CN104130995A - 一种类芽孢杆菌的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌的发酵方法，所述发酵方法包括以下步骤：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于小麦麸皮培养基中，发酵温度为25～30℃，发酵时间15～20小时，250～300r/min震荡培养，所述百分比为质量百分比。利用本发明发酵方法所得具有凝乳酶活性的发酵液的凝乳酶活力高达6460.98±372.80SU/mL；蛋白酶水解活力为0.59±0.03U/mL，二者比值为10982.79±263.53。本发明所述发酵方法在原制干酪生产加工方面具有广阔的应用前景。

Description

一种类芽孢杆菌的发酵方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌的发酵方法。 
背景技术
凝乳是生产原制干酪的关键步骤，凝乳酶在此过程中发挥至关重要的作用，并直接关系到干酪的品质和得率。传统干酪加工中所使用的凝乳酶(rennet)来源于未断奶小牛的第四胃(皱胃)，主要由凝乳酶(chymosin)和胃蛋白酶(pepsin)组成，商业化的小牛皱胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在50～95％。干酪加工中使用的小牛凝乳酶需求早在50多年前就已超过其产量，与此同时自1961年以来，世界干酪产量大约增加了3.5倍，小牛皱胃凝乳酶供应量确呈下降趋势，目前，世界小牛皱胃凝乳酶的仅能满足世界干酪产量所需凝乳酶的20～30％。小牛皱胃凝乳酶的供需矛盾和价格高昂、宗教(***教和犹太教)、饮食(素食主义)以及食品法规等因素，使得寻求其替代物成为乳品领域科学研究的热点之一，寻求小牛皱胃凝乳酶替代物的研究主要动物、植物、基因重组以及微生物四个方面开展。动物和植物来源的凝乳酶主要用于特定种类的干酪，其来源和产量同样受到限制，且植物来源凝乳酶存在较高的蛋白酶水解活力，只适合软质干酪的生产中；利用基因重组技术制备的凝乳酶具有成分单一等优点，但是，一些国家如法国、德国和荷兰禁止使用重组凝乳酶。 
许多微生物，尤其是霉菌和细菌来源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性质，与植物和动物来源凝乳酶(MCEs)相比较，微生物来源的凝乳酶(MCEs)具有生产成本低、具有更加广泛的生化多样性等优点。微生物来源凝乳酶可分为两类：(a)来源于曲霉(Aspergillus spp.)和根霉菌(Rhizopus spp.)的类胃蛋白酶(pepsin-like)；(b)来源于毛霉菌(Mucorspp.)、根霉菌(Rhizomucor spp.)和板栗疫病菌(Endothiaparasitica)的类凝乳酶(rennin-like)。目前， 米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)和板栗疫病菌(Endotiaparasitica)三种来源的凝乳酶已用于大规模商业化生产中，已占到了全球蛋白酶市场的33％。然而，由于霉菌来源凝乳酶存在发酵周期长、营养物质利用率低以及蛋白酶水解活力强等缺点，近年来微生物凝乳酶研究转向细菌来源，已报道的主要集中在芽胞杆菌属(Bacillus)，其蛋白酶通常具有较高的蛋白酶水解活力，并具有耐热性较强、不易灭活，导致蛋白质降解并转化为乳清，因此，对干酪得率具有负面作用，只有部分适合于干酪生产。 
发明内容
因此，本发明要解决的就是针对目前存在的凝乳酶来源和产量严重不足的技术问题，提供了一种制备类芽孢杆菌凝乳酶的发酵方法。利用该发酵方法生产的凝乳酶具有很高的MCA/PA比值，可降低微生物凝乳酶在制备干酪过程中的非特性蛋白水解，提高干酪的得率，具有显著的经济效益。 
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种类芽孢杆菌的发酵方法，所述发酵方法包括以下步骤：将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，发酵温度为25～35℃，发酵时间为12～20小时，震荡培养即得，所述百分比为质量百分比。 
本发明所述发酵温度更佳地为25～30℃，优选地为29.62℃，所述发酵时间更佳地为16～20小时，优选地为16.65小时，所述震荡的速度更佳地为200～300r/min，优选地为300r/min。 
较佳地，本发明所述发酵是在发酵容器中进行的。所述发酵容器为本领域常规的发酵容器，更佳地包括发酵罐，烧瓶，试管，优选地为烧瓶。所述发酵容器中培养基的装液量较佳地为8％～16％，优选地为12％，所述百分比为体积百分比。 
本发明所述培养类芽孢杆菌的培养基为本领域常规的培养基，较佳地为小麦麸皮培养基或米糠培养基，优选地为小麦麸皮培养基。 
本发明所述配方为培养基中的各种配料配比的处方。本发明所述小麦麸皮培养基的配方较佳地为：小麦麸皮的含量为1％～14％，余量为水，小麦麸皮的含量更佳地为1％～10％，余量为水，小麦麸皮的含量最佳地为3％，余量为水，所述百分比为质量百分比。所述小麦麸皮培养基的组分较佳地为蛋白质：13.9～18.6％，脂肪3.3～8.2％，总碳水化合物61.9～74.62％，水分4.8～18.02％，灰分3.38～6.50％，所述百分比为质量百分比。 
本发明所述米糠培养基的配方较佳地为：米糠的含量为3～5％，余量为水，米糠培养基的组分为蛋白质10.5～15.3％，脂肪9.8～24.0％，总碳水化合物42.0～61.9％，水分8.9～13.4％，灰分4.4～9.8％，所述百分比为质量百分比。 
本发明所述类芽孢杆菌Paenibacillus sp.BD3526(CGMCC No.8333)是从西藏当雄县采集的牦牛乳样品中分离出的一株具有高产凝乳酶潜质的类芽孢杆菌，且凝乳酶的MCA/PA比值较高，其中所述MCA为凝乳酶活力(milk clotting activity，MCA)，其中所述PA为蛋白酶水解活力(proteolytic activity，PA)。 
本发明的类芽孢杆菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的分类命名是Paenibacillus sp.，培养物名称为BD3526。 
本发明所述的发酵方法将所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于培养类芽孢杆菌的培养基之前，较佳地还包括该类芽孢杆菌CGMCC No.8333活化的步骤。所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333活化的步骤较佳地包括：将本发明所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种在TYC培养基中，25～30℃培养18～20小时即得类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子液；将所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子液按3％～5％体积百分数的接种量接种于盛有3％的小麦麸皮培养基的发酵容器中震荡培养，摇床转速为200～300r/min，其 中所述百分比为质量百分比。其中所述摇床转速更佳地为250r/min，发酵温度更佳地为29.62℃，发酵时间更佳地16.65小时，其中所述发酵容器的装液量优选地为12％，所述百分比为体积百分比。 
本发明所述TYC培养基为本领域常规的TYC培养基，所述TYC培养基的配方较佳地为：酪蛋白胨或胰胨15g，蔗糖50g，酵母膏5.0g，L-胱氨酸0.2g，乙酸钠20g，Na2SO4 0.1g，NaCl1g，Na2HPO4·12H2O2g，NaHCO32g，琼脂15-20g，该培养基的制备方法较佳地为：取上述各配料，加水至1L，pH7.3，121℃灭菌15分钟即得。 
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。 
本发明所用试剂和原料均市售可得。 
本发明的积极进步效果在于：利用本发明所述类芽孢杆菌发酵方法所得具有凝乳酶活性的发酵液的凝乳酶活力高达6460.98±372.80SU/mL；其蛋白酶水解活力为0.59±0.03U/mL，二者比值为10982.79±263.53。本发明所述类芽孢杆菌的发酵方法在原制干酪生产加工方面具有广阔的应用前景。 
生物材料保藏信息
本发明的类芽孢杆菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，培养物名称为BD3526。该类芽孢杆菌BD3526已经在中国专利申请CN2013107521537中公布，该中国专利申请的申请日是2013年12月31日，公开日是2014年4月23日。 
附图说明
图1为发酵温度和装液量对MCA和PA比值的响应面及等高线。 
图2为发酵温度和发酵时间对MCA和PA比值的响应面及等高线。 
图3为装液量和发酵时间对MCA和PA比值的响应面及等高线。 
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。 
实施例1类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性和蛋白酶水解活力测定 
将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养16h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有20mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于25℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。 
将制备得到粗酶液稀释5倍(D＝5)，取500μL的稀释粗酶液按照下述方法进行凝乳实验，凝乳酶活力(milk clotting activity,MCA)测定方法包括以下步骤： 
将脱脂奶粉以10％(w/v)的比例配置成pH6.0含有10mmol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10min后，将500μL的凝乳酶加入至35℃的10mL脱脂乳溶液中，每15s将样品取出并倾斜45度观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝乳酶单位(Soxhlet unite，SU)定义为35℃条件下，使1mL脱脂乳在40min发生凝乳所需的酶量。 
MCA ( SU / mL ) = 2400 × V S T × V E × D
T——凝乳时间，秒 
VS——底物体积，mL 
VE——酶液体积，mL 
D——稀释倍率 
蛋白酶水解活力(proteolytic activity，PA)的测定方法如下： 
以酪蛋白为底物，采用Folin-Ciocalteu phenol方法进行蛋白水解活力测定。将5mL用0.05mol/L pH6.0的磷酸盐配置12g/L的酪蛋白溶液加入至1mL发酵上清中，混合均匀并在35℃水浴中孵育10min后，加入0.44mol/L TCA终止反应，并于-4℃、10000r/min离心取上清。取2mL上清加入0.28mol/L的NaOH溶液5mL和按1:2比例稀释的Folin-Ciocalteu phenol试剂，35℃水浴中孵育15min后，测定A660nm。配置100μg/mL的酪氨酸溶液，并按照Folin-Ciocalteu phenol方法分别测定0、20、40、60、80和100μg/mL酪氨酸溶液的A660nm，建立标准曲线。1个蛋白水解活力定义为1min释放1μmol酪氨酸所需的酶量。 
发酵温度和装液量对MCA和PA比值的响应面及等高线如图1所示。为发酵温度和发酵时间对MCA和PA比值的响应面及等高线如图2所示。装液量和发酵时间对MCA和PA比值的响应面及等高线如图3所示。 
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株BD3526(CGMCC No.8333)的粗酶液凝乳酶活力为999.10±23.43SU/mL；测得蛋白酶水解活力为0.23±0.03U/mL，MCA/PA比值为4432.59±542.16。 
实施例2类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养20h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有40mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于35℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释3倍(D＝3)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为824.36±82.39SU/mL；测得的蛋白酶水解活 力为0.15±0.02U/mL，MCA/PA比值为5646.88±294.13。 
实施例3类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养20h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比按3％的接种至250mL锥形瓶中装有20mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于35℃，300r/min的条件下，震荡培养20h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为3624.96±282.48SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.87±0.02U/mL，MCA/PA比值为4168.68±350.27。 
实施例4类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养20h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比，按5％的接种至250mL锥形瓶中装有40mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于35℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为2019.64±119.11SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.45±0.05U/mL，MCA/PA比值为4403.42±227.22。 
实施例5类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养20h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有20mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养12h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为2513.13±13.16SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.72±0.02U/mL，MCA/PA比值为3891.18±487.03。 
实施例6类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养20h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有20mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养20h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为4760.71±46.28SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.88±0.06U/mL，MCA/PA比值为5427.82±409.96。 
实施例7类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有40mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min 的条件下，震荡培养12h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为1911.94±67.83SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.51±0.03U/mL，MCA/PA比值为3774.86±271.26。 
实施例8类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有40mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养20h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为4578.64±110.81SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.84±0.04U/mL，MCA/PA比值为5447.91±264.37。 
实施例9类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中25℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比4％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于25℃，300r/min的条件下，震荡培养12h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液不稀释(D＝1)， 取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为116.20±10.88SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.05±0.01U/mL，MCA/PA比值为2237.28±78.91。 
实施例10类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于35℃，300r/min的条件下，震荡培养12h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为3245.86±162.88SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.69±0.04U/mL，MCA/PA比值为4697.59±419.23。 
实施例11类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于25℃，300r/min的条件下，震荡培养20h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为4338.38±73.33SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.72±0.04U/mL，MCA/PA比值为6029.22±263.53。 
实施例12类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于35℃，300r/min的条件下，震荡培养20h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为2091.53±149.86SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.58±0.03U/mL，MCA/PA比值为3625.33±82.77。 
实施例13类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为5822.96±237.94SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.72±0.03U/mL，MCA/PA比值为8087.44。 
实施例14类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min 培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％的接种至250mL锥形瓶中装有30.47mL的3％小麦麸皮培养基中并混匀，于29.62℃，300r/min的条件下，震荡培养16.65小时。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液，按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为6460.98±372.80SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.59±0.03U/mL，MCA/PA比值为10982.79±263.53。 
实施例15类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的14％小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为5865.99±53.86SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.69±0.14U/mL，MCA/PA比值为8755.23±183.06。 
实施例16类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中25℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比5％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的1％小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离 心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为5853.99±53.86SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.51±0.14U/mL，MCA/PA比值为8725.23±182.06。 
实施例17类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中25℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比3％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3％米糠培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为5655.99±53.86SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.69±0.12U/mL，MCA/PA比值为8725.23±175.04。 
实施例18类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.BD3526)CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测 
将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中25℃、180r/min培养18h作为种子液使用，将所得种子液按体积百分比3％接种至250mL锥形瓶中装有30mL的5％米糠培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养16h。 
培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗酶液。将制备得到粗酶液稀释10倍(D＝10)，取500μL的稀释粗酶液按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
测得的粗酶液凝乳酶活力为5841.99±53.86SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.47±0.11U/mL，MCA/PA比值为8613.23±185.02。 
对比实施例1小牛凝乳酶耐热性检测 
将小牛凝乳酶(购买自甘肃华羚生物科技有限公司公司)配置成合适浓度的酶液，小牛凝乳酶液的浓度为5mg/mL，于35℃、40℃、50℃、55℃和60℃不同温度水浴分别孵育30min，结束后样品至于冰水浴中冷却，分别测定样品凝乳酶活力，以未经水浴处理酶液的凝乳酶活力为对照，并计作100％。 
经测定45℃处理30min，凝乳酶活力略有下降；50℃处理30min，凝乳酶活力显著下降，仅为初始值的52.3％；55℃处理30min，凝乳酶活力完全消失。 
对比实施例2其它微生物来源的粗酶液凝乳酶活力检测 
根据实施例1所述类芽孢杆菌的培养方法，分别培养三种类芽孢杆菌：B.subtilis(来自印度德里大学微生物学院)、Bacillus subtils(natto)Takahashi(来自日本Takahashi Yuzo研究所)和B.amyloliquefaciens JNU002(江南大学生物工程学院，CCTCC M2011045)。利用实施例1所述凝乳酶活力检测方法，检测三种类芽孢杆菌的MCA/PA值，所得结果为：B.subtilis凝乳酶的MCA/PA的比值为592.42，Bacillus subtils(natto)Takahashi凝乳酶的MCA/PA的比值为2981，B.amyloliquefaciens JNU002凝乳酶的MCA/PA的比值为1236。其中B.subtilis(natto)Takahashi凝乳酶需要65℃/30min才能灭活，B.subtilis B1凝乳酶需要70℃/5min才能灭活，B.sphaericus NRC24凝乳酶需要70℃/10min才能灭活。 
对比实施例3不同微生物来源的粗酶液凝乳酶活力检测 
将500μL其他微生物来源的粗酶液按照实施例1所述方法进行凝乳实验，所述不同微生物的粗酶液的制备方法如实施例1所述，所得粗酶液的凝乳酶活力数据如表6所示： 
表6其他微生物来源的粗酶液凝乳酶活力测试结果 
微生物 粗酶液酶活
Mucor rouxii[1] 1.90SU/mL
Penicilliumoxalicum[2] 16.8SU/mg
Nocardiopsis spp.[3] 4.7SU/mL
Bacillus amyloliquefaciens D4[4] 1000SU/mL
Bacillus subtilis(natto)Takahashi[5] 685.7SU/mL
Bacillus subtilis B1[6] 1129.05SU/mL
Bacillus subtilis YB-3[7] 200SU/mL
Bacillus sphaericus NRC24[8] 1212SU/mL
其中表6所述微生物Mucor rouxii请参考文献[1]：Yu P J,Chou C C.Factors affecting thegrowth and production of milk clotting enzyme by Amylomycesrouxii in rice liquid medium[J].Food Technology and Biotechnology,2005,43(3):283-288.； 
表6所述微生物Penicilliumoxalicum请参考文献[2]：Hashem MA.Purification and properties of a milk clotting enzyme producedbyPenicilliumoxalicum[J].Bioresource Technology,2000,75(3):219–222.； 
表6所述微生物Nocardiopsis spp.请参考文献[3]：Cavalcanti MTH,Martinez CR,Furtado VC,Neto BB,Teixeira MF,Lima Filho JL,Porto ALF.Milk-clotting protease production by Nocardiopsis sp.in an inexpensive medium[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(2):151-154.； 
表6所述微生物Bacillus amyloliquefaciens D4请参考文献[4]：He X,Zhang W,Ren F,Gan B,Guo H.Screening fermentation parameters of the milk-clotting enzyme produced by newly isolated Bacillus amyloliquefaciens D4from the Tibetan Plateau in China[J].Annals of Microbiology,2012,62(1): 357-365.； 
表6所述微生物Bacillus subtilis(natto)Takahashi请参考文献[5]：Shieh C J,Phan Thi L A,Shih I L.Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis natto[J].Biochemical Engineering Journal,2009,43(1):85-91.； 
表6所述微生物Bacillus subtilis B1请参考文献[6]：Ding Z Y,Liu S P,Gu Z H,Zhang L,Zhang K C,Shi G Y.Production of milk-clotting enzyme by Bacillus subtilis B1from wheat bran[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(46):9370-9378.； 
表6所述微生物Bacillus subtilis YB-3请参考文献[7]：Li Y,Liang S,Zhi D,Chen P,Su F,Li H.Purification and characterization of Bacillus subtilis milk-clotting enzyme from Tibet Plateau and its potential use in yak dairy industry[J].European Food Research and Technology,2012,234(4):733-741.； 
表6所述微生物Bacillus sphaericus NRC24请参考文献[8]：El-Bendary M A,Moharam M E,Ali T H.Purification and Characterization of Milk Clotting Enzyme Produced by Bacillus sphaericus[J].Journal of Applied Sciences Research,2007,3(8):695-699.。 
从上述实验结果中可以看出，利用本发明所述类芽孢杆菌新种BD3526(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333制备的凝乳酶的活力比其他微生物来源的凝乳酶的活力高出数倍甚至数百倍之多，该菌株填补了凝乳酶制备领域的巨大空白。 
对比实施例4利用不同培养基制备类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液提取物 
将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子使用，将所得菌株种子按3％的接种量，分别接种至250mL锥形瓶中装有50mL的3％小麦麸皮培养基和250mL锥形瓶中装有50mL的LB培养基中并混匀，于30℃，100r/min的条件下，震荡培养30h。培养结束后，分别称取5mL培养好的小麦麸皮培养基和LB培养 基均经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。 
将制备得到的小麦麸皮培养基500μL的粗酶液稀释5倍(D＝5)，LB培养基粗酶液不稀释(D＝1)，分别按照实施例1中的方法分别进行MCA和PA的测定。 
小麦麸皮培养基粗酶液测得的凝乳时间为77.67±2.52秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为3092.31±100.88SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为5.23±0.51U/mL，MCA/PA比值为591.26。 
LB培养基粗酶液测得的凝乳时间为3630.67±137.48秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为13.24±0.51SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.03±0.001U/mL，MCA/PA比值为441.33。 
由此可见，利用小麦麸皮培养基制备的凝乳酶粗酶液与利用LB培养基制备的粗酶液相比，所得发酵液提取物的凝乳酶活力提高了233.56倍。 
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种类芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括以下步骤：将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，发酵温度为25～35℃，发酵时间为12～20小时，震荡培养即得，所述百分比为质量百分比。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵是在发酵容器中进行的，所述发酵容器中培养基的装液量为8％～16％，所述百分比为体积百分比。
3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵容器中培养基的装液量为12％，所述百分比为体积百分比。
4.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述培养类芽孢杆菌的培养基为小麦麸皮培养基或者米糠培养基。
5.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，其中所述发酵温度为28～30℃，更佳地为29.62℃。
6.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，其中所述发酵时间为16～18小时，更佳地为16.65小时。
7.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述小麦麸皮培养基的配方为：小麦麸皮的含量为1％～14％，余量为水，该小麦麸皮培养基的组分为：蛋白质13.9～18.6％，脂肪3.3～8.2％，总碳水化合物61.9～74.62％，水分4.8～18.02％，灰分3.38～6.50％，所述百分比为质量百分比。
8.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述米糠培养基的配方为：米糠的含量3～5％，余量为水，该米糠培养基的组分为：蛋白质10.5～15.3％，脂肪9.8～24.0％，总碳水化合物42.0～61.9％，水分8.9～13.4％，灰分4.4～9.8％，所述百分比为质量百分比。
9.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，将所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于培养类芽孢杆菌的培养基之前，还包括该类芽孢杆菌CGMCC No.8333活化的步骤，所述活化的步骤为：将所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种在TYC培养基中，25～30℃培养18～20小时，得到类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子液。
10.如权利要求9所述的发酵方法，其特征在于，将所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子液按3％～5％接种量接种于小麦麸皮培养基中，震荡培养，摇床转速为200～300r/min，其中所述百分比为体积百分比。
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