CN104694412B - 一种蜡样芽孢杆菌及其制剂及应用 - Google Patents

一种蜡样芽孢杆菌及其制剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌、其筛选方法、制剂及应用。所述蜡样芽孢杆菌，具有高效土霉素降解能力，按照如下方法筛选：(1)取受土霉素污染的猪粪菌悬液，在含有400μg/ml至500μg/ml的放线菌酮的培养基中培养出细菌单菌落；(2)不断提高培养基中土霉素的浓度，保留能适应的细菌单菌落；(3)将上述细菌单菌落，加入无机盐培养基培养，不断提高土霉素浓度，保藏土霉素降解率不低于50％且OD600不低于0.2的细菌。所述制剂包括质量比例为1：4至1：5的所述芽孢杆菌干粉和有机基质。所述蜡样芽孢杆菌应用于猪粪堆肥，适应性强，土霉素降解率高，环境影响小、成本低，适合大规模应用。

Description

一种蜡样芽孢杆菌及其制剂及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一种蜡样芽孢杆菌、其筛选方法、制剂及应用。
背景技术
抗生素被广泛用于我国畜牧业养殖中，并以其本体或转化形态随着动物粪便和尿液排入环境，并在环境中蓄积，造成环境中抗生素污染。抗生素进入环境后会破坏环境中原有微生物种类平衡，从而导致相应生态***失衡。另外，环境中的土霉素还可以通过生物链进入人体，对人体健康造成威胁。为此，我国科技部启动国家高技术研究发展计划(863计划)，设立“集约养殖外源化学品污染控制技术”重大专项，主要针对集约养殖场造成的抗生素污染从源头上进行处理。土霉素作为目前使用量最大的兽用抗生素，成为科技攻关的核心问题。
近年来，残留抗生素在环境中的降解、转化、迁移、归趋和对动植物、微生物等影响有关的研究很多并呈上升趋势，成为国内外研究热点，但是有关如何削减环境中残留抗生素的研究目前还比较少见。
目前抗生素污染控制技术主要包括物理、化学及生物处理技术。抗生素的物理去除方法主要有活性炭吸附、胶体吸附、絮凝沉淀以及膜过滤等方法。而抗生素的化学去除方法现在以离子法为主。由于抗生素的生物降解相对其他物理、化学方法，具有成本低廉、环境影响较小的独特优势，目前以受到广泛关注，而微生物在其中的作用也得到了重点研究。许晓玲等从长期堆放四环素药渣的土壤中筛选四环素降解菌株两株，分别为缺陷短波单胞菌和人苍白杆菌。它们均可利用四环素作为碳源生长。李丽等通过研究最终找到一种对氯嘧磺隆10mg/L的降解率为94.78％细菌。
土霉素作为使用最为广泛的抗生素，目前其污染控制技术主要为堆肥，相应的土霉素降解率仅为40％左右。因此，迫切需要找到一种堆肥强化手段以提高土霉素降解率。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种土霉素高效降解菌，其目的在于降解土霉素，由此解决普通不加菌堆肥法降解土霉素效率低下的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种能够降解土霉素的蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌0214 Bacillus cereus 0214，于2014年3月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2014061，保藏地中国武汉。
按照本发明的另一方面，提供了一种筛选土霉素高效降解菌的方法，包括以下步骤：
(1)单菌落培养：取受土霉素污染的猪粪制备成菌悬液，将菌悬液加入到基础培养基中，培养出细菌单菌落；所述基础培养基含有400μg/ml至500μg/ml的放线菌酮；
(2)土霉素筛选：将步骤(1)中获得的细菌单菌落，分别加入含土霉素的基础培养基，不断提高基础培养基中土霉素的浓度直至不低于200mg/L，保留能适应所述土霉素浓度的细菌单菌落；
(3)土霉素降解菌筛选：将步骤(2)中获得的细菌单菌落，分别加入无机盐培养基培养，不断提高土霉素浓度直至不低于200mg/L，分时段测定培养基内土霉素含量和OD600，计算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50％且OD600不低于0.2的细菌；
所述无机盐培养基每升含：NaH2PO40.05％～0.1％、K2HPO40.05％～0.1％、(NH4)2SO40.1％～0.2％，pH值在7.0至7.4之间。
按照本发明的另一方面，提供了一种蜡样芽孢杆菌制剂，包括所述的蜡样芽孢杆菌干粉和有机基质，所述芽孢杆菌干粉和有机基质质量比例在1:4至1:5之间。
优选地，所述蜡样芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述有机基质为腐殖酸、玉米粉、淀粉、麸皮中的一种或多种；优选腐殖酸。
按照本发明的另一方面，提供了一种所述蜡样芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌种子液接入发酵罐培养基内培养，接种量为2％-5％,直至形成芽孢不低于90％，获得发酵液；所述发酵罐培养基的配置如下：大豆粉6～7％、玉米粉7～8％、麸皮1％～2％、腐殖酸0.5％～1％、NaH2PO40.05％～0.1％、K2HPO40.05％～0.1％和(NH4)2SO40.1％～0.2％，调pH值为7.0～7.4，高温高压灭菌15-30min。
(b)将步骤(a)中获得的发酵液离心，去除上清液，添加有机基质，获得含蜡样芽孢杆菌的混合物；
(c)将步骤(b)中的混合物在30℃至50℃下干燥，控制其水分在5％至8％之间，粉碎后即获得所述蜡样芽孢杆菌制剂。
优选地，所述蜡样芽孢杆菌制剂的制备方法，其蜡样芽孢杆菌种子液用所述蜡样芽孢杆菌菌种通过多级培养的方式制得。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌应用于土霉素污染的猪粪堆肥。
优选地，本发明提供的蜡样芽孢杆菌应用于土霉素污染的猪粪堆肥，包括以下步骤：
A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在20至25之间，含水率在60％至70％之间，添加如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌或其活性制剂，使得猪粪混有活菌数目不低于106/g；
B、将经步骤A处理的猪粪，在25℃至35℃的条件下堆肥，不少于20天。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明选择土霉素污染猪粪用于土霉素高效降解菌的筛选研究，是基于所筛得菌株为猪粪中土著菌，相比于现有技术从土霉素生产药渣或土壤中筛选菌株而言，对猪粪生长环境具有更强的适应性，能够缩短后续加入猪粪中进行堆肥处理的延迟期，更快的发挥作用，缩短降解土霉素时间，适合大规模应用，这对工程应用具有重要意义；
(2)本发明提供的土霉素高效降解菌的筛选，通过选择抗菌药物种类及用量，控制细菌菌落及真菌菌落生长状况，从而精确选择目标菌种，防止杂菌干扰，选择效率高；
(3)本发明提供的蜡样芽孢杆菌制剂，通过选择适当的有机基质，与蜡样芽孢杆菌合适的配比结合，使得蜡样芽孢杆菌更加易于保藏，适合环境下生长更为迅速，降解效率更高；
(4)本发明利用所述蜡样芽孢杆菌进行堆肥，能有效降解抗生素，相对于其他物理、化学方法，成本低廉，环境影响小。
附图说明
图1是蜡样芽孢杆菌B.cereus0214的形态特征；
图2是实施例8猪粪堆肥实验数据分析图；
图3是实施例9猪粪堆肥实验数据分析图；
图4是实施例10猪粪堆肥实验数据分析图；
图5是实施例11猪粪堆肥实验数据分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为B.cereus0214，于2014年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址中国武汉大学，保藏编号为CCTCCM 2014061。
经鉴定，该菌具有以下特征：
(1)菌落形态：菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落较大，直径为5～7mm，边缘不整齐呈扩展状，表面稍有光泽呈白蜡状，不分泌色素；
(2)细胞形态：革兰氏阳性杆菌，杆状，菌株宽度为1.0～1.2μm，长为3.0～5.0μm，无鞭毛，中生芽孢，孢囊无明显膨大；
(3)16S rRNA鉴定结果：芽孢杆菌属；
(4)生理生化特征：兼性厌氧，酚红葡萄糖肉汤鉴定实验结果为阳性，改良v-p培养基鉴定实验结果为阳性，硝酸盐肉汤鉴定实验结果为阳性，动力-硝酸盐培养基(A法)鉴定实验结果为阳性，木糖-明胶培养基鉴定实验为颜色不变，液化明胶。
本发明提供了一种土霉素高效降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)单菌落培养：
取受土霉素污染的猪粪制备成菌悬液，将菌悬液加入到基础培养基中。待培养基凝固后倒置培养皿于35℃恒温培养箱中培养3天后选取不同形态、菌落清晰的典型菌落培养，培养出细菌单菌落。
所述基础培养基每升含：蛋白胨1.0％～1.2％、牛肉浸膏0.3％～0.5％、氯化钠0.5％～0.6％、琼脂1.5％～2.0％。
其制备方法为：称取蛋白胨10.0～12.0g、牛肉浸膏3.0～5.0g、氯化钠5.0～6.0g、琼脂15.0～20.0g，加热溶解于1L蒸馏水中，调pH值为7.0～7.4，高温高压灭菌15～30min；待培养基冷却至48～50℃后加入经过滤除菌的放线菌酮，使得放线菌酮的浓度为400μg/ml至500μg/ml；所述培养基中所含放线菌酮的作用为抑制真菌生长。培养出细菌单菌落的方法可采用四区划线培养。
(2)土霉素筛选：
将步骤(1)中获得的细菌单菌落，分别加入含土霉素的基础培养基，不断提高基础培养基中土霉素的浓度直至不低于200mg/L，保留能适应所述土霉素浓度的细菌单菌落。
(3)土霉素降解菌筛选：
将步骤(2)中获得的细菌单菌落，分别加入无机盐培养基培养，不断提高土霉素浓度直至200mg/L，分时段测定培养基内土霉素含量和OD600，计算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50％且OD600不低于0.2的细菌；
所述无机盐培养基每升含NaH2PO40.05％～0.1％、K2HPO40.05％～0.1％和(NH4)2SO40.1％～0.2％。
其制备方法如下：每称取0.5～1.0g NaH2PO4，0.5～1gK2HPO4和1.0～2.0g(NH4)2SO4，慢慢加入超纯水，充分溶解后再加超纯水定容至1L，调pH在7.0至7.4之间在高温高压灭菌15～30min；现配现用。
所述无机盐培养基中土霉素浓度不断提高，每次提高50mg/L；摇瓶发酵；采用紫外分光光度法测定土霉素含量和OD600，测量时段分别为：发酵后第1、2、3天。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌制剂，包括所述的蜡样芽孢杆菌干粉和有机基质，所述蜡样芽孢杆菌干粉和有机基质质量比例在1:4～1:5之间。所述有机基质为腐殖酸、玉米粉、淀粉、麸皮中的一种或多种；优选腐殖酸。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将所述蜡样芽孢杆菌种子液接入发酵罐培养基内培养，接种量2％～5％，直至形成芽孢不低于90％，获得发酵液。
所述发酵罐培养基的配置如下：大豆粉6～7％、玉米粉7～8％、麸皮1％～2％、腐殖酸0.5％～1％、NaH2PO40.05％～0.1％、K2HPO40.05％～0.1％、(NH4)2SO40.1％～0.2％，调pH值为7.0～7.4，高温高压灭菌15～30min。
所述蜡样芽孢杆菌种子液用所述蜡样芽孢杆菌菌种通过多级培养的方式制得，具体方式如下：
(Ⅰ)一级种子：将菌种接种于500mL三角瓶中，装液量为150mL，接种量为4～5％，35～37℃，120～180rpm摇床培养12～16h，获得一级种子；
(Ⅱ)二级种子：将一级种子接种于5L三角瓶中，装液量为2L，接种量为3～4％，35～37℃，120～180rpm摇床培养12～16h，获得二级种子；
(Ⅲ)三级种子：将二级种子接种于100L发酵罐中，装液量为40L，接种量为2～3％，35～37℃，120～180rpm摇床培养12～16h，获得三级种子。
所述种子培养基的配置如下：蛋白胨1.0％～1.2％、牛肉浸膏0.3％～0.5％、氯化钠0.5％～0.6％、琼脂1.5％～2.0％麦芽糖0.5％～1％，酵母浸液0.5％～1％，NaH2PO40.05％～0.1％，K2HPO40.05％～0.1％和(NH4)2SO40.1％～0.2％，调pH值为7.0～7.4，高温高压灭菌15～30min。
(b)将步骤(a)中获得的发酵液离心，去除上清液，添加有机基质，获得含蜡样芽孢杆菌的混合物；所述有机基质为腐殖酸、玉米粉、淀粉、麸皮中的一种或多种；优选腐殖酸。
(c)将步骤(b)中的混合物在30℃至50℃，优选40℃下干燥，控制其水分在5％～8％，粉碎即获得所述蜡样芽孢杆菌制剂。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌可应用于土霉素污染的猪粪堆，具体方法如下：
A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在20至25之间，含水率在60％至70％之间，添加所述的蜡样芽孢杆菌或其制剂，使得猪粪中混有活菌数目在不低于106/g。
B、将经步骤A处理的猪粪，在25℃至35℃的条件下堆肥，不少于20天。
优选地，所述步骤A添加本发明提供的蜡样芽孢杆菌制剂。本发明提供的蜡样芽孢杆菌制剂用于猪粪堆肥优势包括：①使用前不需活化，投加方便；②该制剂为固态，性质稳定，方便运输及储存③该制剂活性菌源于猪粪，使用其进行猪粪堆肥时适应期短，能有效减少堆肥时间；④试验表明，该制剂用于猪粪堆肥时对土霉素的降解效果等同甚至优于投加活菌的实验组。
综上，该蜡样芽孢杆菌制剂具有良好的工程应用前景。
以下为实施例：
实施例1
一种土霉素高效降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)单菌落培养：
取受土霉素污染的猪粪制备成菌悬液，将菌悬液加入到基础培养基中。待培养基凝固后倒置培养皿于35℃恒温培养箱中培养3天后选取不同形态、菌落清晰的典型菌落培养，培养出细菌单菌落。
所述基础培养基按照如下方法制备：准确称取蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15g，加热溶解于1L蒸馏水中，调pH值为7.0，高温高压灭菌15min；待培养基冷却至48℃后加入经过滤除菌的放线菌酮，使得放线菌酮的浓度为400μg/ml。培养出细菌单菌落的方法采用四区划线培养。
(2)土霉素筛选：
将步骤(1)中获得的细菌单菌落，分别加入含土霉素的基础培养基，不断提高基础培养基中土霉素的浓度直至200mg/L，保留能适应所述土霉素浓度的细菌单菌落。
(3)土霉素降解菌筛选：
将步骤(2)中获得的细菌单菌落，分别加入无机盐培养基培养，不断提高土霉素浓度直至200mg/L，分时段测定培养基内土霉素含量和OD600，计算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50％且OD600不低于0.2的细菌；
所述无机盐培养基其制备方法如下：准确称取0.5g NaH2PO4，0.5gK2HPO4和1.0g(NH4)2SO4，慢慢加入超纯水，充分溶解后再加超纯水定容至1L，调pH为7.0，高温高压灭菌15min；现配现用。
所述无机盐培养基中土霉素浓度依次为：50mg/L、100mg/L、150mg/L以及200mg/L；摇瓶发酵；采用紫外分光光度法测定土霉素含量和OD600，测量时段分别为：发酵后第1、2、3天。
实施例2
一种土霉素高效降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)单菌落培养：
取受土霉素污染的猪粪制备成菌悬液，将菌悬液加入到基础培养基中。待培养基凝固后倒置培养皿于35℃恒温培养箱中培养3天后选取不同形态、菌落清晰的典型菌落培养，培养出细菌单菌落。
所述基础培养基按照如下方法制备：准确称取蛋白胨12.0g、牛肉浸膏5.0g、氯化钠6.0g、琼脂20g，加热溶解于1L蒸馏水中，调pH值为7.4，高温高压灭菌30min；待培养基冷却至50℃后加入经过滤除菌的放线菌酮，使得放线菌酮的浓度为500μg/ml。培养出细菌单菌落的方法采用四区划线培养。
(2)土霉素筛选：
将步骤(1)中获得的细菌单菌落，分别加入含土霉素的基础培养基，不断提高基础培养基中土霉素的浓度直至250mg/L，保留能适应所述土霉素浓度的细菌单菌落。
(3)土霉素降解菌筛选：
将步骤(2)中获得的细菌单菌落，分别加入无机盐培养基培养，不断提高土霉素浓度直至250mg/L，分时段测定培养基内土霉素含量和OD600，计算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50％且OD600不低于0.2的细菌；所述无机盐培养基其制备方法如下：准确称取1.0g NaH2PO4，1.0gK2HPO4和2.0g(NH4)2SO4，慢慢加入超纯水，充分溶解后再加超纯水定容至1L，调pH在7.4，在高温高压灭菌30min；现配现用。
所述无机盐培养基中土霉素浓度依次为：50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L以及250mg/L；摇瓶发酵；采用紫外分光光度法测定土霉素含量和OD600，测量时段分别为：发酵后第1、2、3天。
实施例3
一种土霉素高效降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)单菌落培养：
取受土霉素污染的猪粪制备成菌悬液，将菌悬液加入到基础培养基中。待培养基凝固后倒置培养皿于35℃恒温培养箱中培养3天后选取不同形态、菌落清晰的典型菌落培养，培养出细菌单菌落。
所述基础培养基按照如下方法制备：准确称取蛋白胨11.0g、牛肉浸膏4.0g、氯化钠5.5g、琼脂17.5g，加热溶解于1L蒸馏水中，调pH值为7.2，高温高压灭菌23min；待培养基冷却至49℃后加入经过滤除菌的放线菌酮，使得放线菌酮的浓度为450μg/ml。培养出细菌单菌落的方法采用四区划线培养。
(2)土霉素筛选：
将步骤(1)中获得的细菌单菌落，分别加入含土霉素的基础培养基，不断提高基础培养基中土霉素的浓度直至300mg/L，保留能适应所述土霉素浓度的细菌单菌落。
(3)土霉素降解菌筛选：
将步骤(2)中获得的细菌单菌落，分别加入无机盐培养基培养，不断提高土霉素浓度直至300mg/L，分时段测定培养基内土霉素含量和OD600，计算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50％且OD600不低于0.2的细菌；
所述无机盐培养基其制备方法如下：准确称取0.75g NaH2PO4，0.75gK2HPO4和1.5g(NH4)2SO4，慢慢加入超纯水，充分溶解后再加超纯水定容至1L，调pH在7.2，在高温高压灭菌23min；现配现用。
所述无机盐培养基中土霉素浓度依次为：50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L以及300mg/L；摇瓶发酵；采用紫外分光光度法测定土霉素含量和OD600，测量时段分别为：发酵后第1、2、3天。
实施例4
对实施例1中筛选得到的细菌，进行鉴定。经鉴定，该菌具有以下特征：
(1)菌落形态：菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落较大，直径为5～7mm，边缘不整齐呈扩展状，表面稍有光泽呈白蜡状，不分泌色素；
(2)细胞形态：革兰氏阳性杆菌，杆状，菌株宽度为1.0～1.2μm，长为3.0～5.0μm，无鞭毛，中生芽孢，孢囊无明显膨大；
(3)16S rRNA鉴定结果：芽孢杆菌属。其核糖体16S亚基的rRNA序列为序列表中的序列1，其比对结果如表1所示。
表1蜡样芽孢杆菌B.cereus0214的16S rRNA基因测序BLAST结果
(4)生理生化特征：兼性厌氧，酚红葡萄糖肉汤鉴定实验结果为阳性，改良v-p培养基鉴定实验结果为阳性，硝酸盐肉汤鉴定实验结果为阳性，动力-硝酸盐培养基(A法)鉴定实验结果为阳性，木糖-明胶培养基鉴定实验为颜色不变，液化明胶。
将实施例1中筛选得到的蜡样芽孢杆菌，命名为B.cereus0214，于2014年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址中国武汉大学，保藏编号为CCTCC M2014061。
实施例5
实施例1中的蜡样芽孢杆菌，其制剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将所述蜡样芽孢杆菌种子液接入发酵罐培养基内培养，接种量2％,直至形成芽孢不低于90％，获得发酵液。
所述发酵罐培养基的配置如下：大豆粉6％、玉米粉7％、麸皮1％、腐殖酸0.5％、NaH2PO40.05％、K2HPO40.05％、(NH4)2SO40.1％，调pH值为7.0，高温高压灭菌15min。
所述蜡样芽孢杆菌种子液用所述蜡样芽孢杆菌菌种通过多级培养的方式制得，具体方式如下：
(Ⅰ)一级种子：将菌种接种于500mL三角瓶中，装液量为150mL，接种量为4％，35℃，120rpm摇床培养12h，获得一级种子；
(Ⅱ)二级种子：将一级种子接种于5L三角瓶中，装液量为2L，接种量为3％，35℃，120rpm摇床培养12h，获得二级种子；
(Ⅲ)三级种子：将二级种子接种于100L发酵罐中，装液量为40L，接种量为2％，35℃，120rpm摇床培养12h，获得三级种子。
所述种子培养基的配置如下：蛋白胨1.0％、牛肉浸膏0.3％、氯化钠0.5％、麦芽糖0.5％，酵母浸液0.5％，，0.05％NaH2PO4，0.05％K2HPO4和0.1％-(NH4)2SO4，调pH值为7.0，高温高压灭菌15min。
(b)将步骤(a)中获得的发酵液离心，去除上清液，添加有机基质，获得含蜡样芽孢杆菌的混合物；所述有机基质为腐殖酸。
(c)将步骤(b)中的混合物在40℃下干燥，控制其水分在5％～8％，粉碎即获得所述蜡样芽孢杆菌制剂。
制得的蜡样芽孢杆菌制剂，包括所述的蜡样芽孢杆菌干粉和腐殖酸。
实施例6
实施例1中的蜡样芽孢杆菌，其制剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将所述蜡样芽孢杆菌种子液接入发酵罐培养基内培养，接种量5％,直至形成芽孢不低于90％，获得发酵液。
所述发酵罐培养基的配置如下：大豆粉7％、玉米粉8％、麸皮2％、腐殖酸1％、NaH2PO40.1％、K2HPO40.1％、(NH4)2SO40.2％，调pH值为7.4，高温高压灭菌30min。
所述蜡样芽孢杆菌种子液用所述蜡样芽孢杆菌菌种通过多级培养的方式制得，具体方式如下：
(Ⅰ)一级种子：将菌种接种于500mL三角瓶中，装液量为150mL，接种量为5％，37℃，180rpm摇床培养16h，获得一级种子；
(Ⅱ)二级种子：将一级种子接种于5L三角瓶中，装液量为2L，接种量为4％，37℃，180rpm摇床培养16h，获得二级种子；
(Ⅲ)三级种子：将二级种子接种于100L发酵罐中，装液量为40L，接种量为3％，37℃，180rpm摇床培养16h，获得三级种子。
所述种子培养基的配置如下：蛋白胨1.2％、牛肉浸膏0.5％、氯化钠0.6％、麦芽糖1％，酵母浸液1％，NaH2PO40.1％，K2HPO40.1％和(NH4)2SO40.2％，调pH值为7.4，高温高压灭菌30min。
(b)将步骤(a)中获得的发酵液离心，去除上清液，添加有机基质，获得含蜡样芽孢杆菌的混合物；所述有机基质为玉米粉。
(c)将步骤(b)中的混合物在30℃下干燥，控制其水分在6.5％，粉碎即获得所述蜡样芽孢杆菌制剂。
制得的蜡样芽孢杆菌制剂，包括所述的蜡样芽孢杆菌干粉和玉米粉，所述蜡样芽孢杆菌干粉和玉米粉质量比例为1:5。
实施例7
实施例1中的蜡样芽孢杆菌，其制剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将所述蜡样芽孢杆菌种子液接入发酵罐培养基内培养，接种量3.5％,直至形成芽孢不低于90％，获得发酵液。
所述发酵罐培养基的配置如下：大豆粉6.5％、玉米粉7.5％、麸皮1.5％、腐殖酸0.75％、NaH2PO40.075％、K2HPO40.075％、(NH4)2SO40.15％，调pH值为7.2，高温高压灭菌23min。
所述蜡样芽孢杆菌种子液用所述蜡样芽孢杆菌菌种通过多级培养的方式制得，具体方式如下：
(Ⅰ)一级种子：将菌种接种于500mL三角瓶中，装液量为150mL，接种量为4.5％，36℃，150rpm摇床培养14h，获得一级种子；
(Ⅱ)二级种子：将一级种子接种于5L三角瓶中，装液量为2L，接种量为3.5％，36℃，150rpm摇床培养14h，获得二级种子；
(Ⅲ)三级种子：将二级种子接种于100L发酵罐中，装液量为40L，接种量为2.5％，36℃，150rpm摇床培养14h，获得三级种子。
所述种子培养基的配置如下：蛋白胨1.1％、牛肉浸膏0.4％、氯化钠0.55％、麦芽糖0.75％，酵母浸液0.75％，琼脂1.75％，NaH2PO40.075％，K2HPO40.075％和(NH4)2SO40.15％，调pH值为7.2，高温高压灭菌23min。
(b)将步骤(a)中获得的发酵液离心，去除上清液，添加有机基质，获得含蜡样芽孢杆菌的混合物；所述有机基质为腐殖酸和淀粉。
(c)将步骤(b)中的混合物在50℃下干燥，控制其水分在6.5％，粉碎即获得所述蜡样芽孢杆菌制剂。
制得的蜡样芽孢杆菌制剂，包括所述的蜡样芽孢杆菌干粉、腐殖酸和淀粉，所述蜡样芽孢杆菌干粉、腐殖酸和淀粉质量比例为1:1.5:3。。
实施例8
实施例5中制得的蜡样芽孢杆菌制剂，应用于猪粪堆肥，具体步骤如下：
A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在20，含水率为60％，添加所述的蜡样芽孢杆菌制剂，使得猪粪中混有活菌数目在不低于106/g。
B、将经步骤A处理的猪粪，在25℃的条件下堆肥，21d。
实施例9
实施例5中制得的蜡样芽孢杆菌制剂，应用于猪粪堆肥，具体步骤如下：
A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在25，含水率为70％，添加所述的蜡样芽孢杆菌制剂，使得猪粪中混有活菌数目在不低于106/g。
B、将经步骤A处理的猪粪，在35℃的条件下堆肥，24d。
实施例10
实施例5中制得的蜡样芽孢杆菌制剂，应用于猪粪堆肥，具体步骤如下：
A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在22.5，含水率为65％，添加所述的蜡样芽孢杆菌制剂，使得猪粪中混有活菌数目在不低于106/g。
B、将经步骤A处理的猪粪，在30℃的条件下堆肥，27d。
实施例11
实施例1中制得的蜡样芽孢杆菌，应用于猪粪堆肥，具体步骤如下：
A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在22.5，含水率为65％，添加所述的蜡样芽孢杆菌，使得猪粪中混有活菌数目在不低于106/g。
B、将经步骤A处理的猪粪，在30℃的条件下堆肥，21d。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种蜡样芽孢杆菌，其特征在于，其命名为B.cereus0214，于2014年3月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2014061。
2.一种蜡样芽孢杆菌制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌干粉和有机基质，所述芽孢杆菌干粉和有机基质质量比例在1：4至1:5之间。
3.如权利要求2所述蜡样芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述有机基质为腐殖酸、玉米粉、淀粉、麸皮中的一种或多种。
4.如权利要求3所述蜡样芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述有机基质为腐殖酸。
5.如权利要求2或3所述的蜡样芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌种子液接入发酵罐培养基内培养，接种量为2％-5％,直至形成芽孢不低于90％，获得发酵液；所述发酵罐培养基的配置如下：大豆粉6～7％、玉米粉7～8％、麸皮1％～2％、腐殖酸0.5％～1％、NaH2PO4 0.05％～0.1％、K2HPO40.05％～0.1％和(NH4)2SO4 0.1％～0.2％，调pH值为7.0～7.4，高温高压灭菌15-30min；
(b)将步骤(a)中获得的发酵液离心，去除上清液，添加有机基质，获得含蜡样芽孢杆菌的混合物；
(c)将步骤(b)中的混合物在30℃至50℃下干燥，控制其水分在5％至8％之间，粉碎后即获得所述蜡样芽孢杆菌制剂。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌种子液用所述蜡样芽孢杆菌菌种通过多级培养的方式制得。
7.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌应用于土霉素污染的猪粪堆肥。
8.如权利要求7所述的蜡样芽孢杆菌应用于土霉素污染的猪粪堆肥，其特征在于，包括以下步骤：
A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在20至25之间，含水率在60％至70％之间，添加如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌或其活性制剂，使得猪粪混有活菌数目不低于106/g；
B、将经步骤A处理的猪粪，在25℃至35℃的条件下堆肥，不少于20天。
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