CN107354112B - 一株噻虫醛降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株噻虫醛降解菌及其应用，所述降解菌鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，属于革兰氏阳性菌类，其已于2017年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.14200，能以噻虫醛为唯一碳源和能源进行生长，48 h内对300 mg/L噻虫醛的降解率达到90%以上，可以应用于治理噻虫醛残留的废水污水或污染的土壤修复。

Description

一株噻虫醛降解菌及其应用
技术领域
本发明属于生物降解菌技术领域，具体涉及一种噻虫醛降解菌及其应用。
背景技术
我国是农药生产和使用大国，每年农药使用量约80万吨，居世界第一位，农药生产总量从1990年起一直名列世界第二位，仅次于美国。目前，我国农药产品结构仍以杀虫剂为主，具有超高效、作用机制独特、杀虫谱广、对环境相容性好等众多优点的杂环类杀虫剂已成为杀虫剂研制和开发的新重点，杀虫剂的生产量占农药总产量70%左右。由于其出色的防治效果，成为代替高毒高残留农药防治害虫的新选择和重要手段。为了增产和防止病虫害，农药长期以来在我国扮演着重要的角色，然而它的普及使用，对我们生活的环境，特别是对土壤造成了难以估量的影响，某些地区由于滥用或过多使用农药，已经造成了土壤肥力下降，失去耕种这一基本正常功能。土壤对农药的吸附-解析作用，会严重影响农药在土壤中的迁移、转化等活动。
噻虫醛有着胃毒、触杀、内吸性等特性，对很多害虫尤其对刺吸式口器害虫有效，已被广泛应用于防治水稻、果树、棉花、茶叶、草皮和观赏植物等作物上的半翅目、鞘翅目和某些鳞翅目等害虫。其在水体环境中残留时间长，代谢途径复杂，对农产品及环境的安全性问题仍不容忽视。
微生物具有繁殖迅速、变异快和代谢途径多样等特点，微生物修复被认为是污染物修复的有效手段。已在很多方面得到应用，所以筛选出噻虫醛降解菌对于处理噻虫醛残留的废水和土壤具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种噻虫醛降解菌及其应用，使用本菌剂可以使噻虫醛降解率达90%以上，生产和使用成本较低。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种噻虫醛降解菌，其菌株NZJ-37是一株革兰氏阳性菌类，主要生物学特性为菌体椭圆到柱状，边缘光滑、污白色或微黄色、直径1-2 mm。其已于2017年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.14200，经鉴定是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，能以噻虫醛为唯一碳源、氮源进行生长，并将其矿化释放出氨氮。
包含所述枯草芽孢杆菌NZJ-37的菌剂。
所述枯草芽孢杆菌NZJ-37生产菌剂的方法，具体步骤为：
1） 将噻虫醛降解菌枯草芽孢杆菌NZJ-37的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期，LB培养基配方为：NaCl 10.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，pH 7.0；
2） 将步骤1）培养好的菌种按10％的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH4）2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。
3） 将步骤2）所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。
步骤2）所述种子罐和步骤3）所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240 r/min，培养温度为30-35℃，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60 h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，或者制成固体吸附剂。
所述噻虫醛降解菌或者菌剂在降解噻虫醛中的应用。
所述噻虫醛降解菌或者菌剂在修复有噻虫醛残留的废水或土壤中的应用。将噻虫醛降解菌或者菌剂直接加入到含有噻虫醛残留的废水或土壤中，该菌株能以噻虫醛为唯一碳源、氮源进行生长，并将其矿化释放出氨氮，达到降解噻虫醛的目的。
有益效果：
本发明提供的枯草芽孢杆菌NZJ-37对噻虫醛的降解率达90%以上，大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。本发明对于保护生态环境，降低废水处理的成本具有重要的意义。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点。降解菌NZJ-37可以在以噻虫醛为唯一碳源的培养基上生长；按1%的接种量于含噻虫醛的无机盐培养基中接入降解菌NZJ-37，于30℃、pH 7.0条件下，振荡培养48 h后能使废水中一定浓度的噻虫醛降解率达90%以上，具有很好的降解效果。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌NZJ-37的菌落形态图；
图2枯草芽孢杆菌NZJ-37的摇瓶降解图。
具体实施方式
实施例1 菌株的分离和鉴定
将噻虫醛污染的土壤样品制成混悬液，取10mL加入到100mL噻虫醛终浓度300 mg/L的基础盐培养基中，在30℃、160r/min条件下进行富集培养。以10%的接种量转入到新的噻虫醛无机盐培养基中，经过4次连续转接，获得富集液。取富集液1.0 mL配成10-1的富集液，再吸取1.0 ml配好的10-1的富集液加入9.0 ml无菌水中，充分混匀配成10-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1 ml涂布于含噻虫醛浓度为300 mg/L无机盐固体培养基(配方为：每升含1.50 g K2HPO4、0.50 g KH2PO4、0.20 g MgSO4·7H2O、1.00 g NaCl、1.00 g (NH4)2SO4，20.00 g 琼脂， pH 7.0)上，30℃培养7天。从中挑取单菌落验证其降解效果，将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。菌落图如图1所示，鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。主要生物学特性为菌体椭圆到柱状，边缘光滑、污白色或微黄色、直径1-2 mm。
实施例2枯草芽孢杆菌NZJ-37的摇瓶降解实验
在含300 mg/L的噻虫醛无机盐培养基中，其配方为：每升含1.50 g K2HPO4、0.50gKH2PO4、0.20g MgSO4·7H2O、1.00g NaCl、1.00g (NH4)2SO4，pH 7.0，按1%的接种量接种NZJ-37，于30℃振荡培养，隔6 h取样测定。由图2可以看出，48 h内噻虫醛被降解达90%以上。
实施例3 含有枯草芽孢杆菌NZJ-37菌剂的制备
将实施例1筛选和分离的枯草芽孢杆菌NZJ-37的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，LB培养基配方为：酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl 10.00g/L，pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH4）2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl 0.01%， CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 1.2，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例4土壤修复试验
将 300 mg/L噻虫醛水溶液均匀喷洒在300g灭菌试验土壤上，取30 mL菌剂接种于该试验土壤中混匀，加无菌水调节土壤含水量，将试验土壤置于30℃条件下培养，同时以不接菌的为空白对照，每隔6 h取样测定噻虫醛残留量，施用菌剂48 h后噻虫醛降解率达到90%以上。

Claims (7)

1.一株噻虫醛降解菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NZJ-37，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.14200。
2.权利要求1所述噻虫醛降解菌在降解噻虫醛中的应用。
3.权利要求1所述噻虫醛降解菌在修复有噻虫醛残留的废水或土壤中的应用。
4.包含权利要求1所述的一种噻虫醛降解菌的菌剂。
5.权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）：将噻虫醛降解菌的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；
步骤2）：将步骤1）培养好的菌种按10%的接种量接种入500 L种子罐，培养至对数生长期，
步骤3）：将步骤2）种子罐培养得到的种子液按10%的接种量接入生产罐培养；
种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为48-60 h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述LB培养基配方为：NaCl 10.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，pH 7.0。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述种子罐和生产罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH4）2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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CB02 Change of applicant information

Address after: 211132 No. 16, ancient spring road, Tangshan street, Jiangning District, Nanjing, Jiangsu

Applicant after: JIANGSU NANZI ENVIRONMENTAL PROTECTION SCIENCE & TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 211132 No. 16, ancient spring road, Tangshan street, Jiangning District, Nanjing, Jiangsu

Applicant before: JIANGSU NANZI ENVIRONMENTAL PROTECTION CO.,LTD.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
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CP03 Change of name, title or address

Address after: No. 16 Guquan Road, Tangshan Street, Jiangning District, Nanjing City, Jiangsu Province, 211100

Patentee after: Zhongzhi (Jiangsu) Environmental Construction Co.,Ltd.

Address before: 211132 No. 16, ancient spring road, Tangshan street, Jiangning District, Nanjing, Jiangsu

Patentee before: JIANGSU NANZI ENVIRONMENTAL PROTECTION SCIENCE & TECHNOLOGY Co.,Ltd.

CP03 Change of name, title or address