CN101456854A

CN101456854A - 原花青素低聚体及高聚体的医药新用途

Info

Publication number: CN101456854A
Application number: CNA2009100100545A
Authority: CN
Inventors: 吴春福; 杨静玉; 张凤娇; 孙宝山; 王立辉; 赵余庆
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2009-01-09
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2009-06-17

Abstract

本发明提供了原花青素低聚体F2，及高聚体F3在制备抗肿瘤保健食品及药品方面的新用途，尤其是在治疗胶质瘤保健食品及药品方面的新用途。本发明研究了F2对脑内肿瘤、血液***肿瘤、消化道肿瘤、呼吸***肿瘤及泌尿生殖***肿瘤的抑制作用。首次发现F2、F3对胶质瘤细胞株U－87及U251、人源性白血病HL－60细胞株、人源性肝癌Hep3B细胞株、人源性结肠癌Colon－205细胞株、人源性***癌Du－145细胞株和人源性A549肺癌细胞株具有抑制作用，并随剂量的递增而提高。而且F2还能显著抑制甲酰肽诱导的人恶性胶质瘤U－87细胞趋化及该细胞中甲酰肽受体(Formyl peptide receptor，FPR)的表达。该受体在介导人恶性胶质瘤细胞的迁移、存活、生长及血管发生中起重要作用。

Description

原花青素低聚体及高聚体的医药新用途

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及原花青素低聚体(F2)和高聚体(F3)的医药新用途，具体地说是涉及其在制备防治脑内肿瘤、血液***肿瘤、消化道肿瘤、呼吸***肿瘤及泌尿生殖***肿瘤，尤其是防治人恶性胶质瘤保健食品及药品方面的用途。

背景技术：

原花青素(proanthocyanidins或procyanidins，简称PC)是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称。多年来人们对从众多不同植物中提取出的原花青素进行了大量研究。作为天然高效的抗氧化剂，它还具有其他众多优良的生物药理学活性，现已在营养保健、医药卫生及美容化妆品等领域日益受到人们的青睐，具有多种重要生物活性，可用于防治心血管疾病、抗糖尿病、抗肿瘤、抗衰老、改善免疫抑制等。

恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。神经胶质瘤是中枢神经***最常见的恶性肿瘤，居颅内肿瘤发病率的首位。它除具有坏死病灶集中点、善于利用微环境来支持自身存活、生长迅速的特点外，还具有血管丰富，侵袭与转移能力强等特点，利用传统的手术治疗难以彻底切除。罹患恶性胶质瘤的患者存活率极低。除此之外，许多其它***的肿瘤，如血液***肿瘤、消化道肿瘤、呼吸***肿瘤及泌尿生殖***肿瘤等均是较难治愈的恶性疾病。

甲酰肽受体(formyl peptide receptor，FPR)是一种G蛋白偶联受体，广泛分布于人体多种组织和器官，能参与介导白细胞趋化、免疫反应以及恶性肿瘤等多种病理生理过程。近年来，内/外源性FPR受体配体的研究进展迅速。其外源性激动剂包括“经典”的趋化物质甲酰肽(fMLF)及合成多肽类WKYMVM、WKYMVm。内源性激动剂包括HIV-1衣壳蛋白中的部分肽段、线粒体内甲酰化的短肽、糖皮质激素调节蛋白annexin I及存在于中性粒细胞的Cathepsin G。其拮抗剂包括外源性的合成多肽tBoc，来源于真菌的cyclosporine H(CsH)，从牛脊柱中纯化的多肽spinorphin(LVVYPWT)和金黄色葡萄球菌分泌的CHIPS。近年来研究发现，FPR能选择性表达于人恶性胶质瘤细胞系U-87及多数原代IV级恶性胶质瘤与III级星形细胞瘤，在正常的星形胶质细胞及恶性程度较低的胶质瘤表面并不表达。该受体可以通过与宿主来源的FPR激动剂(由坏死的胶质瘤细胞释放的fMLF)作用介导人恶性胶质瘤细胞的迁移、存活、生长及血管发生，还能参与裸鼠的致肿瘤性。因此FPR可以作为一个开发新型抗胶质瘤药物的分子靶点。

发明内容：

本发明的目的是提供一种葡萄籽提取物原花青素低聚体(F2)及高聚体(F3)在制备防治肿瘤保健食品及药品方面的用途。

本发明是通过如下方案实现的：

本发明中葡萄籽提取物原花青素低聚体(F2)及原花青素高聚体(F3)的制备工艺如下：用超速粉碎机将葡萄籽研磨成粒径不高于1mm的粉末。立即以甲醇-水(80:20，V/V)进行初提，再以丙酮-水(75:25，v/v)进行提取得到酚类粗提物。去除有机溶剂后，将该粗提物用色谱柱Lichroprep RP-18(200 X 25mm，粒径＝25-40μm)分离，得到F2、F3。其过程主要包括：首先用PH＝7.0的蒸馏水洗脱以去除酚酸，再以乙酸乙酯洗脱得到葡萄籽提取物低聚体F2。葡萄籽提取物高聚体F3采用甲醇洗脱。将F2、F3在低于30℃下干燥并制成冻干粉。其结构式如下，其中F2的聚合度为2-15，F3的聚合度为10-33。

1、本发明提供了F2、F3在制备防治脑内肿瘤的保健食品及药品方面的用途。

2、F2、F3在制备防治血液***肿瘤的保健食品及药品方面的用途。

3、F2、F3在制备防治消化道***肿瘤的保健食品及药品方面的用途。

4、F2、F3在制备防治呼吸道***肿瘤的保健食品及药品方面的用途。

5、F2、F3在制备防治泌尿生殖***肿瘤的保健食品及药品方面的用途。

6建议的有效剂量为30-100μg/ml。

附图说明：

图1为F2对U-87细胞趋化的影响

###p<0.001与空白组比较，^***p<0.001加药组与模型fMLF组比较；阴影柱状图表示为加趋化剂甲酰肽组，空心柱状图表示空白溶剂组

图2为F3对U-87细胞趋化的影响

图3为F2对于甲酰肽诱导的U-87细胞钙动员的影响；实线组表示空白组，虚线组表示F2(5μg/ml)组，点划线表示F2(10μg/ml)组

图4为F2对于甲酰肽诱导的U-87细胞ERK1/2活化的影响

图5为F2对U-87细胞FPR表达的影响，白色线条表示FPR的表达情况

具体实施方式：

实施例1、以人源性胶质瘤U-87及U251细胞株、人源性白血病HL-60细胞株、人源性肝癌Hep3B细胞株、人源性结肠癌Colon-205细胞株、人源性***癌Du-145细胞株和人源性A549肺癌细胞株为靶细胞进行F2、F3对于这些细胞的抑制作用实验

1.1 材料

人恶性胶质瘤细胞U-87和U251、人源性白血病HL-60细胞株、人源性肝癌Hep3B细胞株、人源性结肠癌Colon-205细胞株、人源性***癌Du-145细胞株和人源性A549肺癌细胞株：由ATCC提供。DMEM干粉：购自Invitrogen/Gibco。胎牛血清：购自TBD公司。胰酶：购自北京华美生科生物技术有限公司。四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)：购自购自北京华美生科生物技术有限公司。F2、F3由葡萄牙国家资源实验室孙宝山教授提供。

1.2 方法

将由ATCC提供的人源性胶质瘤U-87及U251细胞株、人源性白血病HL-60细胞株、人源性肝癌Hep3B细胞株、人源性结肠癌Colon-205细胞株、人源性***癌Du-145细胞株和人源性A549肺癌细胞株用胰酶消化后，悬浮于含10％胎牛血清的培养液中，轻轻吹打成细胞悬液，显微镜下用细胞计数板计数活细胞。将肿瘤细胞接种于无菌的96孔培养板，每孔加肿瘤细胞悬液100μl。将细胞置于37℃、体积百分比为5％的CO₂培养箱中贴壁过夜后，弃去上清液，然后加入不同浓度的F2溶液。药物分别作用一定时间后，转移上清液，在每孔中加入0.5mg/ml四唑盐(MTT)的无血清培养液100μl，37℃、体积百分比为5％的CO₂培养箱中继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入100μl DMSO，测定各孔吸光度，然后按下式计算平均抑制率。结果采用Mean±SEM表示，数据统计采用ANOVA对组间均数比较进行方差齐性分析，并运用Dunnett’s t-test进行组间比较。

计算公式：(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值X100

1.3 结果

结果如表1所示，F2、F3对胶质瘤细胞株U-87及U251细胞株、人源性白血病HL-60细胞株、人源性肝癌Hep3B细胞株、人源性结肠癌Colon-205细胞株、人源性***癌Du-145细胞株和人源性A549肺癌细胞株具有抑制作用，并随剂量的递增而提高。此结果表明，F2、F3是一种很有潜力的新型、有效的抗肿瘤新药，拓宽了葡萄籽提取物原花青素低聚体(F2)及其高聚体(F3)的医药应用。

表1、F2、F3对肿瘤细胞的抑制实验

实施例2、以人源性胶质瘤U-87细胞株为靶细胞进行F2、F3对于甲酰肽诱导的U-87细胞趋化的影响实验

2.1 材料

48孔趋化板：购自Neuro Probe公司。聚碳酸酯膜：购自Neuro Probe公司。I型鼠尾胶原：购自基因公司。甲酰肽(fMLF)：购自Sigma公司。F2、F3由葡萄牙国家资源实验室孙宝山教授提供。

2.2 方法

细胞趋化性的检测采用趋化小室法，趋化小室上孔为分别预先经非细胞毒剂量的F2、F3孵育1h的U-87细胞悬液，下孔为10nM甲酰肽。另加阴性对照组(下孔为空白缓冲液，上孔为空白细胞悬液)、阳性对照组(下孔为10nM甲酰肽，上孔为空白细胞悬液)。上下小室间以8μM孔径的聚碳酸酯膜分隔(预先用50μg/mL的鼠尾胶原包被)，调整细胞密度至0.8×10⁶cells/mL，于培养箱中孵育4h后取出膜，经固定、染色后于光镜下计数每孔中平均迁移的细胞数目。并计算趋化指数(CI)即fMLF组趋化的细胞数与缓冲液对照组中趋化细胞数的比值。结果采用Mean±SEM表示，数据统计采用ANOVA对组间均数比较进行方差齐性分析，并运用Dunnett’st-test进行组间比较。

2.3 结果

结果如图1所示，F2(2.5μg/mL、5μg/mL及10μg/mL)预先作用U87细胞1h能显著抑制fMLF诱导的U-87细胞的趋化，并具有剂量依赖性。因为F2(2.5μg/mL、5μg/mL)预先作用U-87细胞1h不影响U87的随机迁移，所以F2(2.5μg/mL、5μg/mL)对fMLP诱导的U87细胞的趋化的抑制作用不是通过影响其随机迁移而起作用的。相似的，F3(2.5μg/mL、5μg/mL及10μg/mL)预先作用U-87细胞1h能显著抑制fMLF诱导的U-87细胞的趋化，并具有剂量依赖性。因为F3(2.5μg/mL、5μg/mL)预先作用U-87细胞1h不影响U-87的随机迁移，所以F3(2.5μg/mL、5μg/mL)对fMLF诱导的U-87细胞的趋化的抑制作用不是通过影响其随机迁移而起作用的。实施例3、总原花青素与F2、F3的抗胶质瘤活性的对比实验

3.1 材料

受试药：F2、F3和总原花青素均来自葡萄牙国家资源实验室孙宝山教授。

3.2 方法

MTT法和趋化实验(如前所述)。

3.3 结果

结果如表2所示，F2、F3的抗胶质瘤增殖及抗fMLF诱导的胶质瘤细胞趋化活性均显著优于总原花青素。

表2、F2、F3与总原花青素的抗胶质瘤活性对比

实施例4、以人源性胶质瘤U-87细胞株为靶细胞进行F2对于甲酰肽诱导的U-87细胞钙动员的影响实验

4.1 材料

Fura-2探针：购自Biotium公司。酶标仪：购自基因公司。其他同上。

4.2 方法

细胞内钙离子浓度的测定。胰酶消化收集细胞，调整细胞密度为2×10⁷cells/ml，用含10％FBS的培养液悬浮细胞，加入终浓度为10μM的Fura-2，室温避光孵育45min。用缓冲液洗涤负载的细胞三次，重悬并调整细胞密度为5×106cells/ml，接种于96孔黑板，200μl/孔，用酶标仪测定340，380nm处的荧光强度。实验中设以下组别：细胞自身荧光组、高钙缓冲液组、零钙缓冲液组。测定条件为激发波长340nm和380nm，激发光栅5nm；发射波长505nm，发射光栅10nm。观察不同处理条件下荧光强度的变化，按下式计算细胞内[Ca2+]i：[Ca2+]i＝Kd×(Fmin/Fmax)×(R-Rmin)/(Rmax-R)。

4.3 结果

结果如图2所示：fMLF(10nM，100nM)均能显著启动U-87细胞的钙动员。当分别以F2(5μg/ml，10μg/ml)预先作用U-87细胞5min后均能显著脱敏10nM fMLF(Fig.3A)及100nM fMLF(Fig.3B)诱发的钙动员。因此F2能抑制fMLF诱发的U-87细胞钙动员。这从信号通路角度部分说明了F2能抑制fMLF诱导的U-87细胞趋化的原因。

实施例5、以人源性胶质瘤U-87细胞株为靶细胞进行F2对于甲酰肽诱导的U-87细胞ERK1/2活化的影响实验

5.1 材料

ERK1/2及其磷酸化抗体：均购自Cell Signaling公司。ECL：购自碧云天公司。山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗：均购自宝信生物科技有限公司。其他同上。

5.2 方法

Western blot方法。以非细胞毒浓度的F2预先作用U-87细胞2h，然后用100nMfMLF作用U-87细胞2min，提取细胞蛋白进行实验。

5.3 结果

结果如图3所示：ERK作为细胞趋化的重要信号分子，F2预先作用能显著抑制fMLF诱导的U-87细胞ERK磷酸化，部分阐明F2能抑制fMLF诱导的U87细胞趋化的机制。

实施例6、以人源性胶质瘤U-87细胞株为靶细胞进行F2对于其甲酰肽受体表达的影响实验

6.1 材料

FPR抗体：购自Santa Cruze公司。FITC标记的二抗：购自Sigma公司。其他同上。

6.2 方法

免疫荧光染色。将细胞接种于24孔板12h后，PBS洗涤一次，用多聚甲醛固定。然后用正常兔血清封闭。用FPR抗体孵育后用FITC标记的二抗显色，用DNA染料DAPI染核。

6.3 结果

结果如图4所示：2.5-10μg/ml F2处理U87细胞12-48小时，能降低FPR蛋白表达。其中2.5μg/ml F2在48小时时可降低FPR蛋白表达，而在12和24小时对FPR蛋白无效应；5μg/ml和10μg/ml F2在12小时即可降低FPR蛋白表达。

Claims

1、原花青素低聚体(F2)及高聚体(F3)，其结构式如下，其中F2的聚合度为2-15，F3的聚合度为10-33。

2、原花青素低聚体(F2)及高聚体(F3)在制备防治肿瘤的保健食品及药品中的用途。

3、根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤包括脑部肿瘤、血液***肿瘤、消化道***肿瘤、呼吸道***肿瘤、泌尿生殖***肿瘤。

4、根据权利要求3所述的用途，其特征在于：F2、F3能时间并剂量依赖性抑制人恶性胶质瘤U-87的成活率；能显著抑制甲酰肽诱导的U-87细胞迁移；能显著降低U-87细胞中FPR的表达。

5、根据权利要求1所述的原花青素低聚体(F2)及高聚体(F3)，其特征在于：其可以和药学上可接受的载体混合制成临床上可接受的片剂、胶囊、注射液、冲剂。