JP5757580B2 - 新規な細胞外分泌型ヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、上記知見に基づいて完成された発明である。
好ましくは、分子量が、SDS−PAGE法で17,000〜21,000である。
好ましくは、二価金属イオンとして、Mg2+またはMn2+を要求する。
好ましくは、ストレプトマイセス属細菌が、Streptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)である。
(1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列、
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、ヌクレアーゼが本発明の第二の態様のヌクレアーゼとして提供される。
好ましくは、分子量が、SDS−PAGE法で約66,500である。
好ましくは、二価金属イオンとして、Mg2+を要求する。
好ましくは、ストレプトマイセス属細菌が、Streptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)である。
(a)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
(c)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列と85%以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、ヌクレアーゼが本発明の第四の態様のヌクレアーゼとして提供される。
好ましくは、前記核酸がDNAである。
本発明のヌクレアーゼは、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼに関する。本発明のヌクレアーゼは、その性質、機能および構造により2つの酵素群に分類される。以下では本発明のヌクレアーゼを「ヌクレアーゼA」および「ヌクレアーゼB」という名称により説明する。
本発明のヌクレアーゼAは、二本鎖DNA、たとえば、スーパーコイル型およびリラックス型などの二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAを基質とするヌクレアーゼに関する。本発明のヌクレアーゼAは、精製後に1mM MgCl2および1mM CaCl2を含む20mM Tris/HCl、pH 8.5において37℃で30分間二本鎖DNAに供した際の比活性がベンゾナーゼ(登録商標)の比活性と同程度またはそれより高いとの特徴を有する。
本発明のヌクレアーゼBは、二本鎖DNA、たとえば、スーパーコイル型およびリラックス型などの二本鎖DNAおよび一本鎖DNAを基質とし、かつ、RNAを実質的に基質としないヌクレアーゼに関する。
本発明の粗酵素は、ヌクレアーゼ活性成分として本発明のヌクレアーゼA、本発明のヌクレアーゼBまたはこれら2種のヌクレアーゼを含む。本発明の粗酵素において、本発明のヌクレアーゼAおよびヌクレアーゼBの存在比は特に制限されず、基質となる核酸の種類や濃度、これらのヌクレアーゼの活性に影響を与える物質の種類や濃度などに応じて適宜選択できる。
本発明の製造方法は、Streptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)を培養して、少なくとも1種の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法である。具体的には、Streptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)を常法にしたがって適当な培地に接種して適切な条件下で培養し、得られた培養物から細胞外分泌型ヌクレアーゼを採取してなる、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法である。細胞外分泌型ヌクレアーゼとして好ましいのは、本発明のヌクレアーゼAおよび/または本発明のヌクレアーゼBである。
本発明の方法は、核酸を含む試料に本発明のヌクレアーゼA、本発明のヌクレアーゼBまたはこれら両方を供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法に関する。
プラスミドDNAに対する核酸分解活性を指標としたスクリーニングにより、培養上清中に核酸分解酵素を分泌高生産する深海由来Streptomyces sp.MBE174(以下、MBE174ともよぶ)を単離した。本菌株が培養上清中に生産する核酸分解酵素は、SDS−PAGEおよびDeoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes(シグマアルドリッチ社製、Cat no.D1626−1G)を基質とした活性染色により、分子量約66.5kDaおよび17〜21kDaの低分子領域に分布を持つ複数個のタンパクであることが分かった。
MBE174の16S rRNA遺伝子配列(1483塩基対)を解析したところ、Streptomyces akiyoshiensis NBRC12434T(AB184095)、S.viridochromogenes NBRC3113T(AB184728)、S.paradoxus NBRC14887T(AB184628)、S.collinus NBRC12759T(AB184123)、S.griseoflavus LMG19344T(AJ781322)に99%一致した。これより、本菌株はストレプトマイセス属細菌であると判断される。種レベルでの同定には更なる分類学的解析を要する。
分子量約17〜21kDaの低分子核酸分解酵素(Nuclease Sと命名、以下NucSと省略する)を、陰イオン交換(SuperQ)、ハイドロキシアパタイト、陽イオン交換(CMセファロース)、ヘパリンアフィニティー(図1を参照)、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。精製の概要を表1に示した。
分子量約66.5kDaの核酸分解酵素(Nuclease Lと命名、以下NucLと省略する)を疎水性(ブチルトヨパールおよびフェニルセファロース)、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドになるまで精製した(図2を参照)。精製の概要を表2に示した。
NucSとNucLの生化学的性質の試験結果を以下に示す。
(1)酵素活性に対するpHの影響
各pHにおける核酸分解活性は、1mM MgCl2、1mM CaCl2を含む20mM 2−モルホリノエタンスルホン酸,一水和物/NaOH(MES,pH5.5〜7.0)、3−モルホリノプロパンスルホン酸/NaOH(MOPS,pH7〜8)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸/NaOH(TAPS,pH8〜9)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸/NaOH(CHES,pH9〜9.5)、またはN−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸/NaOH(CAPS,9.5〜10)中で、Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes 0.4mg/mL(シグマアルドリッチ社製、Cat no.D1626−1G)を基質として、25℃で15分間測定した。NucSはpH 8.5、NucLはpH 8.8付近が最適反応pHであることが分かった(図3および図4を参照)。
1mM MgCl2、1mM CaCl2を含む20mM Tris/HCl、pH8.5中で15分間、各温度条件における核酸分解活性を測定したところ、NucSは55℃、NucLは45℃付近が最適反応温度であることが分かった(図5を参照)。
1mM MgCl2、1mM CaCl2を含む20mM Tris/HCl、pH8.5中で、各温度で30分熱処理後の残存活性を測定した(図6を参照)。氷浴中に保存しておいた酵素の活性を100%とした。その結果、NucSは45℃まで安定であり、NucLは35℃まで安定であった。
NucSおよびNucLについて一価塩の影響を調べた。1mM MgCl2と0〜1000mM NaClを含む10mM Tris/HCl、pH8.5中で、Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes 0.4mg/mL(シグマアルドリッチ社製、Cat no.D1626−1G)を基質として、各NaCl濃度の核酸分解活性を25℃で15分間測定した。NucS活性はNaCl濃度が低い場合に高く、NucLは1000mMまでのNaCl濃度存在条件でも活性を維持することが分かった(図7を参照)。KClを用いた場合にもほぼ同様の結果が得られた(図8を参照)。
NucSおよびNucLについて二価金属塩の影響を調べた。1mM CaCl2と、0〜20mM MgCl2あるいはMnCl2を含む20mM Tris/HCl、pH8.5中に、基質としてDeoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes 0.4mg/mL(シグマアルドリッチ社製、Cat no.D1626−1G)を加えた反応液に、NucSあるいはNucLを添加、氷中で30分間インキュベートした後、核酸分解活性を25℃で15分間測定した。NucS、NucLは活性に二価の金属塩を要求した。NucS、NucLは0.25〜5mM MgCl2存在下で高い活性を示した(図9を参照)。またNucSは1〜2mM MnCl2存在下でMgCl2存在下とほぼ同等の活性を示した(図10を参照)。なお、本試験では酵素安定性を高めるために、すべての反応液に1mM CaCl2を添加した。
NucSおよびNucLについてリン酸塩の影響を調べた。1mM MgCl2、1mM CaCl2を含む0〜40mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.5中で、Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes 0.4mg/mL(シグマアルドリッチ社製、Cat no.D1626−1G)を基質として、核酸分解活性を25℃で15分間測定した。NucSはリン酸塩に強く阻害され、0.5mM以上のリン酸塩により活性を失った。一方、NucLはNucSと比較して、リン酸塩に対して優れた耐性を示し、10mMのリン酸カリウム存在下でも50%の活性を保持することができた。(図11を参照)
氷浴上で表3中の化合物と1時間接触させたのち、標準比活性測定方法で酵素活性を測定した(表3を参照)。表3に示すように、NucSとNucLはZnCl2、CuCl2、EDTAによって強く阻害された。また、NucSはジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドに高い耐性を示し、NucLはSDSに高い耐性を示した。なお、水に難溶の化合物はジメチルスルホキシドに溶解した後、酵素液に添加した。添加後のジメチルスルホキシドの終濃度は5%とし、5% ジメチルスルホキシド存在下での活性を100%とした。
(1)NucSおよびNucLの環状プラスミドDNAに対する分解様式の解析
プラスミド精製キット(HiSpeed(登録商標)Plasmid Midi Kit;キアゲン社製、Cat no.12643)を用いて精製した環状プラスミドDNA(pUC18)を基質として、NucSおよびNucLそれぞれの核酸分解様式を解析した。標準比活性測定方法による、プラスミド溶液(約2〜10μg)に対して、下の表にある異なる酵素量の酵素液をそれぞれ添加して、25℃で15分間核酸分解反応を行なった。分解後の反応液を1%アガロースゲル電気泳動に供し、その分解されたDNAの分解様式を解析した。酵素濃度を変化させて分解したときの様子(25℃の反応)を図12に示した。参考として、ベンゾナーゼ(同ユニット数)を用いた場合の試験結果も合わせて図12に示した。なお、各レーンの説明は表4に示した。
標準比活性測定方法による、NucSおよびNucLの環状DNA(pUC18プラスミド)に対する分解反応初期における反応様式を解析した(図14および図15を参照)。本結果より、NucSはエンド型様式の分解活性を持つと推察される。また、NucLは、Desai and Shankar(Eur. J. Biochem.267,5123-5135,2000を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用される)によって報告例のある一本鎖特異的なエンド型核酸分解酵素に類似した反応パターンを示した。一本鎖特異的核酸分解酵素による環状プラスミドDNAの分解は、一本鎖のエンド型切断の蓄積による低分子化によって進むと考えられている。
標準比活性測定方法による、環状DNA(pUC18プラスミド)を制限ヌクレアーゼBamHI(5’−突出末端を生じる)、SacI(3’−突出末端を生じる)、SmaI(平滑末端を生じる)を用いて直鎖状にした基質を用いて、NucSおよびNucLを用いた分解反応を行なった(図16および図17を参照)。なお、各レーンの説明は表5に示した。
15分間の標準比活性測定方法による、低温で溶解したサケDNA(二本鎖DNA)と95℃、10分間の熱変性後の同DNA(一本鎖DNA)に対する各酵素の反応性を試験した。その結果、NucSは未変性DNAと熱変性DNAを同程度の効率で分解するが、NucLは未変性DNAに比べて熱変性後DNAを、約5倍の高い効率で分解することが分かった。すなわち、NucLは一本鎖DNAに効率良く作用する酵素であると言える。また、RNA(酵母由来mRNA)に対する分解活性を測定した結果、NucSはRNA分解活性を示したが、NucLはRNA分解活性を示さなかった。
ビス(p−ニトロフェニル)リン酸、p−ニトロフェニルリン酸を基質として、Tomoyedaら(Archives of biochemistry and biophysics.131(1),191-202,1969を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用される)の方法に従い、1mM MgCl2、1mM CaCl2および1%グリセロールを含む100mM Tris/HCl、pH8.5中で、0.2%上記基質とする反応液を用いて、両方酵素のホスホジエステラーゼ活性、ホスファターゼ活性を25℃で測定した。その結果、NucSはホスホジエステラーゼおよびホスファターゼ活性をどちらも持たないが、NucLはホスホジエステラーゼおよびホスファターゼの両活性を有することが分かった。
NucSは、市販核酸分解酵素に比べて格段に高い比活性を持ち、低塩濃度条件下で種々の核酸(一本鎖と二本鎖の直鎖および環状DNA、RNA)を効率良くエンド型に分解する。NucLは広い塩濃度条件下でDNA(一本鎖と二本鎖の直鎖および環状DNA)をエンドエキソ型に分解する。したがってNucSおよびNucLを併用することにより、広範な条件において優れた核酸分解活性が期待される。また両酵素は、Mn2+の添加を必要とせず、低濃度(1mM)のMg2+およびCa2+存在下で高い活性を示すこと、また本酵素の生産菌は培養が容易で、安全性が高いと考えられるストレプトマイセス属細菌であることから、食品や医薬品製造時の核酸分解工業用酵素として有望と考えられる。核酸分解酵素高生産放線菌Streptomyces sp. MBE174を培養することによって、また本酵素をコードする新規遺伝子を用いて、核酸分解酵素を安価に提供することが可能であると考えられる。
No.1 NucSのコア配列
ALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQ;
No.2 NucL成熟タンパク
DSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP;
No.3 NucS
MPKLYARRRFAVLAALTGLIASAGLFHGPAASAALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQVKYYYGLSVDTAEKTALTNRLAGC;
No.4 NucL
MASQSVTRLAALTVAATCSAASVVVLGPPAHADSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP;
No.5 nucS遺伝子
ATGCCGAAGCTCTACGCGCGTCGACGGTTCGCCGTCCTCGCCGCGCTCACCGGACTCATAGCCTCCGCCGGGCTCTTCCACGGTCCGGCCGCCTCCGCCGCCCTCCCCACGCCGGTCAGCGCCGCCACCGCCCGCGGCTACCTCGCCTCCCTGAAGGTGGCCCCCGAGAACCGCACCGGCTACAAGCGCGACCTCTTCCCCCACTGGATCACGCAGTCCGGCACCTGCAACACCCGCGAGACCGTCCTCAAACGCGACGGCACCAACGTCGTCACCGACGCCGCCTGCGCCGCCACCAGCGGCAGTTGGTACTCGCCCTTCGACGGGGCCACCTGGACCGCCGCCTCCGACGTCGACATCGACCACCTCGTCCCGCTGGCCGAGGCGTGGGACTCCGGCGCGAGCGCCTGGACCACGGCCCAGCGCCAGGCGTTCGCCAACGACCTGACACGTCCTCAGCTCCTCGCCGTCACCGACACCGTGAACCAGTCCAAGGGCGACAAGGACCCGGCCGAGTGGATGCCGCCCCGGGCCGCCTACCACTGCACCTACGTACGCGCCTGGGTGCAGGTGAAGTACTACTACGGCCTCTCGGTCGACACCGCCGAGAAGACGGCGCTCACGAACCGGCTCGCCGGCTGCTGA;
No.6 nucL遺伝子
TTGGCCAGCCAGTCCGTCACGCGCCTCGCCGCGCTCACCGTCGCCGCCACCTGTTCGGCGGCGTCCGTCGTCGTCCTCGGTCCGCCCGCGCACGCCGACTCCGTGCGCATCCACGACATCCAGGGCACCACCAGGATCTCCCCGTACGCCGGCCGCCAGGTCGCCGACGTGCCCGGCGTCGTCACCGGAGTCCGCGACCACGGCTCCTCCCGGGGCTTCTGGTTCCAGGACCCGCGGCCCGACGACGACCCCGCCACCAGCGAGGGAGTGTTCGTCTTCACCGGCTCGGCCCCCGGGGTCGAGGCCGGCGACGCGGTCACCGTCTCCGGCACGGTCTCGGAGTTCGTGCCCGGCGGGACCGCCTCCGGCAACCAGTCGCTCACCGAGATCACCCGGCCCACGGTCACCGTGGTCTCCCGCGGCAACCCGGTGCCGGACCCGGTCGTCGTCTCGGCCCGCTCCGTGCCGCACGCCTACGCCCCGGCGGGCGACGCCGCCGCGAACGGCTCCGTCAACGCCCTGCCCCTGCGGCCCGACCGCTACGCCCTGGACTACTACGAGTCCCTGGAGGGCATGAACGTCCAGGTGGCCGACGCCCGCGTGGTCGGCGCGACCGACCCGTACACCGAGCTGTGGGTGACGGTGAAGCCCGGCGAGAACGCGAGCCCCCGGGGCGGCACCGTCTACGGCTCCCGCGACGCGCAGAACACCGGGCGGCTGCAGATCCAGACCCTGGGCGTACCAGCCGGCTTCCCCGCCGCCGACGTGGGCGACACCCTCGCGGGCGCCACCACCGGCCCGCTCGACTACAACCAGTTCGGCGGCTACACCCTGGTCGCCCGTAGTCTCGGCACGCTCACCGCCGGCGGGCTCGCCCGCGAGACGACCCGGGAGCAGCACCGCGACGAGCTGTCGGTGGCCACGTACAACGTCGAGAACCTCGACCCCTCCGACGGCACCTTCGCCGCGCACGCGGAGGCGATCGTCCGGAACCTGCGCTCACCGGACATCGTGTCCCTGGAGGAGATCCAGGACGACAACGGCGCCACGGACGACGGCACGGTGACCGCCGGCGTGACGGTGGGCAAGCTGATCGACGCCGTCGTCGCGGCCGGCGGCCCGCGCTACGACTGGCGCTCGGTGGACCCCGTCGACAAGGCGGACGGCGGGCAGCCGGGCGGCAACATCCGCCAGGTGTTCCTCTTCGACCCGCGGCGGGTCTCCTTCGCCGACCGTCCCGGCGGGGACGCGGTCACCGCGACCGGGGTGGTGAAGGTGCGCGGCAAGGCGGCGCTGACCCACTCCCCCGGCCGGGTCGACCCCGCGAACCCCGCCTGGCTGAACAGCCGCAAGCCGCTGGCCGGCGAGTTCTCGTTCCGCGGGCGGACGGTCTTCGTGATCGCCAACCACTTCGCGTCCAAGGGCGGCGACCAGGGGCTGACCTCCCAGTACCAGCCGCCGGCGCGGAGTTCGGAGACCCAGCGCCACCTCCAGGCGACGGCGGTGAACACCTTCGTCAAGCAGATCCTGGCGGTCCAGAAGAACGCGGACGTCATCGCCCTCGGCGACATCAACGACTTCGAGTTCTCCGGCACGACGGAACGCCTGGAGGCCGGCGGCGCGCTCTGGTCGGCGGTCAGGTCGCTGCCGCCGGGCGAGCGCTACTCGTACGTCTACCAGGGCAACAGCCAGGTGCTCGACCAGATCCTGGTGAGCCCGTCGATCCGGCGCGGGCACCTGTCCTACGACAGCGTGCACATCAACGCCGAGTTCCACGACCAGATCAGCGACCACGACCCGCAGGTGCTGCGGTACCGCCCCTGA;
No.7 primer set A F
CGCATG(C/T)C(A/G)AAG(G/T)TCTACG;
No.8 primer set A R
A(A/G)CTGCCGCTGGTGG;
No.9 primer set B F
AGCGGCAG(C/T)TGGTACTC;
No.10 primer set B R
ACCCGCGATCTGGAAGG;
No.11 primer set C F
GCTACAAGCGCGACCTCTTC;
No.12 primer set C R
TGGACTGGTTCACGGTGTC;
No.13 primer set D F
AACTGCCGCTGGTGG;
No.14 primer set D R
CTGAGCAGTATGTCGACGGTC;
No.15 primer set E F
GCTACAAGCGCGACCTCTTC;
No.16 primer set E R
GTTAGAACGCGTAATACGAC;
No.17 primer set F F
CTGGGTGCAGGTGAAGTACTAC;
No.18 primer set F R
GTAATACGACTCACTATAGG;
No.19 primer set G F
GGCTTCTGGAT(A/G/C)CAGGACCC;
No.20 primer set G R
CTGCGGGTCGTGGTCG;
No.21 primer set H R
CGGTGAGCGACTGGTTG;
No.22 primer set H F
CAGTACATGGC(C/T)GAAACCTTGAC;
No.23 primer set I F
CGAGTTCTCGTTCCGCG;
No.24 primer set I R
GTTAGAACGCGTAATACGAC;
No.25 primer set J F
ATCGCCAACCACTTCGC;
No.26 primer set J R
GTAATACGACTCACTATAGG;
No.27 NucSの共通配列
ALPTPVSAATAR。
Claims (12)
- 二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAを基質とし、かつ、精製後に1mM MgCl2および1mM CaCl2を含む20mM Tris/HCl、pH 8.5において37℃で30分間二本鎖DNAに供した際の比活性がベンゾナーゼ(登録商標)の比活性と同程度またはそれより高く、かつ、分子量がゲルろ過クロマトグラフィー法で16,000である、ストレプトマイセス属細菌であるStreptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼ。
- 二価金属イオンとして、Mg2+またはMn2+を要求する、請求項1に記載のヌクレアーゼ。
- (1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列、
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含み;かつ、二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびRNAを基質とし、かつ、精製後に1mM MgCl2および1mM CaCl2を含む20mM Tris/HCl、pH 8.5において37℃で30分間二本鎖DNAに供した際の比活性がベンゾナーゼ(登録商標)の比活性と同程度またはそれより高い、ヌクレアーゼ。 - 二本鎖DNAおよび一本鎖DNAを基質とし、かつ、100mM Na+の存在下での比活性がNa+を添加しない場合の比活性と比べて60%以上であり、かつ、分子量がSDS−PAGE法で66,500である、ストレプトマイセス属細菌であるStreptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼ。
- 二価金属イオンとして、Mg2+を要求する、請求項4に記載のヌクレアーゼ。
- (a)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
(c)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含み;かつ、二本鎖DNAおよび一本鎖DNAを基質とし、かつ、100mM Na+の存在下での比活性がNa+を添加しない場合の比活性と比べて60%以上である、ヌクレアーゼ。 - ヌクレアーゼ活性成分として請求項1〜3のいずれか1項に記載のヌクレアーゼおよび/または請求項4〜6のいずれか1項に記載のヌクレアーゼを含む粗酵素。
- Streptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)を培養して、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法。
- 請求項8に記載の製造方法により得られる、細胞外分泌型ヌクレアーゼまたはその粗酵素。
- Streptomyces sp.MBE174(受託番号:FERM P−21987)。
- 核酸を含む試料に請求項1〜3のいずれか1項に記載のヌクレアーゼおよび/または請求項4〜6のいずれか1項に記載のヌクレアーゼを供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法。
- 前記核酸がDNAである、請求項11に記載の方法。
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