CN104774909A - 一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法及应用，本发明采用人肝癌HepG2细胞进行实验，测定原花青素对HepG2细胞增殖的影响，诱导HepG2细胞自噬死亡的剂量效应和时间效应，细胞内ROS(reactive oxygen species，高活性氧自由基)含量，细胞周期分布，线粒体膜电位测定。结果证实，原花青素能通过刺激ROS途径诱导人肝癌HepG2细胞自噬性死亡，并将这一成果应用到预防和治疗肝癌之中。

Description

一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种原花青素基于活性氧途径诱导人肝癌细胞自噬性死亡的分析方法和新用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的三大疾病之一，肝癌是最常见的成人恶性肿瘤，其死亡率位居全球癌症死亡率的第三位，且仍呈上升趋势，每年有超过60万新增病例，依然是威胁国人生命的最大疾病之一。预防或干预是临床常用的抑制肝癌恶化或逆转的有效手段。但作为恶性肿瘤治疗主要手段的化疗药物目前仍存在着诸多缺陷，如毒副作用大和肿瘤细胞易产生耐药性等。近年来寻求疗效好、毒副作用小，通过多途径多靶点发挥抗肝癌作用的候选药物成为全世界的重要研究方向。从天然植物中寻找有效、低毒的具有抗肿瘤作用的活性成分一直是世界抗肿瘤药物研究的热点。

原花青素(Procyanidins，简称PC)是由儿茶素或表儿茶素聚合而成的一大类酚类聚合物。该类物质具有多种生物活性，以其高效、低毒和高生物利用率而著称，广泛存在于葡萄、山楂、花生、莲房等蔬菜、水果和坚果中，是近年来研究开发较为广泛的功能因子，原花青素作为公认的自由基清除剂具有强的抗氧化活性，其抗氧化和清除自由基能力是VE50倍，Vc20倍，并能预防80多种因自由基引发的疾病，如心血管***疾病、降血脂、抗辐射、抗衰老等，此外还有抗炎、抗肿瘤活性等等。

我国板栗栽培历史悠久，品种资源丰富。其果实栗子是我国传统的农副产品，年产量超过100万吨，占世界板栗总产量的3/4。但板栗果肉生产和加工过程中近8.9-13.5％的板栗壳仍主要以燃烧和自然腐烂方式被废弃，仅有少数利用板栗壳制备活性炭、培养基、吸附水中重金属离子和杀虫剂的文献报道。而关于板栗壳化学成分研究报道甚少，更未涉及板栗中原花青素(procyanidins from chestnut shell，CSPCs)及其抗肿瘤活性的研究。

自噬(Autophagic)是真核细胞由基因控制的通过降解其自身的细胞质和细胞器实行“自我消化”的一系列程序性死亡过程。自噬作为普遍而重要的生命现象广泛参与多种生理和病理过程。因自噬具有促进细胞存活又可诱导细胞 主动性死亡的双重机制，已引起国内外肿瘤研究者极大的兴趣。自2007年Levine在《Nature》上发表自噬与癌一文中阐述肿瘤治疗与自噬相关性以来，自噬已成为与凋亡并重的抗肿瘤研究热点。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法及原花青素在治疗和预防肝癌方面的应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡的建模分析方法。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法，其包括，

原花青素对肝癌HepG2生长增殖的抑制作用的分析：

取对数生长期的HepG2细胞经胰蛋白酶消化，接种培养24h后，经原花青素处理6～120h，除去培养基并洗涤后，加入MTT孵育，结束后加入DMSO溶解，于酶标仪490nm处测定吸光度，计算生长抑制率；

CSPCs诱导HepG2细胞自噬的剂量效应和时间效应的分析：

标记自噬细胞，将HepG2细胞接种培养孵育24h后，用原花青素处理细胞不同时间或用雷帕霉素处理12h，实验结束后孵育1h后，于倒置荧光显微镜下观察并荧光定量；

透射电镜观察自噬小体的分析：

收集各处理组的HepG2细胞，离心，弃上清，分别固定，然后脱水，超薄切片，乙酸双氧铀和柠檬铅负染，于透射电镜观察并定量；

细胞的周期分析：

取对数生长期HepG2细胞接种孵育24h后，用原花青素处理细胞12h，或经预处理后用原花青素孵育，实验结束后，加入碘化丙锭染色液避光染色，过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化；

细胞内ROS(reactive oxygen species，高活性氧自由基)分析：

细胞内ROS含量采用氧化敏感探针，DCFH-DA进入细胞被ROS氧化成有荧光2'7'-dichlorofluorescein，通过测定DCF荧光强度即能反映ROS产生的量，将细胞分别用原花青素和阳性对照雷帕霉素孵育，随后用原花青素孵育，细胞经DCFH-DA处理后，立即于荧光显微镜观察并定量；

线粒体膜电位测定的分析：

线粒体膜电位测定采用亲脂性荧光探针JC-1，在正常细胞内JC-1以聚合体的形式分布在线粒体内，在590nm处会激发出红色荧光，表明高的膜电位，当线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式与膜结合，在530nm处激发出绿色荧光，因此通过JC-1的红光/绿光强度比可以判断线粒体膜电位的变化，将HepG2细胞经原花青素处理12h，收获细胞，洗涤，用含有JC-1的完全培养基于37℃孵育30min，直接于荧光显微镜下观察并分析；

数据处理分析：

数据以X±SD表示，采用SPSS统计学软件，进行t检验数据处理和方差分析，其中，X代表平均值，SD代表标准偏差，t代表检验某个变量的总体均值和某指定值之间是否存在显著性差异。

本发明的另一个目的是提供一种原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡在治疗和预防肝癌方面的应用。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡在治疗和预防肝癌方面的应用，原花青素低聚体结构式为：

其中，n＝2～4。

作为本发明所述的原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡在治疗和预防肝癌方面的应用的一种优选方案，其中：所述原花青素通过刺激 肝癌HepG2细胞内产生ROS诱导肝癌细胞发生自噬性死亡。

作为本发明所述的原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡在治疗和预防肝癌方面的应用的一种优选方案，其中：所述原花青素通过刺激肝癌HepG2细胞内产生ROS诱导肝癌细胞发生自噬性死亡的过程中，肝癌细胞内的线粒体也参与了此过程。

本发明的有益效果：本发明采用人肝癌HepG2细胞进行实验，测定原花青素对HepG2细胞增殖的影响，诱导HepG2细胞自噬死亡的剂量效应和时间效应，细胞内ROS(reactive oxygen species，高活性氧自由基)含量，细胞周期分布，线粒体膜电位测定。结果证实，原花青素能通过刺激ROS途径诱导人肝癌HepG2细胞自噬性死亡，并将这一成果应用到预防和治疗肝癌之中。

附图说明

图1是CSPCs对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用示意图；

图2是CSPCs诱导HepG2细胞自噬的剂量效应和时间效应示意图，其中，A是CSPCs处理细胞经MDC染色后的荧光强度变化示意图，B和C是300μg/mL CSPCs处理不同时间MDC染色的荧光强度示意图，D和E是300μg/mLCSPCs处理不同时间细胞内LC3水平示意图，F和G是CSPCs处理细胞12h后MDC荧光强度示意图，H是不同剂量CSPCs处理细胞12h LC3水平示意图，I是不同剂量CSPCs处理细胞12h LC3水平柱状示意图；

图3是透射电子显微镜观察HepG2细胞形态(6600×)示意图，其中，A是对照组示意图，B是3-MA处理组示意图，C是预先经3-MA处理1h后用300μg/mL CSPCs处理组示意图，D是阳性对照组，即1nmol/L雷帕霉素处理12h示意图，E是300μg/mL CSPCs处理细胞12h示意图，图中，箭头指示自噬小体，F是自噬小体定量分析示意图，图中，与E组相比^*P＜0.005；

图4是CSPCs诱导HepG2细胞的自噬作用(400×)示意图，其中，A是对照组示意图，B是阳性对照组，即1nmol/L雷帕霉素处理12h示意图，C是300μg/mL CSPCs处理12h示意图，D是MDC的荧光强度评价自噬比率示意图，E和F是LC3-Ⅱ蛋白表达和LC3-Ⅱ/β-actin比率示意图；

图5是3-MA预处理减少CSPCs诱导HepG2细胞的自噬(400×)示意图，其中，A是对照组示意图，B是300μg/mL CSPCs组示意图，C是预先经3-MA处理1h后用300μg/mL CSPCs处理组示意图，D是3-MA组示意图，E是 MDC染色后荧光定量示意图，F是LC3-Ⅱ蛋白表达示意图，G是Average LC3-Ⅱ/actin比率示意图，其中，^*P＜0.005与A组相比；^*P＜0.005与C组相比；

图6是CSPCs诱导HepG2细胞S期阻滞示意图，其中，A是对照组示意图，B是300μg/mL CSPCs组示意图C是预先经3-MA处理1h后用300μg/mL CSPCs处理组示意图，D是3-MA组示意图；

图7是CSPCs刺激HepG2细胞产生ROS示意图，其中，A是CSPCs处理细胞不同时间ROS荧光强度的示意图，B是经CSPCs处理12h剂量依赖产生ROS示意图，C是经不同剂量CSPCs处理细胞12h后ROS荧光强度示意图，其中*P<0.05与对照组相比。

图8是经5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(Nac)预处理2h后，再经300μg/mL CSPCs处理12h对CSPCs诱导的细胞自噬性死亡的影响的示意图，其中，A是MTT分析细胞生存抑制率示意图，B是LC3-II蛋白表达示意图，C是LC3-II/β-actin表达比率示意图，其中*P<0.05与对照相比；^#P<0.05与Nac+CSPCs组相比；

图9是300μg/mL CSPCs处理HepG2细胞12h后JC-1染色示意图，其中，A是JC-1染色荧光图，B是JC-1染色后红/绿荧光强度比图，其中*P<0.05与对照组相比具有显著性差异；**P<0.01与对照组相比具有极显著性差异。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

下面用板栗壳原花青素进行诱导人肝癌HepG2细胞自噬性死亡的活性及ROS途径探讨，说明其在制药和保健品领域的新用途。

经实验测定，应用到预防和治疗肝癌领域的原花青素低聚体结构式为：

其中，n＝2～4。

实施例1 原花青素基于活性氧途径诱导人肝癌HepG2细胞自噬性死亡

1实验材料

1.1试验样品

将板栗壳粉碎，加入0.05‰～0.1‰的亚硫酸氢钠，于沸水中密封浸提0.3-1h，浸提液用200目网筛过滤，滤液流过预先处理好的大孔吸附树脂AB-8柱，用去离子水吸取不吸附的杂质后，用70％的乙醇洗脱树脂柱，得到乙醇洗脱液，45℃以下减压回收乙醇，采用冷冻干燥或喷雾干燥得到浅棕色板栗壳原花青素(procyanidins from chestnut shell，CSPCs)。实验过程中用完全培养基配成需要浓度，现用现配。

1.2人肝癌HepG2细胞

购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。细胞用DMEM培养基(10％新生小牛血清和100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素)。待到细胞长到80％融合，胰蛋白酶消化细胞(0.5％胰蛋白酶/2.6mM EDTA)，用PBS洗脱。

2实验方法

2.1原花青素对肝癌HepG2生长增殖的抑制作用

取对数生长期的HepG2细胞经胰蛋白酶消化后，接种于96孔板中(2.0×103个细胞/孔)，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养24h后，经不同浓度的CSPCs(0-400μg/mL)处理6-120h。培养结束后吸除培养基，用PBS洗2次后，加入100μL的MTT(1mg/mL)，于37℃孵育4h，结束后加入150μL DMSO溶解10min，于酶标仪490nm处测定吸光度(Multiskan MK3，USA)。按以下公式计算生长抑制率：抑制率(％)＝(A_对照组－A_CSPCs)/A_对照组×100。

2.2CSPCs诱导HepG2细胞自噬的剂量效应和时间效应

采用monodansylcadaverine(MDC)标记自噬细胞。将HepG2细胞接种于6孔培养板中(1×105个细胞/每孔)，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下孵育24h后，用不同浓度的CSPCs处理细胞不同时间或1nmol/L雷帕霉素(阳性药物Rapamycin)处理12h，或经1mM 3-MA预处理1h后用CSPCs孵育12h。 实验结束后，用0.05mM MDC 37℃孵育1h后，于倒置荧光显微镜(Leica DMI 4000B，Germany)下观察并荧光定量。其荧光强度(％)＝(处理组荧光强度－对照组荧光强度)/对照组荧光强度×100。

2.3透射电镜观察自噬小体

收集各处理组的HepG2细胞，离心，弃上清，分别用含有3％戊二醛的PBS和含有1％四氧化锇的PBS固定。然后用梯度乙醇脱水，超薄切片，乙酸双氧铀和柠檬铅负染，于透射电镜(TEM)(Philips，Holland)观察并定量。自噬小体＝处理组自噬小体平均值/对照组平均值。

2.4细胞周期分析 

取对数生长期HepG2细胞接种于6孔培养板中(1×105个细胞/每孔)，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下孵育24h后，用300μg/mL CSPCs处理细胞12h，或经1mM 3-MA预处理1h后用CSPCs孵育12h。实验结束后，加入碘化丙锭染色液(含RNA酶)避光染色30min，300目尼龙网过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化。

2.5细胞内ROS分析

细胞内ROS含量采用氧化敏感探针(2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐，DCFH-DA)，DCFH-DA进入细胞被ROS氧化成有荧光2'7'-dichlorofluorescein(DCF)，通过测定DCF荧光强度即能反映ROS产生的量。将细胞分别用300μg/mL CSPCs和1nmol/L阳性对照雷帕霉素孵育12h或预先用1mM 3-MA处理1h，随后用CSPCs孵育12h。随后细胞经5μM DCFH-DA处理30min后，立即于荧光显微镜观察并定量。

2.6线粒体膜电位测定

线粒体膜电位测定采用亲脂性荧光探针JC-1。在正常细胞内JC-1以聚合体的形式分布在线粒体内，在590nm处会激发出红色荧光，表明高的膜电位。当线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式与膜结合，在530nm处激发出绿色荧光，因此通过JC-1的红光/绿光强度比可以判断线粒体膜电位的变化。将HepG2细胞经CSPCs处理12h，收获细胞，洗涤两次，用含有10μg/mL JC-1的完全培养基于37℃孵育30min，直接于荧光显微镜下观察并分析。

2.7数据处理

数据以X±SD表示，采用SPSS统计学软件，进行t检验数据处理和方差 分析其中，X代表平均值，SD代表标准偏差，t代表检验某个变量的总体均值和某指定值之间是否存在显著性差异。

3实验结果

3.1CSPCs对肝癌HepG2细胞增殖的影响

MTT方法评价CSPCs对HepG2细胞增殖的结果如图1所示。CSPCs对HepG2细胞增殖的抑制作用存在剂量和时间依赖关系。25-400μg/mL浓度范围内的CSPCs处理细胞90h到120h，对HepG2细胞的抑制率分别从(6.3±1.16)％到(91.3±1.41)％和(7.5±1.78)％到(91.9±1.64)％，CSPCs作用HepG2细胞6-120h的IC50在(157.5±0.57)μg/mL和(84.55±0.4)μg/mL之间。

3.2CSPCs诱导HepG2细胞自噬作用 

MDC是观察自噬小泡的有效荧光染料，可以通过MDC荧光强度观察细胞自噬水平。CSPCs诱导自噬的时间效应和剂量效应如图2A所示，在试验浓度范围内CSPCs以剂量依赖形式增加MDC荧光强度。300μg/mL CSPCs组在处理细胞12h时，其MDC荧光强度可达到最大值(71.69±9.61)％，36h时下降到(39.68±8.74)％。

为了更好的研究剂量和时间的作用，分别用50、100、150和300μg/mL CSPCs作用6、12、24和36h观察MDC荧光强度和LC3-II表达量，其结果如图2B、C、F和G所示，300μg/mL CSPCs预处理12h组HepG2细胞展现出强的荧光，而且可观察到MDC点状分布。

Western blotting结果如图2D、E、H和I所示，LC3-II/β-actin比例随着CSPCs处理时间的延长和浓度的增加而增强，而且CSPCs处理后可增加LC3-I向LC3-II转换。LC3-II是自噬的标记蛋白，LC3有两种类型，一种是未加工的18kDa的胞质蛋白(LC3-I)和加工蛋白的16kDa蛋白(LC3-II)，LC3-II是结合在细胞膜，而且在自噬期间可由LC3-I转换而成。结果表明，CSPCs可诱导肝癌HepG2细胞自噬。

3.33-MA部分抑制CSPCs诱导的自噬 

本实验选用300μg/mL CSPCs作用HepG2细胞12h为最佳的作用浓度和时间进行后续研究。透射电镜观察自噬泡典型的双层膜和内容物(图3A)。300μg/mL CSPCs处理细胞12h，观察细胞内有空泡，空泡内并含有细胞器和待消 化的物质，表明CSPCs可诱导HepG2细胞自噬体产生(如图3E)。阳性对照雷帕霉素组HepG2细胞也产生自噬泡(图3D)。可是在3-MA加入细胞前经CSPCs处理，发现细胞自噬泡变少(Fig.3C and F)，表明3-MA确实能抑制自噬发生，削弱CSPCs诱导的自噬发生。

MDC荧光强度增加细胞自噬增加，如图4。与对照组相比(图4A)CSPCs处理组(图4C)细胞MDC荧光强度增加。与对照相比，300μg/mL CSPCs处理细胞12h表现出高的MDC荧光密度(61.82±3.06％)(图4D)，而且LC3-II蛋白表达增加(图4E and F)，与阳性对照1nmol/L雷帕霉素表现出相似的结果。与CSPCs组荧光密度(61.82±3.06％)(图5B和E)相比，3-MA预处理组荧光密度是(40.64±1.36％)(图5C和E)和LC3-II蛋白(图5F和G)表达均减少。可是与对照组荧光密度(27.64±3.24％)(图5A和E)和3-MA荧光密度(25.92±2.99％)(Fig.5D and E)，300μg/mL CSPCs组荧光密度更高。微管结合蛋白LC3在诱导自噬后与自噬小体膜结合，所以自噬小体形成与LC3-II的表达成正相关。上述数据说明3-MA抑制CSPCs-诱导HepG2细胞自噬。

3.4CSPCs诱导S期阻滞

为了研究CSPCs对DNA合成的影响，CSPCs对HepG2细胞的细胞周期分布进行了研究。如图6所示，CSPCs作用细胞12小时后，S期细胞的比例增加，同时G0/G1期相应的减少(图6A和B)。与CSPCs作用组相比，3-MA预处理后加入CSPCs组在S期停滞细胞比例明显下降。表1表明，CSPCs作用12小时后G0/G1期细胞(28.84％)显著减少，而63.16％的细胞仍在S期(图6B)。同时，用300μg/mL CSPCs处理细胞后，S期细胞从25.41％上升到63.16％(图6A和B)。用3-MA预处理后加入CSPCs组S期细胞为53.71％(图6C)。表明CSPCs诱导细胞自噬过程中影响了DNA的合成。

表1 CSPCs对HepG2细胞各细胞周期百分率的改变

^*P<0.05与对照组相比 

3.5CSPCs诱导的自噬与ROS产生有关

ROS可作为信号分子可激活细胞自噬。本研究发现CSPCs处理HepG2细胞6h后，DCF荧光强度增加，表明ROS产生增加，ROS的产生与CSPCs不存在时间效应关系(图7A)，但存在剂量依赖性关系(图7B)。图7B和C显示300μg/mL CSPCs处理12h，ROS在细胞中达到最大值，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。与此同时，LC3-II蛋白表达水平也随CSPCs作用时间而增加(图2)，表明ROS参与了自噬过程。

现有研究表明经活性氧阻断剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理，可抑制ROS的增加和下调细胞死亡率。因此，本实验采用ROS阻断NAC考察CPSCs对ROS产生的影响。结果表明，与CSPCs组相比，NAC预处理的细胞生存抑制率减少，LC3-II的表达也减少(图8A，B和C)，NAC+CSPCs处理组对HepG2细胞的毒性也降低，这些结果表明CSPCs介导自噬可能依赖于其产生ROS能力。

线粒体膜电位测定结果表明，与对照组相比，CSPCs预处理组JC-1的红/绿荧光强度显著下降(P<0.01)。与CSPCs单独处理组相比自噬抑制剂3-MA预处理组红/绿荧光强度增强，3-MA+CSPCs组红/绿色荧光强度也有所增加(图9A)。如图9B显示，CSPCs处理的细胞的红/绿色荧光强度为3.55±0.95，3-MA+CSPCs组红/绿色荧光强度为4.15±0.71，表明线粒体膜电位的损失可能参与ROS触发的自噬途径。

本研究证实CSPCs能通过自噬诱导人HepG2细胞死亡。CSPCs诱导HepG2细胞自噬是通过ROS途径，而且自噬作用能部分被ROS阻断剂Nac阻断。自噬形成了典型的双层膜的自噬小泡，通过MDC染色观察自噬荧光强度以及LC3的表达和LC3-I向LC3-II的转变，来研究CSPCs诱导HepG2细胞自噬死亡作用。CSPCs诱导细胞自噬过程中影响了细胞周期的分布。另外，与3-MA组相比CSPCs组细胞膜电位显著降低。这些结果暗示CSPCs通过刺激ROS产生诱导HepG2细胞自噬，可能与线粒体依赖的信号途径有关。

由此可见，本发明提供一种原花青素通过刺激活性氧产生制备抑制肝癌细胞自噬性死亡的药物和保健食品中的用途。具体涉及CSPCs对肝癌HepG2细胞生存力的影响、CSPCs诱导HepG2细胞自噬的剂量效应和时间效应关系、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，简称3-MA)对CSPCs诱导细胞自 噬的影响、CSPCs诱导细胞自噬对细胞周期的影响、ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-cysteine，简称Nac)对CSPCs诱导细胞自噬的影响及与ROS产生的关系，探讨原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的途径。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法，其特征在于：包括，

原花青素对肝癌HepG2生长增殖的抑制作用的分析：

取对数生长期的HepG2细胞经胰蛋白酶消化，接种培养24h后，经原花青素处理6～120h，除去培养基并洗涤后，加入MTT孵育，结束后加入DMSO溶解，于酶标仪490nm处测定吸光度，计算生长抑制率；

CSPCs诱导HepG2细胞自噬的剂量效应和时间效应的分析：

标记自噬细胞，将HepG2细胞接种培养孵育24h后，用原花青素处理细胞不同时间或用雷帕霉素处理12h，实验结束后孵育1h后，于倒置荧光显微镜下观察并荧光定量；

透射电镜观察自噬小体的分析：

收集各处理组的HepG2细胞，离心，弃上清，分别固定，然后脱水，超薄切片，乙酸双氧铀和柠檬铅负染，于透射电镜观察并定量；

细胞的周期分析：

取对数生长期HepG2细胞接种孵育24h后，用原花青素处理细胞12h，或经预处理后用原花青素孵育，实验结束后，加入碘化丙锭染色液避光染色，过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化；

细胞内高活性氧自由基分析：

细胞内高活性氧自由基含量采用氧化敏感探针，DCFH-DA进入细胞被高活性氧自由基氧化成有荧光2'7'-dichlorofluorescein，通过测定DCF荧光强度即能反映高活性氧自由基产生的量，将细胞分别用原花青素和阳性对照雷帕霉素孵育，随后用原花青素孵育，细胞经DCFH-DA处理后，立即于荧光显微镜观察并定量；

线粒体膜电位测定的分析：

线粒体膜电位测定采用亲脂性荧光探针JC-1，在正常细胞内JC-1以聚合体的形式分布在线粒体内，在590nm处会激发出红色荧光，表明高的膜电位，当线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式与膜结合，在530nm处激发出绿色荧光，因此通过JC-1的红光/绿光强度比可以判断线粒体膜电位的变化，将HepG2细胞经原花青素处理12h，收获细胞，洗涤，用含有JC-1的完全培养基于37℃孵育30min，直接于荧光显微镜下观察并分析；

数据处理分析：

数据以X±SD表示，采用SPSS统计学软件，进行t检验数据处理和方差分析，其中，—X代表平均值，SD代表标准偏差，t代表检验某个变量的总体均值和某指定值之间是否存在显著性差异。

2.一种原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡在治疗和预防肝癌方面的应用，其特征在于：原花青素低聚体结构式为：

其中，n＝2～4。

3.如权利要求2所述的原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡在治疗和预防肝癌方面的应用，其特征在于：所述原花青素通过刺激肝癌HepG2细胞内产生高活性氧自由基诱导肝癌细胞发生自噬性死亡。

4.如权利要求3所述的原花青素通过刺激活性氧诱导人肝癌细胞自噬性死亡在治疗和预防肝癌方面的应用，其特征在于：所述原花青素通过刺激肝癌HepG2细胞内产生高活性氧自由基诱导肝癌细胞发生自噬性死亡的过程中，肝癌细胞内的线粒体也参与了此过程。