CN102127526A - 一种酯酶及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酯酶及其编码基因。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由序列1衍生的蛋白质。所述蛋白的编码基因、以及含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于降解硝基苯酚酯。本发明的蛋白可应用于食品加工、洗涤剂，医药化妆品、化合物制备等行业。

Description

一种酯酶及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种酯酶及其编码基因。

背景技术

酯酶(EsteraseE.C.3.1.1.1)是自然界中常见的酯水解酶类，普遍存在于动物、植物和微生物，其中微生物来源的酯酶种类最为丰富。不同来源的酯酶基因差别大，同源性不高但在蛋白质三维结构上具有极高的相似性既α/β折叠酶结构，催化反应机理都遵循丝氨酸水解酶的反应机制，既催化结构域包含丝氨酸-组氨酸-谷氨酸(或天冬氨酸)三联体活性中心结构并在丝氨酸活性位点附近存在丝氨酸水解酶的特征保守序列G-X-S-X-G。酯酶和脂肪酶在结构和催化机理上具有极高的相似性，其主要区别：酯酶主要是水解短链水溶性酯底物，催化过程中遵循典型米氏酶动力学方式；而脂肪酶能够催化水解疏水性长链脂肪酸脂底物，并且在催化过程中表现界面活性；在蛋白质结构上脂肪酶往往具有一个用移动的盖子结构(lid)。

微生物来源的酯酶种类最为繁多，根据的它们的氨基酸序列相似性和基本生物学特性，Arpigny于1999年将其***划分为8个大的家族；其中家族一为脂肪酶，家族二到八为酯酶。几年来随着大量新的酯酶基因的发现，又增添了以Pha27为代表的第九家族和以EstD为代表的第十酯酶家族。

酯酶/脂肪酶由于其蛋白分子稳定、催化反应简单、不依赖辅助因子、底物范围广等优点，被广泛的应用于食品加工、洗涤剂，医药化妆品、化合物制备等行业。据初步统计全球工业酶产值在2004达到了20亿，并以每年4％-5％的数率在增长，其中脂肪酶类的使用占总用酶频率的10％。近年来随着手性化合物在制药、农药、香料、液晶、功能性高分子等工业中广泛的应用，酯酶对手性化合物拆分的特性更加凸现出来。相比于脂肪酶，酯酶在手性拆分上表现着更显著的效果，例如利用酯酶NP对手性萘普生进行拆分可以得到99％光学纯的转化率达到95％的对应体产物。

发明内容

本发明的目的是提供一种酯酶及其编码基因。

本发明提供的酯酶(EstOF4，又名OF4511)，来自Alkaliphilic Bacilluspseudofirmus OF4，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

序列1所示的蛋白由246个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OF4511的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述OF4511蛋白的基因(estof4)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有酯酶活性的蛋白的DNA分子。

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

所述重组表达载体具体可为将所述基因***pET28a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。具体来说，所述重组表达载体为将pET28a质粒NdeI和BamHI酶切位点之间的小片段取代为所述基因得到的重组质粒。

含有以上任一所述基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组菌可为将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

本发明同时保护一种制备酯酶的方法，是培养所述重组菌，得到酯酶。所述制备酯酶的方法具体可为：将所述重组菌37℃培养，OD₆₀₀＝0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM，转至30℃继续培养。

扩增所述基因(estof4)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于降解硝基苯酚酯。

所述硝基苯酚酯具体可为如下任意一种：对硝基苯酚乙酸酯(p-nitrophenylacetate；pNC2)，对硝基苯酚丙酸酯(p-nitrophenyl propionate；pNC3)，对硝基苯酚丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate；pNC4)，对硝基苯酚己酸酯(p-nitrophenyl caproate；pNC6)，对硝基苯酚辛酸酯(p-nitrophenyl caprylate；pNC8)，对硝基苯酚癸酸酯(p-nitrophenyl caprate；pNC10)，对硝基苯酚月桂酸酯(p-nitrophenyl laurate；pNC12)。

应用所述蛋白降解所述硝基苯酚酯(如硝基苯酚己酸酯)时，温度为30-60℃(优选45-55℃，最优选50℃)，pH为7.0-10.5(优选7.5-10.0，最优选8.5)。

本发明的蛋白具有酯酶活性，降解硝基苯酚己酸酯时，最适pH为8.5，最适温度为50℃。本发明的蛋白可应用于食品加工、洗涤剂，医药化妆品、化合物制备等行业。

附图说明

图1为PCR扩增产物的电泳图；1：PCR扩增产物；2：DNA marker III；3：DNAmarkerλ-Hind III。

图2为表达纯化的各个阶段中重组蛋白溶液的SDS-PAGE电泳图；1：对照酶液；2：重组菌粗酶液；3：Ni-IDA His·Bind Column纯化后得到的重组蛋白溶液；4：分子筛Superdex 20010/300GL纯化后得到的重组蛋白溶液。

图3为重组蛋白对不同底物的比活性。

图4为重组蛋白在不同pH下的比活性。

图5为重组蛋白在不同温度下的比活性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。酶活鉴定中，均设置三次重复实验，结果取平均值。

1个酶活力单位：1分钟水解底物生成1μmol对硝基苯酚(ε＝0.016μM^-1)所需要的酶量。

酶活计算公式：酶活(U/mg)＝(ΔOD405×V)/(t×ε×V_酶×C_酶)；ΔOD405代表反应时间内OD405的变化值；V代表反应体积(1ml)；ε为硝基苯酚的消光系数(0.016μM^-1)；t代表反应时间(min)；V_酶代表加入的酶的体积(ml)；C_酶代表酶的浓度(mg/ml)。

Alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4：德国微生物菌种保藏中心，保藏号为8715(DSM 8715)；原始来源不清。

实施例1、酯酶EstOF4的发现

将Alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4(DSM 8715)进行全基因组测序，得到部分基因序列信息，通过同源比对和开放阅读框分析，找到与微生物酯酶基因相似性极高的基因。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为EstOF4(也叫OF4511)。EstOF4由246氨基酸残基组成；理论等电点为5.2；经过序列分析EstOF4没有信号肽标识，即该酶是胞内酶；EstOF4与来自Bacillus sp.01-855的酯酶具有最高同源性，identity＝75％；根据酯酶EstOF4蛋白序列可以将该酶归于酯酶/脂肪酶家族IV；序列表的序列1所示的EstOF4，自按极端第93位氨基酸残基(Ser)、第190位氨基酸残基(Asp)和第220位氨基酸残基(His)为酯酶EstOF4的催化三联体。将EstOF4的编码基因命名为estof4。estof4的开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、EstOF4的表达纯化和鉴定

一、酯酶基因的克隆

根据酯酶基因的核苷酸序列设计特异性引物对如下(上游引物的下划线部分为NdeI的酶切位点，下游引物的下划线部分为BamHI酶切位点)：

上游引物：5’-TGACATATGAAAGTAGTAGCACCTAAGCC-3’；

下游引物：5’-GGACGGATCCACAGTCCAGTCTAATCCTTC-3’。

以Alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4(DSM 8715)的基因组DNA为模板，用所述特异性引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：

10x缓冲液              5μl

dNTP                   4μl

ExTaq DNA聚合酶        0.5μl

上游引物               1μl

下游引物               1μl

模板                   0.5μl

用灭菌水补充至50ul。

PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30秒-58℃退火30秒-72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性(电泳图见图1)，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。

二、重组质粒pETEst-OF4构建

1、用限制性内切酶NdeI和BamHI对PCR产物进行酶切(37℃温育4h)，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2、用限制性内切酶NdeI和BamHI对质粒pET28a(Cat.NO 69864-3，Novogen)进行酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物用T4DNA连接酶(TAKARA公司)进行连接反应(16℃连接过夜)。

将连接产物进行测序鉴定，结果表明得到了目的质粒pETEst-OF4(骨架质粒为pET28a，骨架质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间***了序列表的序列2所示的DNA片段)。

三、重组质粒转化进入表达菌株BL21(DE3)

取大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.NO CB105，TIANGEN)感受态细胞一管，于冰上融化，以预冷的移液管枪尖转移50ul于预冷的1.5ml离心管中，然后加入pETEst-OF41ul，轻摇混匀，冰浴放置30分钟。迅速转移到42℃水浴中，准确放置40秒。迅速转移到冰上，冷却2分钟。每管加入500ul LB培养液，于37℃培养45分钟。涂布20ul于含抗生素的平板(40mg/ml卡那霉素)过夜培养。得到重组菌pETEstOF4/E.coliBL21(DE3)。

用pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)，方法同上，得到对照菌。

四、重组蛋白的表达和纯化

1、重组蛋白的表达

①将重组菌pETEstOF4/E.coliBL21(DE3)加入到200ml LB液体培养基(含有50ug/ml卡那霉素)中，37℃摇床培养；

②当OD600达到0.8左右时，加入诱导剂IPTG(使其终浓度为0.5mM)，30℃诱导过夜；

③6000rpm离心10分钟，收集菌体，按1∶6(1mg∶6mL)加入50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，超声波破碎10分钟(60W，超声2s，停止2s)；

④15000rpm离心10min，去除细胞碎片，得到粗酶液。

2、重组蛋白的Ni-IDA His·Bind Column纯化

将粗酶液流过Novagen公司生产的His·Bind Column(带Ni的IDA琼脂糖1.25mL预装柱)。待粗酶液完全流过层析柱用5ml溶液A(20mM pH7.9Tri s-Cl，0.5M NaCl，10mM咪唑)冲洗Ni柱去除未结合的杂蛋白。再用10ml溶液B(20mM pH7.9Tris-Cl，0.5M NaCl，60mM咪唑)漂洗Ni柱去除结合较弱的杂蛋白。最后用5ml溶液C(20mM pH7.9 Tris-Cl，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液，然后将洗脱液用FPLC(快速蛋白液相层析)脱盐，得到脱盐后样本。

3、分子筛层析柱进行纯化，

将脱盐后样本加入分析筛层析柱Superdex 20010/300GL(1.0×30cm；Amersham Biosciences)，流动相为20mM pH7.9Tris-Cl、0.5M NaCl，在4℃流速为0.6ml/min。收集具有酯酶活性(酯酶活性测定方法同步骤五)的蛋白质组分，即为重组蛋白溶液(0.5mg/ml)。

将步骤三制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

表达纯化的各个阶段中，重组蛋白溶液的SDS-PAGE电泳结果见图2。

五、酯酶活力的测定

以硝基苯酚己酸酯(Sigma)作为酯酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mM Tris-HCl(pH8.0)，底物的终浓度为0.2mM，10ul步骤四得到的重组蛋白溶液(或对照酶液)，50℃用DU800紫外可见分光光度计(Beckman)测定1分钟内405nm的光吸收值的变化曲线。

pNC6＝10U/mg。

对照酶液没有活性。

六、底物选择性

检测重组蛋白对如下几种底物的酶活：对硝基苯酚乙酸酯(p-nitrophenylacetate；pNC2)，对硝基苯酚丙酸酯(p-nitrophenyl propionate；pNC3)，对硝基苯酚丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate；pNC4)，对硝基苯酚己酸酯(p-nitrophenyl caproate；pNC6)，对硝基苯酚辛酸酯(p-nitrophenyl caprylate；pNC8)，对硝基苯酚癸酸酯(p-nitrophenyl caprate；pNC10)，对硝基苯酚月桂酸酯(p-nitrophenyl laurate；pNC12)。检测方法同步骤五。

重组蛋白对几种底物的酶活分别为：

pNC2＝3.7U/mg；pNC3＝6.4U/mg；pNC4＝6.6U/mg；pNC6＝10U/mg；pNC8＝3.3U/mg；pNC10＝1.7U/mg；pNC12＝0.15U/mg。

不管针对哪个底物，对照酶液均没有活性。

结果表明，重组蛋白对硝基苯酚己酸酯(中长链底物)具有最高酶活，kcat＝329min^-1，Km＝60uM。

以该最高酶活为100％，计算重组蛋白对其它几种底物的比活性，见图3。

七、pH对酶活性的影响

在不同的pH值溶液中测定重组蛋白的酶活：以对硝基苯酚己酸酯作为酯酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为A-J中的一种，底物的终浓度为0.2mM，10ul步骤四得到的重组蛋白溶液(或对照酶液)，50℃用DU800紫外可见分光光度计(Beckman)测定1分钟内405nm的光吸收值的变化曲线。

A：缓冲体系为Sodium phosphate(pH7.0)；

B：缓冲体系为Sodium phosphate(pH7.5)；

C：缓冲体系为Sodium phosphate(pH8.0)；

D：缓冲体系为Tris-HCl(pH8.0)；

E：缓冲体系为Tris-HCl(pH8.5)；

F：缓冲体系为Tris-HCl(pH9.0)；

G：缓冲体系为Glycine-NaOH(pH9.0)；

H：缓冲体系为Glycine-NaOH(pH9.5)；

I：缓冲体系为Glycine-NaOH(pH10.0)；

J：缓冲体系为Glycine-NaOH(pH10.5)。

重组蛋白在不同pH下酶活分别为：A：2.4U/mg；B：4.72U/mg；C：5.76U/mg；D：6.24U/mg；E：8.0U/mg；F：7.36U/mg；G：6.8U/mg；H：7.12U/mg；I：6.4U/mg；J：4.8U/mg。

不管针对哪个pH，对照酶液均没有活性。

以该最高酶活为100％，计算重组蛋白在其它几种pH下的比活性，见图4。

结果表明，重组蛋白最适pH为8.5，在pH7.5-pH10该酶都能发挥一般以上的催化活性。

八、温度对酶活性的影响

以硝基苯酚己酸酯作为酯酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mMTris-HCl(pH8.5)，底物的终浓度为0.2mM，10ul步骤四得到的重组蛋白溶液(或对照酶液)，不同温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃)下用DU800紫外可见分光光度计(Beckman)测定1分钟内405nm的光吸收值的变化曲线。

重组蛋白在不同温度下酶活分别为：30℃＝5.3U/mg，35℃＝6.3U/mg，40℃＝6.8U/mg，45℃＝7.8U/mg，50℃＝10U/mg，55℃＝7.9U/mg，60℃＝7.4U/mg)

不管针对哪个温度，对照酶液均没有活性。

结果表明，重组蛋白的最适温度为50℃。以该最高酶活为100％，计算重组蛋白在其它几种温度下的比活性，见图5。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种酯酶及其编码基因

<130>CGGNARY102030

<160>2

<210>1

<211>246

<212>PRT

<213>Alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4

<400>1

Met Lys Val Val Ala Pro Lys Pro Phe Thr Phe Glu Gly Gly Asp Arg

1               5                   10                  15

Ala Val Leu Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Thr Thr Ala Asp Val Arg

            20                  25                  30

Met Ile Gly Arg His Leu Gln Lys Glu Gly Tyr Thr Cys His Ala Pro

        35                  40                  45

Leu Tyr Lys Gly His Gly Val Pro Pro Glu Glu Leu Val His Thr Gly

    50                  55                  60

Pro Glu Asp Trp Trp Lys Asp Val Glu Ala Gly Tyr Asn Tyr Leu Lys

65                  70                  75                  80

Glu Lys Gly His Glu Glu Ile Ala Val Cys Gly Leu Ser Leu Gly Gly

                85                  90                  95

Val Phe Ser Leu Lys Iie Gly Tyr Thr Leu Pro Val Lys Gly Ile Val

            100                 105                 110

Pro Met Cys Ala Pro Val Arg Pro Lys Thr Glu Asp Ala Met Tyr Lys

        115                 120                 125

Gly Val Leu Ala Tyr Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Arg Glu Gln Lys Ser

    130                 135                 140

Asp Asp Val Ile Asn Gln Glu Met Glu Ala Phe Lys Pro Met Gly Thr

145                 150                 155                 160

Leu Ser Ala Leu Gly Glu Le uIle Gln Asp Val His Asn His Leu Asp

                165                 170                 175

His Ile Tyr Ser Pro Thr Phe Val Val Gln Ala Arg Asn Asp Glu Met

            180                 185                 190

Ile Asp Val Glu Ser Ala Asn Ile Ile His Asp Gln Ile Glu Ser Asp

        195                 200                 205

Glu Lys Ser Leu Lys Trp Tyr Glu Glu Ser Gly His Val Ile Thr Leu

    210                 215                 220

Asp Lys Glu Lys Glu Gln Leu His Glu Asp Ile Leu Gln Phe Leu Glu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Asp Trp Thr Val

                245

<210>2

<211>738

<212>DNA

<213>Alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4

<400>2

atgaaagtag tagcacctaa gccatttaca tttgaaggag gagaccgtgc ggttcttctg     60

ttgcacggct tcactggaac aacggccgat gtgagaatga tcggacgcca cttacaaaaa    120

gaagggtaca catgccacgc ccctttatat aaggggcacg gagttcctcc tgaagagctt    180

gttcatacag gtcctgaaga ttggtggaag gatgtagagg caggctataa ctacctaaaa    240

gaaaaaggtc atgaggaaat tgcggtgtgc gggctttctc ttggcggggt attctccctg    300

aaaatcgggt acactttacc tgtaaagggt attgtgccaa tgtgcgctcc cgttcgccca    360

aaaacagagg atgcgatgta taaaggcgtt ctagcctatg cccgtgagta caaaaagcgt    420

gaacaaaagt cagatgatgt gatcaatcaa gagatggaag catttaaacc gatgggaacg    480

ctaagtgccc ttggtgagtt aatacaagat gttcacaatc atctcgatca tatttattct    540

ccaacttttg tggttcaggc taggaatgat gagatgattg acgtggaaag tgcaaatatt    600

atccatgatc aaatcgaatc agatgaaaaa tcattaaaat ggtatgagga atcaggccat    660

gttattacat tagataaaga aaaagaacag cttcatgaag atattcttca atttttagaa    720

ggattagact ggactgta                                                  738

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有酯酶活性的蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述基因***pET28a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求5所述重组质粒转化大肠杆菌BL21得到的。

7.一种制备酯酶的方法，是培养权利要求4或6所述的重组菌，得到酯酶。

8.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。

9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4、5或6所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在降解硝基苯酚酯中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：应用权利要求1所述蛋白降解所述硝基苯酚酯时，温度为30-60℃，pH为7.0-10.5；所述硝基苯酚酯为如下任意一种：对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚癸酸酯和对硝基苯酚月桂酸酯。

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