CN103800390B - 具有增强免疫力及保肝功能的保健品及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有增强免疫力及保肝功能的保健品及其制备方法与应用。本发明所提供的具有增强免疫力及保肝功能的保健品，主要由下述重量份的原料制成：姜黄素15份-60份、灵芝提取物60份-240份、破壁灵芝孢子粉255份-500份和富硒酵母2份-13份。经动物试验证明，本发明所提供的保健品具有增强免疫力的功能。同时，经动物试验证明，本发明所提供的保健品具有对动物酒精性肝损伤辅助保护作用功能。

Description

具有增强免疫力及保肝功能的保健品及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及保健品的制备方法与应用，尤其涉及具有增强免疫力及保肝功能的保健品及其制备方法与应用。

背景技术

免疫力一般情况下也可以叫抵抗力。通常说的人体免疫力就是身体在受到外来的侵害时，比如细菌、病毒入侵人体时，身体抵抗外来入侵的能力。人体的免疫力来自于免疫***，免疫***主要有三方面的功能，第一是免疫防御，它对抗原物质如：病原微生物、菌苗、类毒素、异种蛋白等发生免疫应答，最终消灭抗原物质，起到抗传染免疫的效应。若机体的防御功能发生缺损时，极易患传染性或感染性疾病；第二是免疫自稳，即能清除损伤、衰老、死亡的细胞，并有效地进行免疫调节作用，如自稳功能失调，容易出现自身免疫疾病；其三是免疫监视功能，其主要功能表现在机体通过免疫细胞识别癌变细胞上的抗原，并通过特异或非特异性杀伤细胞将癌细胞破坏，使新出现的癌细胞在未引起大量增殖、扩散前即被消除，而起到抗肿瘤的作用。如免疫监视失司，常易发生肿瘤。随着社会的进步，人们生活节奏的加快，生活环境的变化，以及各方面的压力越来越大，由此导致免疫力下降的人群也越来越多。所以增强机体免疫力，维护身体健康至关重要。

肝脏是重要的物质代谢器官，在碳水化合物、脂类、蛋白质、维生素、激素、胆汁等物质的吸收、储存、生物转化、分泌、***等方面起着重要的作用。同时具有解毒和吞噬功能，参与血液中许多凝血因子的合成，参与造血过程、储存和释放造血因子；还是人体内许多酶类的合成器官，保证着人体正常的新陈代谢。酒精和许多的化学毒物如剧毒类：磷、***、四氯化碳、氯奈、丙烯醛。高毒类：砷、汞、锑、苯胺、氯仿、砷化氢、二甲基甲酰胺等。低毒类的二硝基酚、乙醛、有机磷、丙烯晴、铅等都容易导致肝损伤，而酒精肝损伤是目前最常见的。这些毒物在人群中普遍易感，潜伏期短，可引起肝脏不同程度的干细胞坏死、脂肪变形、肝硬化、胆汁瘀积、肝纤维化、甚至肝癌。对于肝损伤的患者，现代医学采用膜保护剂、抗脂质过氧化剂、抗免疫反应剂等保肝药物进行治疗，但毒副作用较大，疗效也不明显。而中药毒副作用小，有着多靶点、多环节综合作用的特点，在治疗肝损伤方面有独到的疗效。

随着社会的发展亚健康的人数普遍存在且有逐渐增多的趋势。亚健康是一种慢性病，除了生活方式的改善外，服用增强免疫力的保健食品已经成为人们的共识。肝损伤是临床常见的危害人类健康的疾病，除了酒精和化学溶剂外，目前约有500-1000种西药可引起肝脏疾病，严重的肝脏疾病死亡率很高。现代医学在干预肝损伤的治疗方面并无特异性药物，多采用休息、加强营养、补充维生素和对症治疗等，严重者甚至被迫终止用药。中草药经过严格的加工炮制，毒副作用很小。在治疗肝损伤方面已经取得了一定的成效。

姜黄提取物是姜科植物姜黄的块根或根茎经提取精制得到的橘黄色结晶或粉末，其活性成分主要由姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素组成。姜黄性辛温、归脾、肝经，具有破血行气，通经止痛的作用。不溶于水和***，溶于乙醇、冰乙酸、丙二醇，对热稳定、但在光照和碱液中不稳定。具有抗氧化、抗感染、抗炎、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化及抑制肿瘤生长等作用。姜黄素广泛用于食品中、日用品和制药等工业，安全无毒，无副作用，是一种极具有开发前景的天然色素之一。

灵芝提取物是灵芝经加工的提取物。灵芝是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。历代医家认为灵芝是扶正固本，滋补强壮的珍品。其性平、味甘，归心、肺、肝、肾经。《本草纲目》记载，灵芝能“治胸中结，缢心气”，“入心生血，助心充脉”，“安神”，“保神”，“益肺、脾、精气”，“补肝气”等，对全身五脏之气均有补益作用。现代研究表明灵芝含有多糖、氨基酸、蛋白质、多肽、甾类、萜类、有机酸和挥发油等成分。其中灵芝多糖为主要的生物活性。具有调节免疫功能，抑制小鼠体内实瘤体的生长。刺激胰岛素分泌，促进核酸、蛋白质的合成等作用。

灵芝孢子是灵芝繁衍后代的雌雄配子。灵芝孢子含有三萜类、灵芝酸、多糖类、酶类、生物碱、多种维生素等。具有多种药理活性，如灵芝酸能毒杀肿瘤细胞；多糖类、三萜类、酶类能破坏癌细胞的端粒酶，使癌的细胞失去生长能力，促进巨噬细胞生长，提高粒细胞的功能，刺激细胞因子的产生，是一种介导机体多种免疫和炎症过程的重要细胞因子。提高细胞合成抗瘤素Ⅰ和Ⅱ的能力，增强干扰素的生成，含多量的超氧化物歧化酶能迅速清除放、化疗和劳累所产生的自由基及活性氧。并通过刺激淋巴细胞的增殖，提高免疫活性细胞及因子的活性，从而增强免疫功能来拮抗和抑制癌细胞的生长剂蔓延而达到抗癌的目的，灵芝孢子还具有消除化学药物引起肝脏损害的功能，有防止肝硬化和血管硬化的作用。

富硒酵母就是在培养酵母的过程中加入硒元素，酵母生长时吸收利用了硒，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合转化为生物硒，从而消除了化学硒（如***钠）对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有增强免疫力及保肝功能的保健品。

本发明所提供的具有增强免疫力及保肝功能的保健品，其特征在于：所述保健品的活性成分由以下重量份的原料组成：姜黄素15份-60份、灵芝提取物60份-240份、破壁灵芝孢子粉255份-500份和富硒酵母2份-13份。

所述重量份的原料为：姜黄素35份-50份、灵芝提取物60份-185份、破壁灵芝孢子粉225份-360份和富硒酵母6份-10份。

所述保健品还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。

所述灵芝提取物为灵芝水提取物或灵芝有机溶剂提取物；所述姜黄素为姜黄水提取物或姜黄有机溶剂提取物。

所述药学上可接受的辅料或辅助性成分为微晶纤维素和硬脂酸镁。

所述保健品中所述重量份的原料为姜黄素15份-60份、灵芝提取物60份-240份、破壁灵芝孢子粉255份-500份、富硒酵母2份-13份；所述辅料或辅助性成分及其重量份为：微晶纤维素81份-153份和硬脂酸镁3份-6份。

所述保健品中所述重量份的原料为：姜黄素35份-50份、灵芝提取物60份-185份、破壁灵芝孢子粉225份-360份、富硒酵母6份-10份；所述辅料或辅助成分及其重量份为：微晶纤维素81份-106份和硬脂酸镁3份-4份。

所述具有增强免疫力及保肝功能的保健品在制备增强免疫力及保肝药物中的应用也属于本发明的保护范围。

经动物试验证明，本发明所提供的保健品具有增强免疫力的功能。经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，能增强小鼠迟发型***反应，能提高小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力，能促进小鼠的淋巴细胞增值能力；能促进小鼠的抗体生成细胞增值；能提高小鼠的血清溶血素水平；能提高小鼠单和巨噬细胞的碳廓清能力；促进小鼠巨噬细胞吞噬功能；对小鼠体重增长、脏器/体重比值、NK细胞活性无影响。

同时，经动物试验证明，本发明所提供的保健品具有对动物酒精性肝损伤辅助保护作用功能。以0.15g/kg·BW、0.3g/kg·BW、0.6g/kg·BW剂量的受试物灌胃小鼠30天，各组动物生长活动良好，各组动物增重与模型对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；中、高剂量组肝匀浆中MDA浓度及TG浓度均低于模型对照组；中、高剂量组的脂肪变性评分低于模型对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。

具体实施方式

实施例1、制备具有增强免疫力及保肝功能的保健品

该实施例中所用的原料姜黄素、灵芝提取物、破壁灵芝孢子粉、富硒酵母、微晶纤维素和硬脂酸镁均可从商业途径购买得到。

该实施例制备得到的保健品如下：

该实施例具有增强免疫力及保肝功能的保健品的制备方法如下：

该实施例中的姜黄素、灵芝提取物、破壁灵芝孢子粉和富硒酵母可用下述方法制备得到，也可从商业途径购买得到。

一、原料制备

1、制备姜黄素

取姜黄原药材，用9倍体积的70%乙醇，以3mL/min的速度渗漉，利用D101大孔树脂纯化同时调节上样料液pH为7，用80%乙醇以4mL/min的速率洗脱，得到浓缩液；将浓缩液经减压干燥，得到干浸膏；将干浸膏粉碎，并过80目筛后，得到提取物细粉，即为姜黄提取物，姜黄素。

2、制备灵芝提取物

取灵芝原药材，用8倍重量的水提取2次，每次2小时，合并2次水提取液；在60℃，-0.08MPa条件下，将水提取液浓缩至相对密度1.09（60℃），得到浓缩液；将浓缩液经减压干燥（-0.09MPa），得到干浸膏；将干浸膏粉碎，并过80目筛后，得到提取物细粉，即为灵芝提取物。

3、制备破壁灵芝孢子粉

灵芝经过发菌管理和出芝管理，然后上架弹粉采收孢子粉。新采收的孢子粉经过干燥、过筛、复筛、破壁后，密闭保存。

4、制备富硒酵母

以糖蜜加适量硒化合物为培养基，杀菌后接入酵母菌种，加氮、磷等营养盐进行发酵培养，在温度30℃，pH4.5～5.0的条件下通风培养24～48小时，使无机硒结合成有机态的硒，通过离心法分离出酵母，用水反复冲洗后经浓缩和喷雾干燥即得到淡黄色的富硒酵母粉。

二、生产工艺

1.配料、前处理：按照配方要求备齐符合质量要求的原辅料，检查外包装，去掉合格外包装，转入30万级洁净区内，备用。原辅料分别过60目筛，称量，备用。

2.先将富硒酵母和微晶纤维素按等量递增法混合均匀，得混和粉Ⅰ，混和粉Ⅰ再与姜黄提取物、灵芝提取物、破壁灵芝孢子粉混合30分钟，使均匀，得混合粉Ⅱ。

3.制粒：向混合粉Ⅱ中加入纯化水制软材，软材以用手紧握能成团而不粘手，用手指轻压能裂开为度。所得软材过20目筛制颗粒，湿颗粒50-55℃干燥，干燥至颗粒水分≤5%。所得干颗粒用20目筛整粒，得颗粒。

4.总混、填充、抛光：所得颗粒与硬脂酸镁混合10分钟，使均匀，得总混物料。总混物料填充胶囊。填充好的胶囊抛光，检查去除残次胶囊，得抛光胶囊。

实施例2、本发明实施例1制备的保健品用于增强免疫力的功能评价

1.材料与方法

1.1样品：上述实施例1制备得到的保健品A、B、C、D和E。

1.2实验动物

吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供的清洁级ICR雄性小鼠，生产许可证号：SCXK-（吉）2007-0003。饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK-（吉）2010-0001。本实验动物环境设施合格证，吉动设字10-1005，实验动物使用许可证号：SYXK-（吉）2010-0011。选健康雄性小鼠48只，体重18g-22g，分为4组，每组12只，作为免疫一组，进行肝脏/体重比值测定、半数溶血值（HC₅₀）的测定和抗体生成细胞检测；选健康雄性小鼠48只，体重18g-22g，分为4组，每组12只，作为免疫二组，进行碳廓清实验；选健康雄性小鼠48只，体重18g-22g，分为4组，每组12只，作为免疫三组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；选健康雄性小鼠48只，体重18g-22g，分为4组，每组12只，作为免疫四组，进行迟发型***反应试验；选健康雄性小鼠48只，体重18g-22g，分为4组，每组12只，作为免疫五组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。

1.3剂量选择与配制

组合物胶囊1.8g/日，即：1.8g/60kg BW，相当于0.03g/kg BW，以成人摄入量的1、10和30倍设置灌胃剂量，即0.03、0.30、0.90g/kg BW，各剂量组以蒸馏水稀释。以纯水作阴性对照组，各组小鼠灌胃量均为0.2mL/10g BW，连续灌胃30天后测各项免疫指标。

取样品4.50g加纯水至100mL混匀定容即为高剂量组受试物；取样品1.5g加纯水至100mL混匀定容即为中剂量组受试物；取样品0.15g加纯水至100mL混匀定容即为低剂量组受试物。各组受试物新鲜配制，每日灌胃给予受试物一次。

1.4仪器与试剂

电子天平（0.1g）、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴、酶标仪、显微镜等；无菌手术器械、游标卡尺（精密度0.02mm）、微量注射器（25μL）、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等；绵羊红细胞（SRBC）、生理盐水、Hank’s液（PH7.2-7.4）、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、1%冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇（96mL异丙醇加4mL盐酸）、MTT、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g，高铁***0.2g，***0.05g，加蒸馏水至1000mL）、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（Ph8.2）、1%NP40、印度墨汁、Na₂CO₃、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。

1.5实验方法与结果

1.5.1肝脏/体重比值测定

测定方法：小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表明血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。

结果：

（1）受试物对免疫一组小鼠体重的影响

实施例1制备的保健品C对免疫一组小鼠体重的影响见表1。

表1.受试物对免疫一组小鼠体重影响

由表1可见，经统计学处理，经口给予受试物C30天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对免疫一组小鼠体重的影响与表1无显著差异。

（2）受试物对免疫二组小鼠体重的影响

实施例1制备的保健品C对免疫二组小鼠体重的影响见表2。

表2.受试物对免疫二组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表2可见，经统计学处理，经口给予受试物C30天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对免疫二组小鼠体重的影响与表2无显著差异。

（3）受试物对免疫三组小鼠体重的影响

实施例1制备的保健品C对免疫三组小鼠体重的影响见表3。

表3.受试物对免疫三组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表3可见，经统计学处理，经口给予受试物C30天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠体重、增重无明显影响。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对免疫三组小鼠体重的影响与表3无显著差异。

（4）受试物对小鼠脏器/体重比值的影响

实施例1制备的保健品C对小鼠脏器/体重比值的影响见表4。

表4.受试物对小鼠脏器/体重比值的影响

脾脏/体重比值P₁值：各实验组与阴性对照组比较；

胸腺/体重比值P₂值：各实验组与阴性对照组比较；

由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物C30天，各剂量组脾脏/体重比值和胸腺/体重比值与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠脏器/体重比值无明显影响。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠脏器/体重比值的影响与表4无显著差异。

1.5.2迟发型***反应（足跖增厚法DTH）

测定方法：取羊血，生理盐水洗涤，小鼠用2%（V/V）SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL/只。免疫后4天，测量左后足跖部厚度，测量部位皮下注射20%（V/V）SRBC，20μL/只，注射后24h测量左后足跖部厚度三次，计算平均值。

结果：受试物对小鼠细胞免疫功能的影响

实施例1制备的保健品C对小鼠体重和迟发型***反应（DTH）的影响见表5。

表5.受试物对小鼠体重和迟发型***反应（DTH）的影响

P₁值：各实验组与阴性对照组比较。

P₂值：各实验组与阴性对照比较^*P＜0.05

由表5可见，经统计学处理，经口给予受试物C30天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组间比较差异无显著性（P＞0.05）；各剂量组与阴性对照组间比较差异均有显著性（P＜0.05），即各剂量的受试物均能增强小鼠的迟发型***反应。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠体重和迟发型***反应（DTH）的影响与表5无显著差异。

1.5.3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法）

无菌取脾，Hank’s液中将脾磨碎制成单细胞悬液，Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。将细胞悬浮于1mL的完全培养液，台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度至3×10⁶个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5%CO₂37℃CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50mL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，后定OD_570nm。

结果：

实施例1制备的保健品C对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响见表6。

表6.受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表6可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物C30天，经统计学处理，高剂量组淋巴细胞的增殖能力与阴性对照组间比较差异有显著性（P＜0.05），即受试物能增强小鼠淋巴细胞增值、转化能力。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响与表6无显著差异。

1.5.4抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）

将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，4℃冰箱保存备用（可保存2周）。压积SRBC以生理盐水配成2%（V/V）细胞悬液，鼠腹腔注射0.2mL/只。将SRBC免疫4-5天后的小鼠脱臼处死，取脾，放入Hank’s液，将脾磨碎制成细胞悬液，纱布过滤，Hank’s液洗2次，每次离心（1000r/min）10min，后将脾细胞悬液加入RPMI1640培养液中，计数细胞，细胞浓度调至5×10⁶个/mL。琼脂糖加热溶解后，45-50℃水浴保温，与等量pH7.2-7.42倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10%（V/V，用SA液配制）压积SRBC 50μL、脾细胞悬液20μL，混匀后倾倒于已刷有琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，CO₂培养箱中温育1.5h，后用SA缓冲液稀释的补体（1:8）加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。

结果：受试物对体液免疫的影响

实施例1制备的保健品C对小鼠抗体生成细胞数的影响见表7。

表7.受试物对小鼠抗体生成细胞数的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表7可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物C30天，经统计学处理，高剂量组抗体生成细胞数与阴性对照比较差异有显著性（P＜0.05），即受试物能促进小鼠的抗体生成细胞数增值。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠抗体生成细胞数的影响与表7无显著差异。

1.5.5半数溶血值（HC₅₀）的测定

取羊血，生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，腹腔注射2%（V/V，生理盐水配制）压积SRBC 0.2mL/只进行免疫。4天后，取血于离心管，放置约1h，将凝固血于管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释（400倍），稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%（V/V）SRBC0.5mL，补体1mL（用SA缓冲液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）。37℃恒温水浴中保温15-30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10%（V/V）SRBC0.25mL，加都氏试剂4mL，充分混匀，放置10min后，以对照作空白，分别测定各管OD_540nm，溶血素的量以半数溶血值（HC₅₀）表示，计算：

HC₅₀=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数

结果：受试物对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响

实施例1制备的保健品C对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响见表8。

表8.受试物对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表8可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物C30天，经统计学处理，高剂量组半数溶血值与阴性对照组间比较差异有显著性（P＜0.05），即受试物C可以提高小鼠血清溶血素水平。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响与表8无显著差异。

1.5.6小鼠碳廓清实验

小鼠尾静脉注射1:4倍稀释的印度墨汁，立即计时，注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立刻将其加到2mL0.1%Na₂CO₃溶液中，以Na₂CO₃为对照，测定OD_600nm。处死小鼠，取肝脏和脾脏，称重。计算吞噬指数a：

k=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)  

结果：

实施例1制备的保健品C对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响见表9。

表9.受试物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较^*P＜0.05。

由表9可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物C30天，经统计学处理，各剂量组与阴性对照组比较差异均有显著性（P＜0.05），即各剂量组受试物C均能提高小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠半数溶血值（HC₅₀）的影响与表9无显著差异。

1.5.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

小鼠腹腔注射20%（V/V用生理盐水配制）压积鸡红细胞（2000r/min，10min）悬液1mL，间隔30min，脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，37℃孵箱温育20min，生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，甲醇固定，4%（V/V）Giemsa-磷酸缓冲液染色，蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数：

吞噬率%=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数

结果：

实施例1制备的保健品C对小鼠体重和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响见表10。

表10.受试物对小鼠体重和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响

P₁值：各实验组与阴性对照组比较

吞噬率（%）P₂值：各实验组与阴性对照组比较

吞噬指数P₃值：各实验组与阴性对照组比较

由表10可见，经统计学处理，经口给予受试物C30天，各剂量组小鼠体重、增重与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05）；高剂量组吞噬率与阴性对照组比较差异有显著性（P＜0.05）；高剂量组吞噬指数与阴性对照组比较差异有显著性（P＜0.05），即受试物具有促进小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠体重和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响与表10无显著差异。

1.5.8NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶LDH测定法）

实验前24h传代培养靶细胞YAC-1，应用前以Hank’s液洗3次，含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至4×10⁵个/mL。受试小鼠脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，Hank’s液洗3次，每次1500r/min离心10min，用2mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，台酚兰染色计数（活细胞数应在95%以上），调整细胞浓度至2×10⁷个/mL，使效靶比为50:1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液个100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，37℃，5%CO₂培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入1mol的HCl溶液30μL终止反应，测定OD_490nm，计算NK活性：

NK细胞活性%=（反应孔OD–自然释放孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）×100%

LDH基质液的配制：乳酸钠5×10^-2mol/L

硝基氯化四氮唑6.6×10^-4mol/L

吩嗪二甲酯硫酸盐2.8×10^-4mol/L

氧化型辅酶Ⅰ1.3×10^-3mol/L

将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH8.2）。

结果：

实施例1制备的保健品C对小鼠NK细胞活性的影响见表11。

表11.受试物对小鼠NK细胞活性的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表11可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物C30天，经统计学处理，各剂量NK细胞活性与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05），即受试物对小鼠NK细胞活性无明显影响。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠NK细胞活性的影响与表11无显著差异。

2.小结

经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，能增强小鼠迟发型***反应，能提高小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力，能促进小鼠的淋巴细胞增值能力；能促进小鼠的抗体生成细胞增值；能提高小鼠的血清溶血素水平；能提高小鼠单和巨噬细胞的碳廓清能力；促进小鼠巨噬细胞吞噬功能；对小鼠体重增长、脏器/体重比值、NK细胞活性无影响。由此判定，本发明实施例1制备的保健品具有增强免疫力的功能。

实施例3、本发明实施例1制备的保健品用于保肝的功能评价

1材料和方法

1.1样品：上述实施例1制备得到的保健品A、B、C、D和E，人拟用剂量为2.7g/60kg·BW·日。

1.2实验动物：SPF级雄性昆明种小鼠，体重18～22克，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供。合格证号为SCXK-（军）2009-0030001082。

1.3实验动物饲养环境：SPF级实验动物房，温度20～25℃，相对湿度40～70%RH，合格证号：SYXK(津)2008－0004。饲料由天津市华荣实验动物科技有限公司提供，饲料生产许可证号：SCXK（津）2012-0001。

1.4主要仪器：TU-1810紫外可见分光光度计、TOSHIBA TBA-40FR全自动生化分析仪；CM1900冰冻切片机（德国徕卡）、Olympus公司显微镜。

1.5主要试剂：无水乙醇（分析纯）均由利安隆博华（天津）医药化学有限公司提供、丙二醛（MDA）试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒、组织蛋白测定试剂盒（双缩脲法）均由南京建成生物工程研究所提供；甘油三酯（TG）试剂由北京九强生物技术有限公司提供。

1.6实验方法：采用酒精性肝损伤模型，将实验小鼠分高、中、低三个剂量组，一个空白对照组和一个模型对照组，三个剂量组每日灌胃给予受试物，剂量分别为0.15g/kg·BW、0.3g/kg·BW、0.6g/kg·BW（相当于人拟用剂量的5、10、20倍）。分别称取受试物1.5g、3g、6g，各加蒸馏水至200ml，灌胃量0.2ml/10g·BW，空白对照组和模型对照组给予等量蒸馏水。每天1次，连续进行30天。实验结束时将模型对照组和三个剂量组一次灌胃给予50%乙醇（以蒸馏水稀释）0.14ml/10g·BW。禁食16h后，处死全部动物取肝脏，进行各项生化指标检测及组织病理学检查。

1.7检测指标

1.7.1肝脏组织生化指标检测

取肝脏0.3g加生理盐水6ml，充分研磨制成5％肝匀浆。肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、甘油三酯（TG）及组织蛋白含量的测定均采用试剂盒提供的方法进行测定。

1.7.2肝脏组织病理学检查

1.7.2.1病理观察材料：从动物肝左叶中部做横切面取材、冰冻切片、苏丹Ⅲ染色、镜下观察脂滴在肝脏中的分布、范围和面积。

1.7.2.2病理观察方法：每例动物肝组织用40倍物镜连续记录70个视野，每个视野根

据阳性细胞（含脂滴的肝细胞）多少和分布的范围，按0、1、2、3、4分进行评分，将70个视野所得分数的平均值作为该例肝组织的脂肪染色评分。

1.7.2.3病理诊断标准：病理组织学观察以肝细胞脂肪染色作为观察指标，并根据病理改变程度“0”、“1”、“2”、“3”、“4”量化，进行肝损伤程度的评价。肝细胞脂肪染色共分为五级：

1.8实验数据统计：实验数据统计采用SPSS11.5FOR WINDOWS软件包处理。模型对照组与剂量组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett’s T3(Wilcoxon)法进行两两比较。空白对照组与模型对照组则采用T检验。

2结果

2.1受试物对小鼠体重的影响：

实施例1制备的保健品C对小鼠体重的影响见表2-1。

表2-1.受试物对小鼠体重的影响（g，均值±标准差）

由表2-1可见，以不同剂量的受试物C灌胃小鼠30天，各组动物生长、活动正常。各组动物增重与模型对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠体重的影响与表2-1无显著差异。

2.2受试物对MDA、GSH、TG含量的影响：

实施例1制备的保健品C对MDA、GSH、TG含量的影响见表2-2。

表2-2.受试物对MDA、GSH、TG含量的影响（均值±标准差）

^*与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)

由表2-2可见，模型对照组与空白对照组比较，MDA、TG高于对照组，GSH低于对照组，且差异均有统计学意义（P<0.05），表明模型建立成功。以不同剂量的受试物C灌胃小鼠30天，中、高剂量组肝匀浆中MDA浓度及TG浓度均低于模型对照组，且差异均有统计学意义（P<0.05）。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对MDA、GSH、TG含量的影响与表2-2无显著差异。

2.3肝脏组织病理学检查结果：

实施例1制备的保健品C对小鼠肝脏脂肪变性评分结果见表2-3。

表2-3.肝脏脂肪变性评分结果（均值±标准差）

^*与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)

由表2-3可见，模型对照组脂肪变性油红O染色评分高于空白对照组，空白对照组和模型对照组脂肪变性油红O染色评分差异有统计学意义（P<0.05），表明模型建立成功。以不同剂量的受试物C灌胃小鼠30天，中、高剂量组的脂肪变性油红O染色评分均低于模型对照组，且差异有统计学意义（P<0.05）。

实施例1制备的保健品A、B、D和E对小鼠肝脏脂肪变性评分结果与表2-3无显著差异。

3小结

以0.23g/kg·BW、0.45g/kg·BW、0.90g/kg·BW剂量的受试物灌胃小鼠30天，各组动物生长活动良好，各组动物增重与模型对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；中、高剂量组肝匀浆中MDA浓度及TG浓度均低于模型对照组；中、高剂量组的脂肪变性评分低于模型对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）辅助保护化学性肝损伤功能结果判定标准，提示本申请实施例1制备的保健品具有对动物酒精性肝损伤辅助保护作用功能。

Claims (6)

1.一种具有增强免疫力及保肝功能的保健品，其特征在于：所述保健品的活性成分由以下重量份的原料组成：姜黄素45份-60份、灵芝提取物60份-120份、破壁灵芝孢子粉255份-500份和富硒酵母6份-13份。

2.根据权利要求1所述的具有增强免疫力及保肝功能的保健品，其特征在于：所述保健品还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。

3.根据权利要求2所述的具有增强免疫力及保肝功能的保健品，其特征在于：所述灵芝提取物为灵芝水提取物或灵芝有机溶剂提取物；所述姜黄素为姜黄水提取物或姜黄有机溶剂提取物。

4.根据权利要求2所述的具有增强免疫力及保肝功能的保健品，其特征在于：所述药学上可接受的辅料或辅助性成分为微晶纤维素和硬脂酸镁。

5.根据权利要求4所述的具有增强免疫力及保肝功能的保健品，其特征在于：所述保健品中所述重量份的原料为姜黄素45份-60份、灵芝提取物60份-120份、破壁灵芝孢子粉255份-500份、富硒酵母6份-13份；所述辅料或辅助性成分及其重量份为：微晶纤维素81份-153份和硬脂酸镁3份-6份。

6.权利要求1-5中任一所述的具有增强免疫力及保肝功能的保健品在制备增强免疫力及保肝药物中的应用。