CN103509746A

CN103509746A - 一种天然l-(+)-酒石酸的发酵生产方法

Info

Publication number: CN103509746A
Application number: CN201310481586.3A
Authority: CN
Inventors: 贾士儒; 王洪翠; 谭之磊; 李艳艳; 钟成; 刘淼
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2033-10-15
Also published as: CN103509746B

Abstract

本发明公布了一株利用5-酮基-D-葡萄糖酸及其盐生产天然L-(+)-酒石酸的恶臭假单胞菌及其生产方法。所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas pudita）突变菌株TUST于2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.7648。该菌株能利用5-酮基-D-葡萄糖酸及其盐生产天然L-(+)-酒石酸，摇瓶发酵产量为1.6g/L，达到理论值的12%，发酵强度为每天3%，发酵罐发酵产量为7.1g/L，达到理论值的24%，发酵强度为每天4%，其发酵产物为天然L-(+)-酒石酸，且生产工艺简单，污染少。该菌株及生产方法能够为国内天然L-(+)-酒石酸的生产提供新工艺，有效提升其经济价值。

Description

一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法。

背景技术

L-(+)-酒石酸是一种天然有机酸，存在于多种植物中，如在葡萄和罗望子等植物的果实中有较高含量，其用途广泛且需求量逐年递增。在食品工业中L-(+)-酒石酸可以作酸味剂、膨胀剂、抗氧化剂之辅助剂以及食用色素成分之一等，其最大的用途是饮料添加剂；在药物工业上，可用作医药拆分剂；在有机合成中可以用来制备多种手性催化剂，或作为手性源来合成复杂的天然产物分子，是非常重要的手性配体和手性子；在制镜工业中，是一个重要的助剂和还原剂，可以控制银镜的形成速度，获得均一的镀层；在其他行业中还可作印染防染剂、照相显影剂等。

早期，L-(+)-酒石酸主要从葡萄酒的副产物酒石中提取得到，但由于受到原料的限制，产量无法满足需求。近几年，L-(+)-酒石酸的主要生产技术是化学合成法和半生物合成法。化学合成法由于在生产过程中产生大量的废水和废固等环境非友好性物质，为后期治理带来诸多麻烦。

半生物合成法则主要利用具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物通过酶转化生产L-(+)-酒石酸。例如在申请号为201010609478.6的《一种L（+）酒石酸的生产方法》中公开了一种L-(+)-酒石酸的生产方法，步骤为：(1)将顺式环氧琥珀酸氢钠加到冷冻母液的水溶液中制成混合溶液，调pH，加红色红球菌水解；(2)加硫酸钙钙化，过滤得L(+)酒石酸钙固体和钙化母液，将钙化母液冷冻，离心分离得到十水硫酸钠固体和冷冻母液，冷冻母液回用到步骤(1)；(3)将L-(+)-酒石酸钙固体用硫酸酸解，过滤得到L-(+)-酒石酸水溶液，依次经过阳离子、阴离子交换树脂，经浓缩、结晶、分离和烘干得到L-(+)-酒石酸。该发明在生产过程中产生的钙化母液和硫酸钙可循环利用，减少了环境污染的问题，还对钙化母液中溶解的少量产物L-(+)-酒石酸钙和未完全反应的顺式环氧琥珀酸钠进行了回收，提高了产品收率。但是该法中生产L-(+)-酒石酸所使用的前体物质顺式环氧琥珀酸仍需采用化学法合成。

随着社会经济的快速发展，人们的生活水平得到了大幅度的提高，饮食文化日益多样化，人们对食品安全重视程度提高，食品的卫生安全性日趋得以重视。人们对天然的食品添加剂的需求更为显著，所以目前世界各国都致力于天然食品添加剂的开发和研究。而目前，国内尚未发现利用生物直接发酵法合成天然L-(+)-酒石酸的工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物法发酵生产天然L-(+)-酒石酸的方法，其底物5-酮基-葡萄糖酸或其盐由氧化葡萄糖杆菌利用葡萄糖发酵生产而得，其产物为天然L-(+)-酒石酸。改变了L-(+)-酒石酸的化学合成和半生物合成的现状。

本发明所述的一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法，包括如下步骤：

种子液的制备：斜面菌种经转接培养获得种子液；

发酵培养：将种子液接入发酵培养基中发酵培养；

摇瓶发酵条件为：发酵培养基装量10～20%，接种量5～10%，摇床转速150～200r/min，温度28～32℃，发酵时间为2～5d。

发酵罐培养条件为：5L发酵罐装液量为3L，接种量为5～10%，转速为200～400r/min，温度为28～32℃，发酵时间为6-8d。

所述发酵培养基的组成为：5-酮基-葡萄糖酸钾10～100g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆10～20g/L；

检测方法：采用高效液相色谱（HPLC）法测定L-(+)-酒石酸的含量，所述HPLC检测条件为：

色谱柱shodex DE-613（6.0mm ID×150mm），流动相为10mmol/L HClO₄，流速0.2mL/min，柱温30℃，检测波长210nm，进样量20μL；

仪器型号：高效液相色谱仪，安捷伦1100，安捷伦（中国）有限公司

本发明所述的菌种具体为恶臭假单胞菌（Pseudomonas pudita）TUST，该菌株于2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC No.7648，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

该菌株特点如下：

该菌株在LB固体平板上菌落颜色为淡黄色，圆形，表面光滑，边缘整齐，湿润。菌体呈杆状,大小为0.6–0.8×2.0–2.4μm，革兰氏染色阴性,为具有运动性的好氧性细菌，过氧化氢酶阳性，可以利用柠檬酸盐，不水解明胶。最适生长温度为28-30℃。

16SrDNA测序结果核苷酸序列表所示，将测得的序列首先采用DNAMAN软件进行相似性归并，将相似性大于97%的序列归并为一个操作单元，选取每个操作单元中的代表序列利用BLAST与GenBank数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性分析，选取1400bp以上长度进行比对(Clustelx1.83)，采用邻位连接(Neighbour Joining)法进行***学分析(MEGA4.1)，***发育树如图1所示。由图可知菌株TUST与恶臭假单胞杆菌的同源性较高，可以初步认定为恶臭假单胞杆菌。

所述恶臭假单胞杆菌TUST能利用5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐生产L-(+)-酒石酸，摇瓶发酵产量为1.6g/L，达到理论值的12%，发酵强度为每天3%，发酵罐发酵产量为7.1g/L，达到理论值的24%，发酵强度为每天4%。

有益效果：

第一，通过根际土壤取样筛得一株利用5-酮基-D葡糖酸或其盐生产L-(+)-酒石酸的恶臭假单胞菌，该方法为生物发酵法，产物为天然L-(+)-酒石酸，且该菌株生产L-(+)-酒石酸工艺简单，污染少。第二，利用本发明菌种，摇瓶培养2～5d，L-(+)-酒石酸的产量为理论值的12%，发酵强度为每天3%，发酵罐培养6～8d，L-(+)-酒石酸产量为理论值的24%，发酵强度为每天4%。。第三、本发明筛选出了能够利用5-酮基-D葡糖酸或其盐生产L-(+)-酒石酸的新菌株，发酵产物为天然L-(+)-酒石酸，满足了人们对天然食品添加剂的需求，而且为国内L-(+)-酒石酸的生产提供新的工艺，从而创造更多的经济效益。

附图说明：

图1为恶臭假单胞菌CGMCC No.7648的***发育树

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：利用5-酮基葡萄糖酸盐生产L-(+)-酒石酸菌种的筛选

1根际土样的采集

取样时，取各点正常植株4-5穴，带土挖出根部，剪掉地上部分，留根及附着于根的土样装入样品袋，封好袋口，放入4℃冰箱，以备微生物分离。

2分离与培养

（1）培养基

富集培养基：蛋白胨20g/L，K₂HPO₄1.5g/L，甘油10g/L，MgSO₄1.5g/L，琼脂15g/L，pH7.2。

分离培养基：同富集培养基。

（2）分离培养

制备土壤稀释液：称取1.0g的根际土，放入99ml无菌水并装有玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床振荡5min使土壤均匀分散，成为土壤悬液（10^-2）。用1ml的无菌吸头从中吸取0.5ml土壤悬液，注入事先分装有4.5ml无菌水的试管中，吹吸、振荡均匀（10^-3）。用同样的方法，分别配制稀释度为10^-4、10^-5、10^-6土壤悬液。

涂布：分别从各浓度土壤稀释液中吸取100μl，放入KB培养基平板上，用无菌玻璃涂布器涂布均匀，每个浓度做3个平板。

培养：将KB培养基平板置于30℃恒温箱中培养48h，观察同一稀释度三个平板上的菌落平均数，确定最佳稀释度

3分离纯化

取30℃下培养48小时的KB培养基平板，在紫外光（256nm）下挑取有荧光产生的菌落，在KB培养基平板上三区划线，将平板倒置于30℃恒温箱中培养24h，然后将典型菌落在KB培养基平板上划线纯化2-3次后得到单一菌落。

实施例2L-(+)-酒石酸的发酵培养

从活化斜面上挑取一环TUST菌体接种至装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中培养，30℃、170r/min摇床培养24h，得种子液。种子培养基组成为：蛋白胨20g/L，K₂HPO₄1.5g/L，甘油10g/L，MgSO₄1.5g/L，琼脂15g/L，pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

种子液以10%接种量接入发酵培养基中，30℃、170r/min摇瓶发酵，培养5d。所述发酵培养基的组成为：5-酮基-葡萄糖酸钾60g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米面10g/L。

发酵5d后，L-(+)-酒石酸产量为0.3g/L，达到理论值的2%，发酵强度为每天0.4%。

检测条件：采用安捷伦1100高效液相色谱仪，shodex DE-613（6.0mm ID×150mm）色谱柱，以10mmol/L HClO₄为流动相，流速0.2mL/min，柱温30℃，检测波长210nm，进样量20μL的高效液相色谱（HPLC）方法进行检测。

实施例3L-(+)-酒石酸的发酵培养

发酵培养基：5-酮基-葡萄糖酸钾60g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆10g/L，其发酵及检测条件均同实施例2，发酵时间为4d，L-(+)-酒石酸产量为1.2g/L，达到理论值的10%，发酵强度为每天2.5%。

实施例4L-(+)-酒石酸的发酵培养

发酵培养基：5-酮基-葡萄糖酸钾10g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆20g/L。其发酵及检测条件均同实施例2，发酵时间为4d，L-(+)-酒石酸产量为0.2g/L，达到理论值的5%，发酵强度为每天1.25%。

实施例5L-(+)-酒石酸的发酵培养

发酵培养基：5-酮基-葡萄糖酸钾60g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆20g/L，其发酵及检测条件均同实施例2，发酵时间为4d，L-(+)-酒石酸产量为1.6g/L，达到理论值的12%，发酵强度为每天3%

实施例6L-(+)-酒石酸发酵罐培养

种子液以10%接种量接入发酵培养基中，30℃、300r/min发酵罐培养6d。所述发酵培养基的组成为：5-酮基-葡萄糖酸钾60g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆20g/L。检测条件同实施例2，发酵时间为6d，L-(+)-酒石酸产量为7.1g/L，达到理论值得24%，发酵强度为每天4%。

Claims

1.一株利用5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐生产天然L-(+)-酒石酸的恶臭假单胞菌TUST，其特征在于，所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas pudita）TUST，保藏编号为CGMCC No.7648。

2.一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法，其特征在于，以5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐为底物，通过恶臭假单胞菌（Pseudomonas pudita）TUST经生物发酵获得天然L-(+)-酒石酸。

3.如权利要求2所述的一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

种子液的制备：恶臭假单胞菌TUST斜面菌种经转接培养获得种子液；

发酵培养：将种子液接入发酵培养基中发酵培养；发酵培养在摇瓶或发酵罐中进行；所述摇瓶发酵条件为：发酵培养基装量10～20%，接种量5～10%，摇床转速150～200r/min，温度28～32℃，发酵时间为2-5d；发酵罐条件为：5L发酵罐装液量为3L，接种量为5～10%，转速为200～400r/min，温度为28～32℃，发酵时间为6-8d。

4.如权利要求2或3所述的一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法，其特征在于：所述发酵培养基组成为：5-酮基-葡萄糖酸钾10～100g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆10～20g/L。

5.如权利要求2或3所述的一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法，其特征在于：包括如下步骤：

种子液的制备：斜面菌种经转接培养获得种子液；

发酵培养：将种子液接入发酵培养基中发酵培养；发酵培养在摇瓶中进行；所述摇瓶发酵条件为：发酵培养基装量20%，接种量10%，摇床转速170r/min，温度30℃，发酵时间为4d；

发酵培养基：5-酮基-葡萄糖酸钾60g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆20g/L。

6.如权利要求2或3所述的一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法，其特征在于：包括如下步骤：

种子液的制备：斜面菌种经转接培养获得种子液；

发酵培养：将种子液接入发酵培养基中发酵培养；发酵培养在发酵罐中进行；所述发酵罐发酵条件为：5L发酵罐装液量为3L，接种量为10%，转速为300r/min，温度为30℃，发酵时间为6d；

发酵培养基：5-酮基-葡萄糖酸钾60g/L，MgSO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.6g/L，尿素2g/L，玉米浆10～20g/L。

7.如权利要求2或3所述的一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法，其特征在于：所述恶臭假单胞菌TUST利用5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐生产L-(+)-酒石酸或其盐的摇瓶发酵产量为1.6g/L，达到理论值的12%，发酵强度达到每天3%，发酵罐发酵产量为7.1g/L，达到理论值的24%，发酵强度达到每天4%。

8.如权利要求2所述的一种天然L-(+)-酒石酸的发酵生产方法在生产L-(+)-酒石酸中的应用。