CN104911167A - 类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法 - Google Patents

类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333的凝乳酶及制备方法。所述的方法包括以下的步骤：(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的发酵液离心得发酵上清液；(2)将发酵上清液与硫酸铵混合，至发酵液中硫酸铵的饱和度为50～75％，得混合液，2～6℃静置混合液0～5小时，离心收集沉淀物；(3)将沉淀物溶解，离心，取上清液即得。所述的方法大幅简化了凝乳酶的制备工艺步骤；并且与使用乙醇提取凝乳酶相比，大大节约了生产成本，操作简便有效，安全可靠，有利于应用于工业化生产。

Description

类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法。
背景技术
与植物来源和动物来源的凝乳酶相比较，微生物来源的凝乳酶具有生产成本低、生化多样性高、基因易改造的优势。目前，越来越多的报道说明微生物的胞外蛋白酶具有凝乳功能，部分微生物的凝乳酶已实现大规模工业化生产，并广泛应用于干酪生产中。能够产生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要属于放线菌、细菌和霉菌等的范畴，包括放线菌中的链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属，霉菌中根霉、总状毛霉、微小毛霉、米黑毛霉、易脆毛霉，细菌中粟疫菌、寄生内座壳菌以及其他通过基因工程或辐照获得的高产凝乳酶的菌株等。
将凝乳酶从发酵上清中分离出来并实现凝乳酶的高效回收是分离纯化、酶学性质研究以及工业化生产凝乳酶的前提和基础。常用的分离方法有盐析法、有机溶剂沉淀法(乙醇、丙酮)以及等电点法，其中，盐析、乙醇和丙酮沉淀应用最为广泛。例如，有学者使用1％氯化钠溶液浸提微小毛霉发酵液中的凝乳酶，后用95％的乙醇对浸提物进行沉淀；有学者使用乙醇按不同比例分步提取微小毛霉发酵液中的凝乳酶；还有学者以总状毛霉R132的发酵液为研究对象，对其超滤后进行乙醇分步提取。另有其他学者利用丙酮、乙醇等对栗疫菌、根霉、青霉、曲霉、枯草芽孢杆菌、粘球菌、粪肠球菌产凝乳酶进行初步分离提取。
中国专利申请(CN103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种类芽孢杆菌BD3526，Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并将其于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。中国专利申请(CN104450655A)公开了使用乙醇提取类芽孢杆菌BD3526麸皮发酵液上清中凝乳酶，但是其操作工艺复杂，所得凝乳酶的回收率低，难以满足大规模工业化生产的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶时，所得的发酵物粘稠难以将凝乳酶纯化分离，所得的凝乳酶回收率低，难以满足大规模工业化生产的需要的不足，提供一种利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶的方法。所述的方法达到了凝乳酶回收率高和粗酶样品中多糖含量较低的良好效果。
本发明发明人发现，类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有高产凝乳酶的特性外，还具有很强的胞外多糖的合成能力，发酵液中的多糖具有强的悬浮性能，不能实现凝乳酶和胞外多糖的有效分离。利用乙醇沉淀时，凝乳酶回收率虽高，但混杂了很多的胞外多糖，溶解性能差、黏度很高，限制了后期分离纯化和酶学性质研究，在工业化生产上也不具备可行性，因此本发明人对类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液分离纯化凝乳酶的工艺进行调整改进。
本发明提供一种利用类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333发酵液制备凝乳酶的方法，其包括以下的步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上清液；
(2)将步骤(1)所得发酵上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，2～6℃静置混合液0～5h，离心收集沉淀物；
(3)将步骤(2)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。
步骤(1)为：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上清液。其中，较佳地，发酵液是由包括以下的步骤制备而得的：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液接种于麸皮培养基发酵培养得发酵液。所述的麸皮培养基为本领域常规的麸皮培养基，其包括麸皮和水。所述的麸皮为本领域常规的麸皮，较佳地为小麦麸皮。所述麸皮的含量为本领域常规的含量，较佳地为1％～5％，更佳地为2％，所述百分比为质量百分比。较佳地，所述发酵培养在锥形瓶中进行，更佳地在250mL锥形瓶中进行。所述锥形瓶中所述的麸皮培养基的装液量为本领域常规装液量，更佳地为50mL。所述发酵培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为48～72小时。所述发酵培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28～30℃。所述的种子液的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为2～4％，所述百分比为体积百分比。所述发酵培养的方式为本领域常规的方式，较佳地为震荡培养。所述震荡培养的速度为本领域常规的速度，较佳地为180～300r/min。
较佳地，所述的种子液是由包括以下的步骤制备而得的：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌接种于种子培养基种子培养得种子液。所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地为TYC培养基。所述的TYC培养基为常规的TYC培养基，较佳的由以下组分组成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO3 2g/L，琼脂15～20g/L，余量为水。所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为20小时。所述种子培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28～30℃。所述离心的时间为本领域常规的时间，较佳地为15min。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4℃。所述离心的速度为本领域常规的速度，较佳地为15000g。
步骤(2)为：将步骤(1)所得发酵上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，2～6℃静置混合液0～5小时，离心收集沉淀物。其中，较佳地，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～60％，更佳地为60％。所述静置的时间为0～5小时，较佳地为2小时。所述静置的温度为2～6℃，较佳地为2～4℃。所述离心的时间为本领域常规的时间，较佳地为15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4℃。所述离心完成后，初步获得了凝乳酶含量较高的粗提物。
步骤(3)为：将步骤(2)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。其中，所述溶解的溶剂为本领域常规的溶剂，较佳地为水或PBS溶液。所述的PBS溶液为本领域常规的PBS溶液，较佳地为0.02mol/L、pH 7.0的PBS溶液。所述离心的时间为本领域常规的时间，较佳地为15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4℃。所述离心的速度为本领域常规的速度，较佳地为15000g。所述离心的步骤回收率残留在凝乳酶中不溶解的杂质，如菌体、培养基和其他的代谢产物等。较佳地，步骤(3)还包括将步骤(3)所述上清液冻干的步骤。所述的冻干为本领域常规的冻干，能够将上清液冷冻干燥即可。
本发明提供一种由上述的方法制备获得的凝乳酶。
所述的凝乳酶具有较高的酶活性，凝乳酶活回收率高达21.86％，适用于工业化应用生产。
本发明所述的类芽孢杆菌CGMCC No.8333从西藏当雄县采集的牦牛乳样品中分离获得，但不仅限于所述的来源。本发明所用的类芽孢杆菌已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为：CGMCC No.8333，命名为BD3526。并且其在中国专利申请CN103740618A中公开，该专利申请的全文为本发明所引用。
本发明的一较佳的实施例是，将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基(酪蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO3 2g/L，琼脂15g/L，余量为水)中30℃种子培养20小时获得种子液，将4％(v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，30℃、摇床震荡速度180r/min发酵培养72小时得BD3526发酵液。所述麸皮培养基的中，小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水。将BD3526发酵液于4℃、15000g条件下离心15分钟后收集发酵上清液，使用0.02mol/L、pH7.0的PBS溶液将发酵上清液稀释3倍，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的60％，混合均匀后4℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15分钟，得沉淀物a。将沉淀物a用pH7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5分钟，回收沉淀物，并将上清液做冻干处理。计算得知，粗酶回收率为21.86％，总糖的回收率为15.0％，
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的方法在保持凝乳酶活力以及凝乳酶回收率的前提下，大幅简化了凝乳酶的制备工艺步骤；并且与使用乙醇提取凝乳酶相比，大大节约了生产成本，操作简便有效，安全可靠，有利于应用于工业化生产。利用饱和度为60％硫酸铵提取所得凝乳酶的活力尤其高，凝乳酶活回收率可高达21.86％；同时该方法有效降低了发酵液离心后上清液中总糖的含量，总糖含量回收率仅为15％。由此可见，本发明所述的方法所得类芽孢杆菌凝乳酶具有较高的活力，有效排除糖类对凝乳酶的影响，便于工业化操作。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中所述的“室温”是指常规的操作室内温度，一般为10-30℃。
实施例中所述的各个试剂若无特别说明均为分析纯试剂，购自国药集团。
实施例中所述的凝乳酶活力(MCA)值的测得包括以下步骤：
用pH 7.0、0.02mol/L的PBS溶液稀释发酵液离心后所得的粗提凝乳酶液，得500μL稀释后的待检样品；将脱脂奶粉(购自Fonterra公司)以10％(w/v)的比例配制成pH6.0并含有10mmol/L CaCl2的脱脂乳溶液，35℃水浴10分钟(min)；将500μL稀释后的待检样品加入10mL 35℃的脱脂乳溶液中，即能进行检测；每15s将样品取出并倾斜45°观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝乳酶单位(Soxhlet unite，SU)定义为35℃，使1mL脱脂乳在40min发生凝乳所需的酶量。
M C A ( S U / m L ) = 2400 × V S T × V E × D
其中，T表示凝乳时间，单位为秒；VS表示底物体积，单位为mL；VE表示酶液体积，单位为mL；D表示稀释倍率。
酶活回收率计算公式如下：
其中，MCA1表示发酵上清液Q1凝乳酶活力，单位为SU/mL；MCA2表示发酵上清液Q2凝乳酶活力，单位为SU/mL；V1表示发酵上清液Q1体积，单位为mL；V2表示沉淀物溶解体积，单位为mL。
实施例中所述的总糖含量的测得包括以下步骤：
制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖10mg于10mL容量瓶中，加水至刻度配制成葡萄糖标准液；分别吸取2、5、10、50和100μL葡萄糖标准液，分别添加蒸馏水补至200μL，然后加入5％苯酚0.4mL及98％浓硫酸2.0mL，摇匀冷却，所述百分比为质量百分比；室温放置20分钟后，于490nm测光密度，以2.0mL蒸馏水作为空白对照，得标准曲线y＝0.002x+0.043
R2＝0.9984(x表示总糖浓度)。
样品中总糖含量的测定：吸取用pH7.0、0.02mol/L的PBS溶液稀释后的冻干粗酶样品200μL，然后加入0.4mL 5％苯酚及2mL 98％浓硫酸(98％浓硫酸密度为1.84g/mL)，所述百分比为质量百分比；摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以200μL蒸馏水作为空白对照，依据标准曲线计算样品总糖含量mg/mL。
总糖含量回收率计算公式如下：
其中，C1表示发酵上清液Q1总糖含量，单位为mg/mL；V1表示发酵上清液Q1体积，单位为mL；C2表示发酵上清液Q2总糖含量，单位为mg/mL；V2表示沉淀物溶解体积，单位为mL。
实施例中所用的类芽孢杆菌BD3526已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为：CGMCC No.8333，并且在中国专利申请CN103740618A中公开，该专利申请的全文为本发明所引用。
实施例1
将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中30℃种子培养20小时获得种子液，所述TYC培养基由以下组分组成：酪蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO3 2g/L，琼脂15g/L，余量为水。
将种子液4％(v/v)接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，30℃、摇床震荡速度180r/min发酵培养72小时得BD3526发酵液。所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水。
将BD3526发酵液于4℃、15000g条件下离心15min后收集发酵上清液Q1，使用0.02mol/L、pH7.0的PBS溶液将发酵上清液稀释3倍，测定发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL)及发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL)。
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液Q1溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的60％，混合均匀后4℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
将沉淀物C1用pH 7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5min，得上清液Q2和沉淀物C2。测定上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL)及上清液Q2总糖含量(mg/mL)，并计算酶活回收率(％)和总糖回收率(％)，测定结果如表1所示。表1说明，采用饱和度为60％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为21.86％，且总糖的回收率仅为15.0％，该饱和度的硫酸铵能够实现较高酶活回收率，并有效地减少糖类的干扰。
将上清液Q2进行冻干处理(冻干条件：在-80℃冰箱预冻2h后，将上清液转入LABCONCO-12L型冻干机，冻干24小时后取出样品)，最终获得类芽孢杆菌BD3526发酵产生的凝乳酶粗酶。
表1测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 240
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2360.65
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 3.20
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 3096.77
沉淀物溶解体积(mL) 40
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 2.88
酶活回收率(％) 21.86
总糖回收率(％) 15.0
实施例2
将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中30℃种子培养20小时获得种子液，所述TYC培养基由以下组分组成：胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO3 2g/L，琼脂20g/L，余量为水。
将种子液2％(v/v)接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，28℃、摇床震荡速度300r/min发酵培养48小时得BD3526发酵液。所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为1％，余量为水。
将BD3526发酵液于4℃、15000g条件下离心15min后收集发酵上清液Q1，使用0.02mol/L、pH7.0的PBS溶液将发酵上清液稀释3倍，测定发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL)及发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL)值。
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的50％，混合均匀后4℃静置0小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
将沉淀物C1用pH 7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5min，得上清液Q2和沉淀物C2。测定上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL)及上清液Q2总糖含量(mg/mL)，计算酶活回收率(％)和总糖回收率(％)，测定结果如表2所示。表2说明，采用饱和度为50％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为6.17％，总糖的回收率为2.40％。因此，该饱和度的硫酸铵能够提取出部分凝乳酶，但酶的回收率有限。
表2测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2440.67
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 3.71
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 885.36
沉淀物溶解体积(mL) 8.5
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 0.51
酶活回收率(％) 6.17
总糖回收率(％) 2.4
实施例3
将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中28℃种子培养20小时获得种子液，所述TYC培养基由以下组分组成：酪蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO3 2g/L，琼脂15g/L，余量为水。
将种子液4％(v/v)接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，30℃、摇床震荡速度180r/min发酵培养72小时得BD3526发酵液。所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为5％，余量为水。
将BD3526发酵液于4℃、15000g条件下离心15min后收集发酵上清液Q1，使用0.02mol/L、pH7.0的PBS溶液将发酵上清液稀释3倍，测定发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL)及发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL)值。
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的55％，混合均匀后4℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
将沉淀物a用pH 7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5min，得上清液Q2和沉淀物C2。测定上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL)及上清液Q2总糖含量(mg/mL)，计算酶活回收率(％)和总糖回收率(％)，测定结果如表3所示。表3说明，采用饱和度为55％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为12.73％，且总糖的回收率仅为2.86％，该饱和度的硫酸铵能够提取出部分凝乳酶，并有效地排除糖类的干扰，但是酶活回收率比较低。
将上清液进行冻干处理(冻干条件：在-80℃冰箱预冻2小时后，将上清液转入LABCONCO-12L型冻干机，冻干24小时后取出样品)，最终获得类芽孢杆菌BD3526发酵产生的凝乳酶粗酶。
表3测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2261.47
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 3.47
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 1600
沉淀物溶解体积(mL) 9
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 0.57
酶活回收率(％) 12.73
总糖回收率(％) 2.86
实施例4
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液Q1溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的65％，混合均匀后6℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
将沉淀物C1用pH7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5min，得上清液Q2和沉淀物C2。测定上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL)及上清液Q2总糖含量(mg/mL)，计算酶活回收率(％)和总糖回收率(％)，测定结果如表4所示。
其余步骤均与实施例1完全相同。
表4说明，采用饱和度为65％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为16.09％，总糖的回收率为53.46％，说明该饱和度硫酸铵进行盐析时，酶活回收率较50％、55％饱和度硫酸铵盐析时有所提高，较60％饱和度硫酸铵盐析时没有明显的提高，但此时沉淀中多糖含量有显著的增加。其余上清液进行冻干处理(冻干条件：在-80℃冰箱预冻2小时后，将上清液转入LABCONCO-12L型冻干机，冻干24小时后取出样品)，最终获得类芽孢杆菌BD3526发酵产生的凝乳酶粗酶。
表4测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2360.65
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 3.21
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 345.32
沉淀物溶解体积(mL) 55
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 1.56
酶活回收率(％) 16.09
总糖回收率(％) 53.46
实施例5
摇床震荡的速度为200r/min。麸皮培养基中小麦麸皮的质量百分含量为1％。
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液Q1溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的70％，混合均匀后6℃静置5小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
其余步骤均与实施例1完全相同。测定结果如表5所示。
表5说明，采用饱和度为65％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为16.13％，总糖的回收率为69.19％，说明该饱和度硫酸铵进行盐析时，该饱和度硫酸铵进行盐析时，酶活回收率较50％、55％饱和度硫酸铵盐析时有所提高，较60％饱和度硫酸铵盐析时没有明显的提高，但此时沉淀中多糖含量有显著的增加。
表5测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2409.55
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 3.45
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 607.59
沉淀物溶解体积(mL) 32
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 3.73
酶活回收率(％) 16.13
总糖回收率(％) 69.19
实施例6
摇床震荡的速度为300r/min。
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液Q1溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的75％，混合均匀后6℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
其余步骤均与实施例1完全相同。测定结果如表6所示。
表6说明，采用饱和度为75％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为16.14％，总糖的回收率为71.87％，说明该饱和度硫酸铵进行盐析时，该饱和度硫酸铵进行盐析时，酶活回收率较50～70％饱和度硫酸铵盐析时有所提高，较60％饱和度硫酸铵盐析时没有明显的提高，但此时沉淀中多糖含量进一步增加。
表6测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2359.35
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 3.69
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 951.99
沉淀物溶解体积(mL) 20
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 6.63
酶活回收率(％) 16.14
总糖回收率(％) 71.87
实施例7
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液Q1溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的60％，混合均匀后6℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
将沉淀物C1用pH 7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5min，得上清液Q2和沉淀物C2。测定上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL)及上清液Q2总糖含量(mg/mL)，计算酶活回收率(％)和总糖回收率(％)，测定结果如表7所示。
其余步骤均与实施例3完全相同。
表7说明，采用饱和度为60％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为22.54％，总糖的回收率为16.82％。
表7测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2236.25
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 2.24
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 2100.21
沉淀物溶解体积(mL) 12
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 1.57
酶活回收率(％) 22.54
总糖回收率(％) 16.82
对比实施例1
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液Q1溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的40％，混合均匀后6℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
将沉淀物C1用pH 7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5min，得上清液Q2和沉淀物C2。测定上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL)及上清液Q2总糖含量(mg/mL)，计算酶活回收率(％)和总糖回收率(％)，测定结果如表8所示。
其余步骤均与实施例1完全相同。
表8说明，采用饱和度为40％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为0.98％，总糖的回收率仅为0.87％。
表8测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2136.25
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 2.94
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 130.84
沉淀物溶解体积(mL) 8
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 0.16
酶活回收率(％) 0.98
总糖回收率(％) 0.87
对比实施例2
在具有机械搅拌的情况下，将硫酸铵缓慢加入至发酵上清液Q1溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的80％，混合均匀后6℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15min，得沉淀物C1。
将沉淀物C1用pH 7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心5min，得上清液Q2和沉淀物C2。测定上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL)及上清液Q2总糖含量(mg/mL)，计算酶活回收率(％)和总糖回收率(％)，测定结果如表8所示。
其余步骤均与实施例1完全相同。
表9说明，采用饱和度为80％的硫酸铵进行盐析时，粗酶回收率为14.13％下降不明显，总糖的回收率为87.14％，说明有大量糖伴随凝乳酶沉淀，为后续纯化工作带来不便。由此可见，类芽孢杆菌BD3526发酵液的上清液中添加硫酸铵终浓度控制在饱和度55％～75％为宜，较佳为60％。
表9测定结果
发酵上清液Q1体积(mL) 50
发酵上清液Q1凝乳酶活力(SU/mL) 2136.25
发酵上清液Q1总糖含量(mg/mL) 2.94
上清液Q2凝乳酶活力(SU/mL) 503.09
沉淀物溶解体积(mL) 30
上清液Q2总糖含量(mg/mL) 4.27
酶活回收率(％) 14.13
总糖回收率(％) 87.14
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种利用类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCCNo.8333的发酵液制备凝乳酶的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上清液；
(2)将步骤(1)所得发酵上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，2～6℃静置混合液0～5小时，离心收集沉淀物；
(3)将步骤(2)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述静置的时间为0～2小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述静置的温度为2～4℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～60％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发酵液是由包括以下的步骤制备而得的：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液接种于麸皮培养基发酵培养得发酵液；所述的麸皮培养基包括麸皮和水，所述麸皮的含量为1％～5％，所述百分比为质量百分比；和/或，所述麸皮为小麦麸皮。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵培养的时间为48～72小时；所述发酵培养的温度为28～30℃；所述的种子液的接种量为2～4％，所述百分比为体积百分比；和/或，所述发酵培养的方式为震荡培养，所述震荡培养的速度为180～300r/min。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的种子液是由包括以下的步骤制备而得的：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌接种于种子培养基种子培养得种子液；所述的种子培养基为TYC培养基；所述种子培养的时间为20小时；和/或，所述种子培养的温度为28～30℃。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述溶解的溶剂为水或PBS溶液；和/或，还包括将将步骤(3)所述上清液冻干的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述溶解的溶剂为0.02mol/L、pH 7.0的PBS溶液。
10.一种由权利要求1～9任一项所述的方法制得的凝乳酶。
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