CN104845921B - 一株噬菌体抗性l‑天冬氨酸转化菌及其应用 - Google Patents

一株噬菌体抗性l‑天冬氨酸转化菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104845921B
CN104845921B CN201510324836.1A CN201510324836A CN104845921B CN 104845921 B CN104845921 B CN 104845921B CN 201510324836 A CN201510324836 A CN 201510324836A CN 104845921 B CN104845921 B CN 104845921B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cicc
aspartic acids
strain
etec
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510324836.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104845921A (zh
Inventor
程池
马玉岳
徐友强
刘勇
裴疆森
姚粟
李金霞
姜增妍
张京涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
YANTAI HENGYUAN BIOENGINEERING CO Ltd
China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Original Assignee
YANTAI HENGYUAN BIOENGINEERING CO Ltd
China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by YANTAI HENGYUAN BIOENGINEERING CO Ltd, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries filed Critical YANTAI HENGYUAN BIOENGINEERING CO Ltd
Priority to CN201510324836.1A priority Critical patent/CN104845921B/zh
Publication of CN104845921A publication Critical patent/CN104845921A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104845921B publication Critical patent/CN104845921B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一株大肠埃希氏菌CICC 11021S（Escherichia coli CICC 11021S），具有噬菌体CICC 80001抗性，且具有l‑天冬氨酸酶活力，可以转化富马酸生产l‑天冬氨酸。本发明的有益效果是大肠埃希氏菌CICC 11021S，可以有效抵抗噬菌体CICC 80001的污染，并且细胞生长速率良好，有效提高了l‑天冬氨酸生产企业的经济效益。

Description

一株噬菌体抗性L-天冬氨酸转化菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株具有噬菌体抗性的l-天冬氨酸生产菌，是一种新的菌株品种，属于生物工程技术领域。
背景技术
l-天冬氨酸是一种重要的氨基酸，是生产阿斯巴甜、聚天冬氨酸、l-丙氨酸等化合物的主要原料，全球年需求量约30万吨，市场需求巨大（Lee KM, et al. J Org Chem.1989, 54:3195–3198）。微生物转化法利用产l-天冬氨酸酶的菌种转化富马酸铵生产l-天冬氨酸，与物理或者化学生产方法相比，具有反应条件温和、转化率高、副产物少等优点，是目前广泛使用的规模化生产方法（盛晓燕, 等. 食品科技. 2010, 35:23−26.）。
微生物工业规模生产l-天冬氨酸中的噬菌体污染是一个常见现象，容易造成发酵周期的延长，发酵底物消耗和产物形成变慢，影响发酵产品的产量和质量，甚至造成发酵的中止导致发酵失败，给生产造成巨大损失，成为制约产品产能稳定和品质提升的关键因素之一（孙文敬, 等. 食品科技. 2013, 38:323–327; 周海岩, 等. 食品与发酵工业.2013, 39:88–93）。选育噬菌体抗性的生产菌种是解决这一问题的有效途径之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的菌株品种，具有噬菌体CICC 80001抗性，且可以产l-天冬氨酸酶，转化富马酸生产l-天冬氨酸。
本发明所要解决的技术问题是提供一株大肠埃希氏菌菌种CICC 11021S，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.9850。该菌种具有对噬菌体CICC 80001的抗性。噬菌体CICC 80001可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买获取。
所述抗噬菌体l-天冬氨酸生产菌种，其优选培养基组成为：
（1）种子培养基
LB培养基（g/L）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化钠10.0，pH 7.0 – 7.2，固体培养基添加2%的琼脂粉。
（2）发酵培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：玉米浆干粉 13.0，硫酸镁 0.2，磷酸二氢钾 1.0，氯化钠 1.5，富马酸 5.0，葡萄糖 5.0，pH 6.5 – 7.0。
所述具有l-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其活化方法为：
用接种环从大肠埃希氏菌菌种CICC 11021S斜面刮取少量菌种，接入装有100 mLLB培养基的500 mL三角瓶中，37oC，200 rpm条件下培养8 – 16小时，获得种子液。
所述具有l-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其发酵罐培养方法为：
将种子液以1‰ – 5%的接种量接入5 L发酵罐中，发酵培养基体积为2.0 – 4.0L，通气量0.5 – 1.5 vvm，搅拌转速为200 – 500 rpm，培养8 – 16小时。
所述具有l-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其l-天冬氨酸转化罐转化生产方法为：
配置富马酸溶液，用氨水调节pH，至转化体系富马酸终浓度为0.8 – 1.2 M，pH为7.7 – 8.0，加入发酵液。40 – 50oC，搅拌转速30 – 100 rpm，转化8 – 16小时。转化生成的l-天冬氨酸经脱色、过滤、结晶、干燥得成品。l-天冬氨酸测定方法采用氨基酸常用测定方法——高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）柱前衍生方法（Hender JW, et al., Rapid, accurate, sensitive and reproducible HPLC analysisof amino acids. Agilent Technologies. USA. 2000）。
有益效果：
本发明提供一株具有噬菌体抗性的l-天冬氨酸生产菌种，与之前的l-天冬氨酸生产菌种相比，可以有效抵抗噬菌体CICC 80001的污染，并且细胞生长速率良好，遗传稳定性好，有效提高了l-天冬氨酸生产企业的经济效益。
微生物保藏信息
微生物分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）
保藏编号：CGMCC No.9850
保藏日期：2014年10月27日；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐明本发明，但不限于此。
实施例一
噬菌体CICC 80001的分离纯化
菌种：前期筛选的l-天冬氨酸转化生产菌种大肠埃希氏菌HY-05C（专利号CN201110382584.X）。
取受噬菌体污染的大肠埃希氏菌转化液10 ml，6,000 rpm离心10分钟，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，取200 μl接入装有5 ml上层LB培养基的试管中，同时加入HY-05C菌悬液200 μl，混匀，倒入已凝固的LB平板上，铺匀，置37oC培养箱培养18 – 24 小时。用接种针穿刺培养法挑取形态和大小不一的单个噬菌斑，分别接入含有HY-05C的液体LB培养基中，37oC，200 rpm培养18 – 24小时。重复上述操作进行噬菌斑形态和大小的检验，直至得到形态和大小均一的纯化噬菌体。噬菌体CICC 80001保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 80001。目前噬菌体CICC 80001可从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买获得。
噬菌体分离纯化培养基：LB培养基（酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0g/L，pH 7.0 – 7.2，上层琼脂0.8%，下层琼脂2%）。
实施例二
在添加噬菌体CICC 80001裂解液的条件下，大肠埃希氏菌CICC 11021S与无噬菌体抗性大肠埃希氏菌HY-05C对照组转化富马酸生产l-天冬氨酸能力的对比验证。
优选培养基组成为：
（1）种子培养基
LB培养基：酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.0 – 7.2，固体培养基添加2%的琼脂粉。
（2）发酵培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：玉米浆干粉 13.0，硫酸镁 0.2，磷酸二氢钾 1.0，氯化钠 1.5，富马酸 5.0，葡萄糖 5.0，用氨水调pH至6.5 – 7.0。
菌种活化方法为：用接种环从大肠埃希氏菌菌种HY-05C或者CICC 11021S斜面刮取少量菌种，接入装有100 mL LB培养基的500 mL三角瓶中，37oC，200 rpm条件下培养8 –16小时，获得种子液。
发酵罐培养方法为：将种子液以1‰ – 5%接种量接入5 L发酵罐中，发酵培养基体积为2.0 – 4.0 L，通气量0.5 – 1.5 vvm，搅拌转速为200 – 500 rpm，培养8 – 16小时，平行实验发酵罐在接种种子液的同时加入CICC 80001噬菌体裂解液50 ml。
l-天冬氨酸转化生产方法为：将发酵罐培养的发酵液转入20 L转化罐，加入终浓度为0.8 – 1.2 M用氨水调节pH为7.7 – 8.0的富马酸水溶液。40 – 50oC，搅拌转速30 –100 rpm，转化8 – 16小时。加入CICC 80001噬菌体裂解液和不加裂解液的转化体系作为对照。结果见表1。
表 1 菌种HY-05C和CICC 11021S转化富马酸生产l-天冬氨酸能力对比
菌种 转化率（%）
HY-05C 98.5
HY-05C* 1.20
CICC 11021S 98.8
CICC 11021S* 97.5
* 发酵罐培养菌体时加入噬菌体裂解液。
表1的数据表明，l-天冬氨酸生产菌种CICC 11021S具有明显的噬菌体CICC 80001抗性，可以有效抵抗噬菌体侵染，而且与HY-05C相比，l-天冬氨酸转化生产能力非常稳定，有效保障了l-天冬氨酸转化生产过程的稳定。
实施例三：l-天冬氨酸规模化生产
菌种：大肠埃希氏菌CICC 11021S
发酵培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：玉米浆干粉 13.0，硫酸镁 0.2，磷酸二氢钾 1.0，氯化钠 1.5，富马酸 5.0，葡萄糖 5.0，用氨水调pH至6.5 – 7.0。
菌种活化方法为：用接种环从大肠埃希氏菌菌种CICC 11021S斜面刮取少量菌种，接入装有1000 mL发酵培养基的5000 mL三角瓶中，37oC，100 – 200 rpm条件下培养8 – 16小时，获得种子液。
发酵罐培养方法为：将种子液以1‰ – 5%接种量接入20 m3发酵罐中，发酵培养基体积为12 – 16 m3，搅拌转速为80 – 200 rpm，培养8 – 16小时。
l-天冬氨酸转化生产方法为：将20 m3发酵罐培养的发酵液转入60 m3转化罐，加入终浓度为0.8 – 1.2 M用氨水调节pH为7.7 – 8.0的富马酸水溶液。40 – 50oC，搅拌转速30– 200 rpm，转化8 – 16小时。
转化液经脱色、过滤、结晶、干燥，获得l-天冬氨酸成品。

Claims (2)

1.一株具有噬菌体CICC 80001抗性的L-天冬氨酸生产菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）CICC 11021s，2014年10月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.9850。
2.如权利要求1所述的大肠埃希氏菌CICC 11021s的应用，其特征在于，用于生产L-天冬氨酸。
CN201510324836.1A 2015-06-15 2015-06-15 一株噬菌体抗性l‑天冬氨酸转化菌及其应用 Active CN104845921B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510324836.1A CN104845921B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 一株噬菌体抗性l‑天冬氨酸转化菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510324836.1A CN104845921B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 一株噬菌体抗性l‑天冬氨酸转化菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104845921A CN104845921A (zh) 2015-08-19
CN104845921B true CN104845921B (zh) 2018-02-27

Family

ID=53845913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510324836.1A Active CN104845921B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 一株噬菌体抗性l‑天冬氨酸转化菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104845921B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109207463A (zh) * 2018-09-14 2019-01-15 宿州学院 一种l-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基及发酵培养l-天冬氨酸酶基因工程菌方法
CN110396533B (zh) * 2019-07-04 2023-05-26 成都英普博集生物科技有限公司 具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株、筛选方法、重组工程菌表达重组蛋白的制备方法
CN112391326B (zh) * 2019-08-13 2022-05-24 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一株抗噬菌体天冬氨酸酶变体生产菌及选育方法和其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1165860A (zh) * 1996-03-29 1997-11-26 协和发酵工业株式会社 L-天冬氨酸的制造方法
WO2004065568A2 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Invitrogen Corporation Rapid growing microorganisms for biotechnology applications
CN102010847A (zh) * 2010-03-15 2011-04-13 江南大学 一种抗噬菌体l-苯丙氨酸生产菌及选育方法和其应用
CN102559538A (zh) * 2011-11-25 2012-07-11 烟台恒源生物工程有限公司 高产l-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5578464A (en) * 1989-10-31 1996-11-26 Schering Corporation E. coli secretory strains

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1165860A (zh) * 1996-03-29 1997-11-26 协和发酵工业株式会社 L-天冬氨酸的制造方法
WO2004065568A2 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Invitrogen Corporation Rapid growing microorganisms for biotechnology applications
CN102010847A (zh) * 2010-03-15 2011-04-13 江南大学 一种抗噬菌体l-苯丙氨酸生产菌及选育方法和其应用
CN102559538A (zh) * 2011-11-25 2012-07-11 烟台恒源生物工程有限公司 高产l-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bacteriophage-Resistant Mutants in Escherichia Coli;M. Demerec等;《Genetics》;19450331;第30卷(第2期);119-136 *
大肠杆菌 glyA工程菌抗噬菌体菌株选育;梅运军 等;《安徽农业科学》;20121231;第40卷(第10期);5771-5772 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104845921A (zh) 2015-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103602623A (zh) 高产l-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产l-丙氨酸的方法
CN104845921B (zh) 一株噬菌体抗性l‑天冬氨酸转化菌及其应用
CN106119323A (zh) 一种可提高枯草菌脂肽钠产量的发酵培养方法
CN102851224B (zh) 产琥珀酸放线杆菌菌株及其筛选和发酵生产丁二酸的方法
CN102242075B (zh) 一种用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法
CN103146525B (zh) 绵柔型复合多微功能曲生产方法
CN108642041B (zh) 一种提高重组大肠杆菌发酵生产l-丙氨酸能力的方法
CN102618474A (zh) 枯草芽孢杆菌及其分离培养方法
CN112094769B (zh) 一株巴氏醋杆菌巴氏亚种、微生物菌剂及其应用
CN107311756B (zh) 含聚谷氨酸的肥料的制备方法
CN103952447B (zh) 一种利用厌氧条件下发酵生产丁二酸的方法
CN108004285B (zh) 一种用于生产葡萄糖胺的培养基及其应用
CN109266578B (zh) 大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用
CN104357497B (zh) 一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法
CN109609388A (zh) 一种黑曲霉及其应用
CN113699069B (zh) 菌株hscy 2073及其分离筛选和在提高食醋风味品质中的应用
CN109136313A (zh) 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧腺苷的方法
CN109161507A (zh) 一种高产l-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及其应用
CN103509746A (zh) 一种天然l-(+)-酒石酸的发酵生产方法
CN108728370A (zh) 一株高效产壳聚糖酶的鲑亚科肾杆菌菌株qd-01及其发酵方法和应用
CN110195081A (zh) 大豆蛋白液发酵工艺
CN105296407A (zh) 一种副鸡禽杆菌菌液的培养方法
CN105483060B (zh) 一种高产瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产瓜氨酸中的应用
Pajčin et al. Distillery fruit waste as a substrate for biocontrol agents production
CN117431189B (zh) 一株副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株qh-20029及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant