CN104940944A

CN104940944A - 蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的制作方法及在治疗骨关节炎药物中的应用

Info

Publication number: CN104940944A
Application number: CN201510305779.2A
Authority: CN
Inventors: 陈鹏飞; 欧阳宏伟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明公开了一种蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的制作方法及在治疗骨关节炎药物中的应用，该方法包括透明质酸醛基修饰，透明质酸己二酸二酰肼修饰和透明质酸体外交联；本发明所述蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶具有缓释药物的性能，能有效缓解大鼠骨性关节炎，促进大鼠骨性关节炎膝蛋白聚糖的表达和抑制蛋白聚糖降解产物的表达。本发明结合生物材料和药物，通过组织工程手段治疗骨关节炎，利用关节腔给药方式，减少了骨关节炎治疗的创伤；缓释给药的给药途径，可以在提高局部药物浓度的同时减少全身用药产生相应的副作用。

Description

蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的制作方法及在治疗骨关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的应用，特别涉及其在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。

背景技术

骨性关节炎最常见的骨科疾病之一，据统计，仅在西方大约就有12%的中老年人群患有不同程度的骨关节炎。在美国约有2700多万人患有骨关节炎，其中60岁以上的人群中患病率可达50%以上，美国疾病防控中心和哈佛大学公共***门的一项研究表明骨关节炎是引起老年人残疾的五个主要疾病之一。骨关节炎以关节表面软骨的塌陷、坏死为特征，并伴随着疼痛、关节肿胀、关节间隙变小、形成骨赘、关节畸形以及表面关节软骨磨损后软骨下骨的暴露。骨关节炎的发病率高、病程长严重影响我国和世界居民的健康水平。

目前临床治疗药物主要为非甾体类抗炎药，全身镇痛药（如对乙酰氨基酚），糖皮质激素等。由于该疾病致残率为53%，晚期往往需要外科手术治疗，如关机置换术、截骨术，这些手术的费用高昂而且对患者的创伤都很大。骨关节炎的发病机制在学术界尚无清晰的概念，这为其药物筛选开发带来了极大的困难。骨关节炎通常是由不正常的力学刺激引起，引起关节软骨的病变，关节软骨由于缺乏血管，难以自发修复。

软骨由软骨细胞和大量的细胞外基质组成，蛋白聚糖是组成细胞外基质的一种主要成分。在骨关节炎的发展中，蛋白聚糖的降解被认为是一个重要的特征，在这之中蛋白聚糖酶被认为是起着重要的作用。转基因小鼠的研究表明ADAMTS-5是主要的降解蛋白聚糖的酶。目前部分研究已经着眼于对ADAMTS-5有抑制作用的小分子抑制剂，然而截至目前，它们对软骨缺损或者是OA治疗效果的研究几乎没有。透明质酸（HA）是临床上常用的一种关节润滑剂，被用于促进细胞分化和形态建成，治疗炎症以及创伤。HA以及它的衍生物已经被广泛研究，有研究表明体外交联的透明质酸水凝胶可以被用于促进软骨再生。同时，由于凝胶可以作为药物载体，将凝胶与药物结合可以成为一种有效的治疗软骨缺损的方式。在这项研究中，我们设计了一种体外交联的透明质酸体系（两种组分分别为乙醛和己二酸二酰肼）。拟探讨结合体外交联的透明质酸水凝胶和ADAMTS-5抑制剂对骨关节炎的治疗作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出了一种蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的方法及其在治疗骨关节炎中的应用。

一种蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

步骤一：透明质酸醛基修饰

将60mg的透明质酸先溶解在20ml的双蒸水内，然后再加入218μl浓度为10 mg/mL的NaIO₄，在室温下反应两个小时；然后加入0.2ml的己二醇搅拌1小时来终止反应，得到的混合物在水中透析三天；将得到的醛基修饰的透明质酸冻干再储存在4℃的温度下；

步骤二：透明质酸己二酸二酰肼修饰

将至少30倍摩尔浓度的己二酸二酰肼加入到3 mg/mL的HA中，然后把pH调整到6.8；在混合物中加入1 mol/L的二氯乙烷和1 mol/L的三氮唑，保持pH为6.8使其反应4小时；再通过调整pH到7.0将反应停止，得到的混合物在水中透析三天，将得到的己二酸二酰肼修饰的透明质酸冻干再储存在4℃的温度下；

步骤三：透明质酸体外交联

将0.6mg的ADAMTS-5抑制剂和50ul的醛基修饰的透明质酸混合，再将混合液与50ul的己二酸二酰肼修饰的透明质酸混合，反应1分钟内成凝胶状。

所述蛋白聚糖酶抑制剂为ADAMTS-5抑制剂，所述ADAMTS-5抑制剂化学名称为：5-((4-氯代苄-3-三氟甲基-N-甲基-1氢-吡唑-4-甲基)亚甲基)-2-硫代噻唑烷-4-酮,分子式为：C₁₆H₁₁ClF₃N₃OS₃。

一种蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。

骨关节炎的治疗目的是减轻或消除疼痛，矫正畸形，改善或恢复关节功能，改善生活质量，然而骨关节炎的发病机理和分子机制在学术界尚无清晰的概念，这为骨关节炎的药物开发和诊断治疗带来了极大的困难，近年来，随着研究的深入，软骨细胞外基质的降解和降解酶的表达增高被认为是骨关节炎发病的中心事件，本发明从ADAMTS-5抑制剂对骨性关节炎形成过程中蛋白聚糖的合成和其降解产物的表达入手，首先建立大鼠膝关节前交叉韧带切除骨性关节炎模型，通过对关节腔注射蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶后大鼠膝关节病理组织学观察并进行相应的组织学评分，观察大鼠软骨组织的破坏程度，以及蛋白聚糖的及其降解产物的表达情况，并通过空白组，模型组，体外交联透明质酸水凝胶组，ADAMTS-5抑制剂组和ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组用药组的比较，来研究蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶关节腔注射对大鼠骨性关节炎的防治作用，探讨ADAMTS-5抑制剂对骨性关节炎转归机制的影响，表明ADAMTS-5抑制剂可通过促进蛋白聚糖的合成和抑制蛋白聚糖降解产物的表达来抑制骨性关节炎的病理过程，从而为该药物的进一步临床应用提供实验依据。

SD大鼠20只抽取15 只切除大鼠膝关节的前交叉韧带进行骨性关节炎造模，造模后分为空白组，模型组，体外交联透明质酸水凝胶组，ADAMTS-5抑制剂组和ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组。骨性关节炎组6只腿造模后不做任何处理，体外交联透明质酸水凝胶组6 只腿造模3 周后开始关节腔注射20μl 透明质酸水凝胶，每周1次，ADAMTS-5抑制剂组6支腿造模3 周后开始关节腔注射0.12mg ADAMTS-5抑制剂，每周1次，ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组组6 只腿造模3 周后开始关节腔注射ADAMTS-5抑制剂结合透明质酸水凝胶，每周1次，实验8 周后处死所有大鼠，观察各组大鼠膝关节病理组织学改变并进行相应的组织学评分。结果表明：ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶能有效缓解外伤导致的大鼠骨性关节炎进程，促进大鼠骨性关节炎膝蛋白聚糖的表达和抑制蛋白聚糖降解产物的表达。

本发明有益效果主要体现在：本发明所述蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶具有缓释药物的性能，能有效缓解大鼠骨性关节炎，促进大鼠骨性关节炎膝蛋白聚糖的表达和抑制蛋白聚糖降解产物的表达。此外，本发明结合生物材料和药物，通过组织工程手段治疗骨关节炎，利用关节腔给药方式，减少了骨关节炎治疗的创伤；缓释给药的给药途径，可以在提高局部药物浓度的同时减少全身用药产生相应的副作用，具有临床应用前景。

附图说明

图1为透明质酸进行醛基修饰示意图。

图2为傅里叶红外光谱检测醛基修饰结果。

图3为透明质酸进行己二酸二酰肼修饰示意图。

图4为核磁共振检测己二酸二酰肼修饰结果。

图5为所制备体外交联透明质酸水凝胶缓释牛血清蛋白曲线。

图6为所制备体外交联透明质酸水凝胶体外降解曲线。

图7 为软骨组织切片的番红- 阿辛蓝染色图，A 为假手术组，B 为骨性关节炎组，C为体外交联透明质酸水凝胶组，D为ADAMTS-5抑制剂组，E为ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组。

图8 为骨性关节炎组，体外交联透明质酸水凝胶组，ADAMTS-5抑制剂组和ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组织的Mankin组织学（Mankin Histologic Histochemical Grading System）评分。

图9 为软骨组织切片蛋白聚糖降解产物免疫组化染色图，A 为假手术组，B 为骨性关节炎组，C为体外交联透明质酸水凝胶组，D为ADAMTS-5抑制剂组，E为ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组。

图10 为软骨组织切片蛋白聚糖免疫组化染色图，A 为假手术组，B 为骨性关节炎组，C为体外交联透明质酸水凝胶组，D为ADAMTS-5抑制剂组，E为ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用实验材料：

实验动物：雌性12周龄Sprague-Dawley大鼠15 只SPF 级浙江大学动物实验中心提供。

实验药品：

ADAMTS-5抑制剂(114810): 南京科佰生物科技有限公司

透明质酸，次碘酸钠（NaIO4）和己二酸二酰肼：广东阿拉丁公司

二氯乙烷(EDC)：美国Sigma公司

蛋白聚糖抗体，蛋白聚糖降解产物抗体：美国Abcam公司

DAB显色液：丹麦DAKO公司

其他试剂：国药公司。

实验仪器设备：

傅里叶红外光谱仪瑞士Nicolet公司

核磁共振仪瑞士Bruker公司

水浴锅金坛市国旺实验仪器厂

石蜡切片机德国MICROW公司

显微镜摄影机日本OLYMPUS公司

BMJ-III包埋机及冷冻台中国常州中威电子仪器有限公司

实施例1体外交联透明质酸水凝胶制备和表征检测

本发明采用体外交联的方法制备透明质酸水凝胶：（1）透明质酸醛基修饰：60mg的透明质酸先溶解在20ml的双蒸水内，然后218μl的NaIO4 (10 mg/mL)被加入到该溶液中，在室温下反应两个小时，反应方程式见图1。然后加入0.2ml的己二醇搅拌1小时来终止反应。在这之后，混合物在水中透析三天。最后把产品冻干再储存在4℃。制备完成的醛基修饰的透明质酸采用红外光谱来检测修饰效果，醛分析曲线的结果表明氧化反应产生了31.66±0.117%的醛基在每个透明质酸的单位上，这些结果说明了醛基基团被成功构建到了透明质酸链上， NaIO4的氧化效率大约为31%（图2）。（2）透明质酸己二酸二酰肼修饰：至少30倍摩尔浓度的己二酸二酰肼被加入到3 mg/mL的透明质酸中，然后把pH调整到6.8。接下来，在混合物中加入二氯乙烷和三氮唑（1 mol/L），保持pH为6.8使其反应4小时。最后通过调整pH到7.0将反应停止。反应方程式见图3。在这之后，混合物在水中透析三天。最后把产品冻干再储存在4℃。制备完成的己二酸二酰肼修饰的透明质酸采用核磁共振来检测修饰效果，~δ1.5ppm和1.9ppm处观察到两个吸收峰，以及在δ2.1和δ2.4之间的吸收峰，这些分别代表着己二酸二酰肼上的CH2CH2基团，一个酰胺基和NHNHCO·CH2 和CH2NHNH2基团（图4）。（3）将0.6mg的ADAMTS-5抑制剂和50ul的醛基修饰的透明质酸混合，再将混合液与50ul的己二酸二酰肼修饰的透明质酸混合，反应1分钟内成凝胶状。

透明质酸水凝胶的溶胀性检测：将水凝胶（质量为W₀）加入磷酸盐缓冲盐水中，在37℃下自由溶胀一天，然后称重，质量记为W₁，材料的溶胀比即为Q= W₁结合W₀。经测算材料的溶胀比为1.45 ± 0.188。

透明质酸水凝胶的缓释性能检测：10mg/ml的胎牛血清（Bovine serum albumin ，BSA）被加入到己二酸二酰肼修饰的透明质酸中，然后加入等量的醛基修饰的透明质酸，一直搅拌直到成胶。在这之后，形成的含有BSA的水凝胶被加入到10ml的磷酸盐缓冲盐水，在37℃下自由释放BSA。最后，在不同的时间点下用Pierce BCA试剂盒检测溶液中BSA的量，缓释曲线见图5，在最初的9h内，80%的BSA被迅速释放，然后释放速度慢慢下降，在24h之后完全释放结束。。

透明质酸水凝胶的体外降解曲线检测：在37℃下，五个透明质酸的样本被加入到含有10单位/ml的透明质酸酶溶液中（400μl，磷酸盐缓冲液）。在不同的时间点（0天，0.5天，1天，2天，4天，6天），100μl降解液被洗出，100μl新的降解液被加入到溶液中以维持总量。通过使用咔唑曲线来测量糖醛酸的浓度（透明质酸降解后的产物），从而评估透明质酸的降解量。100μl硫酸（含有0.025M的四硼酸钠）被加入到20μl的样本中，将混合物在100℃下加热15分钟。冷却到4℃后，4μl含有0.125%咔唑的乙醇被加入到溶液中，将混合物在100℃下加热15分钟。最后将混合物冷却到4℃，并在530nm下测量吸光度，通过与左旋葡萄醛酸标准液比较来计算糖醛酸的量。所测降解曲线见图6，在6天之后，~35.7%的凝胶残余。

实施例2

所述蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶质量用量为200μl/Kg 体重，即蛋白聚糖酶抑制剂质量用量为3mg/Kg 体重；

蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的应用

1. 动物模型建立：

①麻醉：按40mg/kg 计算，用1％戊巴比妥钠腹腔麻醉。

②在无菌环境下行大鼠膝关节皮肤准备，用2％碘伏消毒，沿髌韧带内侧缘切开约1cm 大小的切口，逐层切开暴露膝关节，用显微外科器械在显微镜下切断膝关节前交叉韧带，立即消毒，缝合。假手术组仅暴露膝关节后消毒缝合。

2. 实验动物分组：

20只SD大鼠随机抽取15只进行模型建立，造模后随机分为5组(每组3只) ：假手术组，骨性关节炎组，体外交联透明质酸水凝胶组， ADAMTS-5抑制剂组， ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组。

3. 给药方式：

第一组(假手术组) ：正常饲养；

第二组(骨性关节炎组) ：正常饲养；

第三组(体外交联透明质酸水凝胶组) ：造模3周之后，每周膝关节注射20μl 透明质酸水凝胶(实施例1制备)。

第四组(ADAMTS-5抑制剂组) ：造模3周之后，每周膝关节注射0.12mg ADAMTS-5抑制剂。

第五组(ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶组) ：造模3周之后，每周膝关节注射20μl 透明质酸水凝胶（含有0.12mg ADAMTS-5抑制剂）。

4. 标本采取

实验8 周后处死全部大鼠，取膝关节后置于10％***溶液中固定48 小时后，用4％乙二胺四乙酸(EDTA) 脱钙8周，经脱水，石蜡包埋切片，按常规番红- 阿辛蓝染色，进行病理组织学分析。同时行蛋白聚糖及其降解产物免疫组化检测。

5. 组织学评分方法：

Mankin评分***：对每组膝关节的石蜡切片行番红- 阿辛蓝染色后进行软骨的评分。软骨结构：正常，0分；表明凹凸不平，1分；血管翳和表明凹凸不平，2分；移行带裂缝，3分；放射带裂缝，4分；钙化带裂缝，5分；组织完全破坏，6分。软骨细胞：正常，0分；核皱缩，1分；细胞簇，2分；细胞肥大，3分。番红- 阿辛蓝染色：正常，0分；少量减少，1分；中等减少，2分；严重减少，3分；无染色，4分。潮线完整性：完整，0分；破坏，1分。

6. 统计学方法

统计学处理：计量数据均用x±s 表示，采用SPSS13.0 统计分析软件进行处理。多组间比较及两两之间比较采用方差分析。P<0.01 认为两两组之间有显著统计学差异，P<0.05 认为两两组之间有统计学差异。

7. 实验结果

番红- 阿辛蓝染色的结果表明在第二组的样本中有更多的骨关节炎样的变化，包括蛋白聚糖在深层软骨的丢失。第三组和第四组也产生了骨关节炎样的变化，包括软骨细胞数量的减少和蛋白聚糖在表层和中层软骨的丢失。第五组与其他组相比显示了最少的降解（图7）。同时第五组的Mankin评分比其余的组都低（p < 0.01，图8）。为了表明抑制剂是否能够对体内骨关节炎模型中的蛋白聚糖降解有抑制作用，我们通过免疫组化检测了蛋白聚糖和它的降解产物（图9，10）。我们发现降解产物的表达被抑制剂明显的抑制了，同时能促进蛋白聚糖的表达。在仅仅药物处理或者材料处理的组，我们也没有发现大鼠在一般表现和生理学表现上与其他组相比有异常，这说明了药物和材料的处理没有明显的副作用，根据以上结果，我们认为结合ADAMTS-5抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶能够明显的延缓外伤导致的骨关节炎的进程。

Claims

1.蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的制作方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

步骤一：透明质酸醛基修饰

步骤二：透明质酸己二酸二酰肼修饰；

步骤三：透明质酸体外交联；

2.根据权利要求1所述的蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的制作方法，其特征在于：所述蛋白聚糖酶抑制剂为ADAMTS-5抑制剂，所述ADAMTS-5抑制剂化学名称为：5-((4-氯代苄-3-三氟甲基-N-甲基-1氢-吡唑-4-甲基)亚甲基)-2-硫代噻唑烷-4-酮,分子式为：C₁₆H₁₁ClF₃N₃OS₃。

3.根权利要求要求1所述的蛋白聚糖酶抑制剂结合体外交联透明质酸水凝胶的制作方法在治疗骨关节炎药物中的应用。