(3)进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像***拍照，记录并用软件分析实验结果。

(4)然后进行肿瘤细胞蛋白提取，使用酶标仪，BCA法(碧云天BCA蛋白浓度检测试剂盒)测定蛋白浓度，-80℃保存备用。

(5)通过蛋白免疫印迹(Western blot)方法测定PD-1基因在苯并硫杂蒽类衍生物存在和不存在下的蛋白表达量。

化合物对JF305细胞PD-1表达的抑制实验结果如图11和图12所示：

如图11所示，与对照组相比，JF305细胞的PD-1基因的转录水平呈现出不同程度的降低，呈现剂量依赖的关系，但其中化合物6对JF305细胞PD-1的表达影响较弱。化合物在1μM的浓度时，作用效果不明显。通过进一步处理分析，当药物浓度达到5μM时，化合物1、2、3、4、5表现出对PD-1转录的抑制，PD-1的表达量分别下降了30.8％、38％、36.4％、47.3％、54.7％，在最大浓度10μM时，化合物1～5对PD-1转录的抑制均能超过60％。

如图12所示，化合物1～5对JF305细胞PD-1的表达有较明显的抑制，作用活性的强弱与PCR结果并不完全相符，但基本都呈现剂量依赖的关系。化合物6作用效果较弱。

化合物对Bel-7401细胞PD-1表达的抑制实验结果如图12和图13所示:

如图13所示，与不加化合物的对照组相比，Bel-7401细胞的PD-1基因的转录水平呈现出不同程度的降低。通过进一步处理分析，化合物1～6在1μM的浓度下，对Bel-7401细胞的抑制作用并不明显，当用药浓度达到5μM时，化合物1、3、4对PD-1的转录受有明显的抑制，PD-1的表达量分别下降了55.2％、56.7％、35.8％，化合物6在所有浓度下的抑制活性均较弱。

如图14所示，在浓度为5μM时，Bel-7401细胞PD-1蛋白的表达量在不同化合物下分别下降了了33％、21.1％、68.8％、35.9％、17.4％、0％；在化合物浓度为10μM时，PD-1的表达量分别降低了75％、66.5％、60％、55.3％、18.5、24.1％。综合分析，可以看出化合物1、3、4对PD-1蛋白的抑制最明显，化合物2和5较弱，化合物6抑制活性非常弱，实验结果与RT-PCR的结果基本相同。

通过实施例5，说明苯并硫杂蒽类衍生物是通过抑制PD-1基因表达对JF305细胞和Bel-7401细胞增长产生细胞毒性。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims

1.一种苯并硫杂蒽类衍生物，其特征在于，该化合物选自：

化合物2a：N-(N^，，N^，-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物3a：N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物4a：N-(3-氨基丙基吡咯烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物5a：N-(3-氨基丙基哌啶烷基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺；

化合物6a：N-(3-氨基丙基吗啉)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺。

2.一种苯并硫杂蒽类衍生物，其特征在于，该化合物选自：

3.一种制备权利要求2所述的化合物的方法，其特征在于，将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐溶入无水乙醇中，氮气保护下，加入边链胺，加热搅拌回流；待苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱纯化得到固体；用最少量的二氯甲烷溶解纯化后的所述固体，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时，然后抽滤得目标产物。

4.如权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

加边链：将苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐溶入无水乙醇当中,氮气保护下，加入1.5倍当量的边链胺，80℃加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k,l]硫杂蒽-3,4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱纯化得到固体；

5.如权利要求2或3所述的化合物的制备方法，其特征在于，

所述边链胺为N^，，N^，–二甲基丙二胺，所述固体为N-(N^，，N^，-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(N^，-N^，-二甲基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

或者所述边链胺为N^，，N^，–二乙基基丙二胺，所述固体为N-(N^，，N^，-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(N^，-N^，-二乙基胺基丙基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

或者所述边链胺为N^，，N^，–二乙醇基丙二胺，所述固体为N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(3-氨基丙基二乙醇基)苯并噻吨-3,4-二甲酰亚胺盐酸盐；

6.权利要求1或2所述的苯并硫杂蒽类衍生物，其特征在于，适于做抗癌药物或抗癌药物组合物的有效成分。