CN104829740A - 一种从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法，所述的方法应用微波辅助提取、双水相萃取和膜分离技术从草叶马尾藻中同步提取获得草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚。本发明还提供了通过以上方法获得的草叶马尾藻多糖提取物和草叶马尾藻多酚提取物。其优点在于：马尾藻多糖提取率高，生物活性损失小，马尾藻多糖和马尾藻多酚的纯度都很高，同时本发明的方法具有时间短、处理量大、操作可连续化、成本低廉、环境清洁的优势，因此非常适合工业应用。
Description
技术领域
本发明涉及药品和保健品领域的马尾藻多糖和马尾藻多酚，具体地说，涉及一种从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法。
背景技术
马尾藻(Sargassum)是褐藻门鹿角菜目马尾藻科植物。草叶马尾藻(Sargassum.graminifolium.turn)属于马尾藻属的一种，生长于低潮带和潮下带的岩礁上，藻体绿色或褐色，高约50厘米，在我国分布在浙江舟山、象山、福建、广东及澳门沿海，资源十分丰富。
目前马尾藻的加工利用范围比较窄，只有小部分被用作饲料、藻胶的原料，部分食用，大部分尚未得到全面的开发利用。马尾藻同其他类的海藻一样也含有丰富的多糖、褐藻多酚、γ-亚麻酸、氨基酸和微量元素等多种生物活性物质；其中，马尾藻多糖是从马尾藻中提取出来的一种易溶于水、黏度较高的多糖复合物，更是因为其较高的药用价值而备受关注。褐藻多酚是从褐藻中提取的由间苯三酚作为单体组成的结构不同、含有多羟基酚类化合物的总称，具有优良的抗氧化功能，以往研究表明昆布属和马尾藻属中褐藻多酚含量较其他褐藻属高。
对草叶马尾藻当中的多糖和多酚进行分离研究有助于充分利用草叶马尾藻资源，发展蓝色经济，为研究开发褐藻多酚和马尾藻多糖类活性物质或其他医疗保健制品提供依据和奠定基础。
目前，海藻多糖制备工艺普遍采用热水浸提、超声波或者是微波辅助提取，提纯方法多采用乙醇沉淀或是膜分离；褐藻多酚的提取方法有醇提、微波浸提、酶解、超临界流体等方法。其中醇提得率高、产物抗菌活性好、污染小，但溶剂用量大；微波辅助提取被认为是最高效的提取方法，节能、环保。
中国期刊《食品研究与开发》，2006.Vol.27.No.7，刊出的论文“马尾藻多糖提取工艺的优化”，通过响应面分析法优化了马尾藻多糖的提取条件，对关键影响因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究，得出结论：当超声波破碎时间为469s，提取温度为90.9℃，提取时间为4.66小时，多糖的理论得率最大为2.48％。
中国期刊《安徽农业科学》2009年第37卷第17期，刊出的论文“马尾藻多酚的提取、分离纯化及抗菌活性检验”，采用试验的方法，对广西北海马尾藻中多酚的提取、分离纯化、定性、定量分析以及抗菌的活性检验进行研究，考察不同的乙醇浓度、体积数及提取时间对褐藻多酚提取量的影响，结果：40ml65％乙醇提取2h对褐藻多酚的提取有显著影响，测得马尾藻中褐藻多酚的含量为7.777mg/g，结论：乙醇的浓度、体积数和提取时间都会影响马尾藻多酚的提取。
然而，目前还未见利用微波辅助提取、双水相萃取分离和膜分离技术从同一种海藻中同步、高效的提取分离多糖和多酚这两种活性物质，且适于工业应用的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种从草叶马尾藻中同步、高效的提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法，以及所提取得到的草叶马尾藻多糖提取物、草叶马尾藻多酚提取物。
本发明提供了一种从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法，包括以下步骤：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％；所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，所述的超滤膜工作压力为0.1-0.6MPa，超滤膜的截留分子量为3000-20000Da，超滤时间20-40min，超滤温度30-40℃，对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到草叶马尾藻多糖提取物；收集上相，于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比1g:(15-25)ml加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥，得到草叶马尾藻多酚提取物。
优选地，步骤(d)中所述的双水相***是聚乙二醇/无机盐，所述的无机盐是硫酸铵。
更优选地，所述的聚乙二醇分子量为6000，质量浓度为10％-20％；所述的无机盐质量浓度为20％-25％。
优选地，步骤(d)中温度为50℃。
本发明还提供了一种草叶马尾藻多糖提取物，它是通过以下方法制备得到的：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，所述的超滤膜工作压力为0.1-0.6MPa，超滤膜的截留分子量为3000-20000Da，超滤时间20-40min，超滤温度30-40℃，对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多糖提取物。
优选地，步骤(d)中所述的双水相***是聚乙二醇/无机盐，所述的无机盐是硫酸铵。
优选地，所述的草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量为19.6％-25.6％。
本发明还提供了一种草叶马尾藻多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，所述的超滤膜工作压力为0.1-0.6MPa，超滤膜的截留分子量为3000-20000Da，超滤时间20-40min，超滤温度30-40℃，对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多糖提取物。
本发明还提供了一种草叶马尾藻多酚提取物，它是通过以下方法制备得到的：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集上相，于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比1g:(15-25)ml加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多酚提取物。
优选地，步骤(d)中所述的双水相***是聚乙二醇/无机盐，所述的无机盐是硫酸铵。
本发明还提供了一种草叶马尾藻多酚提取物的制备方法，包括以下步骤：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集上相，于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比1g:(15-25)ml加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多酚提取物。
本发明优点在于：
1、本发明应用微波辅助提取、双水相萃取和膜分离技术可以从草叶马尾藻中同步提取得到草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚，且步骤和参数设置恰当，使得草叶马尾藻多糖提取率高，生物活性损失小，草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的纯度都很高；
2、本发明的方法具有时间短、处理量大、操作可连续化、成本低廉的优势，可以快速、高效地从草叶马尾藻中分离纯化草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚；
3、本发明工艺的能源、溶剂耗量较常规工艺比较属典型的环境清洁生产工艺；
4、本发明的方法制备得到的草叶马尾藻多糖提取物纯度高，生物活性好，可很好的用于马尾藻多糖药品、保健品和食品的开发；
综上所述可知，本发明的方法非常适合工业应用。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法(一)
1、方法步骤
1.1同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚
(1)将原料草叶马尾藻去除杂质并用水洗净，将洗净的草叶马尾藻放入烘干箱内，30℃干燥20小时至恒重，然后把干燥后的草叶马尾藻在粉碎机内粉碎得到粉末，过20目筛得到草叶马尾藻干粉，冷冻保藏备用。
(2)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数80％的乙醇后回流提取3小时左右，料液比(草叶马尾藻干粉体积:乙醇体积)为1:8。回流结束后滤去乙醇，然后将草叶马尾藻粉末放置于通风橱内使乙醇完全挥发，最后将草叶马尾藻粉末在烘干箱中干燥，干燥温度为30℃，干燥至恒重，备用。
(3)取干燥脱脂的草叶马尾藻粉末用微波辅助提取：选用频率为2450MHz、功率在800瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液比(干燥脱脂的草叶马尾藻粉末体积:水体积)为1:20，每次微波处理时间为20分钟，共微波处理3次。
(4)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇(PEG)/无机盐双水相***分离纯化草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚，双水相萃取体系中聚乙二醇分子量6000，质量浓度为10％；无机盐为硫酸铵，质量浓度为20％。置于恒温振荡器中在50℃下振荡30分钟。静置后分成两相，草叶马尾藻多酚进入乙醇上相，草叶马尾藻多糖进入无机盐下相。
(5)纯化
a.因马尾藻多酚易氧化变色，因此得到的上相，于40℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比(g:ml)1:20加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于40℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥3天，得到草叶马尾藻多酚提取物。
b.得到的无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，超滤膜工作压力为0.15MPa，膜的截留分子量为10000Da，超滤时间30min，超滤温度35℃。对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到草叶马尾藻多糖提取物。
1.2粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率的测定
(1)收集上述步骤(3)的微波提取液，浓缩成浸膏，烘干即得粗多糖。粗多糖得率％＝(所得总粗多糖质量/原料质量)×100％。
(2)采用苯酚-硫酸比色法测定粗品中多糖的含量。以葡萄糖为标准品，准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml溶液至刻度试管中，再各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟后于490nm测定吸光度值，横坐标为葡萄糖浓度μg/ml，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线，得到线性回归方程。同样条件下取粗多糖2mg，定容至50ml容量瓶中，吸取1.0ml待测液至刻度试管中用蒸馏水补齐至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟后于490nm测定吸光度值。根据之前的标准曲线计算出待测液的浓度C。粗品中多糖含量％＝[(C×1000×50)/所取粗多糖质量]×100％。
(3)多糖提取率％＝多糖质量/原料质量＝(粗品中多糖含量％×所得总粗多糖质量)/原料质量。
1.3草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度的测定
(1)草叶马尾藻多糖的纯度＝(上述步骤(5)得到的草叶马尾藻多糖提取物中多糖含量/草叶马尾藻多糖提取物重量)×100％。
(2)草叶马尾藻多酚的纯度＝(上述步骤(5)得到的草叶马尾藻多酚提取物中多酚含量/草叶马尾藻多酚提取物重量)×100％。
采用Folin-Ciocalteu法测定草叶马尾藻多酚含量。分别取没食子酸标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml置于10ml棕色容量瓶中，加超纯水稀释至lml。加入2ml Folin-Ciocalteu工作液并摇匀，2min后加入12mol/L的Na2CO3溶液6ml，混合充分后暗处静置60min，于765nm处测定吸光度。按照上述测定方法检测提取物中多酚含量，计算草叶马尾藻提取物中多酚含量(以毫克没食子酸当量(GAE)每克干粉重表示)。
1.4草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量的测定
采用硫酸钡比浊法测定硫酸基含量。
(1)实验原理
多糖通过盐酸水解，释放硫酸基。硫酸基与氯化钡生成硫酸钡。在360nm处测定其吸光度，硫酸基含量与其吸光度呈线性关系。一般用硫酸钾作为标准物，计算出硫酸基的含量。
(2)实验试剂的配置
①硫酸钾标准溶液的配制：准确称取经105℃干燥至恒重的硫酸钾200mg，以lmoL/L的盐酸溶液定容至200mL，即得硫酸基标准储备液。
②1moL/L HCl的配置：36％-38％浓盐酸83.333mL定容至1L容量瓶。
③0.5％明胶：1.25g明胶在60-70℃溶解于200mL水中，冷却后定容至250mL容量瓶。
④l％氯化钡-明胶：1g氯化钡溶于100mL明胶溶液中。
⑤三氯乙酸：3g三氯乙酸溶于100mL蒸馏水中。
(3)标准曲线的制作
精确吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mL标准硫酸基溶液于试管以盐酸溶液补至0.2mL，以0.2mL HCl溶液作为空白，加入三氯乙酸溶液3.8mL及氯化钡-明胶溶液1.0mL，摇匀，室温静置15min，于360nm测吸收度A1，另用同样标准溶液系列以明胶试液代替氯化钡-明胶溶液，以0.2mL HCI溶液作为空白对照得A2。以硫酸基毫克数为横坐标，纵坐标为吸收度(A1-A2)作出标准曲线。
(4)草叶马尾藻多糖提取物的处理及测定
精密称取上述步骤(5)得到的草叶马尾藻多糖提取物5mg放入盛有3mL1mol/L HCL的试管中，密封，于100℃水解6小时。取水解液0.1mL放入检测试管中，用1mol/L HCl溶液补加总体积至0.2mL，重复制作标准曲线时的操作，测定其在360nm处的吸光值。重复三次，取其平均值。
2、结果
2.1粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率
粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率测定结果分别为15.30％、41.08％、6.285％。
2.2草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度
草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度的测定结果分别为91.53％、72.37％。
2.3草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量
草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量为25.6％。
实施例2本发明的从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法(二)
1、方法步骤
(1)将原料草叶马尾藻去除杂质并用水洗净，将洗净的草叶马尾藻放入烘干箱内，20℃干燥24小时至恒重，然后把干燥后的草叶马尾藻在粉碎机内粉碎得到粉末，过40目筛得到草叶马尾藻干粉，冷冻保藏备用。
(2)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数90％的乙醇后回流提取2小时左右，料液比(草叶马尾藻干粉体积:乙醇体积)为1:10。回流结束后滤去乙醇，然后将草叶马尾藻粉末放置于通风橱内使乙醇完全挥发，最后将草叶马尾藻粉末在烘干箱中干燥，干燥温度为20℃，干燥至恒重，备用。
(3)取干燥脱脂的草叶马尾藻粉末用微波辅助提取：选用频率为2450MHz、功率在500瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液比(干燥脱脂的草叶马尾藻粉末体积:水体积)为1:10，每次微波处理时间为30分钟，共微波处理1次。
(4)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇(PEG)/无机盐双水相***分离纯化草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚，双水相萃取体系中聚乙二醇分子量6000，质量浓度为20％；无机盐为硫酸钠，质量浓度为25％。置于恒温振荡器中在40℃下振荡35分钟。静置后分成两相，草叶马尾藻多酚进入乙醇上相，草叶马尾藻多糖进入无机盐下相。
(5)纯化
a.因马尾藻多酚易氧化变色，因此得到的上相，于35℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比(g:ml)1:15加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于35℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥4天，得到草叶马尾藻多酚提取物。
b.得到的无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，超滤膜工作压力为0.6MPa，膜的截留分子量为20000Da，超滤时间20min，超滤温度40℃。对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到草叶马尾藻多糖提取物。
按照实施例1的方法测定粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率、草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度，以及草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量。
2、结果
2.1粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率
粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率测定结果分别为13.36％、38.24％、5.109％。
2.2草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度
草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度的测定结果分别为89.63％、69.18％。
2.3草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量
草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量为24.8％。
实施例3本发明的从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法(三)
1、方法步骤
(1)将原料草叶马尾藻去除杂质并用水洗净，将洗净的草叶马尾藻放入烘干箱内，40℃干燥12小时至恒重，然后把干燥后的草叶马尾藻在粉碎机内粉碎得到粉末，过10目筛得到草叶马尾藻干粉，冷冻保藏备用。
(2)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％的乙醇后回流提取4小时左右，料液比(草叶马尾藻干粉体积:乙醇体积)为1:5。回流结束后滤去乙醇，然后将草叶马尾藻粉末放置于通风橱内使乙醇完全挥发，最后将草叶马尾藻粉末在烘干箱中干燥，干燥温度为40℃，干燥至恒重，备用。
(3)取干燥脱脂的草叶马尾藻粉末用微波辅助提取：选用频率为2450MHz、功率在1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液比(干燥脱脂的草叶马尾藻粉末体积:水体积)为1:30，每次微波处理时间为15分钟，共微波处理4次。
(4)合并所有提取液，过滤，滤液利用乙醇/无机盐双水相***分离纯化草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚，双水相萃取体系中乙醇质量浓度为20％；无机盐为磷酸氢二钾，质量浓度为10％。置于恒温振荡器中在45℃下振荡25分钟。静置后分成两相，草叶马尾藻多酚进入乙醇上相，草叶马尾藻多糖进入无机盐下相。
(5)纯化
a.因马尾藻多酚易氧化变色，因此得到的上相，于45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比(g:ml)1:25加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥2天，得到草叶马尾藻多酚提取物。
b.得到的无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，超滤膜工作压力为0.1MPa，膜的截留分子量为3000Da，超滤时间40min，超滤温度20℃。对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到草叶马尾藻多糖提取物。
按照实施例1的方法测定粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率、草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度，以及草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量。
2、结果
2.1粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率
粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率测定结果分别为12.42％、35.07％、4.356％。
2.2草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度
草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度的测定结果分别为79.65％、60.17％。
2.3草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量
草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量为20.3％。
实施例4本发明的从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法(四)
1、方法步骤
(1)将原料草叶马尾藻去除杂质并用水洗净，将洗净的草叶马尾藻放入烘干箱内，30℃干燥12小时至恒重，然后把干燥后的草叶马尾藻在粉碎机内粉碎得到粉末，过20目筛得到草叶马尾藻干粉，冷冻保藏备用。
(2)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数80％的乙醇后回流提取3小时左右，料液比(草叶马尾藻干粉体积:乙醇体积)为1:8。回流结束后滤去乙醇，然后将草叶马尾藻粉末放置于通风橱内使乙醇完全挥发，最后将草叶马尾藻粉末在烘干箱中干燥，干燥温度为30℃，干燥至恒重，备用。
(3)取干燥脱脂的草叶马尾藻粉末用微波辅助提取：选用频率为2450MHz、功率在800瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液比(干燥脱脂的草叶马尾藻粉末体积:水体积)为1:20，每次微波处理时间为15分钟，共微波处理4次。
(4)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇(PEG)/无机盐双水相***分离纯化草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚，双水相萃取体系中聚乙二醇分子量为6000，质量浓度为10％；无机盐为氯化钠，质量浓度为20％。置于恒温振荡器中在40℃下振荡30分钟。静置后分成两相，草叶马尾藻多酚进入乙醇上相，草叶马尾藻多糖进入无机盐下相。
(5)纯化
a.因马尾藻多酚易氧化变色，因此得到的上相，于50℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比(g:ml)1:20加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于50℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥3天，得到草叶马尾藻多酚提取物。
b.得到的无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，超滤膜工作压力为0.15MPa，膜的截留分子量为10000Da，超滤时间20min，超滤温度30℃。对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到草叶马尾藻多糖提取物。
按照实施例1的方法测定粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率、草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度，以及草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量。
2、结果
2.1粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率
粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率测定结果分别为12.28％、35.14％、4.315％。
2.2草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度
草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度的测定结果分别为75.85％、56.33％。
2.3草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量
草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量为19.6％。
实施例5本发明的从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法(五)
1、方法步骤
(1)将原料草叶马尾藻去除杂质并用水洗净，将洗净的草叶马尾藻放入烘干箱内，40℃干燥20小时至恒重，然后把干燥后的草叶马尾藻在粉碎机内粉碎得到粉末，过40目筛得到草叶马尾藻干粉，冷冻保藏备用。
(2)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数80％的乙醇后回流提取2小时左右，料液比(草叶马尾藻干粉体积:乙醇体积)为1:10。回流结束后滤去乙醇，然后将草叶马尾藻粉末放置于通风橱内使乙醇完全挥发，最后将草叶马尾藻粉末在烘干箱中干燥，干燥温度为40℃，干燥至恒重，备用。
(3)取干燥脱脂的草叶马尾藻粉末用微波辅助提取：选用频率为2450MHz、功率在500瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液比(干燥脱脂的草叶马尾藻粉末体积:水体积)为1:20，每次微波处理时间为30分钟，共微波处理2次。
(4)合并所有提取液，过滤，滤液利用乙醇/无机盐双水相***分离纯化草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚，双水相萃取体系中乙醇质量浓度为40％；无机盐为硫酸钠，质量浓度为20％。置于恒温振荡器中在40℃下振荡30分钟。静置后分成两相，草叶马尾藻多酚进入乙醇上相，草叶马尾藻多糖进入无机盐下相。
(5)纯化
a.因马尾藻多酚易氧化变色，因此得到的上相，于50℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比(g:ml)1:20加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于50℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥3天，得到草叶马尾藻多酚提取物。
b.得到的无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，超滤膜工作压力为0.15MPa，膜的截留分子量为10000Da，超滤时间20min，超滤温度30℃。对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到草叶马尾藻多糖提取物。
按照实施例1的方法测定粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率、草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度，以及草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量。
2、结果
2.1粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率
粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率测定结果分别为13.59％、38.83％、5.277％。
2.2草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度
草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度的测定结果分别为75.19％、57.43％。
2.3草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量
草叶马尾藻多糖提取物中硫酸根含量为20.7％。
对比例1热水浸提法从草叶马尾藻中提取草叶马尾藻粗多糖
1、方法步骤
称取一定量的预处理后的草叶马尾藻干粉置于烧瓶中，加入蒸馏水10-15倍量，将烧瓶置于电热套中进行加热提取，每次提取2-4小时，过滤收集滤液，将滤渣重复提取2次，将3次水提液合并。取液4000r/min离心收集上清液，上清液浓缩成浸膏，在烘箱里85℃后干燥24-48小时，就可得到草叶马尾藻粗多糖。
按照实施例1的方法测定粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率。
2、结果
粗多糖得率、粗品中多糖含量、多糖提取率测定结果分别为11.95％、33.07％、3.951％。
对比例2水提醇沉法从草叶马尾藻中提取提纯草叶马尾藻多糖、草叶马尾藻多酚
1、方法步骤
(1)称取一定量的预处理后的草叶马尾藻干粉置于烧瓶中，加入蒸馏水10-15倍量，将烧瓶置于电热套中进行加热提取，每次提取2小时，过滤收集滤液，将滤渣重复提取2次，将3次水提液合并。
(2)将步骤(1)中的滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1/6，加入95％乙醇，使乙醇的总浓度达到80％，静置过夜，8000r/min离心10min，所得的沉淀即为草叶马尾藻粗多糖。分别用无水乙醇、丙酮洗涤，冷冻干燥，即得到马尾藻多糖。
(3)将步骤(2)中的乙醇上层液体用旋转蒸发仪减压浓缩直到完全除去乙醇，烧瓶中的浸膏即为含草叶马尾藻多酚的提取物。
按照实施例1的方法测定草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的纯度。
2、结果
草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚纯度的测定结果分别为34.82％、15.26％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从草叶马尾藻中同步提取草叶马尾藻多糖和草叶马尾藻多酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％；所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，所述的超滤膜工作压力为0.1-0.6MPa，超滤膜的截留分子量为3000-20000Da，超滤时间20-40min，超滤温度30-40℃，对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到草叶马尾藻多糖提取物；收集上相，于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比1g:(15-25)ml加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥，得到草叶马尾藻多酚提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中所述的双水相***是聚乙二醇/无机盐，所述的无机盐是硫酸铵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的聚乙二醇分子量为6000，质量浓度为10％-20％；所述的无机盐质量浓度为20％-25％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中温度为50℃。
5.一种草叶马尾藻多糖提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，所述的超滤膜工作压力为0.1-0.6MPa，超滤膜的截留分子量为3000-20000Da，超滤时间20-40min，超滤温度30-40℃，对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多糖提取物。
6.根据权利要求5所述的草叶马尾藻多糖提取物，其特征在于，步骤(d)中所述的双水相***是聚乙二醇/无机盐，所述的无机盐是硫酸铵。
7.一种草叶马尾藻多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集无机盐下相，采用超滤膜过滤浓缩，所述的超滤膜工作压力为0.1-0.6MPa，超滤膜的截留分子量为3000-20000Da，超滤时间20-40min，超滤温度30-40℃，对超滤膜过滤浓缩后的截留液进行冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多糖提取物。
8.一种草叶马尾藻多酚提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集上相，于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比1g:(15-25)ml加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多酚提取物。
9.根据权利要求8所述的草叶马尾藻多酚提取物，其特征在于，步骤(d)中所述的双水相***是聚乙二醇/无机盐，所述的无机盐是硫酸铵。
10.一种草叶马尾藻多酚提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将原料草叶马尾藻干燥后粉碎，过10-40目筛得到草叶马尾藻干粉；
(b)向草叶马尾藻干粉中加入体积分数70％-90％的乙醇后回流提取2-4小时，料液体积比为1:5-10，回流结束后除去乙醇，烘干，得到干燥脱脂的草叶马尾藻粉末；
(c)选用功率在500-1000瓦的微波对干燥脱脂的草叶马尾藻粉末以水为溶剂进行提取，料液体积比为1:10-30，每次微波处理时间为15-30分钟，共微波处理1-4次；
(d)合并所有提取液，过滤，滤液利用聚乙二醇/无机盐或乙醇/无机盐双水相***分离纯化，置于恒温振荡器中在40-50℃下振荡25-35分钟，静置；所述的聚乙二醇或乙醇的质量浓度为10％-40％，所述的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钾或氯化钠，质量浓度为10％-25％；
(e)收集上相，于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，然后按固液比1g:(15-25)ml加入无水乙醇，待残余的无机盐完全析出后滤去其中固体，再于35-45℃用真空旋转蒸发器蒸去乙醇，冷冻干燥，得到所述的草叶马尾藻多酚提取物。
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