CN108348454A - 原位可交联多糖组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在各种美容和治疗应用中扩充、填充或替代软组织的无菌原位可交联多糖组合物。该组合物包括用亲核基团官能化的第一多糖衍生物和用亲电子基团官能化的第二多糖衍生物。所述亲核官能团和所述亲电子官能团在共注射到患者的身体后自发地原位形成共价键，导致在共注射部位形成交联的水凝胶。

Description

原位可交联多糖组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于在各种美容和治疗应用中扩充、填充或替代软组织的无菌原位可交联多糖组合物。该组合物包括用亲核基团官能化的第一多糖衍生物和用亲电子基团官能化的第二多糖衍生物。所述亲核官能团和所述亲电子官能团在共注射到患者的身体后自发地原位形成共价键，导致在该共注射部位形成交联的水凝胶。
背景技术
如今，可注射填充剂被用于许多治疗和美容应用中以增加软组织的体积。在美学医疗中，皮肤填充剂越来越多地用于脸部和身体选定区域的年轻化。它们允许增强面部特征(例如，面颊和嘴唇)、减少皱纹(例如，鼻唇沟皱褶)和褶皱，并且可恢复一些随着年龄增长发生的皮肤和下层组织的体积和弹性的丢失。这使得皮肤看起来更光滑更饱满，从而提供更年轻的外貌。
已知用于软组织填充剂的各种各样的材料。由于这些材料中的大多数(例如，胶原、透明质酸(HA)、羟基磷灰石钙(CaHA)和聚-L-乳酸(PLLA))在体内会被吸收，因此仅具有短暂的效果(大约三至十八个月)。还有一些永久(即不可吸收)填充剂，诸如FDA批准的基于聚甲基丙烯酸甲酯珠(PMMA微球)的填充材料。一些软组织填充剂还含有旨在减少与注射有关的疼痛或不适的利多卡因(局部麻醉剂)。
今天，世界范围内软组织填充剂中最常用的材料为透明质酸(HA)。这是由于透明质酸具有卓越的形成体积的能力和有利的安全形象。HA为存在于例如真皮的细胞外基质中的天然存在的糖胺聚糖，并且由交替的β-D-(1→3)葡糖醛酸(GlcUA)和β-D-(1→4)-N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)构成。HA在凝胶形态下能够与水结合并膨胀，从而产生平滑/填充效果。在大多数情况下，用于皮肤填充剂的HA被交联以使其在体内保持更长时间(约六至十八个月)。
用于将多糖(例如，HA)分子的聚合物链共价结合在一起以形成具有分子间和分子内交联的填充材料基质的各种交联方法为本领域已知的。一种广泛使用的方法为用化学试剂进行化学交联。这些试剂通常与多糖的羟基和/或羧基官能团反应。常用的交联剂包括但不限于DVS(二乙烯砜)、双官能或多官能环氧化物(例如，1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE))、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)和1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO))、基于PEG的交联剂(例如，季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE))、双碳二亚胺(BCDI)(例如，亚苯基双(乙基)-碳二亚胺和1,6-六亚甲基双(乙基碳二亚胺))、二胺或多胺交联剂(例如，六亚甲基二胺(HMDA)和3-[3-(3-氨基丙氧基)-2,2-双(3-氨基-丙氧基甲基)-丙氧基]-丙胺(4AA))、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、表氯醇、醛(例如，甲醛和戊二醛)和酰肼(双价酰肼化合物、三价酰肼化合物和多价酰肼化合物，例如己二酸二酰肼(ADH))。
已采用用于交联可注射多糖水凝胶的其他方法包括甲基丙烯酸酯化聚合物的光化学交联(等人，Int.J.Artif.Organs 2011,34:93-102)、迈克尔加成交联(Shu等人，Biomacromolecules 2002,3:1304-1311)、Schiff碱反应交联(Tan等人，Biomaterials2009,30:2499-2506)、使用诸如巯基-烯反应或叠氮化物-炔环加成等反应的“点击”化学方法(Hoyle等人，Chem.Soc.Rev.2010,39:1355-1387；van Dijk等人，Bioconjug.Chem.2009,20:2001-2016)。用于扩充软组织的基于多糖的光交联填充剂也是本领域已知的(参见例如WO 2011/069475)。此外，酸性多糖的羧基官能团与同一或不同多糖分子的羟基基团发生酯化反应从而形成“内部”的分子间和/或分子内酯基交联(称为“自交联聚合物”或“ACP”)也已在本领域中进行了研究。此外，US 2006/0084759描述了酪胺修饰和交联的HA水凝胶材料，其中交联通过可体内进行的过氧化物酶介导的二酪胺键合来实现。
然而，常规的预成形水凝胶通常具有这样的缺点，即它们太粘稠而不能通过细针注射。因此，已作出很多努力来开发适用于不同应用的原位胶化水凝胶组合物。这些组合物以液体形式而不是以预成形凝胶形式注射到组织中。例如，WO 95/15168描述了通过采用EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)偶联化学方法来合成HA酰肼衍生物。酰肼-HA可用同型或异型双功能交联剂或Traut's交联剂进行交联以形成用于药物递送的水凝胶。WO 00/016818公开了通过将HA的醛或胺官能化衍生物(例如，己二酸二酰肼基-HA)与同型或异型双功能交联剂(例如，双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯交联剂诸如(SPA)1-PEG))交联原位形成水凝胶。
此外，WO 01/40314公开了包括氧化多糖(例如具有醛基的藻酸盐聚合物(PAG))和至少一种交联剂的水凝胶组合物，该交联剂具有两个或更多个能够在水凝胶体系中可逆地交联多糖的官能团，诸如己二酸二酰肼(ADH)交联剂。此外，WO 2011/100469公开了用作玻璃质替代生物材料的通过使带有醛官能团的氧化HA(氧化-HA)与二酰肼交联剂(例如，己二酸二酰肼(ADH))反应制得的交联HA水凝胶。
另外，WO 2009/108100公开了通过将醛修饰的HA和酰肼修饰的聚乙烯醇(PVAH)交联剂混合以形成呈现出多个羟基基团的交联结构而原位制备的基于HA的水凝胶。WO 2011/069475公开了通过使用TEMPO(2,2,6,6-四甲基-哌啶氧基)/共氧化剂体系氧化葡糖胺重复单元的C6处的伯羟基基团来制备含有醛基的醛-HA衍生物的方法以及所述醛-HA衍生物通过与二胺化合物(例如，己二胺)或胺-HA(例如，己二胺取代的HA)反应制备交联的HA水凝胶的用途。
Dahlmann等人(Biomaterials 2013,34:940-951)描述了用于心肌组织工程的充分定义的原位可交联的藻酸盐和HA水凝胶。该水凝胶通过使醛和酰肼官能化藻酸盐和HA在人I类胶原和新生大鼠心脏细胞(NRHC)存在下反应来制备，以产生腙交联的基于水凝胶的生物人工心脏组织。
Ossipov等人(Biomacromolecules 2010,11:2247-2254)公开了使用具有中间二价保护基团的特定对称二官能试剂合成酰肼官能化HA，该中间二价保护基团可与HA的羧酸根残基在水溶液中进行酰胺类反应。酰肼官能化的HA可用于通过与醛HA衍生物混合原位形成腙HA水凝胶。所得的水凝胶适合用作组织工程应用的生长因子递送载体。
Varghese等人(J.Am.Chem.Soc.2009,131:8781-8783)报道了用酰肼基团和能够共价结合双膦酸酯(BP；一种抗破骨细胞肿瘤和抗肿瘤小分子药物)的氨基亚甲基双膦酸酯基团双重官能化的HA衍生物。所述双重官能化的HA与醛官能化的HA混合导致原位形成可注射HA水凝胶，用于在植入部位受控的释放BP药物。
Oommen等人(Adv.Funct.Mater 2013,323:1273-1280)描述了通过将HA-醛衍生物与碳二酰肼(CDH)官能化的HA衍生物混合以获得具有腙键的HA水凝胶而制备的HA水凝胶。其还描述了在治疗性蛋白质(例如，重组人生长因子BMP-2)存在下原位HA水凝胶的形成提供了用于体内应用的能够为骨组织再生递送生长因子的水凝胶。
对于许多临床用途，原位可交联多糖水凝胶为可取的，因为它们甚至可通过细针容易地注射，这有助于更好地控制注射速率并改善注射器的操作。此外，原位可交联多糖水凝胶可形成为任何复杂的形状，然后进行随后的交联，可易于与生物活性试剂和/或细胞混合，并在凝胶形成过程中粘附到给定的组织上。
但是，现有的原位可交联水凝胶组合物令人不满意的地方在于，它们不具有预期目的所期望或所需的一种或多种性质。一般来讲，原位可交联水凝胶组合物应当是生物相容的、非免疫原性的、非炎性的和安全的。它应当既不与周围组织的生物成分发生反应，也不会产生有害的副产物，并且在施用后有效地原位交联。此外，它应当是生物可降解的，但同时提供足够长的体内持久性。此外，重要的是，原位可交联水凝胶应当可通过细针注射，然而，这要求所注射的原位可交联水凝胶组合物的粘度要足够低。
发明目的
鉴于以上所述，本发明的目的为提供一种原位可交联组合物，其可通过细针容易地挤出并在施用后原位形成具有期望性质(例如，在机械、化学、流变学、生物学和免疫学性质方面)的交联的水凝胶，用于在各种美容和治疗应用中扩充、填充或替代软组织。
发明内容
上述目的通过提供两种在注射到患者的身体后(即在体内条件下)自发地形成共价交联的官能化多糖衍生物来解决。因此形成的呈水凝胶形式的原位交联的多糖网络充当软组织填充剂，例如皮肤填充剂。本发明的原位可交联多糖组合物的优点在于，两种官能化多糖衍生物可以液体形式共注射，从而使得即使通过细针也能以低挤出力进行共注射。可取的是，原位凝胶形成不会产生任何有害的副产物。唯一的副产物为容易被所形成的水凝胶和/或周围组织吸收的水。除此之外，原位形成的水凝胶在组织整合、皮肤改善、组织整形能力和丰体能力方面具有期望的性质。
在第一方面，本发明涉及第一多糖衍生物和第二多糖衍生物在美容应用中原位形成交联水凝胶的用途，其中该第一多糖衍生物用亲核基团官能化并且该第二多糖衍生物用亲电子基团官能化，并且该第一多糖衍生物和该第二多糖衍生物均为已灭菌的，并且其中在该第一多糖衍生物和该第二多糖衍生物被共注射到患者的身体的靶部位后，该亲核基团和该亲电子基团原位形成共价键，导致在该靶部位处形成交联的水凝胶。
另一方面，本发明提供优选地为第一前体溶液形式的第一多糖衍生物和优选地为第二前体溶液形式的第二多糖衍生物，根据本文所述用于治疗应用中交联的水凝胶的原位形成。该治疗应用或适应症包括但不限于压力性尿失禁、***干燥、膀胱-输尿管反流、声带功能不全和声带内移。
另一方面，本发明提供根据本文所述的第一透明质酸(HA)衍生物和第二透明质酸(HA)衍生物的组合，优选地为包括第一透明质酸(HA)衍生物的第一前体溶液和包括第二透明质酸(HA)衍生物的第二前体溶液的形式。
又一方面，本发明提供了一种多筒注射器***，该多筒注射器***至少：(a)在一个筒中预填充有包括根据本文所述的第一多糖衍生物的第一前体溶液，以及(b)在另一个筒中预填充有包括根据本文所述的第二多糖衍生物的第二前体溶液。
另一方面，本发明提供了一种用于原位形成交联的多糖水凝胶的试剂盒，该试剂盒包括：(i)第一容器，该第一容器包括根据本文所述的第一多糖衍生物的第一前体溶液，以及(ii)第二容器，该第二容器包括根据本文所述的第二多糖衍生物的第二前体溶液，以及任选地(iii)使用说明。
另一方面，本发明提供了一种用于在美容或治疗应用中原位形成交联的多糖水凝胶的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供第一多糖衍生物的第一前体溶液，以及与其分开的第二多糖衍生物的第二前体溶液，其中该第一多糖衍生物用亲核基团官能化并且该第二多糖衍生物用亲电基团官能化，并且该第一前体溶液和该第二前体溶液均为已灭菌的，
(b)该第一前体溶液和该第二前体溶液混合成原位可交联的混合溶液，并且
(c)将该混合溶液注射到患者的身体的靶部位，其中该第一多糖衍生物的亲核基团和该第二多糖衍生物的亲电子基团原位形成共价键，导致在该靶部位处形成交联的水凝胶。
本发明的具体实施方案在所附的从属权利要求中示出。
附图说明
参考以下描述和附图可更完整地理解本发明，其中：
图1为示出了通过一个通道(部位D；左上)、两个通道(部位I；右上)和四次推注(部位J；右下)皮内注射200μL后t＝0h时在试验兔子1的皮肤上由测试制品1体内凝胶化形成的梯形体填充的图片。在部位E处注射PBS对照(200μL)(左下)；并且
图2为示出了向兔子2皮下注射1000μL后t＝4h时由测试制品2形成的鼓包在切开皮肤后的宏观图片。
具体实施方式
本发明的无菌原位可交联多糖组合物可易于通过细针以低注射力注射，并且提供皮肤改善、皮肤成形或良好的丰体效果。更具体地讲，原位可交联组合物可通过以无菌低粘度液体混合物的形式注射方便地施用于靶组织，该液体混合物伴随注射过程由两种无菌前体溶液的简单物理混合产生，每种前体溶液含有不同的官能化多糖衍生物。这有利地允许使用细针，这继而提高了患者的舒适度(减轻注射时的疼痛、降低背压)，并且进一步使从业者能够精确地和安全地(无血管堵塞)将水凝胶注射到期望的靶部位(诸如各种皮肤层)。
而且，所注射的前体溶液的混合物快速且有效地原位交联，以在身体内的靶部位处形成共价交联的水凝胶。该交联反应不需要添加剂、不需要催化剂、不需要pH转换、不需要UV照射以及任何其他外部刺激(或“触发”)来诱导。具体地讲，不使用或者不需要交联剂。交联反应产生的唯一副产物通常为容易被水凝胶和/或周围组织吸收的水。此外，本发明的官能化多糖衍生物可通常在单步反应中以相对简单的方式合成，并且有利地，可方便地通过湿热灭菌法(例如，蒸汽灭菌，优选地高压灭菌)进行灭菌。
而且，原位形成的交联的水凝胶呈现出有利的用作软组织填充剂材料的机械、化学和流变性质。具体地讲，其具有很高的形成体积的能力。另外，本发明的原位交联的水凝胶具有长效的体内停留时间，同时仍是可生物降解的。此外，希望的是，其可包括麻醉剂(例如，利多卡因)和各种其他成分(例如，包括干细胞和脂肪细胞的细胞、脂肪、脂质、生长因子和维生素)。因此，本发明的原位可交联组合物特别适合用作美容(美学)目的的皮肤填充剂。
在第一方面，本发明涉及第一多糖衍生物和第二多糖衍生物用于在美容应用中原位形成交联的水凝胶的用途。该第一多糖衍生物用亲核基团官能化并且该第二多糖衍生物用亲电基团官能化。此外，该第一多糖衍生物和该第二多糖衍生物均为已灭菌的。在该第一多糖衍生物和该第二多糖衍生物被共注射到患者的身体的靶部位后，该亲核基团和该亲电子基团原位形成共价键，导致在该靶部位处形成交联的水凝胶。
如本文所用，术语“原位”意指在施用部位。因此，为了在施用部位形成水凝胶，通常第一多糖衍生物和第二多糖衍生物被共注射或以其他方式一起施用到患者的身体中的特定部位(靶部位)(例如出于美学原因需要组织扩充的部位)，并允许在该共注射部位共价交联。在本发明中，术语“原位”和“体内”可互换使用。本发明意义上的“患者”可以为例如出于美容(美学)或治疗目的需要治疗特定病症、状态或疾病的任何个体或对象，例如哺乳动物并且，优选地人。
在本发明的上下文中，术语“共注射”通常意指将第一多糖衍生物和第二多糖衍生物作为单一液体组合物(例如，溶液)一起注射到患者的身体的靶部位。如本文所用，术语“可注射”或“注射”是指原位水凝胶形成组合物可从注射器或注射器***分配。具体地讲，术语“共注射”优选地意指第一多糖衍生物和第二多糖衍生物在从针尖排出并进入到患者的身体的靶部位之前被混合(具体地为均匀混合)，然后作为混合物注射到患者的身体的靶部位。在本发明中，术语“注射”或“共注射”可指真皮内注射、皮肤内注射或真皮下注射或皮下注射。此外，如本文所用，术语“针”旨在包括“插管”或任何其他适用于注射的针状物体或者与其同义。
如本文所用，术语“水凝胶”是指由共价交联的聚合物链组成的水溶胀三维网络。优选地，原位交联(或“凝胶化”)的水凝胶为内聚性的。在本发明含义内的术语“内聚性”或“内聚力”被定义为材料(例如，水凝胶)因其分子相互之间的亲和力而不离解的能力。内聚力为凝胶植入物(例如，本文所述的原位凝胶化水凝胶)的关键特征，并认为其对于固相和流体相的凝胶保持完整并因此对于凝胶的完整性是必需的。在本发明的上下文中，多糖水凝胶(具体地为基于HA的水凝胶)的内聚力可使用Gavard-Sundaram内聚力量表(Sundaram等人，Plast.Reconstr.Surg.136:678-686,2015)来确定。
如本文所用，术语“自发”或“自发地”旨在表示第一多糖衍生物的亲核基团和第二多糖衍生物的亲电子基团共注射到患者的身体的靶部位后，在体内条件下(即在没有任何外部刺激(也称为“触发器”)如热或紫外线的情况下)形成共价键，导致在该靶部位处原位形成交联的多糖水凝胶的事实。
在本发明中，原位(或体内)形成的水凝胶通常适用于、被用作和/或作为软组织填充剂起作用。如本文所用，术语“软组织填充剂”通常是指被设计成增加软组织缺陷区域的体积的材料。这包括例如扩充、填充或代替软组织。此处，术语“软组织”通常是指连接、支撑或包围身体的其他结构和器官的组织。软组织包括例如肌肉、肌腱(连接肌肉与骨骼的纤维带)、纤维组织、脂肪、血管、神经和滑膜组织(关节周围的组织)。在本发明的上下文中，软组织填充剂优选地为皮肤填充剂。
如本文所用，术语“衍生物”优选地是指已用亲核基团或亲电基团官能化并且适合用于在患者的身体的施用部位处原位(或体内)形成交联的多糖水凝胶的多糖。优选地，本发明的官能化多糖衍生物不含除亲核基团或亲电子基团之外的其他化学修饰。
该第一多糖衍生物和该第二多糖衍生物通常均为已灭菌的。如本文所用，术语“已灭菌的”或“无菌”旨在表示加热灭菌，具体地为湿热灭菌(例如，蒸汽灭菌)，并且优选地是指高压灭菌。高压灭菌可在120℃至132℃的温度下持续0.3分钟至20分钟，或者在121℃至130℃下持续0.5分钟至10分钟，例如在121℃下持续0.5分钟至2分钟。
优选地，第一多糖衍生物以第一无菌前体溶液的形式存在并且第二多糖衍生物优选地以第二无菌前体溶液的形式存在。
第一无菌前体溶液和第二无菌前体溶液通常具有0.001Pa·s至5.0Pa·s、具体地0.005Pa·s至3.0Pa·s、优选地0.001Pa·s至1.0Pa·s、更优选地0.001Pa·s至0.1Pa·s的低复数粘度，如通过振荡流变测量法在1Hz和25℃下所确定的。此外，第一前体溶液和第二前体溶液的特征在于均可具有0.01N至15N、优选地0.1N至10N、更优选地0.5N至7.5N以及最优选地0.01N至50N或1.0N至5.0N的低挤出力，如使用标准的1.0ml玻璃注射器(BD HypakSCF，1ml长RF-PRTC，ISO 11040，内径6.35mm)通过30G针头(TSK实验室)在约0.21mm/s的挤出速率下所测得的。
根据本发明，第一多糖衍生物和第二多糖衍生物在共注射过程中混合以形成包括第一多糖衍生物和第二多糖衍生物的混合物的液体原位可交联组合物。通常，第一多糖衍生物和第二多糖衍生物均分别作为单独的第一前体溶液和第二前体溶液存在。在注射(或“共注射”)过程中混合这两种前体溶液产生最终离开针并植入到身体的液体原位可交联组合物。
如上所述测量时，液体原位可交联组合物优选地具有0.1Pa·s至100Pa·s或0.1Pa·s至75Pa·s或1.0Pa·s至75Pa·s，更优选地为1Pa·s至50Pa·s或5Pa·s至50Pa·s的复数粘度。此外，如上所述测量时，组合物的注射力优选地为0.01N至20N或0.01N至10N、更优选地0.1N至10N以及最优选地1.0N至5.0N。
混合和注射(或“共注射”)可使用如下文所述的双筒注射器或任何其他合适的注射器***来实现，其中第一多糖衍生物和第二多糖衍生物在同时挤出和伴随的混合以及该混合的第一多糖衍生物和第二多糖衍生物通过针(插管)共注射到患者的身体之前在物理上分开。因此，共注射应尽可能快以避免在第一多糖衍生物和第二多糖衍生物沉积在身体的靶部位处之前发生初步交联。另一方面，凝胶化时间应相当短，以避免共注射物质扩散到周围组织中。
存在于第一前体溶液中的第一多糖衍生物的量可以为0.1重量％至5.0重量％、优选地0.5重量％至4.0重量％、更优选地1.0重量％至3.0重量％以及最优选地1.5重量％至2.5重量％，并且存在于第二前体溶液中的第二多糖衍生物的量可以为0.1重量％至5.0重量％、优选地0.5重量％至4.0重量％、更优选地1.0重量％至3.0重量％以及最优选1.5重量％至2.5重量％。此外，共注射的第一多糖衍生物和第二多糖衍生物的重量比为优选地15:85至85:15、更优选地30:70至70:30以及最优选地40:60至60:40或50:50(第一衍生物比第二衍生物)。
此外，第一前体溶液和/或第二前体溶液可包括另外的物质，诸如包括干细胞和脂肪细胞的细胞、脂肪、脂质、生长因子、细胞因子、药物和生物活性物质。更具体地讲，第一前体溶液和/或第二前体溶液可包括局部麻醉剂、多元醇、维生素、碱金属和碱土金属盐、金属、抗氧化剂、氨基酸和陶瓷颗粒。
在本发明的上下文中，考虑到其缓解注射时的疼痛的能力，加入局部麻醉剂为特别可取的。示例性的局部麻醉剂包括但不限于：氨布卡因、阿莫拉酮、阿米洛卡因、丁氧普鲁卡因、苯佐卡因、贝托卡因、苯柳胺酯、布比卡因、布大卡因、氨苯丁酯、布坦卡因、丁胺卡因、丁托西卡因、卡替卡因、氯普鲁卡因、可卡乙碱、***、环美卡因、二丁卡因、盐酸奎尼卡因、二甲异喹、二甲卡因、地哌冬、双环维林、芽子定、芽子碱、乙基氯、依替卡因、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、福莫卡因、海克卡因、羟丁卡因、对氨基苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮卡因、左沙屈尔、利多卡因、马比佛卡因、美普卡因、美布卡因、甲基氯、麦替卡因、纳依卡因、辛卡因(octacaine)、奥索卡因、奥昔卡因、对乙氧卡因、非那卡因、苯酚、哌罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、普莫卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、假***、吡咯卡因、罗哌卡因、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏及其盐。
优选地，麻醉剂为利多卡因，诸如为盐酸利多卡因的形式。第一前体溶液和/或第二前体溶液中可具有例如0.05重量％至8.0重量％、0.1重量％至4.0重量％、0.2重量％至3.0重量％、0.3重量％至2.0重量％或0.4重量％至1.0重量％的利多卡因浓度。
用于本文的合适的多元醇包括但不限于甘油、甘露糖醇、山梨醇、丙二醇、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。特别适用于本文使用的为甘露糖醇和甘油。此外，多元醇优选地为二醇，任选地与上述多羟基化合物中的一者或多者(具体地为甘露糖醇)结合。合适的维生素包括维生素C、维生素E和B族维生素(即B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9和B12维生素中的一者或多者)。可存在维生素以刺激和维持细胞代谢，从而促进胶原的产生。本文特别优选的使用维生素C、维生素E和维生素B6。用于软组织填充剂组合物的优选的盐为锌盐。陶瓷颗粒优选地为羟基磷灰石颗粒，例如羟基磷灰石钙(CaHA)颗粒。
在本发明中，亲电子基团优选地为醛部分，并且亲核基团可选自氨基、氨基氧基、肼基甲酸基或酰肼部分，并且优选地为酰肼部分。如本文所用，术语“醛部分”包括醛官能团(即-CHO为“甲酰基”)或具有侧链-CHO官能团(具体地为醛(即-CHO)-端基(例如，线性或分支C1-C6烷基或具有末端-CHO基团的烯基基团))的任何基团或残基。
用于本发明的醛官能化多糖衍生物优选地具有完整的环状多糖环。这意味着醛官能化多糖衍生物在多糖内不具有糖单元的任何氧化开环(也称为“线性”糖单元)。因此，根据该优选的实施方案，用于制备醛官能化多糖衍生物的任何方法适用于本文，前体条件是其不导致多糖环状糖单元开环。因此，本发明优选地不使用现有技术常用的方法并优选地将其排除在外，该方法为通过使用高碘酸盐(例如NaIO4)氧化单体糖单元内的邻二醇而将醛基引入多糖中。
如本文所用，术语“酰肼部分”包括碳原子总数通常不超过15、10、5、4、3或2个的酰肼官能团和酰肼-封端的基团或残基。酰肼部分优选地为酰肼(即[多糖]-C(O)-NH-NH2)或二酰肼部分，具体地为以下通式的二酰肼部分：
[多糖]-C(＝O)-NH-NH-R1-C(＝O)-NH-NH2
其中R1＝共价键、C(＝O)、C(＝O)-O-R2、(C＝O)-R2，其中R2＝线性或分支C1、C2、C3、C4、C5或C6烷基或烯基基团。特别优选的用于本文的为碳二酰肼(CDH)。如果使用CDH作为酰肼部分并与多糖的羧基偶联，则所得的经修饰的多糖具有以下侧酰肼封端部分：多糖-C(＝O)-R，其中R为NH-NH-C(＝O)-NH-NH2。
第一多糖衍生物和第二多糖衍生物的多糖可选自天然多糖和半合成多糖。合适的羧酸多糖的具体示例包括：羧基化纤维素和羧基化纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素)、羧甲基葡聚糖、羧甲基淀粉、藻酸盐、透明质酸、果胶、壳多糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、肝素原等。
优选地，第一多糖衍生物基于透明质酸、藻酸盐、肝素原、肝素或硫酸肝素，第二官能化多糖优选地基于透明质酸、纤维素、壳聚糖、壳多糖或肝素原。特别优选的是，第一多糖衍生物和第二多糖衍生物都基于透明质酸或者另选地基于肝素原，或者第一多糖衍生物基于肝素原并且第二多糖衍生物基于透明质酸，或者第一多糖衍生物基于透明质酸而第二多糖衍生物基于肝素原。
根据本发明的一个优选的方面，第一多糖衍生物为(第一)酰肼官能化透明质酸(HA)衍生物并且第二多糖衍生物为(第二)醛官能化透明质酸(HA)衍生物。在原位交联时，酰肼官能化的HA衍生物和醛官能化的HA衍生物形成腙交联的透明质酸(HA)水凝胶。
除非另有说明，否则上文提供的关于第一“多糖”衍生物和第二“多糖”衍生物的用途的所有定义、说明和描述也适用于第一透明质酸(HA)衍生物和第二透明质酸(HA)衍生物。此外，对透明质酸或HA的任何具体提及还可包括肝素原。换句话讲，在整个本申请中，术语“透明质酸”或“HA”可包括“肝素原”或可被“肝素原”替代。
酰肼官能化的透明质酸(HA)衍生物的酰肼部分和醛官能化的透明质酸(HA)衍生物的醛部分优选地如上文所定义。因此，酰肼部分优选地为酰肼或二酰肼基团或残基，具体地为根据上文所述的碳二酰肼(CDH)。优选地，第一HA衍生物在HA的糖单元的羧基基团上用酰肼部分进行官能化。
羧基基团的修饰可通过本领域已知的任何方法使用水溶性偶联剂进行。例如，合适的方法涉及使用标准碳二亚胺化学法，诸如使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)作为偶联剂，将酰肼封端的部分与羧基基团偶联以形成相应的HA酰基酰肼(参见例如WO 95/15168)。其他可用的偶联剂为三嗪化合物(诸如DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物；参见例如WO 2016/097211))、活性酯(诸如N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)和四甲基铵盐(tetramethyl aminium salts)(例如，HATU)。
第二HA衍生物优选地在不破坏环状糖环(例如，不使HA骨架线性化)的情况下用醛部分官能化。此类线性化糖单元例如通过典型的高碘酸氧化产生，该高碘酸氧化导致醛基被引入到HA的糖单元的环状环结构中并因此伴随导致HA骨架的断裂和“线性化”。有关更多详细信息，请参阅上文列出的同样适用于此处的相应解释。
优选地，第二HA衍生物通过将-CH2OH基团转化成-CHO基团而制得，并且具体地，醛官能化的HA衍生物优选地如下进行修饰：HA的N-乙酰基葡糖胺单元的C6处的羟基被氧化而产生甲酰基(-CHO)官能团。合适的用于后续修饰的方法例如在WO 2011/069475中有所描述，其使用TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基)作为氧化剂将伯醇基团转化成醛。
进入患者的身体的液体原位可交联HA组合物(即两种前体溶液的混合物)优选地含有总量为0.1重量％至5.0重量％的酰肼官能化的HA衍生物和醛官能化的HA衍生物，并且/或者酰肼官能化的HA衍生物与醛官能化的HA衍生物的重量比优选地在15:85至85:15范围内。关于所述总量和所述重量比的优选范围，参考上述关于多糖的注释，该注释同样适用于透明质酸作为优选的多糖。
根据本发明，存在于液体组合物中的酰肼官能化HA衍生物和醛官能化HA衍生物的总量为优选地0.1重量％至5.0重量％、具体地0.5重量％至4.0重量％、更优选地1.0重量％至3.0重量％以及最优选地1.5重量％至2.5重量％。此外，酰肼官能化的HA衍生物与醛官能化的HA衍生物的重量比为优选地15:85至75:25、更优选地25:75至60:40、特别优选地40:60至60:40，以及最优选地为50:50。
酰肼官能化的HA衍生物和醛官能化的HA衍生物各自独立地由具有3.0×104至5.0×106Da、更优选地0.1×106至4.0×106Da以及最优选地0.3×106至3.0×106Da或0.5×106至2.0×106Da的平均分子量的HA起始物质制得或基于该HA起始物质。如本文所用，术语“透明质酸”或“HA”包括透明质酸、透明质酸酯和任何透明质酸的盐诸如透明质酸钠。
第一前体溶液和/或第二前体溶液可还包括未交联的HA，优先地未交联的HA具有介于5.0×105Da和4.0Da×106Da之间，优选地介于1.0Da×106Da至3.0Da×106Da之间的分子量。交联的HA与未交联的HA的重量比可介于1:1和1:0.001之间，具体地介于1:0.5和1:0.005之间或1:0.1至1:0.01之间。
酰肼官能化的HA衍生物和醛官能化的HA衍生物的修饰程度(以酰肼部分或醛部分的总和与HA二糖单元总和的比例表示)可彼此独立地在0.1％至50％、优选地0.5％至25％、0.5％至15％或0.5％至5.0％的范围内。修饰的程度可通过光谱测定法和/或光谱分析方法(诸如NMR、UV-VIS和IR)、滴定法、HPLC、SEC、粘度法等来确定。适宜地，修饰的程度可由1H-NMR来确定。
本文中表述多糖(例如，HA)的“分子量”“分子质量”“平均分子量”或“平均分子质量”的所有数字均应被理解为指示质均摩尔质量(或质均分子质量)或Mw(w为重量；也称为重均分子量(WAMW))，其单位为道尔顿(Da)。质均摩尔质量(Mw)定义如下：Mw＝∑iNiMi 2/∑iNiMi，其中Ni为分子质量Mi的分子数。
本文可使用各种方法来确定HA的分子量，诸如特性粘度测量法(例如，欧洲药典7.0-透明质酸专论号1472,01/2011)、毛细管电泳法(CE)(例如根据Kinoshita等人，Biomed.Chromatogr.,2002,16:141-45)、凝胶渗透色谱法(GPC)(例如，根据Kim等人，FoodChem.,2008,109:63-770)以及多角度激光光散射联合尺寸排阻色谱法(SEC-MALLS)(例如，根据Hokputsa等人，Eur.Biophys.J.Biophys.Lett.,2003,32:450-456)。
在本发明的框架中，HA聚合物的质均摩尔质量(Mw)优选地通过凝胶渗透色谱法(GPC)或通过Mark-Houwink方程的粘度测定法来确定。GPC技术涉及在高达几百巴的压力下迫使聚合物溶液通过交联的聚合物颗粒基质。如本领域技术人员所熟知的，使用低分散度标准允许将保留时间与分子质量相关联。
使用Mark-Houwink方程确定的质均摩尔质量(Mw)也可是指粘度平均摩尔质量或Mv。Mark-Houwink方程给出了特性粘度(η)和分子量M之间的关系，并且允许根据特性粘度的数据来确定聚合物的分子量，并且反之亦然。在本发明的上下文中，特性粘度优选地根据欧洲药典7.0(透明质酸专论No.1472,01/2011)中定义的规程来测量。为了从特性粘度数据计算出HA的分子量，本文使用以下Mark-Houwink方程：
[η]＝K×Ma，
其中[η]＝特性粘度，单位为m3/kg，M＝分子量，K＝2.26×10-5，a＝0.796。
根据本发明，美容应用可包括但不限于治疗皮肤皱纹和细纹、眉间纹、鼻唇沟皱褶、下巴皱褶、嘴角纹、下巴松弛、颊连合、口周皱纹、眼角皱纹、皮肤凹陷、疤痕、鬓角、眉毛皮下支撑、颧骨和颊脂垫、泪槽、鼻子、嘴唇、面颊、下巴、口周区域、眶下区和面部不对称。
本发明定向的治疗应用包括但不限于治疗压力性尿失禁、***干燥、膀胱-输尿管反流、声带功能不全和声带内移。
另一方面，本发明涉及根据本文所述的第一透明质酸(HA)衍生物和第二透明质酸(HA)衍生物的组合，其中第一HA衍生物用酰肼部分官能化并且第二HA衍生物用醛部分官能化，并且其中所述肼部分和所述醛部分能够例如在体内条件下原位形成共价键。
优选地，第一透明质酸(HA)衍生物为第一前体溶液的形式并且第二透明质酸(HA)衍生物为第二前体溶液的形式。
酰肼官能化的HA衍生物、醛官能化的HA、第一无菌前体溶液和第二无菌前体溶液以及腙交联的透明质酸(HA)水凝胶的原位形成可如上文所述的进一步定义。
又一方面，本发明涉及一种用于原位形成交联的多糖水凝胶的多筒注射器***，其中该多筒注射器至少：(a)在一个筒中预填充有根据本文所述的用亲核基团官能化的第一多糖衍生物的第一前体溶液，以及(b)在另一个(即单独的)筒中预填充有根据本文所述的用亲电子基团官能化的第二多糖衍生物的第二前体溶液。如上所述，第一前体溶液和第二前体溶液均为无菌的。
具体地讲，本发明涉及一种多筒注射器***，优选地双筒或三筒***，该***至少：(a)在一个筒中预填充有根据本文所述的用亲核基团官能化的第一多糖衍生物的第一(无菌)前体溶液，以及(b)在另一个(单独的)桶中预填充有根据本文所述的用亲电子基团官能化的第二多糖衍生物的第二(无菌)前体溶液，以及任选地，在任选地存在的第三筒中预填充有具有另外的组分(例如，脂肪、脂肪酸、干细胞、维生素、多元醇、矿物盐、麻醉剂(诸如利多卡因)、抗氧化剂、氨基酸、碱金属和碱土金属盐)的溶液。优选地，注射器***为：(a)预填充有根据本文所述的第一前体溶液和(b)另一个筒中预填充有根据本文所述的第二前体溶液的双筒注射器***。
第一多糖衍生物和第二多糖衍生物、亲核基团和亲电基团、第一无菌前体溶液和第二无菌前体溶液和原位形成的交联的多糖水凝胶可根据上文所述的进一步定义。此外，多筒注射器***(包括双筒注射器***)适用于美容或治疗应用，具体地为根据本文所述出于美容或治疗应用目的用于替代或填充生物组织或增加生物组织的体积，或特别优选的用作美学用途的皮肤填充剂。
如本文所用，术语“多筒***”旨在表示任何***或装置，通常为包括至少两个单独的筒并且可具有两个或更多个活塞的注射器。如本文所用，术语“双筒注射器***”旨在表示任何***或装置，通常为包括两个单独的筒并且可具有一个或两个活塞的注射器。另外，为了密封注射器***的一个或多个端部，多筒(例如，双筒)注射器***通常包括顶端盖帽或者针或插管，具有或不具有针护罩。筒通常具有储存容量，用于容纳足够的第一前体溶液和第二前体溶液。筒可由玻璃、塑料或任何其他合适的材料制得，并且可具有不同的几何形状、内径、材料组成、透明度等。此外，多筒注射器***可以是其中一个注射器具有两个整体连接的注射器(即，两个整体连接的筒和用于从筒中分配内容物的单活塞或双活塞组件)形式的双筒注射器***。而且，注射器***可包括两个可拆卸连接的筒和两个或一个可拆卸连接的活塞。
此外，注射器***还可包括被构造成在通过施加器尖端分配之前彻底混合容纳在筒中的组分的装置(例如，施加器尖端)。因此，这些筒通常为连接的，并且活塞组件通常被构造成同时从筒中分配内容物，使得保持这些前体溶液的适当的混合比例。
优选地，多筒注射器***(包括双筒注射器***)用于原位形成腙交联的透明质酸(HA)水凝胶，其中该双筒注射器(a)在一个筒中预填充有酰肼官能化的透明质酸(HA)衍生物的第一前体溶液以及(b)在另一个单独的筒中预填充有醛官能化的HA衍生物的第二前体溶液。酰肼官能化的HA衍生物、醛官能化的HA衍生物、第一无菌前体溶液和第二无菌前体溶液以及腙交联的透明质酸(HA)水凝胶的原位形成优选地根据上文所述。
另一方面，本发明涉及一种用于原位形成交联的多糖水凝胶的试剂盒，该试剂盒包括：(i)第一容器，该第一容器包括根据本文所述的用亲核基团官能化的第一多糖衍生物的第一无菌前体溶液，以及(ii)第二容器，该第二容器包括根据本文所述的用亲电子基团官能化的第二多糖衍生物的第二无菌前体溶液，以及任选地(iii)使用说明。
第一多糖衍生物和第二多糖衍生物、亲核基团和亲电基团、第一无菌前体溶液和第二无菌前体溶液以及原位形成的交联的多糖水凝胶可根据上文所述的进一步定义。如本文所用，术语“容器”不受特别限制，并且包括例如玻璃瓶或塑料瓶、小瓶、安瓿或任何其他密封容器。
“使用说明”优选地是用于美容或治疗应用的说明，具体地为根据本文所述出于美容或治疗应用目的替代或填充生物组织或增加生物组织的体积，或者特别优选地用作美学用途的皮肤填充剂的说明。
优选地，该试剂盒用于原位形成腙交联的透明质酸(HA)水凝胶，该试剂盒包括：(i)第一容器，该第一容器包括酰肼官能化HA衍生物的第一无菌前体溶液，以及(ii)第二容器，该第二容器包括醛官能化HA的第二无菌前体溶液，以及任选地(iii)使用说明。酰肼官能化的HA衍生物、醛官能化的HA衍生物、第一无菌前体溶液和第二无菌前体溶液以及腙交联的透明质酸(HA)水凝胶的原位形成可根据上文所述(具体地根据关于本发明的第一方面所述)的进一步定义。任选地，该试剂盒可包括第三无菌溶液，其包括如关于多筒注射器***所提及的那些的另外的组分。
另一方面，本发明提供了一种用于在美容或治疗应用中原位形成交联的水凝的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供第一多糖衍生物的第一前体溶液，以及与其分开的第二多糖衍生物的第二前体溶液，其中该第一多糖衍生物用亲核基团官能化并且该第二多糖衍生物用亲电基团官能化，并且该第一前体溶液和该第二前体溶液均为已灭菌的，
(b)该第一前体溶液和该第二前体溶液混合成原位可交联的混合溶液，并且
(c)将该混合溶液注射到患者的身体的靶部位，其中该第一多糖衍生物的亲核基团和该第二多糖衍生物的亲电子基团原位形成共价键，导致在该靶部位处形成交联的水凝胶。
可使用如根据本文所述的注射器***进行混合和注射，通常使两种组分(即第一前体组合物和第二前体组合物)在从针(插管)分配之前能够优选地均匀地物理混合。如本文所用，术语“均匀”意指整个混合物、分散体或溶液均匀混合、分散或稀释，或者是指始终具有均匀结构和/或组分的材料。
现在将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
下文提供的实施例示出了一种原位可交联的透明质酸(HA)水凝胶的制备，并且在动物试验中示出该水凝胶对于各种美容和治疗应用为具有前景的填充材料。此外，这些实施例证明该原位可交联的HA组合物可在施加适当力的情况下容易地通过细针注射，同时仍提供用于扩充生物组织的期望的机械和流变性质(即复数粘度(η*)、储能模量(G')、损耗模量(G”)和损耗角正切(tanδ))。
挤出力的测量
挤出力(注射力)使用配有1.0mL玻璃注射器(BD Hypak SCF，1mL长RF-PRTC，ISO11040，内径6.35mm)和30G针(TSK实验室)的质构分析仪(TA.XTPlus,TextureTechnologies,Corp.)进行测量。该挤出力使用0.21mm/s的测试速度在25mm的距离上进行测量(目标模式：距离；力：100.0g)。预测试和事后测试速度分别为0.21mm/s和10.0mm/s。触发力为2.0g(触发器类型：自动(力))并且应变为10.0％。将达到稳定后的平均力作为挤出力。
复数粘度(η*)以及储能模量和损耗模量(G'和G”)的测量
使用配有锥板几何仪(50mm直径，0.1°角，CP50-1，间隙尺寸0.1mm)的流变仪(Anton Paar Physica MCR 302流变仪，Anton Paar GmbH)在25℃下测量复数粘度(η*)以及储能模量和损耗模量(G'和G”)。样品在1Pa的应力下振荡并且振荡频率从0.1Hz到10Hz不等。
在下文的实施例中，如本文所用，除非另有说明，否则术语“当量”或“eq.”是指透明质酸二糖重复单元。除非另有说明，否则百分比为重量百分比。
实施例1
HA-醛衍生物(HA-Ald)的合成
醛官能化的HA衍生物如下进行制备：根据WO 2011/069475中所述的方法(参见例如实施例1)选择性地氧化HA的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)单元的伯C6羟基基团。简而言之，透明质酸(HA)(Mw＝1.0×106Da)用TEMPO/共氧化剂体系(TEMPO、2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基)进行氧化。透析后，将溶液冻干以产生醛官能化的HA(在下文中称为“HA-Ald”)。
实施例2
HA-酰肼衍生物(HA-Hyd)的合成
将HA(6000.0mg，14.9mmol二糖重复单元)在室温下溶解于700.0mL去离子水中，持续12小时。加入HOBt(2289.3mg，14.9mmol)，并且然后加入固体EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(1428.9mg，7.84mmol)。将pH调节至5.5至6.5，并将溶液搅拌1小时。接下来，加入碳酰肼(CDH；4043.5mg，44.88mmol)，并在室温下继续搅拌10小时。
然后使溶液在5.0L异丙醇中沉淀，并且收集沉淀物并将其溶于盐水中，然后加载到透析袋(Spectra Por-6,MWCO 3500)中。该沉淀用含有0.1M NaCl的蒸馏水透析(2×2L，48小时)，然后用盐水透析(2×2L，24小时)。最后，将溶液冻干以产生5000mg至5500mg的HA-酰肼衍生物(在下文中称为“HA-Hyd”)。
实施例3
HA水凝胶的形成和表征
HA水凝胶如下进行制备：在室温(约25℃)下混合等量的实施例1的蒸汽灭菌(131℃，0.7分钟)的HA-醛衍生物(“HA-Ald”)和实施例2的蒸汽灭菌(131℃，0.7分钟)的HA-肼衍生物(“HA-Hyd”)。将该HA-Ald衍生物和该HA-Hyd衍生物分别溶解于无菌PBS中，pH 6.5至7.5，各自的浓度分别为15mg/mL和24.5mg/mL。然后，将1.0mL的HA-Ald前体溶液和HA-Hyd前体溶液中的每一种(分别针对15mg/mL和24.5mg/mL浓度中的每一种)以1:1的体积比加载到1mL鲁尔锁注射器中。所使用的两个注射器各自在各自的尖端处连接至Y型连接器，以使两种前体溶液随着针的挤出能够同时有效地混合。
所测得的平均挤出力以及无菌前体溶液和无菌前体溶液混合物的流变性质(η*、G'、G”和tan(δ))示于表1中。
表1：挤出力以及无菌前体溶液和前体溶液混合物的流变性质(η*、G'、G”和tan (δ))
从表1可以看出，HA-Hyd前体溶液和HA-Ald前体溶液的挤出力和复数粘度非常低，表示前体溶液处于液体(非凝胶)状态。此外，发现这两种前体溶液的混合物仅具有约5N的挤出力，其大约是紧接在通过30G细针从单独的注射器挤出后的每种前体溶液(15mg/ml)的总和。因此，与为预成形水凝胶形式的皮肤填充剂组合物相比，该混合的前体溶液更容易注射。
这些原位交联的HA水凝胶分别由表1所示的15mg/ml和24.5mg/ml前体溶液在培养皿上制备。由于获得最终的凝胶状态需要充分和足够的交联持续时间，经流变学测定为约30分钟的时间段。如上所述，使用Anton Paar流变仪评估在混合两种前体溶液30分钟后的水凝胶的流变性质(η*、G'、G”和tan(δ))。结果示于表2中。
表2：随HA-Hyd和HA-Ald浓度变化的两种HA水凝胶的流变性质(η*、G'、G”和tan (δ))
1 Sundaram等人，Cohesivity of Hyaluronic Acid Fillers:Development andClinical Implications of a Novel Assay,Pilot Validation with a Five-PointGrading Scale，以及Evaluation of Six U.S.Food and Drug Administration-ApprovedFillers,Plast.Reconstr.Surg.136:678-686,2015
如表2所示，原位可交联的水凝胶呈现出与其他商购可获得的填充剂相当的流变性质，这些商购可获得的填充剂先预成形然后注射到患者体内。此外，所测试的原位可交联的水凝胶都为内聚性的，如Gavard-Sundaram内聚力量表得分等于或高于3所指示。
实施例4
建立概念验证的动物试验
初步的动物研究
表2中给出的两个配方用于在兔子体内形成水凝胶。通过将HA-Hyd前体溶液(15mg/ml)和HA-Ald前体溶液(15mg/ml)(体积比1:1)共注射到兔子皮肤中产生第一水凝胶(“测试制品1”)。通过将HA-Hyd前体溶液(24.5mg/ml)和HA-Ald前体溶液(24.5mg/ml)(体积比1:1)共注射到兔子皮肤中产生第二水凝胶(“测试制品2”)。
根据注射深度，通过皮内注射(ID)和皮下注射(SD)将100μL至1000μL的体积注射到兔子的不同皮肤层中，并与两种商购可获得的皮肤填充剂进行比较(对照制品1：Belotero Balance；对照制品2：Belotero Volume)。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为阴性对照。结果示于图1和图2中。
从图1中可以看出，测试制品1在皮内注射后在真皮中显现为大致梯形体，如通常基于HA的填充剂所遇到的那样。此外，还可以看出，注射的类型(即，团注、单通道和双通道注射)不会导致任何形态上的差异。对于测试制品2，也观察到基本相同的结果。此外，另外的测试显示，皮内注射不同体积的测试制品1和测试制品2不会导致测试制品在分布上的相关差异(结果未示出)。
图2为t＝4h时由测试制品2体内交联形成的“鼓包”或“泡”的宏观图片。可以看出，测试制品2在注射后几小时提供了提升效果。相比之下，盐水溶液在此期间已完全消失。测试制品1也观察到了同样的结果。体内交联后获得的泡类似于在注射与预成形的市售填充剂(例如，填充剂系列(Merz Aesthetics))具有类似的流变特征的填充剂后获得的泡。
总之，皮内和皮下注射不同量的测试制品1和测试制品2提供了期望的提升效果，并且不会在兔子皮肤中产生任何不利的组织病理学效应。
随访12周动物研究
在兔子中进行12周的研究，以确定上述测试制品1的皮内注射(ID)和上述测试制品2的皮下注射(SC)后皮肤反应的严重程度。将该响应与ID注射的对照制品1(BeloteroBalance)和SC注射的对照制品2(Belotero Volume Lidocaine)进行比较。注射四周后，肉眼观察部位并进行组织病理学分析以评估每种制品的皮肤反应。注射后肉眼观察所有的部位，然后每天一次持续五天，并且然后每周一次直到终止。
令人惊讶的是，发现这两种测试制品(体内HA填充剂)形成了非常小的浸润到皮肤胶原纤维之间的颗粒和针状物。对照制品(Belotero Balance和Belotero BalanceLidocaine)形成了较大的颗粒和色淀，其填充皮肤中的大空间但未浸润到真皮胶原中。换句话讲，体内HA填充剂实现了像Belotero Balance一样显著更好的组织浸润(全组织整合相比于局部填充)，尽管Belotero Balance以其优秀的组织整合能力而闻名(Flynn等人，Comparative histology of intradermal implantation of mono and biphasichyaluronic acid fillers,Dermatol Surg.2011,37:637-643；以及Micheels等人，Superficial dermal injection of hyaluronic acid soft tissue fillers:comparative ultrasound study,Dermatol Surg.2012,38:1162-1169)。
总而言之，对兔子的12周研究显示，本发明的HA填充剂与市售的皮肤填充剂具有可比性。其还显示，体内HA填充剂提供独特的特征，诸如产生与局部填充相反的全组织整合的改善的组织浸润。这些结果有力地证明，本发明的体内HA填充剂用于在各种美容和治疗应用中扩充、填充或替代软组织的潜力。

Claims (15)

1.第一多糖衍生物和第二多糖衍生物用于在美容应用中原位形成交联的水凝胶的用途，其中所述第一多糖衍生物用亲核基团官能化并且所述第二多糖衍生物用亲电子基团官能化，并且所述第一多糖衍生物和所述第二多糖衍生物均为已灭菌的，并且其中在将所述第一多糖衍生物和所述第二多糖衍生物共注射到患者的身体的靶部位后，所述亲核基团和所述亲电子基团原位形成共价键，导致在所述靶部位处形成交联的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用途，其中在共注射时共价键的原位形成自发地发生并且/或者其中共价键的所述原位形成导致不释放除水以外的其他副产物。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述第一多糖衍生物以第一无菌前体溶液的形式存在并且所述第二多糖衍生物以第二无菌前体溶液的形式存在。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述第一无菌前体溶液和所述第二无菌前体溶液各自具有0.001Pa·s至5.0Pa·s的复数粘度，如通过振荡流变测量法在1Hz和25℃下所确定的，或者各自具有0.01N至15N的注射力，如使用1.0ml玻璃注射器通过30G针在0.21mm/s的挤出速率下所测得的，或具有两者。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其中第一前体溶液和第二前体溶液在共同注射期间但在进入所述患者的所述身体之前混合以形成液体原位可交联组合物，并且其中所述液体原位可交联组合物优选地具有0.1Pa·s至100Pa·s的复数粘度，如通过振荡流变测定法在1Hz和25℃下所确定的，或者具有0.01N至20N的注射力，如使用1.0ml玻璃注射器通过30G针在0.21mm/s的挤出速率下所测得的，或具有两者。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的用途，其中存在于所述第一前体溶液中的所述第一多糖衍生物的浓度为0.1重量％至5.0重量％，并且存在于所述第二前体溶液中的所述第二多糖衍生物的浓度为0.1重量％至5.0重量％，并且/或者其中注射到患者的所述身体的靶部位的所述液体原位可交联组合物中包括的所述第一多糖衍生物与所述第二多糖衍生物的重量比为15:85至85:15。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述亲核基团为酰肼部分并且所述亲电子基团为醛部分，优选地在不破坏多糖主链的环状糖环的情况下将所述醛部分引入所述多糖中。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中所述第一多糖衍生物和所述第二多糖衍生物独立地选自由以下项组成的组：羧化纤维素和羧化纤维素衍生物、羧甲基葡聚糖、羧甲基淀粉、透明质酸、藻酸盐、肝素原、肝素、硫酸肝素、果胶、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、纤维素、壳聚糖或壳多糖。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述第一多糖衍生物为酰肼官能化的第一透明质酸(HA)衍生物并且所述第二多糖衍生物为醛官能化的第二透明质酸(HA)衍生物，其中所述第一HA衍生物为优选地在HA的糖单元的羧基基团上用酰肼部分官能化，或者所述第二HA衍生物优选地通过用将-CH2OH基团转化成-CHO基团而制得的醛部分官能化，或两者。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述原位可交联组合物用于治疗皮肤皱纹和细纹、眉间纹、鼻唇沟皱褶、下巴皱褶、嘴角纹、下巴松弛、颊连合、口周皱纹、眼角皱纹、皮肤凹陷、疤痕、鬓角、眉毛皮下支撑、颧骨和颊脂垫、泪槽、鼻子、嘴唇、面颊、下巴、口周区域、眶下区和面部不对称。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的第一多糖衍生物和第二多糖衍生物用于在治疗应用中原位形成交联的水凝胶，具体地用于治疗压力性尿失禁、***干燥、膀胱-输尿管反流、声带功能不全和声带内移。
12.根据权利要求9所述的第一透明质酸(HA)衍生物和第二透明质酸(HA)衍生物的组合。
13.一种多筒注射器***，所述多筒注射器***至少：(a)在一个筒中预填充有根据权利要求3至9中任一项所述的第一前体溶液，以及(b)在另一个筒中预填充有根据权利要求3至9中任一项所述的第二前体溶液。
14.一种用于原位形成交联的多糖水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)第一容器，所述第一容器包括根据权利要求3至9中任一项所述的第一前体溶液，以及(ii)第二容器，所述第二容器包括根据权利要求3至9中任一项所述的第二前体溶液，以及任选地(iii)使用说明。
15.一种用于在美容或治疗应用中原位形成交联的水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供第一多糖衍生物的第一前体溶液，以及与其分开的第二多糖衍生物的第二前体溶液，其中所述第一多糖衍生物用亲核基团官能化并且所述第二多糖衍生物用亲电子基团官能化，并且所述第一前体溶液和所述第二前体溶液均为已灭菌的，
(b)所述第一前体溶液和所述第二前体溶液混合成原位可交联的混合溶液，并且
(c)将所述混合溶液注射到患者的身体的靶部位，其中所述第一多糖衍生物的所述亲核基团和所述第二多糖衍生物的所述亲电子基团原位形成共价键，导致在所述靶部位处形成交联的水凝胶。
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