CN102532192B

CN102532192B - 一种对乙酰氨基酚—磷酰氮芥抗肿瘤药物及其制备方法

Info

Publication number: CN102532192B
Application number: CN201110434041.8A
Authority: CN
Inventors: 宋杨; 宋尔群; 李效尧
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2031-12-22
Also published as: CN102532192A

Abstract

本发明提供了一种具有双活性功能基团的氮芥类化合物，及其作为抗肿瘤药物的应用。该化合物结构如下：通过体外抗肿瘤实验发现，本发明化合物对人肝癌细胞有较好的抑制作用，通过体外DNA交联实验发现其对质粒DNA有较好的交联作用，通过小鼠镇痛实验发现其有较好的镇痛效果。本发明合成步骤简单，抗肿瘤效果好，并且可能在体内模拟对乙酰氨基酚的镇痛作用，是一种具有双功能的抗肿瘤药物，具有极大的药用价值。

Description

一种对乙酰氨基酚—磷酰氮芥抗肿瘤药物及其制备方法

技术领域

本发明所涉及医药领域，一种对乙酰氨基酚-磷酰氮芥衍生物的抗肿瘤化合物。

背景技术

氮芥是最早用于临床并取得突出疗效的烷化剂类抗肿瘤药物，具有高度活泼的性质。由于氯乙基中氯原子容易脱去形成碳正离子，再进一步发生分子内成环反应，形成高度活泼的乙烯亚胺离子。氮芥可以和其他体内大分子的亲核基团发生反应，如蛋白质的羧基、氨基、巯基、核酸的氨基和羟基、磷酸根等，进行烷基化修饰。氮芥容易与鸟嘌呤第7位氮共价结合，产生DNA的双链内的交叉联结或DNA的同链内不同碱基的交叉联结。

氮芥为细胞周期非特异性药物，作为抗肿瘤药物时选择性差，存在严重的副作用，影响了临床的使用。所以设计低毒的氮芥类抗肿瘤药物成为科学研究的热点。在氮原子上引入芳香基团形成芳香氮芥类药物，由于氮原子的孤对电子和苯环共轭，减弱了氮原子的碱性，较难形成环状亚乙基亚胺，通过失去氯原子形成碳正离子中间体发挥作用。

肿瘤患者通常伴随着剧烈的、持续的疼痛。癌症疼痛主要是由于癌组织的过度生长，压迫神经或者神经末梢造成。另外，癌组织感染、溃疡、坏死等也都会引起疼痛。对患者疼痛的控制有助于改善肿瘤病人的生活质量和延长生存期。

对肿瘤患者疼痛的控制主要使用镇痛剂和辅助使用抗焦虑、抗忧郁等药物改善癌症其他症状，加强镇痛作用。其中非阿片类止痛药对乙酰胺基酚片被广泛使用。

发明内容

本发明的目的在于发明一种芳香氮芥类药物，其分子内含有对乙酰氨基酚结构，其能够有效的降低毒性，在抗肿瘤的同时，产生对乙酰氨基酚类似的镇痛作用，增加适用范围。

本发明提出的乙酰氨基酚-磷酰氮芥衍生物结构如下：

其结构特征为磷酰氮芥结合1-2个对乙酰氨基酚。

所述化合物的制备方法包括两步反应，

第一步：采用双二氯乙基胺盐酸盐(1)与POCl₃(2)反应，制备磷酰氮芥(3)；

第二步：采用磷酰氮芥(3)与对乙酰氨基酚(4)反应，制备乙酰氨基酚-磷酰氮芥；

具体过程如下：

本发明的药物合成方法简单，适合大批量生成。

本发明进一步提出保护上述化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，尤其是在制备治疗白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、***、***癌的药物中的应用，以及在制备治疗癌症患者镇痛药物中的应用。

通过体外抗肿瘤实验发现，本发明化合物对人肝癌细胞有较好的抑制作用，通过体外DNA交联实验发现其对质粒DNA有较好的交联作用，通过小鼠镇痛实验发现其有较好的镇痛效果。本发明合成步骤简单，抗肿瘤效果好，并且可能在体内模拟对乙酰氨基酚的镇痛作用，是一种具有双功能的抗肿瘤药物，具有极大的药用价值。

可以用化学办法简便地合成。其显示出良好的抗肿瘤活性和镇痛效果。

附图说明

图1为乙酰氨基酚-磷酰氮芥交联质粒pBR322的凝胶电泳图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：化合物5的合成

步骤1：化合物3的制备

双二氯乙基胺盐酸盐(1)(20g，0.112mol)和52mL(0.60mol)新蒸的POCl₃(2)置于200mL的圆底烧瓶中，110℃回流20h至固体双二氯乙基胺盐酸盐消失。减压除去过量的POCl₃，所得的固体残渣加乙酸乙酯溶解，过滤除掉不溶物质，浓缩乙酸乙酯滤液，滤液用丙酮：石油醚(v/v＝1∶5)重结晶，得无色晶体，即磷酰氮芥二氯3共18.0g，收率61％，产物结构经熔点，IR，NMR，MS和元素分析确定。

步骤2：化合物5的制备

对乙酰氨基酚(4)(151mg，1mmol)溶于20mL甲醇中，于0℃加入三乙胺(185mL，1.34mmol)搅拌，将溶于10mL甲醇的磷酰氮芥二氯(3)(0.13mg，0.5mmol)加入反应体系。于室温反应48h，减压除去甲醇，得固体残渣。再加入乙酸乙酯重新溶解，过滤收集滤液，浓缩滤液。粗产物用甲醇：二氯甲烷(v/v＝1∶10)过硅胶柱分离，得100mg化合物5(产率20.5％)。产物结构经熔点，IR，NMR，MS和元素分析确定。

实施例2：体外抗肿瘤实验

选择本发明的化合物5试验其对细胞株HepG-2、A549和HL-60的细胞毒性，采用MTT法。

1、将化合物5分别用RPMI-1640培养液配置成不同浓度，4℃保存。

2、癌细胞培养于含10％小牛血清，100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，放在5％CO₂饱和湿度细胞培养箱中恒温培养。

3、取对数生长期的癌细胞，96孔板中加入5.0×10⁴个/mL细胞悬液100μL。

4、同时设置空白以及环磷酰胺(CP)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)阳性对照空，空白组加入相同体积的培养液，阳性对照组加入4μmol/L，每一浓度设八个平行孔。

5、继续培养48h后，每孔加入MTT(5g/L，20μL)，继续培养5h。

6、吸出孔内培养液(尽量完全)，加入DMSO液(100μL/孔)，置37℃振荡器上摇匀15min，使晶体充分溶解。

7、用酶标仪在波长490nm下，测OD值。

从表-1中可以看出，化合物5具有良好的抗肿瘤活性。

表-1：药物(5)抗肿瘤活性测试结果(MTT法)

实施例3：药物与DNA交联

选择本发明的化合物5检测其对质粒pBR322DNA的体外交联活性，采用碱性凝胶电泳法。

1、制备线性pBR322DNA。配制下列体系的混合物(共200μL)：超螺旋型的pBR322DNA(10μL，10μg)，限制性内切酶EcoR I(4μL，40-80u)，10倍EcoR I缓冲溶液(20μL)，乙酰化BSA(20μL，1mg/mL)，二次水(146μL)。将上述混合物在37℃恒温水箱里培育3小时，再加入醋酸钠(20μL，3M)和冰乙醇(440μL)，-20℃静置过夜。取出混合物，以16,000转/分钟离心15分钟，倾倒出乙醇，倒置数分钟以挥发掉残余乙醇。加入30μL二次水备用。浓度约0.25μg/μL。

2、在0.2mL的EP管里加入线性化的pBR322DNA 2μL(0.25μg/μL)，再加入一定量的化合物5溶液，加入pH＝8的TE缓冲液，调节总体积至10μL，将溶液混合均匀。

3、将EP管置于37℃恒温水箱里，孵育50分钟。

4、孵育完毕后，每个EP管里加入1μL加样缓冲液。

5、将样品置于0.9％琼脂糖凝胶上，40V电压，120mA电流下电泳约2小时，至溴酚兰条带迁移约5cm，停止电泳。然后将凝胶转入溶液(1M Tris pH＝7/1.5MNaCl)里中和30min。

6、将碱性胶置于EB染色液中染色20分钟。

7、取出，用清水漂洗，成像。

由图-1线性pBR322DNA的交联实验，可见化合物5具有一定的交联DNA的能力，由此判断其引起细胞毒性和抗肿瘤活性的机理可能为DNA交联作用。

实施例4：药物镇痛实验

取雌性体重18-22g雌性小鼠，用热板测痛仪致痛(55.0±0.5)℃，以小鼠舔后足作为痛反应指标。于实验前预先挑选合格者，以潜伏期不超过60s为合格。将合格小鼠随机分为5组，每组10只：空白对照组(给予同体积的生理盐水)，对乙酰氨基酚组(80mg/kg)，化合物5大、中、小剂量组(40mg/kg、80mg/kg和160mg/kg)。经尾静脉注射给药后将小鼠投入热板仪中，记录自小鼠投入热板仪后至出现舔后足的时间(s)，作为该鼠的痛阈值。

记录给药后30和60min时的痛阈值，比较各组间痛阈的差异。

从表-2可以看出化合物5具有良好的镇痛作用。

表-2：化合物5对小鼠热板镇痛作用的影响

*和生理盐水组相比，对乙酰氨基酚组和药物各计量组均p＜0.05。

实验证明本发明的药物对肿瘤细胞株具有明显的抑制作用，可以用于制备治疗恶性癌症的药物；同时，本药物能够有效提高小鼠的疼痛阀值，在抗肿瘤的同时发挥镇痛作用，增加适用范围。

Claims

1.一类抗肿瘤化合物，具有如下的结构式，其结构特征为磷酰氮芥结合2个对乙酰氨基酚：

2.如权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

3.如权利要求1所述的化合物在制备治疗白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、***、***癌的药物中的应用。

4.如权利要求1所述的化合物在制备治疗癌症患者镇痛药物中的应用。