CN104673915A - 基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、上游引物、下游引物、突变型分子信标、野生型分子信标、MgCl2、PCR缓冲液和细胞裂解液。本发明提供一种监测效率高、方便临床用药的快速诊断的基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其检测方法。

Description

基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其方法。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指由于转换、颠换、***、缺失等原因，使不同个体在基因组DNA某特定核苷酸位置上存在不同种类碱基的多态性。SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。位于编码区内的SNP(coding SNP，cSNP)比较少，但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。可通过研究SNP的性状，判定疾病的类型。
研究发现，SNP与许多疾病相关，决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。SNP对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。通过研究SNP图谱，可以更深刻地认识癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等发病率高的多基因疾病的发生机制。
分子信标(molecular beacon)是一种在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对， 因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在这种结构下，荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，所以不会产生荧光。在高温变性或之后的退火杂交过程中，这种结构被破坏，导致荧光基团远离淬灭基团，荧光便能被激发和探测到。
目前检测SNP的方法主要有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态(SSCP)、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)杂交、基因芯片、探针法、焦磷酸法、直接测序法等。这些技术检测的样本都要求提取纯化的DNA作为模板，而不能直接加入细胞进行反应，提取纯化的DNA，增加了抽取血液和提取血液DNA的步骤。从抽血到提取纯化DNA至少需要4个小时；并且限制性片段长度多态性、单链构象多态、等位基因特异的寡核苷酸杂交、基因芯片、焦磷酸法、直接测序法等技术操作时需要多个步骤，操作复杂，耗时耗力，检测周期至少需要一周时间。
目前用于临床检测SNP的方法多用探针法，利用分子信标标记提取纯化的DNA，检测SNP的性状，从而判定疾病的类型，但是，提取纯化的DNA作为模板，检测一次最快也要8个小时，检测的效率低，难以满足指导临床用药的快速诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种监测效率高、方便临床用药的快速诊断基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案:基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、上游引物、下游引物、突变型分子信标、野生型分子信标、MgCl2、PCR缓冲液和细胞裂解液。
采用本发明技术方案的基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，本PCR混合液中的PCR缓冲液有助于酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合的 催化反应条件；
dNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写，dNTPs则是由四种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)以相同的比例混合而成，是DNA复制的原料；
MgCl2的作用是提供Mg2+与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别；
DNA聚合酶，以DNA为复制模板，从DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
上游引物、下游引物作为DNA复制的起始点，由于在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上，无法指定起始点，因此，在核酸合成反应时，上游引物、下游引物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用。
细胞裂解液的作用是溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质对PCR反应的影响。因此，由于上述PCR反应混合液中含有细胞裂解液，所以加入口腔细胞作为模板就可实现对基因型的检测。上游引物和下游引物是在基因检测位点两端设计的特异性引物，突变型分子信标特意地与突变序列结合，而野生型分子信标与正常的基因特异结合。
本发明的检测原理为：在基因突变位点两侧保守区域设计一对引物，并在突变位点序列处设计两个分子信标，突变型分子信标、野生型分子信标，野生型分子信标与未突变序列结合，突变型分子信标与突变位点序列结合。两个分子信标分别用不同颜色的荧光基团标记，利用碱基互补配对的原则，在PCR退火阶段，野生型分子信标与未突变的序列结合，而突变型分子信标与有突变位点的序列结合，在结合后，荧光基团远离淬灭基团，此时发出的荧光被实时荧光定量检测仪记录下来，通过荧光值增长曲线来判断所检测基因的基因型。此方法也可以多加几对引物和探针对多个SNP位点同时进行检 测。试剂盒中的PCR反应混合物中包括有细胞裂解液，通常，PCR反应都是以细胞中提取纯化的DNA作为模板，如果直接加入细胞提供模板，则在PCR过程中细胞裂解不彻底，并且细胞裂解之后的细胞碎片以及一些蛋白酶会对PCR反应造成阻碍，容易造成实验失败。而发明人在通过多次试验，把细胞裂解液的成分以一定的比例混合加在PCR反应混合液中，实现了直接以口腔细胞为模板进行PCR反应，从而可在PCR反应的过程中省略提纯DNA的步骤，且避免污染样品，从而节约时间。细胞裂解液的作用是溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质对PCR反应的影响，因此，在检测时，可直接取得口腔细胞作为模板进行检测，细胞裂解液将口腔细胞的细胞膜和细胞质溶解后，分解蛋白酶并破坏化学键，得到所需DNA，这个过程仅需要约1h，可快速检测出结果进行分析，进而为临床的快速诊断带来依据，减小患者疾病治疗风险。
进一步，所述的细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，十二烷基硫酸钠是一种能够使蛋白质变性的强阴离子去污剂。在细胞和分子生物学领域，十二烷基硫酸钠，简称SDS，经常被用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸与蛋白复合物，在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。聚乙二醇辛基苯基醚简称Triton X-100，被用于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中还用作限制性内切酶的缓冲液的成分之一，实验过程中，发明人发现通过SDS和Triton X-100混合组成，可快速解决溶解样品的问题。
进一步，所述的PCR缓冲液为5x Colorless Reaction Buffer。5x Reaction Buffer称为5x无色反应缓冲液。
进一步，PCR反应混合液原料的终浓度为：
DNA聚合酶0.04-0.1U/ul  dNTPs 0.1-0.5mM
上游引物  0.2-0.5uM
下游引物  0.2-0.5uM
突变型分子信标  0.2-0.5uM
野生型分子信标  0.2-0.5uM
5x Colorless Reaction Buffer  0.5-1.5x 
MgCl2  1-2.5mM
细胞裂解液的原料终浓度为：
十二烷基硫酸钠  0.005-0.015％w/v
聚乙二醇辛基苯基醚  0.001-0.03％w/v。
由实验可知PCR反应混合液的原料为上述范围时，均可完成检测，且检测结果准确。
进一步，所述的PCR反应混合液原料的终浓度为：
DNA聚合酶0.08U/ul  dNTPs  0.3mM
上游引物  0.4uM
下游引物  0.4uM
突变型分子信标  0.4uM
野生型分子信标  0.3uM
5x Colorless Reaction Buffer  1x
MgCl2  2mM
细胞裂解液的原料终浓度为：
十二烷基硫酸钠  0.005％w/v
聚乙二醇辛基苯基醚  0.01％w/v。由实验可知，PCR反应混合液的终浓度为上述值时，检测结果最准确。
进一步，所述的试剂盒的分装量为10-50ul。根据需要，10-50ul均能检测处结果，且操作时，仅需要拿取一个分装量为10-50ul的试剂盒即可完成检测，无需再次分取，操作简单、方便、快捷。
基因单核苷酸多态性位点快速检测方法，检测步骤包括：
第一步：取样 
A：患者先用温水漱口2-3次，去除口腔内的食物残渣；
B：打开装有检测试剂的试剂盒，取出装有试剂的试剂管；
C：用取样装置伸入患者口腔內颊处前、后或者上、下刮取3-4次，取得样品；
D：将取得的细胞样本放入试剂管中；
待试剂冻融完全之后，弹试剂管，细胞样品在试剂中混合均匀；
去除气泡； 
第二步：反应 
将样品处理后的试剂管放入PCR仪器进行反应；
第三步：分析结果
得到扩增曲线和荧光颜色分析结果。
进一步，所述第二步的反应步骤为：
a、95℃预变性5min；
b、95℃变性5s；
c、56℃退火30s；
且a、b、c步骤反应50个循环；
在反应过程中的光学条件为：荧光PCR至少为双通道，且双通道的激发光波长分别为450-500nm和550-600nm之间。
进一步，所述的第一步D步骤中的取样装置为牙签。牙签方便易得，且操作方便。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明：
图1是本发明实施例二的荧光检测结果；
图2是本发明实施例二的检测结果一；
图3是本发明实施例二的检测结果二；
图4是本发明实施例二的检测结果三；
图5是本发明实施例一的检测结果一；
图6是本发明实施例一的检测结果二；
图7是本发明实施例一的检测结果三；
图8是本发明实施例四的检测结果一；
图9是本发明实施例四的检测结果二；
图10是本发明实施例四的检测结果三；
图11是本发明实施例七的检测结果一；
图12是本发明实施例七的检测结果二；
图13是本发明实施例七的检测结果三。
具体实施方式
本发明CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒及其检测方法包括以下步骤：
按照23ul的反应体系配制50支试剂，以下所指的终浓度是指各组分在23ul体系中的浓度，ul/支是指各个组分在试剂管中的含量。
以下实验操作均在生物安全柜中进行，保证无污染。
实施例一至实施例六均为CYP2C19*2基因型的检测；
CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，在肝脏中大量表达，参与多种药物的代谢。由于CYP2C19基因具有单核苷酸多态性，因此CYP2C19酶活性存在显著的个体差异和种族差异。其最常见的两种突变是CYP2C19*2和CYP2C19*3，它们都属与非同义突变，所以能直接影响该酶对药物的代谢能力。CYP2C19*2(681G>A，rs244285)变异，导致翻译过程中产生一个异常的剪接位点从而产生一个截短的无功能的蛋白质。在药物代谢过程中，该突变会使一些药物的血药浓度升高，如抗凝血药物氯吡格雷、抗抗癫痫药物苯妥英钠等，使患者出现不良的药物反应。
CYP2C19*2突变基因型有纯合子A/A和杂合子G/A两种，其野生型基因型为G/G。纯合子A/A患者对药物的代谢类型属于慢代谢型，杂合子G/A患者对药物的代谢类型属于中等代谢型，而野生型G/G患者对药物的代谢属于正常代谢型。通过确定患者的基因型，就可以判定患者的药物代谢类型，从而帮助医生正确选择合适的药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，降低毒副作用。
一、细胞裂解液的配制：配置1000ul的细胞裂解液试剂，试剂原料及其终浓度如表1所示，十二烷基硫酸钠(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)购自上海普洛麦格生物制品有限公司，初始浓度分别为0.1g/ml、1.0655g/ml。
表1
表1中四个实施例细胞裂解液配方均为在PCR反应体系中的最终浓度，由于此浓度非常小，配制少量此浓度的裂解液加样时误差会增大，所以为了配制的裂解液的浓度准确，采用对上述四个实施例中的十二烷基硫酸钠(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的浓度扩大，在加样时，将其扩大的浓度加一定体积量，使其满足上述终浓度的要求，如果定义上述四个实施例中的最终浓度为1倍(1x)，则将浓度扩大为200倍(200x)，细胞裂解液在加入PCR反应体系时稀释200倍，使其终浓度为1倍即可。
二、PCR反应混合液的配制：使用移液器进行PCR反应混合液的配制，DNA聚合酶采用GoTaq DNA Polymerase。
PCR反应混合液的原料及其终浓度如表2所示：
表2
以下为以上述表1和表2中实施例举例具体说明本发明。
实施例二、 
一、配置细胞裂解液：
使用1.5ml的离心管，加入100ulSDS和18.78ulTriton X-100，再加入881.22ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到1％，使Triton X-100的终浓度达到2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
以上述表1和表2中实施例二的终浓度为例说明本发明，其中，dNTPs、MgCl2、5x Colorless Reaction Buffer、DNA聚合酶采用GoTaq DNA Polymerase均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。
二、配制23ul的PCR反应混合液：各原料加入量如表3所示：
表3
按表3中每支试剂盒中的加入量加入各原料制成PCR反应混合液。 
其中：CYP2C19*2上游引物、CYP2C19*2下游引物、CYP2C19*2突变型分子信标和CYP2C19*2野生型分子信标序列均由Primer 5.0软件设计，野生型分子信标的5’端用6-FAM荧光素标记，3’端用BHQ1淬灭基团标记；而突变型分子信标5’端用Alexa Fluor 594荧光素标记，3’端用BHQ2淬灭基团标记，上游引物、下游引物、突变型分子信标和野生型分子信标均由上海英骏生物技术有限公司合成。
上游引物和下游引物的序列为：
上游引物(5’-3’)：TGCAATAATTTTCCCACTATCATTG；
下游引物(5’-3’)：CCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCA。
突变型和野生型分子信标序列分别为：
突变型分子信标(5’-3’)：
CGGACCTTTCCCGGGAACCCATAACGGTCCG；
野生型分子信标(5’-3’)：
CGGACCTCCCAGGAACCCATAACAAATGGTCCG。
一、CYP2C19*2基因型检测试剂盒的制作；
将配制好的PCR反应混合液分装在试剂管中，每支试剂管分装23ul，分装完之后在-20℃避光保存；
CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒由分装好的装有试剂的试剂管组成，每个试剂盒中装有16支试剂，每个患者检测需要1支。
四、CYP2C19*2基因型快速检测步骤为：
(1)取样
第一步：患者先用温水漱口2-3次，去除口腔内的食物残渣；
第二步：打开装有检测试剂的试剂盒，取出试剂管；
第三步：用牙签伸入患者口腔內颊处前、后或者上、下刮取3-4次，取得口腔细胞样品，取完样品之后，拔掉试剂管的塞子，将取过样品的牙签带有样品的一端***试剂管中，在试剂冻融之前完成取样过程；
第四步：待试剂完全冻融之后，轻弹试剂管，使得刮取的口腔细胞在试剂中混合均匀，试剂管中如有气泡，用手指轻弹，使气泡破裂或者漂浮在试剂上层。
(2)反应：
1、将试剂管放入OM-1000型荧光PCR仪器(专利授权公告号：CN103820306B)进行反应，采用两步法，温度程序是：
2、标记取样日期、患者姓名、性别和年龄等信息；
3、一个小时后，观察结果，结果共有三种，分别是“GG”、“GA”或“AA”，其中阴性结果是“GG”，阳性结果是“GA”和“AA”。如图1、图2和图3所示，图中G线表示CYP2C19*2未突变基因扩增情况，A线表示CYP2C19*2突变基因扩增情况；
(3)结果分析：
分析时，在一个反应体系中加入细胞裂解液，在另一个反应体系中未加细胞裂解液进行分析对比，分析结果如图1所示，由图1可见：通过本发明检测分析得到的荧光值发现，反应体系中加了细胞裂解液的荧光值要比没有加细胞裂解液的荧光值高65.67％，因此，细胞裂解液试剂有助于反应效率和荧光值的提高。
图2、图3和图4均为加有细胞裂解液的反应体系得到的结果。
由图2可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；
由图3可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；
由图4可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；
由此，可从图2、图3和图4中分析得出CYP2C19*2的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。
实施例一、 
与实施例二的区别在于细胞裂解液、PCR反应混合液配置，具体操作如下：
一、配置细胞裂解液：
使用1.5ml的离心管，加入10ul SDS和1.88ul Triton X-100，再加入988.12ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到0.1％，使Triton X-100的终浓度达到2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
以上述表1和表2中实施例一的终浓度为例说明本发明，其中，dNTPs、 MgCl2、5x Colorless Reaction Buffer、DNA聚合酶采用GoTaq DNA Polymerase均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。
二、配制23ul的PCR反应混合液：加入量如表4所示：
表4
按表4中每支试剂盒中的加入量加入各原料制成PCR反应混合液。 
其中：CYP2C19*2上游引物、CYP2C19*2下游引物、CYP2C19*2突变型分子信标和CYP2C19*2野生型分子信标序列均由Primer 5.0软件设计，野生型分子信标的5’端用6-FAM荧光素标记，3’端用BHQ1淬灭基团标记；而突变型分子信标5’端用Alexa Fluor 594荧光素标记，3’端用BHQ2淬灭基团标记，上游引物、下游引物、突变型分子信标和野生型分子信标均由上海英骏生物技术有限公司合成。
上游引物和下游引物的序列为：
上游引物(5’-3’)：TGCAATAATTTTCCCACTATCATTG；
下游引物(5’-3’)：CCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCA。
突变型和野生型分子信标序列分别为：
突变型分子信标(5’-3’)：
CGGACCTTTCCCGGGAACCCATAACGGTCCG；
野生型分子信标(5’-3’)：
CGGACCTCCCAGGAACCCATAACAAATGGTCCG。
其余CYP2C19*2基因型检测试剂盒的制作、CYP2C19*2基因型快速检测步骤中的取样、反应均与实施例二相同。
实施例一的CYP2C19*2基因型快速检测步骤(3)结果分析如下：
由图5可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；
由图6可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；
由图7可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；
由此，可从图5、图6和图7中分析得出CYP2C19*2的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。实施例四、
与实施例二的区别在于细胞裂解液、PCR反应混合液配置，具体操作如下：
一、配置细胞裂解液：
使用1.5ml的离心管，加入300ul SDS和56.34ulTriton X-100，再加入643.66ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到3％，使Triton X-100的终浓度达到6％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
以上述表1和表2中实施例四的终浓度为例说明本发明，其中，dNTPs、 MgCl2、5x Colorless Reaction Buffer、DNA聚合酶采用GoTaq DNA Polymerase均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。
二、配制23ul的PCR反应混合液：加入量如表5所示：
表5
组分 终浓度 ul/支
无核酸酶的水 - 11.53
Promega Colourless Buffer 1x 6.9
dNTPs 0.3mM 1.15
MgCl2 2.0mM 2.3
200x细胞裂解液 1x 0.12
CYP2C19*2上游引物 0.4uM 0.15
CYP2C19*2下游引物 0.4uM 0.17
野生型分子信标 0.4uM 0.1
突变型分析信标 0.3uM 0.14
GoTaq DNA Polymerase 0.08U/ul 0.46
按表5中每支试剂盒中的加入量加入各原料制成PCR反应混合液。 
其中：CYP2C19*2上游引物、CYP2C19*2下游引物、CYP2C19*2突变型分子信标和CYP2C19*2野生型分子信标序列均由Primer 5.0软件设计，野生型分子信标的5’端用6-FAM荧光素标记，3’端用BHQ1淬灭基团标记；而突变型分子信标5’端用Alexa Fluor 594荧光素标记，3’端用BHQ2淬灭基团标记，上游引物、下游引物、突变型分子信标和野生型分子信标均由上海英骏生物技术有限公司合成。
上游引物和下游引物的序列为：
上游引物(5’-3’)：TGCAATAATTTTCCCACTATCATTG；
下游引物(5’-3’)：CCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCA。
突变型和野生型分子信标序列分别为：
突变型分子信标(5’-3’)：
CGGACCTTTCCCGGGAACCCATAACGGTCCG；
野生型分子信标(5’-3’)：
CGGACCTCCCAGGAACCCATAACAAATGGTCCG。
其余CYP2C19*2基因型检测试剂盒的制作、CYP2C19*2基因型快速检测步骤中的取样、反应均与实施例二相同。
实施例四的CYP2C19*2基因型快速检测步骤(3)结果分析如下：
由图8可知：只有G线有指数增长，而A线没有指数增长，因此检测结果是野生型GG，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；
由图9可知：G线和A线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型GA，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；
由图10可知：只有A线有指数增长，而G线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型AA，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致药物活性成分血药浓度降低；
由此，可从图8、图9和图10中分析得出CYP2C19*2的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。
实施例五： 
以上述表1和表2中的实施例二中原料的终浓度为例，配制10ul的PCR反应混合液，各原料加入量如表6所示：
10ul PCR反应混合液的配制表6
实施例六： 
以上述表1和表2中的实施例二中原料的终浓度为例，配制50ul的PCR反应混合液，各原料加入量如表7所示：
50ul PCR反应混合液的配制表7
实施例七为ABCB1基因型的检测。
实施例七： 
氯吡格雷和阿司匹林双联抗血小板治疗是急性冠脉综合症(Acute coronary syndrome，ACS)和经皮冠状动脉介入术(Percutaneous coronary intervention，PCI)后防治血栓性事件发生的基础。但是不同个体对氯吡格雷的反应是多样的，即使应用标准剂量的氯吡格雷，部分患者仍会发生心血管事件，称为氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)。氯吡格雷在体内需要经过肠道的吸收和肝脏的代谢才能发挥其抗血小板作用。在肠道上皮细胞内存在的P-gp，可以直接影响氯吡格雷从消化道进入血液，从而影响氯吡格雷的抗血小板作用。P-gp是由ABCB1(ATP-binding cassette subfamily B member1)基因编码的，其cDNA全长4660bp，包含28个外显子，转录可得到4.5kb的mRNA。ABCB1编码的P-gp的功能在不同个体间存在差异，研究发现这是由于ABCB1基因rs1045642(C3435T)位点多态性导致的结果。ABCB1C3435T位点突变基因型有纯合子T/T和杂合子C/T两种，其野生型基因型为C/C。研究发现，携带T等位基因的患者肠道对氯吡格雷的吸收能力降低，导致血药浓度和活性代谢产物减少，严重影响了治疗效果。因此对于服用氯吡格雷的患者有必要了解其ABCB1基因C3435T位点基因型，对于C3435T位点突变的患者选用其它的药物或者调节剂量，降低患者疾病治疗的风险，并使治疗效果达到最佳状态。
以下为通过本发明对ABCB1基因C3435T位点的检测。 
一、配置细胞裂解液：
使用1.5ml的离心管，加入100ulSDS和18.78ulTriton X-100，再加入881.22ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使SDS的终浓度达到1％，使Triton X-100的终浓度达到2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。
以上述表1和表2中实施例二的终浓度为例说明本发明，其中，dNTPs、MgCl2、5x Colorless Reaction Buffer、DNA聚合酶采用GoTaq DNA Polymerase均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。
二、配制23ul的PCR反应混合液：各原料加入量如表8所示：
表8
按表8中每支试剂盒中的加入量加入各原料制成PCR反应混合液。 
其中：其中：ABCB1上游引物、ABCB1下游引物、ABCB1突变型分子信标和ABCB1野生型分子信标序列均由Primer 5.0软件设计，野生型分子信标的5’端用6-FAM荧光素标记，3’端用BHQ1淬灭基团标记；而突变型分子信标5’端用Alexa Fluor 594荧光素标记，3’端用BHQ2淬灭基团标记，上游引物、下游引物、突变型分子信标和野生型分子信标均由上海英骏生物技术有限公司合成。
上游引物和下游引物的序列分别为：
上游引物(5’-3’)：
GAACATTGCCTATGGAGACA；
下游引物(5’-3’)：
CCAGGCTGTTTATTTGAAGA；
野生型分子信标和突变型分子信标的序列分别为：
突变型分析信标(5’-3’)：
CGGGACCTGCCCTCACGATCTCTTCGTCCCG；
野生型分子信标(5’-3’)：
CGTGCAGCTGCCCTCACAATCTCTTTGCACG。
一、ABCB1基因型检测试剂盒的制作；
将配制好的PCR反应混合液分装在试剂管中，每支试剂管分装23ul，分装完之后在-20℃避光保存；
ABCB1基因型快速检测试剂盒由分装好的试剂管组成，每个试剂盒中装有16支试剂，每个患者检测需要1支。
四、ABCB1基因型快速检测步骤为：
(1)取样
第一步：患者先用温水漱口2-3次，去除口腔内的食物残渣；
第二步：打开装有检测试剂的试剂盒，取出试剂管；
第三步：用牙签伸入患者口腔內颊处前、后或者上、下刮取3-4次，取得口腔细胞样品，取完样品之后，拔掉试剂管的塞子，将取过样品的牙签带有样品的一端***试剂管中，在试剂冻融之前完成取样过程；
第四步：待试剂完全冻融之后，轻弹试剂管，使得刮取的口腔细胞在试剂中混合均匀，试剂管中如有气泡，用手指轻弹，使气泡破裂或者漂浮在试剂上层。
(2)反应：
1、将试剂管放入OM-1000型荧光PCR仪器(专利授权公告号：CN103820306B)进行反应，采用两步法，温度程序是：
2、标记取样日期、患者姓名、性别和年龄等信息；
3、一个小时后，观察结果，结果共有三种，分别是“CC”、“CT”或“TT”，其中阴性结果是“CC”，阳性结果是“CT”和“TT”。如图11、图12和图13所示，图中C线表示ABCB1C3435T位点未突变的序列扩增情况，T线表示ABCB1C3435T位点突变的基因序列扩增情况；
(3)结果分析：
图11：只有C线有指数增长，而T线没有指数增长，因此检测结果是野生型CC，提示所检测基因表达或活性可能正常，不影响肠道对氯吡格雷的吸收；
图12：C线和T线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型CT，提示ABCB1编码的P-gp活性可能下降，导致肠道对氯吡格雷的吸收能力下降；
图13：只有T线有指数增长，而C线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型TT，提示ABCB1编码的P-gp活性明显下降或可能丧失，导致肠道对氯吡格雷的吸收能力很弱或者丧失，严重影响治疗效果。
由此，可从图11、图12和图13中分析得出ABCB1的基因型，从而可得出，患者对药物的代谢类型。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (9)

1.基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、上游引物、下游引物、突变型分子信标、野生型分子信标、MgCl2、PCR缓冲液和细胞裂解液。
2.如权利要求1所述基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，其特征在于：所述的细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。
3.如权利要求2所述基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR缓冲液为5x Colorless Reaction Buffer。
4.如权利要求3所述基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应混合液原料的终浓度为：
DNA聚合酶 0.04-0.1U/ul        dNTPs  0.1-0.5mM
上游引物   0.2-0.5 uM
下游引物   0.2-0.5 uM
突变型分子信标  0.2-0.5uM
野生型分子信标  0.2-0.5 uM
5x Colorless Reaction Buffer   0.5-1.5x
MgCl2    1-2.5 mM
细胞裂解液的原料终浓度为：
十二烷基硫酸钠  0.005-0.015%w/v
聚乙二醇辛基苯基醚  0.001-0.03%w/v。
5.如权利要求4所述基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，其特征在于：
所述的PCR反应混合液原料的终浓度为：
DNA聚合酶 0.08U/ul        dNTPs  0.3mM
上游引物   0.4 uM
下游引物   0.4 uM
突变型分子信标  0.4 uM
野生型分子信标  0.3 uM
5x Colorless Reaction Buffer   1x
MgCl2    2 mM
细胞裂解液的原料终浓度为：  
十二烷基硫酸钠  0.005%w/v
聚乙二醇辛基苯基醚  0.01%w/v。
6.如权利要求4或5所述基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的分装量为10-50ul。
7.基因单核苷酸多态性位点快速检测方法，其特征在于：检测步骤包括：
第一步：取样
A：患者先用温水漱口2-3次，去除口腔内的食物残渣；
B：打开装有检测试剂的试剂盒，取出装有试剂的试剂管；
C：用取样装置伸入患者口腔內颊处前、后或者上、下刮取3-4次，取得样品；
D：将取得的细胞样本放入试剂管中；
待试剂冻融之后，弹试剂管，细胞样品在试剂中混合均匀；
去除气泡；
第二步：反应
将样品处理后的试剂管放入PCR仪器进行反应；
第三步：分析结果
得到扩增曲线和荧光颜色分析结果。
8.如权利要求7所述的基因单核苷酸多态性位点快速检测方法，其特征在于：所述第二步的反应步骤中反应步骤为：
a、95℃预变性5min；
b、95℃变性5s；
c、56℃退火30s；
且a、b、c步骤反应50个循环；
在反应过程中的光学条件为：荧光PCR至少为双通道，且双通道的激发光波长分别为450-500nm和550-600nm之间。
9.如权利要求6或7所述的基因单核苷酸多态性位点快速检测方法，其特征在于：所述的第一步D步骤中的取样装置为牙签。
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