CN108913707A - 一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法。本发明分别优化了鲎C因子酶原、B因子酶原和凝血酶原基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1～3所示；还优化了共同表达三种因子的核苷酸序列，如SEQ ID NO:4所示；并成功构建了单独表达或共同表达三种因子的真核表达载体，将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行表达，成功获得了类似天然鲎试剂的重组鲎试剂，可用于检测内毒素。所述试剂灵敏度高，特异性强，可降低假阳性，且制备工艺简单，无需分别提取纯化表达的蛋白，生产成本低，同时大大减少对野生鲎资源的需求，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法。
背景技术
鲎的血细胞溶解物可被微量的细菌内毒素或微量的真菌细胞壁成分(1-3)-β-D-葡聚糖激活产生一系列的酶促反应最终形成凝胶，该反应的机理如图1所示。美国科学家Bang和Levin于上世纪六十年代发现鲎血的凝集机理并建立了鲎实验方法。药典收载细菌内毒素检查法后，鲎试剂得以广泛的应用和进入工厂化生产；其中以美国的产量最大，质量和标准最高，产品的技术含量也最高。医药工业对于鲎试剂的依赖程度越来越高，消耗鲎试剂的量逐年上升。但由于我国南方大肆捕杀食用鲎，鲎生存环境的逐步恶化已使其濒临灭绝，造成鲎试剂原料供应出现紧张。
目前，生产鲎试剂仍依赖从鲎提取的血细胞溶解物，经氯仿抽提后冷冻干燥制备而成。这种方法制备的鲎试剂具有难以克服的缺陷：①鲎试剂灵敏度差异较大。由于鲎的个体差异大和目前鲎试剂的生产工艺的不同，生产的鲎试剂灵敏度差异较大。②鲎试剂缺乏特异性。因为鲎凝血过程具有两条不同的激活途径，所以这种制备鲎试剂的工艺不能保证生产出来的鲎试剂具有特异性，也就造成实际应用鲎试剂检测时会出现假阳性结果，不易区分是内毒素引起的鲎反应还是(1-3)-β-D-葡聚糖引起的鲎反应。③不符合临床检测需要。由于鲎试剂缺乏特异性，因而限制了其在临床上的推广使用。鲎试剂的特异性是当前鲎试剂生产技术领域亟待解决的问题，同时也是药品质量控制、降低生产成本、减少鲎试验假阳性结果的要求。
目前，国外用基因工程技术克隆表达了C因子，成功制备了特异性检测内毒素的鲎试剂。国内张惟杰等用大肠杆菌已经成功克隆制备重组鲎凝血C因子，但因大肠杆菌本身就产内毒素，所以该法获得的C因子是被激活的C因子，不能用于鲎试剂的制备。C因子实际是一个糖蛋白，不适合用原核表达***表达，国内未见重组C因子用于检测细菌内毒素的报告。此外，目前国外基因工程技术生产的C因子制备的检测试剂仍存在灵敏度不高、生产成本高、检测结果不能完全与天然鲎试剂一致等缺点。因此，现急需研究一种灵敏度高、特异性强的人工鲎试剂及其相应的制备方法，以缓解鲎资源短缺，满足内毒素检测的需求。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有方法制备的鲎试剂灵敏度及特异性较低，鲎资源有限的缺陷，提供一种特异性检测内毒素的试剂。本发明首先对鲎C因子酶原基因、B因子酶原基因和凝血酶原基因的核苷酸序列进行密码子优化，然后成功构建了单独表达或共同表达上述三种密码子优化后的酶原基因的真核表达载体，再将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行真核表达，成功获得了类似天然鲎试剂的重组鲎试剂，可用于检测内毒素，具有灵敏度高、特异性强的优点。
本发明的另一目的在于提供一种表达鲎C因子酶原的重组基因。
本发明的另一目的在于提供一种表达鲎B因子酶原的重组基因。
本发明的另一目的在于提供一种表达鲎凝血酶原的重组基因。
本发明的另一目的在于提供一种共表达鲎C因子、B因子和凝血酶原的重组基因。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述任一所述的重组基因的真核表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述真核表达载体的宿主细胞。
本发明的另一目的在于提供上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备检测内毒素的试剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种表达鲎C因子酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种表达鲎B因子酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种表达鲎凝血酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
一种共表达鲎C因子、B因子和凝血酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明通过对鲎C因子酶原基因、B因子酶原基因和凝血酶原基因的核苷酸序列进行密码子优化，其优化后的序列分别如SEQ ID NO:1～3所示，并成功构建了单独表达或共同表达(SEQ ID NO:4)上述三种密码子优化后的酶原基因的真核表达载体，通过将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行真核表达，成功获得了类似天然鲎试剂的重组鲎试剂，可用于检测内毒素。
本发明还请求保护一种真核表达载体，含有上述任一所述的重组基因。
本发明还请求保护一种宿主细胞，含有上述真核表达载体。
所述的宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：将上述任一所述的重组基因装载入真核表达载体中，再将真核表达载体导入动物细胞中并采用抗生素筛选能分别稳定表达C因子、B因子、凝血酶原的细胞或能稳定共表达三种因子的细胞，即得。
优选地，所述真核表达载体为哺乳类表达载体或昆虫表达载体。
更优选地，所述真核表达载体为含有CMV启动子的pcDNA3.1载体。
优选地，所述动物细胞为COS细胞系、CHO细胞系或其他能利用CMV启动子的细胞系。
本发明还请求保护上述任一所述的重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备检测内毒素的试剂中的应用。
一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法，先构建单独表达SEQ ID NO:1～3所示重组酶原基因的真核表达载体，然后分别导入动物细胞中，筛选得到稳定表达上述三个基因的细胞；再将筛选到的三种细胞扩增、漂洗后混匀，得细胞混合液；最后将细胞混合液裂解、离心，收集上清液；加入等体积冰冷氯仿，离心后取上清液，即得；
或构建SEQ ID NO:4所示重组酶原基因的真核表达载体，然后导入动物细胞中，筛选得到稳定表达上述重组基因的细胞，将筛选到的细胞扩增、漂洗后再裂解、离心，收集上清液；加入等体积冰冷氯仿，离心后取上清液，即得。
本发明还请求保护所述方法制备得到的特异性检测内毒素的试剂，含有SEQIDNO:1～3所示重组基因的表达产物或含有SEQ ID NO:4所示重组基因的表达产物。
优选地，所述试剂还含有无内毒素水、终浓度为0.06～0.2％的氯化钠、终浓度为0.15～0.6M的氯化钙、终浓度为0.2～0.5M的氯化镁和终浓度为5～10％的右旋糖酐。
作为一种优选的具体实施方式，所述特异性检测内毒素的试剂的制备方法包括如下步骤：
S1.分别将3个关键因子(C因子酶原、B因子酶原、凝血酶原)的基因序列装载入含有CMV启动子的真核表达载体中，然后分别导入动物细胞中，并根据载体所携带的抗性基因使用抗生素筛选分别稳定表达上述3个关键因子的细胞；
S2.将S1所得细胞进行细胞扩增，当细胞扩增到汇合度达90％时，分别收集3种细胞，用无内毒素的生理盐水或缓冲液漂洗三次，计数；然后将三种细胞按照以下数量比例混合，即表达C因子酶原的细胞数目：表达B因子酶原的细胞数目：表达凝血酶原的细胞数目＝1:2～5:10～25；
S3.用无内毒素水裂解细胞混合液，于10000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，按体积比(细胞裂解液:氯仿＝1:0.6～2)加入相应体积的氯仿，于3～10℃下剧烈振摇10～30min，于5000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，上清液即人工制备的特异检测内毒素的试剂原液，加入氯化钠使之终浓度为0.06～0.2％，CaCl2终浓度为0.15～0.6M，MgCl2终浓度为0.2～0.5M，再加入右旋糖酐为赋形剂，右旋糖酐的终浓度为5～10％，混匀，分装0.1～1mL/支安培瓶，冷冻干燥，即为制备的重组鲎试剂，可用于内毒素的检测。
优选地，S2中所述表达C因子酶原的细胞数目：表达B因子酶原的细胞数目：表达凝血酶原的细胞数目＝1:3:9。
作为另一种优选的具体实施方式，所述特异性检测内毒素的试剂的制备方法包括如下步骤：
S1.将3个关键因子(C因子酶原、B因子酶原和凝血酶原)的基因序列设计同时装载入一个含有CMV启动子的真核表达载体中，然后导入动物细胞中，并根据载体所携带的抗性基因使用抗生素筛选同时稳定表达上述3个关键因子的细胞；
S2.将S1所得细胞进行细胞扩增，当细胞扩增到汇合度达90％时，收集细胞，用无内毒素的生理盐水或缓冲液漂洗三次，计数；
S3.用无内毒素水裂解细胞，于10000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，按体积比(细胞裂解液:氯仿＝1:0.6～2)加入相应体积的氯仿，于3～10℃下剧烈振摇10～30min，于5000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，上清液即人工制备的特异检测内毒素的试剂原液，加入氯化钠使之终浓度为0.06～0.2％，CaCl2终浓度为0.15～0.6M，MgCl2终浓度为0.2～0.5M，再加入右旋糖酐为赋形剂，右旋糖酐的终浓度为5～10％，混匀，分装0.1～1mL/支安培瓶，冷冻干燥，即为制备的重组鲎试剂，可用于内毒素的检测。
优选地，S1中所述的真核表达载体转入动物细胞的方法为转染或病毒感染法。
优选地，S1中所述的抗生素为新霉素。
优选地，S2中所述的缓冲液为Tis-HCl缓冲液。
采用化学显色法验证所述重组鲎试剂对内毒素的检测结果，步骤如下：将显色基质鲎三肽(BOC-Leu-Gly-Arg pNA.HCl)底物溶于无热原水中，于-20℃避光保存，储存液浓度为1mM。将上述制备的重组鲎试剂用0.1～1mL无热原水复溶解，加入鲎三肽显色剂(终浓度为10μM)混匀，然后分别加入不同浓度的内毒素或2000pg/mL(1-3)-β-D-葡聚糖，混匀，于37℃水浴30min后，加入12.5％乙酸0.1mL终止反应。用酶标仪测量405nm的OD值。
结果表明，所述重组鲎试剂的最小产色灵敏度可达0.003EU/mL内毒素；且200pg/mL(1-3)-β-D-葡聚糖不能激活重组鲎试剂，表明制备的人工鲎试剂只对内毒素敏感，而对(1-3)-β-D-葡聚糖不敏感，特异性强。利用本发明所述重组鲎试剂来检测细菌内毒素，排除了G因子旁路的干扰，从而有效地避免了葡聚糖产生假阳性的可能性，并且解决了鲎资源有限、鲎试剂各批次稳定性差的缺点，可作为内毒素检测试剂推广应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的特异性检测内毒素的试剂灵敏度高，最小产色灵敏度可达0.003EU/mL内毒素；只对内毒素敏感，而对(1-3)-β-D-葡聚糖不敏感，特异性强，可降低假阳性；且制备工艺简单，无需分别提取纯化表达的蛋白，提高了生产效率，减少污染，生产成本低，同时大大减少对野生鲎资源的需求，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1为鲎的血细胞溶解物被细菌内毒素或真菌细胞壁成分(1-3)-β-D-葡聚糖激活后产生的酶促反应机理图。
图2为本发明采用的pcDNA3.1质粒图谱。
图3为实施例1中C因子、B因子和凝血酶原在不同细胞中的表达情况。
图4为实施例2中在细胞中共表达C因子、B因子和凝血酶原的情况。
图5为实施例2中以-ln(内毒素浓度)为横坐标，-ln(OD405nm)为纵坐标建立的标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例通过优化鲎C因子酶原、B因子酶原和凝血酶原基因的核苷酸序列，并成功构建了分别单独表达三种因子的真核表达载体，将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行表达，获得了重组鲎试剂，可用于检测内毒素。
所述优化后的表达鲎C因子酶原的重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述优化后的表达鲎B因子酶原的重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述优化后的表达鲎凝血酶原的重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本实施例还提供了一种含有上述任一所述重组基因的真核表达载体。
本实施例还提供了一种含有上述真核表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：将上述任一所述的重组基因装载入含有CMV启动子的pcDNA3.1载体(如图2所示)中，再将pcDNA3.1载体转染COS细胞系中并采用新霉素筛选能分别稳定表达C因子、B因子、凝血酶原的细胞，即得。
将各组宿主细胞裂解后，收集蛋白溶液，用免疫印迹分析检测蛋白表达情况，结果如图3所示，转染C因子、B因子和凝血酶原基因的细胞均成功表达三种蛋白质。
本实施例还提供了一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法，包括如下步骤：
1、分别将SEQ ID NO:1～3所示的3个关键因子(C因子酶原、B因子酶原、凝血酶原)的基因序列装载入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3.1中，然后采用转染法分别导入动物细胞中，并根据载体所携带的抗性基因使用新霉素筛选分别稳定表达上述3个关键因子的COS细胞；
2、将步骤1所得细胞进行细胞扩增，当细胞扩增到汇合度达90％时，分别收集3种细胞，用无内毒素的生理盐水漂洗三次，计数；然后将三种细胞按照以下数量比例混合，即表达C因子酶原的细胞数目：表达B因子酶原的细胞数目：表达凝血酶原的细胞数目＝1:3:9；
3、用无内毒素水裂解细胞混合液，于10000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，按体积比(细胞裂解液:氯仿＝1:0.6～2)加入相应体积的氯仿，于3～10℃下剧烈振摇10～30min，于5000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，上清液即人工制备的特异检测内毒素的试剂原液，加入氯化钠使之终浓度为0.06～0.2％，CaCl2终浓度为0.15～0.6M，MgCl2终浓度为0.2～0.5M，再加入右旋糖酐为赋形剂，右旋糖酐的终浓度为5～10％，混匀，分装0.1～1mL/支安培瓶，冷冻干燥，即为制备的重组鲎试剂，可用于内毒素的检测。
采用化学显色法验证所述重组鲎试剂对内毒素的检测结果，步骤如下：将显色基质鲎三肽(BOC-Leu-Gly-Arg pNA.HCl)底物溶于无热原水中，于-20℃避光保存，储存液浓度为1mM。将上述制备的重组鲎试剂用0.1～1mL无热原水复溶解，加入鲎三肽显色剂(终浓度为10μM)混匀，然后分别加入不同浓度的内毒素或2000pg/mL(1-3)-β-D-葡聚糖，混匀，于37℃水浴30min后，加入12.5％乙酸0.1mL终止反应。用酶标仪测量405nm的OD值。随着内毒素浓度增加显色基质释放越多，OD405nm值越大，提示酶被激活越多。
孵育1h后终止反应，内毒素检测结果如表1所示，重组鲎试剂最小产色灵敏度可达0.0015EU/mL内毒素，灵敏度范围在0.0015～1EU/mL内毒素。同时表1中的结果还表明，200pg/mL(1-3)-β-D-葡聚糖不能激活本试剂，表明制备的人工鲎试剂只对内毒素敏感，而对(1-3)-β-D-葡聚糖不敏感，特异性强。
表1内毒素检测结果
实施例2
本实施例通过优化共同表达鲎C因子酶原、B因子酶原和凝血酶原的基因核苷酸序列，并成功构建了共表达三种因子的真核表达载体，所述三种优化后基因装载入含有CMV启动子的pcDNA3.1载体的具体操作为：如图2所示，将包含有2A肽(F2A和E2A)开放读码框序列和C因子基因、B因子基因、凝血酶原基因开放读码框连接，排列顺序如：5’-NheI-C因子基因flag-F2A基因-B因子基因flag-E2A基因-凝血酶原基因flag-TGA-XhoI-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，然后***到pcDNA3.1质粒多克隆位点NheI～XhoI之间。
将上述真核表达载体转化进工程细胞中进行表达，获得了重组鲎试剂，可用于检测内毒素。
本实施例还提供了一种含有上述重组基因的真核表达载体。
本实施例还提供了一种含有上述真核表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：将上述重组基因装载入含有CMV启动子的pcDNA3.1载体中，再将pcDNA3.1载体转染CHO细胞系中并采用新霉素筛选能同时稳定表达上述3个关键因子的细胞，即得。
将宿主细胞裂解后，收集蛋白溶液，用免疫印迹分析检测蛋白表达情况，结果如图4所示，转染5’-NheI-C因子基因flag-F2A基因-B因子基因flag-E2A基因-凝血酶原基因flag-TGA-XhoI-3’序列的细胞成功共表达三种蛋白质。由于B因子与凝血酶原分子量相差不大，集中在38～46KD范围，因此电泳分不开，在电泳图谱上显示为同一条带。
本实施例还提供了一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法，包括如下步骤：
1、将3个关键因子(C因子酶原、B因子酶原、凝血酶原)的基因序列设计同时装载入含有CMV启动子的真核表达载体中(即SEQ ID NO:4)，然后采用转染法分别导入动物细胞中，并根据载体所携带的抗性基因使用新霉素筛选同时稳定表达上述3个关键因子的CHO细胞；
2、将步骤1所得细胞进行细胞扩增，当细胞扩增到汇合度达90％时，收集细胞，用无内毒素的Tis-HCl缓冲液漂洗三次，计数；
3、用无内毒素水裂解细胞，于10000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，按体积比(细胞裂解液:氯仿＝1:0.6～2)加入相应体积的氯仿，于3～10℃下剧烈振摇10～30min，于5000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，上清液即人工制备的特异检测内毒素的试剂原液，加入氯化钠使之终浓度为0.06～0.2％，CaCl2终浓度为0.15～0.6M，MgCl2终浓度为0.2～0.5M，再加入右旋糖酐为赋形剂，右旋糖酐的终浓度为5～10％，混匀，分装0.1～1mL/支安培瓶，冷冻干燥，即为制备的重组鲎试剂，可用于内毒素的检测。
采用化学显色法验证所述重组鲎试剂对内毒素的检测结果，步骤如下：将显色基质鲎三肽(BOC-Leu-Gly-Arg pNA.HCl)底物溶于无热原水中，于-20℃避光保存，储存液浓度为1mM。将上述制备的重组鲎试剂用0.1～1mL无热原水复溶解，加入鲎三肽显色剂(终浓度为10μM)混匀，然后分别加入不同浓度的内毒素或2000pg/mL(1-3)-β-D-葡聚糖，混匀，于37℃水浴30min后，加入12.5％乙酸0.1mL终止反应。用酶标仪测量405nm的OD值。随着内毒素浓度增加显色基质释放越多，OD405nm值越大，提示酶被激活越多。
孵育1h后终止反应，内毒素检测结果如表2所示，重组鲎试剂最小产色灵敏度可达0.003EU/mL内毒素，灵敏度范围在0.003～1EU/mL内毒素。同时表2中的结果还表明，200pg/mL(1-3)-β-D-葡聚糖不能激活本试剂，表明制备的人工鲎试剂只对内毒素敏感，而对(1-3)-β-D-葡聚糖不敏感。
表2内毒素检测结果
以-ln(内毒素浓度)为横坐标，-ln(OD405nm)为纵坐标建立线性方程y＝0.7387x-0.5447，R2＝0.9812。结果表明，标准曲线如图5所示，内毒素浓度在0.003～1EU/mL范围线性良好，R2＝0.9812。同时表2中的结果也显示，200pg/mL(1-3)-β-D-葡聚糖不能激活所述重组鲎试剂，表明制备的人工鲎试剂只对内毒素敏感，而对(1-3)-β-D-葡聚糖不敏感，特异性强。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广东医科大学
<120> 一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3090
<212> DNA
<213> 鲎(Tachypleus tridentatus Leach)
<400> 1
atggtgctgg ccagcttcct ggtgagcggc ctggtgctgg gcatcctggc ccagcagatg 60
cgccccgtgc agagccgcgg cgtggacctg ggcctgtgcg acgagacccg cttcgagtgc 120
aagtgcggcg accccggcta cgtgttcaac gtgcccatga agcagtgcac ctacttctac 180
cgctggcgcc cctactgcaa gccctgcgac gacctggagg ccaaggacat ctgccccaag 240
tacaagcgct gccaggagtg caaggccggc ctggacagct gcgtgacctg cccccccaac 300
aagtacggca cctggtgcag cggcgagtgc cagtgcaaga acggcggcat ctgcgaccag 360
cgcaccggcg cctgcacctg ccgcgaccgc tacgagggcg cccactgcga gatcctgaag 420
ggctgccccc tgctgcccag cgacagccag gtgcaggagg tgcgcaaccc ccccgacaac 480
ccccagacca tcgactacag ctgcagcccc ggcttcaagc tgaagggcgt ggcccgcatc 540
agctgcctgc ccaacggcca gtggagcagc ttccccccca agtgcatccg cgagtgcgcc 600
aaggtgagca gccccgagca cggcaaggtg aacgccccca gcggcaacat gatcgagggc 660
gccaccctgc gcttcagctg cgacagcccc tactacctga tcggccagga gaccctgacc 720
tgccagggca acggccagtg gagcggccag atcccccagt gcaagaagct ggtgttctgc 780
cccgacctgg accccgtgaa ccacgccgag caccaggtga agatcggcgt ggagcagaag 840
tacggccagt tcccccaggg caccgaggtg acctacacct gcagcggcaa ctacttcctg 900
atgggcttca acaccctgaa gtgcaacccc gacggcagct ggagcggcag ccagcccagc 960
tgcgtgaagg tggccgaccg cgaggtggac tgcgacagca aggccgtgga cttcctggac 1020
gacgtgggcg agcccgtgcg catccactgc cccgccggct gcagcctgac cgccggcacc 1080
gtgtggggca ccgccatcta ccacgagctg agcagcgtgt gccgcgccgc catccacgcc 1140
ggcaagctgc ccaacagcgg cggcgccgtg cacgtggtga acaacggccc ctacagcgac 1200
ttcctgggca gcgacctgaa cggcatcaag agcgaggagc tgaagagcct ggcccgcagc 1260
ttccgcttcg actacgtgag cagcagcacc gccggccgca gcggctgccc cgacggctgg 1320
ttcgaggtgg aggagaactg cgtgtacgtg accagcaagc agcgcgcctg ggagcgcgcc 1380
cagggcgtgt gcaccaacat ggccgcccgc ctggccgtgc tggacaagga cctgatcccc 1440
agcagcctga ccgagaccct gcgcggcaag ggcctgacca ccacctggat cggcctgcac 1500
cgcctggacg ccgagaagcc cttcgtgtgg gagctgatgg accgcagcaa cgtggtgctg 1560
aacgacaacc tgaccttctg ggccagcggc gagcccggca acgagaccaa ctgcgtgtac 1620
ctggacatcc gcgaccagct gcagcccgtg tggaagacca agagctgctt ccagcccagc 1680
agcttcgcct gcatgatgga cctgagcgac cgcaacaagg ccaagtgcga cgaccccggc 1740
cccctggaga acggccacgc caccctgcac ggccagagca tcgacggctt ctacgccggc 1800
agcagcatcc gctacagctg cgaggtgctg cactacctga gcggcaccga gaccgtgacc 1860
tgcaccacca acggcacctg gagcgccccc aagccccgct gcatcaaggt gatcacctgc 1920
cagaaccccc ccgtgcccag ctacggcagc gtggagatca agccccccag ccgcaccaac 1980
agcatcagcc gcgtgggcag ccccttcctg cgcctgcccc gcctgcccct gcccctggcc 2040
cgcgccgcca agcccccccc caagccccgc agcagccagc ccagcaccgt ggacctggcc 2100
agcaaggtga agctgcccga gggccactac cgcgtgggca gccgcgccat ctacacctgc 2160
gagagccgct actacgagct gctgggcagc cagggccgcc gctgcgacag caacggcaac 2220
tggagcggcc gccccgccag ctgcatcccc gtgtgcggcc gcagcgacag cccccgcagc 2280
cccttcatct ggaacggcaa cagcaccgag atcggccagt ggccctggca ggccggcatc 2340
agccgctggc tggccgacca caacatgtgg ttcctgcagt gcggcggcag cctgctgaac 2400
gagaagtgga tcgtgaccgc cgcccactgc gtgacctaca gcgccaccgc cgagatcatc 2460
gaccccagcc agttcaagat ctacctgggc aagtactacc gcgacgacag ccgcgacgac 2520
gactacgtgc aggtgcgcga ggccctggag atccacgtga accccaacta cgaccccggc 2580
aacctgaact tcgacatcgc cctgatccag ctgaagaccc ccgtgaccct gaccacccgc 2640
gtgcagccca tctgcctgcc caccgacatc accacccgcg agcacctgaa ggagggcacc 2700
ctggccgtgg tgaccggctg gggcctgaac gagaacaaca cctacagcga gatgatccag 2760
caggccgtgc tgcccgtggt ggccgccagc acctgcgagg agggctacaa ggaggccgac 2820
ctgcccctga ccgtgaccga gaacatgttc tgcgccggct acaagaaggg ccgctacgac 2880
gcctgcagcg gcgacagcgg cggccccctg gtgttcgccg acgacagccg caccgagcgc 2940
cgctgggtgc tggagggcat cgtgagctgg ggcagcccca gcggctgcgg caaggccaac 3000
cagtacggcg gcttcaccaa ggtgaacgtg ttcctgagct ggatccgcca gttcatctta 3060
atggactaca aagacgatga cgacaagtac 3090
<210> 2
<211> 1233
<212> DNA
<213> 鲎(Tachypleus tridentatus Leach)
<400> 2
atgacctgga tctgcgttat caccctgttc gctctggctt ctgctaccct gggtaacaaa 60
gtttctcgtg ttggtgttct gttcccgaaa acccgtaacg acaacgaatg caccgctcgt 120
ggtggtctga aaggttcttg caaatctctg atcgactgcc cgtctgttct ggctaccctg 180
aaagactctt tcccggttgt ttgctcttgg aacggtcgtt tccagccgat cgtttgctgc 240
ccggacgcta tcgctccgcc gccggttacc accaccgctg ttaccgttat ctctaccaaa 300
gaaccgaaac tgccgcgtct gcacatctct ggttgcggta aacgtaaagt taaaatcgac 360
atcaccaccg ttggtcgttc tggttctccg atcctgccgc cgatctctac cccgcagaac 420
tctaccggtg gtcgtggtat catcgctggt ggtgttgaag ctaaaatcgg tgcttggccg 480
tggatggctg ctgttttcgt taaaaacttc ggtatcggtc gtttccactg cgctggttct 540
atcatctcta acaaatacat cctgtctgct gctcacgctt tcctgatcgg tggtcgtaaa 600
ctgaccccga cccgtctggc tgttcgtgtt ggtggtcact acatcaaacg tggtcaggaa 660
tacccggtta aagacgttat catccacccg cactacgttg aaaaagaaaa ctacaacgac 720
atcgctatca tcgaactgaa agaagaactg aacttcaccg acctggttaa cccgatctgc 780
ctgccggacc cggaaaccgt taccgacccg ctgaaagacc gtatcgttac cgctgctggt 840
tggggtgacc tggacttctc tggtccgcgt tctcaggttc tgcgtgaagt ttctatcccg 900
gttgttccgg ttgacaaatg cgaccaggct tacgaaaaac tgaacacccc gtctctgaaa 960
aacggtatca ccaacaactt cctgtgcgct ggtctggaag aaggtggtaa agacgcttgc 1020
cagggtgact ctggtggtcc gctgatgctg gttaacaaca cccgttggat cgttgttggt 1080
gttgtttctt tcggtcacaa atgcgctgaa gaaggttacc cgggtgttta ctctcgtgtt 1140
gcttcttacc tggactggat cgctaaagtt accaactctc tggaccacgc tgttaccaac 1200
ttaatggact acaaagacga tgacgacaag taa 1233
<210> 3
<211> 1158
<212> DNA
<213> 鲎(Tachypleus tridentatus Leach)
<400> 3
atgttggtga ataacgtgtt ttcactactg tgtttcccac tcttgatgtc tgtggttaga 60
tgcagtactc tcagcagaca gcgtagacag tttgttttcc ctgacgagga agaactttgc 120
tcaaaccgat ttactgaaga aggaacatgc aaaaatgtct tggattgtag aatactttta 180
caaaaaaatg attataattt actcaaagaa tcaatatgcg gctttgaagg cataacaccc 240
aaagtttgtt gtccgaaatc aagccatgta atttcaagta cacaggcacc tccagaaacc 300
actacgactg aacgcccacc aaaacagata ccacccaatc ttcctgaagt gtgtggaatt 360
cacaatacta caactaccag gattattgga ggtcgggaag cacctattgg agcctggccg 420
tggatgactg ctgtctacat aaaacaagga ggaatcagaa gtgttcagtg tggtggcgca 480
cttgtcacta acaggcacgt gattacagct tcgcactgtg ttgtaaacag tgcaggaaca 540
gatgtgatgc cagctgatgt attctcggtt cgtctgggtg aacacaattt atacagtacc 600
gatgacgatt cgaatccaat agattttgca gttacgtcgg tgaaacatca cgaacacttt 660
gtactcgcga cgtatttgaa tgacatcgca attctaacgt taaatgacac agttacgttt 720
acagacagaa ttcgacccat ttgtctacct tatcgtaagt tgagatacga tgatctagca 780
atgagaaaac cgtttatcac tggatgggga acaacagcat ttaacggccc atctagtgca 840
gtgttgagag aagtacagtt accaatatgg gaacacgagg cctgtagaca ggcctacgag 900
aaggatttaa atattacaaa cgtgtatatg tgtgctggct ttgcagatgg cgggaaggat 960
gcttgccagg gtgattctgg aggtccaatg atgttgcctg ttaaaaccgg agagttttat 1020
ctcattggaa ttgtgtcttt cggaaagaaa tgcgcattgc ctggatttcc tggggtttac 1080
acaaaagtga cagagttttt agattggatt gcagaacata tggtgttaat ggactacaaa 1140
gacgatgacg acaagtag 1158
<210> 4
<211> 5619
<212> DNA
<213> 鲎(Tachypleus tridentatus Leach)
<400> 4
ctagctagca tggtgctggc cagcttcctg gtgagcggcc tggtgctggg catcctggcc 60
cagcagatgc gccccgtgca gagccgcggc gtggacctgg gcctgtgcga cgagacccgc 120
ttcgagtgca agtgcggcga ccccggctac gtgttcaacg tgcccatgaa gcagtgcacc 180
tacttctacc gctggcgccc ctactgcaag ccctgcgacg acctggaggc caaggacatc 240
tgccccaagt acaagcgctg ccaggagtgc aaggccggcc tggacagctg cgtgacctgc 300
ccccccaaca agtacggcac ctggtgcagc ggcgagtgcc agtgcaagaa cggcggcatc 360
tgcgaccagc gcaccggcgc ctgcacctgc cgcgaccgct acgagggcgc ccactgcgag 420
atcctgaagg gctgccccct gctgcccagc gacagccagg tgcaggaggt gcgcaacccc 480
cccgacaacc cccagaccat cgactacagc tgcagccccg gcttcaagct gaagggcgtg 540
gcccgcatca gctgcctgcc caacggccag tggagcagct tcccccccaa gtgcatccgc 600
gagtgcgcca aggtgagcag ccccgagcac ggcaaggtga acgcccccag cggcaacatg 660
atcgagggcg ccaccctgcg cttcagctgc gacagcccct actacctgat cggccaggag 720
accctgacct gccagggcaa cggccagtgg agcggccaga tcccccagtg caagaagctg 780
gtgttctgcc ccgacctgga ccccgtgaac cacgccgagc accaggtgaa gatcggcgtg 840
gagcagaagt acggccagtt cccccagggc accgaggtga cctacacctg cagcggcaac 900
tacttcctga tgggcttcaa caccctgaag tgcaaccccg acggcagctg gagcggcagc 960
cagcccagct gcgtgaaggt ggccgaccgc gaggtggact gcgacagcaa ggccgtggac 1020
ttcctggacg acgtgggcga gcccgtgcgc atccactgcc ccgccggctg cagcctgacc 1080
gccggcaccg tgtggggcac cgccatctac cacgagctga gcagcgtgtg ccgcgccgcc 1140
atccacgccg gcaagctgcc caacagcggc ggcgccgtgc acgtggtgaa caacggcccc 1200
tacagcgact tcctgggcag cgacctgaac ggcatcaaga gcgaggagct gaagagcctg 1260
gcccgcagct tccgcttcga ctacgtgagc agcagcaccg ccggccgcag cggctgcccc 1320
gacggctggt tcgaggtgga ggagaactgc gtgtacgtga ccagcaagca gcgcgcctgg 1380
gagcgcgccc agggcgtgtg caccaacatg gccgcccgcc tggccgtgct ggacaaggac 1440
ctgatcccca gcagcctgac cgagaccctg cgcggcaagg gcctgaccac cacctggatc 1500
ggcctgcacc gcctggacgc cgagaagccc ttcgtgtggg agctgatgga ccgcagcaac 1560
gtggtgctga acgacaacct gaccttctgg gccagcggcg agcccggcaa cgagaccaac 1620
tgcgtgtacc tggacatccg cgaccagctg cagcccgtgt ggaagaccaa gagctgcttc 1680
cagcccagca gcttcgcctg catgatggac ctgagcgacc gcaacaaggc caagtgcgac 1740
gaccccggcc ccctggagaa cggccacgcc accctgcacg gccagagcat cgacggcttc 1800
tacgccggca gcagcatccg ctacagctgc gaggtgctgc actacctgag cggcaccgag 1860
accgtgacct gcaccaccaa cggcacctgg agcgccccca agccccgctg catcaaggtg 1920
atcacctgcc agaacccccc cgtgcccagc tacggcagcg tggagatcaa gccccccagc 1980
cgcaccaaca gcatcagccg cgtgggcagc cccttcctgc gcctgccccg cctgcccctg 2040
cccctggccc gcgccgccaa gccccccccc aagccccgca gcagccagcc cagcaccgtg 2100
gacctggcca gcaaggtgaa gctgcccgag ggccactacc gcgtgggcag ccgcgccatc 2160
tacacctgcg agagccgcta ctacgagctg ctgggcagcc agggccgccg ctgcgacagc 2220
aacggcaact ggagcggccg ccccgccagc tgcatccccg tgtgcggccg cagcgacagc 2280
ccccgcagcc ccttcatctg gaacggcaac agcaccgaga tcggccagtg gccctggcag 2340
gccggcatca gccgctggct ggccgaccac aacatgtggt tcctgcagtg cggcggcagc 2400
ctgctgaacg agaagtggat cgtgaccgcc gcccactgcg tgacctacag cgccaccgcc 2460
gagatcatcg accccagcca gttcaagatc tacctgggca agtactaccg cgacgacagc 2520
cgcgacgacg actacgtgca ggtgcgcgag gccctggaga tccacgtgaa ccccaactac 2580
gaccccggca acctgaactt cgacatcgcc ctgatccagc tgaagacccc cgtgaccctg 2640
accacccgcg tgcagcccat ctgcctgccc accgacatca ccacccgcga gcacctgaag 2700
gagggcaccc tggccgtggt gaccggctgg ggcctgaacg agaacaacac ctacagcgag 2760
atgatccagc aggccgtgct gcccgtggtg gccgccagca cctgcgagga gggctacaag 2820
gaggccgacc tgcccctgac cgtgaccgag aacatgttct gcgccggcta caagaagggc 2880
cgctacgacg cctgcagcgg cgacagcggc ggccccctgg tgttcgccga cgacagccgc 2940
accgagcgcc gctgggtgct ggagggcatc gtgagctggg gcagccccag cggctgcggc 3000
aaggccaacc agtacggcgg cttcaccaag gtgaacgtgt tcctgagctg gatccgccag 3060
ttcatcttaa tggactacaa agacgatgac gacaaggcac ctgcaaaaca acttttgaac 3120
tttgatttgc tcaagttggc aggagacgtt gagtccaacc ccgggcccat gacctggatc 3180
tgcgttatca ccctgttcgc tctggcttct gctaccctgg gtaacaaagt ttctcgtgtt 3240
ggtgttctgt tcccgaaaac ccgtaacgac aacgaatgca ccgctcgtgg tggtctgaaa 3300
ggttcttgca aatctctgat cgactgcccg tctgttctgg ctaccctgaa agactctttc 3360
ccggttgttt gctcttggaa cggtcgtttc cagccgatcg tttgctgccc ggacgctatc 3420
gctccgccgc cggttaccac caccgctgtt accgttatct ctaccaaaga accgaaactg 3480
ccgcgtctgc acatctctgg ttgcggtaaa cgtaaagtta aaatcgacat caccaccgtt 3540
ggtcgttctg gttctccgat cctgccgccg atctctaccc cgcagaactc taccggtggt 3600
cgtggtatca tcgctggtgg tgttgaagct aaaatcggtg cttggccgtg gatggctgct 3660
gttttcgtta aaaacttcgg tatcggtcgt ttccactgcg ctggttctat catctctaac 3720
aaatacatcc tgtctgctgc tcacgctttc ctgatcggtg gtcgtaaact gaccccgacc 3780
cgtctggctg ttcgtgttgg tggtcactac atcaaacgtg gtcaggaata cccggttaaa 3840
gacgttatca tccacccgca ctacgttgaa aaagaaaact acaacgacat cgctatcatc 3900
gaactgaaag aagaactgaa cttcaccgac ctggttaacc cgatctgcct gccggacccg 3960
gaaaccgtta ccgacccgct gaaagaccgt atcgttaccg ctgctggttg gggtgacctg 4020
gacttctctg gtccgcgttc tcaggttctg cgtgaagttt ctatcccggt tgttccggtt 4080
gacaaatgcg accaggctta cgaaaaactg aacaccccgt ctctgaaaaa cggtatcacc 4140
aacaacttcc tgtgcgctgg tctggaagaa ggtggtaaag acgcttgcca gggtgactct 4200
ggtggtccgc tgatgctggt taacaacacc cgttggatcg ttgttggtgt tgtttctttc 4260
ggtcacaaat gcgctgaaga aggttacccg ggtgtttact ctcgtgttgc ttcttacctg 4320
gactggatcg ctaaagttac caactctctg gaccacgctg ttaccaactt aatggactac 4380
aaagacgatg acgacaagac taattatgca cttttgaaat tggccggaga tgttgagtcc 4440
aaccccgggc ccatgttggt gaataacgtg ttttcactac tgtgtttccc actcttgatg 4500
tctgtggtta gatgcagtac tctcagcaga cagcgtagac agtttgtttt ccctgacgag 4560
gaagaacttt gctcaaaccg atttactgaa gaaggaacat gcaaaaatgt cttggattgt 4620
agaatacttt tacaaaaaaa tgattataat ttactcaaag aatcaatatg cggctttgaa 4680
ggcataacac ccaaagtttg ttgtccgaaa tcaagccatg taatttcaag tacacaggca 4740
cctccagaaa ccactacgac tgaacgccca ccaaaacaga taccacccaa tcttcctgaa 4800
gtgtgtggaa ttcacaatac tacaactacc aggattattg gaggtcggga agcacctatt 4860
ggagcctggc cgtggatgac tgctgtctac ataaaacaag gaggaatcag aagtgttcag 4920
tgtggtggcg cacttgtcac taacaggcac gtgattacag cttcgcactg tgttgtaaac 4980
agtgcaggaa cagatgtgat gccagctgat gtattctcgg ttcgtctggg tgaacacaat 5040
ttatacagta ccgatgacga ttcgaatcca atagattttg cagttacgtc ggtgaaacat 5100
cacgaacact ttgtactcgc gacgtatttg aatgacatcg caattctaac gttaaatgac 5160
acagttacgt ttacagacag aattcgaccc atttgtctac cttatcgtaa gttgagatac 5220
gatgatctag caatgagaaa accgtttatc actggatggg gaacaacagc atttaacggc 5280
ccatctagtg cagtgttgag agaagtacag ttaccaatat gggaacacga ggcctgtaga 5340
caggcctacg agaaggattt aaatattaca aacgtgtata tgtgtgctgg ctttgcagat 5400
ggcgggaagg atgcttgcca gggtgattct ggaggtccaa tgatgttgcc tgttaaaacc 5460
ggagagtttt atctcattgg aattgtgtct ttcggaaaga aatgcgcatt gcctggattt 5520
cctggggttt acacaaaagt gacagagttt ttagattgga ttgcagaaca tatggtgtta 5580
atggactaca aagacgatga cgacaagtag ctcgagcgg 5619

Claims (10)

1.一种表达鲎C因子酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2. 一种表达鲎B因子酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
3. 一种表达鲎凝血酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
4. 一种共表达鲎C因子、B因子和凝血酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.一种真核表达载体，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述的重组基因。
6.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求5所述的真核表达载体。
7.权利要求1～4任一所述的重组基因或权利要求6所述的真核表达载体或权利要求6所述的宿主细胞在制备检测内毒素的试剂中的应用。
8. 一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法，其特征在于，先构建单独表达SEQ IDNO:1～3所示重组基因的真核表达载体，然后分别导入动物细胞中，筛选得到稳定表达上述三个基因的细胞；再将筛选到的三种细胞扩增、漂洗后混匀，得细胞混合液；最后将细胞混合液裂解、离心，收集上清液；加入等体积冰冷氯仿，离心后取上清液，即得；
或构建表达SEQ ID NO:4所示重组基因的真核表达载体，然后导入动物细胞中，筛选得到稳定表达上述重组基因的细胞，将筛选到的细胞扩增、漂洗后再裂解、离心，收集上清液；加入等体积冰冷氯仿，离心后取上清液，即得。
9. 权利要求8所述方法制备得到的特异性检测内毒素的试剂，其特征在于，含有SEQID NO:1～3所示重组基因的表达产物或含有SEQ ID NO:4所示重组基因的表达产物。
10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于，所述试剂还含有无内毒素水、终浓度为0.06～0.2%的氯化钠、终浓度为0.15～0.6M的氯化钙、终浓度为0.2～0.5M的氯化镁和终浓度为5～10%的右旋糖酐。
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