CN105669763B - 9‑氨基氧化异阿朴啡‑铂(ii)配合物及其合成方法和应用 - Google Patents

9‑氨基氧化异阿朴啡‑铂(ii)配合物及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种9‑氨基氧化异阿朴啡‑铂(II)配合物及其合成方法和应用。该9‑氨基氧化异阿朴啡‑铂(II)配合物是以9‑氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)为原料，在极性溶剂中进行配位反应，制得目标产物。申请人的研究表明，本发明所述配合物对端粒酶的抑制作用相对于现有的1‑氮杂苯并蒽酮的铂(II)配合物和6‑羟基氧化异阿朴啡的铂(II)配合物有明显提高，达到了56.97％，对端粒酶活性抑制作用明显；且该配合物对多种人肿瘤细胞株和一株正常肝细胞具有较好的选择性和显著的体外抗肿瘤活性。本发明所述配合物的结构式如下式(I)所示：

Description

9-氨基氧化异阿朴啡-铂(II)配合物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种9-氨基氧化异阿朴啡-铂(II)配合物及其合成方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤大约占当今世界疾病的25％，是目前危及人类生命的最主要疾病之一。目前，化学药物治疗疗、放射性物理疗法是治疗恶性肿瘤的传统手段之一，其中，以顺铂为代表的数种无机铂类抗癌药物对多种癌症类型(如睾丸癌、子宫癌，膀胱癌、肺癌、***癌等)有良好的治愈效果。然而，顺铂、卡铂、奥沙利铂、乐铂、庚铂等铂类药物存在水溶性低、较严重的毒性和胃肠道反应等副作用，其临床应用受到明显限制(Rosenberg,B.；etal.Nature,1965,205:698-699.)。因此，设计合成具有高选择性的铂类抗肿瘤药物将是创新药物的一个方向(如靶向端粒G-四连体或端粒酶等)，继而基于药用活性配体的金属抗肿瘤药物化学成为一个新的研究热点(Bowen,M.L.；et al.Dalton Trans.,2009,9928-9236.)，也带动了无机药物化学的研究。
20世纪30年代初，著名遗传学家Muller和Barbava MeClintock发现了端粒(telomere)结构的存在，它能够以自身的RNA为模板，延伸端粒的长度，维持染色体末端的端粒序列，从而抵消因细胞***而导致的端粒DNA的消耗。随后，Kim等人研究出端粒酶活性检测的TRAP-PCR方法，并提出其活性与肿瘤的发生发展有着特殊的关系(Kim,N.W.；etal.Science,1994,266:2011–2015.)。研究指出端粒酶在肿瘤细胞中参与了对肿瘤细胞的凋亡和基因组稳定的调控过程；而且，85％以上的人类的恶性肿瘤细胞中能够检测到端粒酶的活性，使其成为一个几乎普遍的癌标志物，而在大多数正常体细胞中，端粒酶是阴性的。因此，抑制端粒酶的活性可能是一个很好地降低癌细胞生长的抗肿瘤策略。另一方面，端粒酶活性与细胞的永生化有着密切的关系，使之成为治疗老年痴呆症的关键靶点。
氧化异阿朴啡是一种优良的有机配体，本发明人之前合成得到了一系列氧化异阿朴啡的铂(II)配合物，如1-氮杂苯并蒽酮的铂(II)配合物(公开号为CN103450281A)及6-羟基氧化异阿朴啡的铂(II)配合物(公开号为CN103421048A)等。本发明人的研究表明，1-氮杂苯并蒽酮的铂(II)配合物与6-羟基氧化异阿朴啡的铂(II)配合物均可选择性稳定端粒、原癌基因(c-myc)G-四链体，对端粒酶的抑制率分别为40.28％和43.96％(Chen,Z.F.；etal.J.Med.Chem.2015,58:2159-2179.)。然而，上述配合物中的氧化异阿朴啡配体均是通过母环上的1-N和11-C以双齿螯合配位方式与金属离子(如铂(II))配位，申请人认为这在一定程度上破坏了氧化异阿朴啡母环的芳香平面性，从而影响其电子云密度和可能的活性位点；而良好的芳香平面性和电子云密度被认为是靶向作用于端粒酶和端粒G-四链体的关键结构因素，这也是上述的两种铂配合物的端粒酶抑制活性仍然比较偏低的原因。
申请人对现有技术进行检索，尚未发现有以9-氨基氧化异阿朴啡为配体的铂(II)配合物及其合成方法和应用的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的9-氨基氧化异阿朴啡-铂(II)配合物，以及它的合成方法和应用。
本发明涉及下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：
上述式(I)所示化合物的化学名称为二氯·二甲基亚砜·9-氨基氧化异阿朴啡合铂(II)配合物，化学式为C18H16Cl2N2O2PtS，分子量为589g/mol。
上述化合物的合成方法为：取9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，溶解于极性溶剂中，进行配位反应，即得到目标产物。其合成路线如下：
更为具体的合成方法包括以下步骤：
1)取9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，溶解于极性溶剂中，得到混合溶液；
2)所得混合溶液于常温至极性溶剂的回流温度范围内进行配位反应；
3)将反应后溶液过滤，分离出固体，即得到目标产物。
本发明所述的合成方法中，9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)的物质的量之比通常为1：0.8～1.2。
本发明所述的合成方法中，所述的极性溶剂为甲醇和乙腈的组合，或者是甲醇和乙腈与选自丙酮和二甲基亚砜中的一种或两种的组合；所述甲醇的浓度为50～90v/v％，优选为60～70v/v％；在极性溶剂的组成中，所述甲醇在极性溶剂中所占的比例为0.5～99.5v/v％，乙腈在极性溶剂中所占的比例为0.5～99.5v/v％，丙酮在极性溶剂中所占的比例为0～99v/v％，二甲基亚砜在极性溶剂中所占的比例为0～99v/v％。优选地，所述甲醇在极性溶剂中所占的比例为1～99v/v％，乙腈在极性溶剂中所占的比例为1～99v/v％，丙酮在极性溶剂中所占的比例为0～98v/v％，二甲基亚砜在极性溶剂中所占的比例为0～98v/v％；进一步优选甲醇在极性溶剂中所占的比例为5～95v/v％，乙腈在极性溶剂中所占的比例为5～95v/v％，丙酮在极性溶剂中所占的比例为0～90v/v％，二甲基亚砜在极性溶剂中所占的比例为0～90v/v％。所述极性溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，1mmol的9-氨基氧化异阿朴啡和0.8～1.2mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)用70～160mL的极性溶剂来溶解。在具体的溶解步骤中，可将9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)分别用极性溶剂溶解(此时，用来溶解9-氨基氧化异阿朴啡的极性溶剂最好选用甲醇和乙腈两种混合溶剂)，再混合在一起反应；也可将9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)混合后再加极性溶剂溶解。
本发明所述的合成方法中，配位反应优选是在加热条件下进行，更优选是在60℃至极性溶剂的回流温度范围内进行。配位反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测，当配位反应是在60℃至极性溶剂的回流温度范围内进行回流反应时，反应至完全大约需要12～48h的时间；也可根据需要将反应时间延长至48h以上。当反应在常温或60℃以下的加热条件下进行时，反应至完全需要更长的时间。
本发明所述的合成方法中，当前序步骤中极性溶剂的加入量较大(如接近配比的上限)或溶剂对产物的溶解性较好时，则反应后溶液可能呈澄清状态，这是因为所形成的产物沉淀被极性溶剂溶解所致，此时可将反应后溶液减压蒸馏以除去部分溶剂(除去极性溶剂加入量的75～90％)，使产物主要以沉淀形式析出，取出析出的沉淀后再进行下一步操作。
本发明所述合成方法中涉及的原料9-氨基氧化异阿朴啡可参考现有文献(Tang,H.；et al.Eur.J.Med.Chem.,2009,44:2523-2532.)进行制备，另一种原料二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)为顺式二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，可参考现有文献(Al-Allaf T AK,et al.Trans.Met.Chem.，1998)进行制备。
本发明还包括上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明进一步包括以上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的抗肿瘤药物。
更进一步地，本发明还包括上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备端粒酶抑制剂中的应用。以及以本上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的端粒酶抑制剂。
与现有技术相比，本发明提供了一种结构新颖的9-氨基氧化异阿朴啡-铂(II)配合物及其合成方法和应用。本发明人有目的地选择9-氨基氧化异阿朴啡生物碱为活性配体，通过对配合物合成条件的控制，首次获得了目标配合物——二氯·二甲基亚砜·9-氨基氧化异阿朴啡合铂(II)配合物，这也是在国内外首次报道的该生物碱的金属配合物。与现有的此类配合物相比，该配合物的配位结构明显不同，配体9-氨基上的N原子与铂(II)单齿配位，母环上的原子或基团未参与配位，这种配位模式最大程度地保留了氧化异阿朴啡母环的完整性，几乎不改变其芳香平面性和电子云密度，从而为获得具有更高端粒酶抑制活性的新型配合物提供了结构基础。而实验结果也充分显示，本发明所述配合物对端粒酶的抑制作用相对于现有的1-氮杂苯并蒽酮的铂(II)配合物和6-羟基氧化异阿朴啡的铂(II)配合物有明显提高，达到了56.97％，对端粒酶活性抑制作用明显。此外，申请人对该配合物对多种人肿瘤细胞株和一株正常肝细胞HL-7702的增殖抑制活性的试验结果表明，该配合物具有较好的选择性和显著的体外抗肿瘤活性。因此，本发明所述配合物具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。
附图说明
图1为本发明制得的9-氨基氧化异阿朴啡的电喷雾质谱谱图；
图2为本发明实施例1制得的最终产物的电喷雾质谱谱图；
图3为本发明实施例1制得的最终产物对端粒酶的抑制作用结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
以下各实施例中所涉及的配体L为9-氨基氧化异阿朴啡的简称，该配体L的合成参照现有技术进行合成(Tang,H.；et al.Eur.J.Med.Chem.,2009,44:2523-2532.)，具体如下：
将15.0g(约0.1mol)邻苯二甲酸酐和2.0g(约0.1mol)4-溴苯乙胺溶于100mL乙醇中，回流5小时，趁热过滤，冷却至室温，析出结晶，抽滤，得到白色片状晶体化合物a，产率75％。将75g(0.56mol)的无水三氯化铝和15g氯化钠混合加热至140℃熔融，向其缓慢加入53g(0.2mol)的化合物a，加入完毕，升温至180℃，搅拌反应2小时，乘热导入研磨中，冷却，捣碎，得到化合物b，最后分批加入到80℃的100mL浓硫酸中，加入完毕，升温至260℃，搅拌反应2小时，冷却，倒入到约600g的冰中，用NaOH调节pH值约2-3，析出大量固体，抽滤，水洗，得到粗产品。粗产品用醋酸重结晶，140℃真空干燥24小时，得到黄色的1-氮杂苯并蒽酮，产率约31％。(Chen,Z.F.；et al.J.Med.Chem.2015,58:2159-2179)。
在冰浴中，向含有63％的硝酸1.2mL和12mL浓硫酸的混合液中加入2.3g(0.01mol)l-氮杂苯并蒽酮，反应于冰浴中反应l小时，室温反应l小时，55℃反应1小时，冷却后导入约100g的冰中，用氨水中和至pH值为7-8。过滤，用水洗涤。粗产品用甲苯重结晶，得到橙黄色针状晶体—9-硝基-1-氮杂苯并蒽酮，产率约55％。将9-硝基-1-氮杂苯并蒽酮2.8g(0.01mol)和九水合硫化钠5.5g(22.5mmol)在100mL乙醇和水(乙醇：水(体积比)＝7：3)回流6小时，冷却，减压蒸掉乙醇，静置，抽滤，得到粗产品。粗产品用甲苯重结晶，得到9-氨基氧化异阿朴啡为暗红色固体。
对所得暗红色固体进行鉴定：
(1)红外光谱，具体波谱表征数据如下：
IR(KBr):3426,3332,3206,3043,1658,1636,1597,1495,1437,1394,1348,1321,1284,1260,1167,1002,882,838,807,764,714,655,585,539,439cm-1。
(2)电喷雾质谱，其谱图如图1所示。
ESI-MS m/z:247.2[M+H]+，其中M为L的分子量。
(3)的元素分析结果，如下述表1所示。
表1 配体L和实施例1中配合物1的元素分析结果
实施例1：
准确称量0.5mmol的配体L与0.5mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，将配体L溶解于55mL的70v/v％甲醇和乙腈(甲醇和乙腈的体积比为1:1))中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于2mL的二甲基亚砜和丙酮(二甲基亚砜和丙酮的体积比为3:1)的混合溶液中，两种溶液混合，在65℃下反应24小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的85％)后，冷却至室温静置，析出黄色固体产物(产率95％)。
对所得黄色固体产物进行鉴定：
(1)红外光谱，具体波谱表征数据如下：
IR(KBr):3527,3216,3110,2917,1653,1601,1494,1439,1396,1299,1222,1131,1026,977,920,843,768,716,655,590,503,441cm-1。
(2)核磁共振氢谱谱图，具体波谱表征数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.63(d,J＝5.5Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,2H),8.31(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(t,J＝7.7Hz,1H),7.79(d,J＝5.5Hz,1H),7.40(d,J＝1.8Hz,1H),7.04(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),6.04(s,2H),2.53(s,6H).
(3)核磁共振碳谱谱图，具体波谱表征数据如下：
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ183.57,151.86,149.32,144.48,135.26,134.60,133.62,131.29,129.88,129.12,127.28,124.89,121.27,120.42,119.60,110.46,40.82×2.
(4)电喷雾质谱，其谱图如图2所示。
ESI-MS m/z:589.11[M-DMSO+Cl+CH3CN]-，其中M为配合物1的分子量。
(5)元素分析结果，如上述表1所示。
因此，可以确定所得的黄色固体产物即为目标产物二氯·二甲基亚砜·9-氨基氧化异阿朴啡合铂(II)配合物(以下简称为配合物1)，其结构式如下：
实施例2
准确称量物质的量为0.5mmol的配体L与0.4mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，将配体L溶解于35mL的85v/v％甲醇和乙腈(甲醇和乙腈的体积比为20:80)混合溶液中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于5mL的丙酮中，两种溶液混合，在80℃下反应48小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的90％)后，冷却至室温静置，析出黄色固体目标产物(产率80％)。
实施例3
准确称量物质的量为0.5mmol的配体L与0.55mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，将配体L溶解于43mL的60v/v％甲醇和乙腈(甲醇和乙腈的体积比为0.6:99.4)混合溶液中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于1mL的二甲基亚砜中，两种溶液混合，在60℃下反应12小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的75％)后，冷却至室温静置，析出黄色固体目标产物(产率85％)。
实施例4
准确称量物质的量为0.5mmol的配体L与0.5mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，将配体L溶解于69mL的81v/v％甲醇和乙腈(甲醇和乙腈的体积比为50:1)混合溶液中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于5mL二甲基亚砜和丙酮(体积比为1:1)的混合溶液中，两种溶液混合，在78℃下反应36小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的77％)后，冷却至室温静置，析出黄色固体目标产物(产率92％)。
实施例5
准确称量物质的量为0.5mmol的配体L与0.48mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，将配体L溶解于41mL的64v/v％甲醇和乙腈(体积比为5:1)混合溶液中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于0.5mL二甲基亚砜和丙酮(二甲基亚砜和丙酮体积比为5:1)中，两种溶液混合，在70℃下反应32小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的79％)后，冷却至室温静置，析出黄色固体目标产物(产率82％)。
实施例6
准确称量物质的量为0.5mmol的配体L与0.6mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，将配体L溶解于80mL的64v/v％甲醇和乙腈(甲醇和乙腈的体积比为99.5:0.5)混合溶液中，然后向其中加入二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，溶解后在77℃下反应28小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的75％)后，冷却至室温静置，析出黄色固体目标产物(产率95％)。
实施例7
准确称量0.5mmol的配体L与0.6mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，将配体L和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于80mL的极性溶剂(由90v/v％甲醇、乙腈和丙酮按0.5：0.5：99的体积比组成)中，在60℃下反应48小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的80％)后，冷却至室温静置，析出黄色固体目标产物(产率82％)。
为了充分说明本发明所述的配合物1在制药中的用途，申请人对配合物1进行了抗肿瘤活性实验，其次探讨在Hep-G2细胞内对端粒酶的抑制作用。
一、配合物1对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：
1、细胞株与细胞培养
本实验选用人肝癌细胞BEL-7402和Hep-G2、卵巢癌细胞SK-OV-3、人肺癌细胞NCI-H460、人结直肠腺癌细胞HCT-8以及人正常肝细胞HL-7702等6种人类细胞株。
所有细胞株均培养在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养。
2、待测化合物的配制
所用的配体L和配合物1(按实施例1所述方法制备)的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配制成20μmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的终浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长的抑制程度。
3、细胞生长抑制实验(MTT法)
(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
(2)5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；
(3)5％CO2，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h；
(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。
(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：
计算化合物对肿瘤细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算各受试化合物对几种肿瘤细胞株的IC50值。其结果如以下表2所示。
表2：配体L和配合物1对不同肿瘤细胞株的IC50值(μM)
从基于IC50值的抗肿瘤活性测试结果来看，配合物1对多种人肿瘤细胞株均显示出很强的增殖抑制活性，显著高于配体L。其中，配合物1对人肝癌细胞Hep-G2和人肺癌细胞NCI-H460的抑制作用最强，其IC50值分别为9.89±0.47和14.25±1.64μM，活性与配体L相比提高了3.4～10.9倍以上；且其活性也显著高于顺铂，相对于顺铂，配合物1分别提高了约1.4和1.3倍。另一方面，配合物1对人正常肝脏细胞HL-7702的细胞毒性仍然较小，与配体L相当，且显著低于顺铂，显示出对肿瘤细胞良好的毒性选择性。
二、配合物1在Hep-G2细胞内对端粒酶的抑制作用：
1、细胞培养和加药方式
所选细胞株为Hep-G2细胞，药物作用时间为24小时，药物终浓度为10μM，细胞培养和加药方式等其他步骤参照前述步骤进行。
2、端粒酶提取和抑制实验
端粒酶提取盒采用北京中西远大公司的端粒酶提取盒，货号NKJ15DLM，-20℃保存。
2.1、端粒酶提取
配合物1作用后，从Hep-G2细胞抽取端粒酶提取液，端粒酶的银染实验(TRAP-silver staining assay)参照Reed等人(Reed,J.E.；et al.J.Am.Chem.Soc.,2006,128:5992–5993.)报道的方法进行。详细步骤如下：
(1)收集不少于1×106个细胞(约为6孔板的1-2孔细胞量)，离心2000rpm，5min，离心收集细胞，预冷的PBS洗涤后于冰浴上研磨匀浆；
(2)加入1mL冰冷的Wash buffer(使用前每毫升PBS中加入1μL(1mol/L)的DTT)，重悬上述样品，置冰上5min，4℃离心(3,000rpm，5min)，弃上清；
(3)加入40μL冰冷的Lysis buffer(用前每1mL Lysis buffer中加入0.5μL PMSF和0.5μLβ-巯基乙醇)悬浮沉淀，涡旋振荡10s，置冰上45min，4℃，离心(13,000rpm，30min)取上清；
(4)上清转移至新的EP管中(必要时测定总蛋白浓度)以Lysis buffer调浓度10μg/μL，于-20℃保存备用；
2.2、PCR扩增
(1)吸取5μL 10×TRAP buffer，另加入1μL dNTPs，1μL Taq-DNA polymerase，1μLTS primer，2μL端粒酶提取物，然后加入39μL灭菌超纯水，于室温下保温30min；
(2)加入1μL CX primer混匀，在扩增仪上进行30个循环，94℃预热5min，设置循环参数如下：94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸90s；最后72℃延伸5min，4℃保存产物并尽快电泳。
2.3、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)制备12％非变性聚丙烯酰胺凝胶(10mL)：包括30％Acr-Bis(29:1)4mL、H2O(4.92mL)、10×TBE(1mL)、10％APS(70μL)和10μL的TEMED。
(2)取9μL PCR产物加上1μL 10×上样缓冲液，于电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳预跑45min，在电压220V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳2h；
2.4、硝酸银染色
(1)将凝胶置10％乙酸固定30min，去离子水漂洗3次，每次5min；
(2)将凝胶置于0.2g/L硫代硫酸钠浸泡1min，去离子水漂洗3次，每次30s；
(3)将凝胶置于硝酸银染液染色30min，去离子水漂洗30s；
(4)将凝胶置于显色液中显色10-15min左右直到条带显色完全为止；
(5)最后将凝胶置于10％乙酸浸泡5min终止反应。
2.5、结果判断与数据处理：
PCR扩增产物以硝酸银染色，出现6bp或间隔6bp整数倍的梯形条带为阳性结果，以凝胶成像软件测定条带，得出各标本的相对吸光度IOD值代表端粒酶活性。阳性条带以Gelpro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD(integrated optical density)累积光密度，每次均设有空白对照组。计算公式如下：
计算化合物对Hep-G2肿瘤细胞中端粒酶的抑制率，其实验结果如以下图3所示。
从端粒酶实验结果可以看出，在人肝癌细胞Hep-G2中，配合物1(10μM)对端粒酶的抑制作用高达56.97％，其抑制作用远远大于同等浓度下的顺铂(抑制率为17.89)；与本申请人已经报道的1-氮杂苯并蒽酮与6-羟基氧化异阿朴啡的铂(II)配合物的端粒酶抑制活性相比(抑制率分别为40.28％和43.96％)，也显著提高，充分说明配合物1对端粒酶具有了更高的靶向作用，是一种较好的端粒酶抑制剂。
综上所述，本发明所述的配合物1表现出优异的体外抗肿瘤活性和选择性，对肿瘤细胞的细胞毒性优于配体L，具有良好的潜在药用价值，是一种较好的端粒酶抑制剂。

Claims (8)

1.下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：
2.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：取9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，溶解于极性溶剂中，进行配位反应，即得到目标产物；所述的极性溶剂为甲醇和乙腈的组合，或者是甲醇和乙腈与选自丙酮和二甲基亚砜中的一种或两种的组合；所述甲醇的浓度为50～90v/v％；在极性溶剂的组成中，所述甲醇在极性溶剂中所占的比例为0.5～99.5v/v％，乙腈在极性溶剂中所占的比例为0.5～99.5v/v％，丙酮在极性溶剂中所占的比例为0～99v/v％，二甲基亚砜在极性溶剂中所占的比例为0～99v/v％。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取9-氨基氧化异阿朴啡和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，溶解于极性溶剂中，得到混合溶液；
2)所得混合溶液于常温至极性溶剂的回流温度范围内进行配位反应；
3)将反应后溶液浓缩过滤，分离出固体，即得到目标产物。
4.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于：配位反应在60℃至极性溶剂的回流温度范围内进行。
5.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.以权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的抗肿瘤药物。
7.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备端粒酶抑制剂中的应用。
8.以权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的端粒酶抑制剂。
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