CN109251975A - 基于poct模式的cyp2c19*2或*3基因型快速检测试剂盒 - Google Patents
基于poct模式的cyp2c19*2或*3基因型快速检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109251975A CN109251975A CN201810152076.4A CN201810152076A CN109251975A CN 109251975 A CN109251975 A CN 109251975A CN 201810152076 A CN201810152076 A CN 201810152076A CN 109251975 A CN109251975 A CN 109251975A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cyp2c19
- probe
- primer
- genotype
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种基于POCT模式的CYP2C19*2或*3基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒至少含有用于检测CYP2C19*2(rs4244285，SEQ ID NO:1‑4)或*3(rs4986893，SEQ ID NO:5‑8)基因型的荧光定量PCR引物和探针及细胞裂解液，此外还可包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、反应缓冲液、标准阳性模板、采样棒、样品收集管等。本试剂盒可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，特别适合DNA含量较低样本(如口腔脱落细胞)的快速、准确检测，检测准确率达99％以上，检测灵敏度高，可准确检测低至0.125ng基因组DNA；整个检测耗时短，1小时内可得检测结果，能在第一时间给医生提供用药依据，降低患者用药风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种基于POCT模式的CYP2C19*2或*3基因型快 速检测试剂盒。
背景技术
细胞色素P450(CytochromeP450)同工酶，是由一系列结构和功能相关的酶组成的超家族， 包括CYP1、2、3家族。CYP2C19是CYP2C家族的重要酶，在体内药物代谢反应中发挥重要作用。
CYP2C19基因具有遗传多样性，酶活性在不同个体间存在差异，使得不同个体对于药物的代 谢能力存在较大差异，使得人群出现快代谢型、中间代谢型和慢代谢型3种表型。CYP2C19基因多 态性主要由两种突变引起：一种突变降低酶活性；一种突变增强酶活性。其中，CYP2C19*2 (681G>A，rs4244285)和CYP2C19*3(636G>A，rs4986893)突变是最主要的两种突变类型，引 起CYP2C19酶活性降低。研究表明，慢代谢型个体携带两个降低CYP2C19酶活性的突变位点，如 CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3和CYP2C19*2/*3；中间代谢型个体携带一个降低或增加CYP2C19 酶活性的突变位点，如CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3等。
研究表明，CYP2C19各基因型发生率在中国、亚洲以及洲际之间存在较大差异，在亚洲健康 人群中，CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3基因型 总的发生率分别为37.1％、6.6％、8.3％、3.5％和1.0％，亚洲人群CYP2C19*2和CYP2C19*3携带者 各基因型的发生率均高于欧洲白种人和非洲黑种人。其中，东亚(中国、日本和韩国)人群中 CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3基因型的发生率在整个亚洲人群中最高，而 CYP2C19*1/*1野生型发生率在整个亚洲人群中是最低的，说明东亚(中国、日本和韩国)人群 CYP2C19*3基因的发生率在亚洲是最高的。
研究发现，CYP2C19参与多种药物代谢，其中，包括氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、雷 贝拉唑(质子泵抑制剂)、伏立康唑、安定、去甲安定、丙戊酸(抗癫痫药)、阿米替林(抗抑郁 药)等。据研究表明，CYP2C19基因多态性严重影响以上药物的疗效。如氯吡格雷作为血小板受 体P2Y12抑制剂，是目前噻吩吡啶类使用最广泛的抗血小板药物。氯吡格雷属于无活性前体药物， 需经肝脏细胞色素酶P450***代谢后，转化为活性产物，阻断二磷酸腺苷(ADP)受体抑制血小 板聚集，阻止病理性血栓的形成。临床研究发现，服用常规剂量的氯吡格雷的患者中，4％～30％的 患者在24h内达不到预期的抗血小板效果，有专家把此现象统称为氯吡格雷抵抗，而此现象主要受 CYP2C19基因多态性的影响。CYP2C19*2和CYP2C19*3基因发生突变后，降低CYP2C19酶活性， 难以将氯吡格雷代谢为活性产物，从而影响了氯吡格雷的抗血小板能力。研究数据显示，CYP2C19*2和CYP2C19*3基因携带者较CYP2C19*1基因携带者更容易发生支架植入后血栓，并且， 在植入支架1个月内形成血栓的风险更大。临床用药前，最好对患者CYP2C19基因进行检测，因此， 快速、准确的CYP2C19基因分型检测对患者个体化用药，提高药物临床疗效，有着重要的临床意 义。
目前，检测CYP2C19的方法主要有测序法、基因芯片法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态 性(PCR-RFLP)、多重PCR和荧光定量PCR法。测序法和基因芯片法对检测结果具有很高的精度， 其依赖大型精密仪器设备、固定实验室以及专业操作人员，因此，这两种检测方法成本高，步骤繁 琐并且耗时长，在临床上很难进行推广。PCR-RFLP法虽然降低了测序法和基因芯片法中的仪器和 试剂的成本，但其操作复杂，步骤繁多，也不适用于临床。CN103184265 A公开了一种多重PCR 方法，但该方法在PCR反应后需要使用凝胶电泳分析结果。这种开放式的操作很容易导致环境污染， 影响结果的准确性，因此也不适合临床推广。目前常规的检测技术难以满足国内携带CYP2C19突 变基因的人群对CYP2C19基因检测快速、准确的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一套用于检测CYP2C19*2(rs4244285)及*3(rs4986893)基因型的荧光 定量PCR引物和探针。
本发明的另一目的是提供一种基于POCT模式的CYP2C19*2(rs4244285)或*3基因型 (rs4986893)快速检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明提供一套用于检测CYP2C19*2(rs4244285)及*3(rs4986893) 基因型的荧光定量PCR引物和探针，包括上游引物、下游引物、野生型探针和突变型探针，它们的 核苷酸序列分别如下：
用于检测CYP2C19*2基因型的荧光定量PCR引物和探针：
上游引物：5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATCTATA-3’
下游引物：5’-CGAGGGTTGTTGATGTCCATC-3’
野生型探针：5’-F1-TTTCCCGGGAACC-Q-3’
突变型探针：5’-F2-TTCCCAGGAACCC-Q-3’
用于检测CYP2C19*3基因型的荧光定量PCR引物和探针：
上游引物：5’-CAGCAATTTCTTAACTTGATGGA-3’
下游引物：5’-CAATATAGAATTTTGGATTTCCCAG-3’
野生型探针：5’-F1-CCCCTGGATCCAG-Q-3’
突变型探针：5’-F2-ACCCCCTGAATCCA-Q-3’
优选地，所述探针如下：
CYP2C19*2探针：
野生型探针：5’-F1-TTTCCCGGGAACC-Q-3’
突变型探针：5’-F2-TTCCCAG+GAACCC-Q-3’
CYP2C19*3探针：
野生型探针：5’-F1-CCCCTGG+ATCCAG-Q-3’
突变型探针：5’-F2-ACCCCCTG+AATCCA-Q-3’
其中，+表示LNA修饰碱基；F1和F2为不同的荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
本发明还提供含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。
本发明还提供一种用于荧光定量PCR检测CYP2C19*2或*3基因型的反应体系，所述反应体系包 括SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:5-8所示引物和探针、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和 细胞裂解液；
其中，所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成。
所述反应体系中各组分的终浓度为：0.5-1.5×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs 0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、 Mg2+1-2.5mM和细胞裂解液；
其中，所述反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.0005-0.015％w/v 和0.001-0.03％w/v。
优选地，所述反应体系的总体积为23.5μL，各组分的终浓度或用量为：1.1×PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚合酶1.25U、dNTPs 0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.5μM、突 变型探针0.5μM、Mg2+2.5mM和细胞裂解液；所述反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基 醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％w/v，或0.009％w/v和0.01％w/v，或0.005％w/v和0.02％w/v，或 0.005％w/v和0.001％w/v，或0.015％w/v和0.003％w/v；优选0.005％w/v和0.01％w/v。
本发明还提供一种基于POCT模式的CYP2C19*2或*3基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒至少 含有SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:5-8所示引物和探针以及细胞裂解液；
其中，所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成。在配制的PCR反应体 系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.0005-0.015％w/v和0.001-0.03％w/v。优选 地，在配制的PCR反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和 0.01％w/v，或0.009％w/v和0.01％w/v，或0.005％w/v和0.02％w/v，或0.005％w/v和0.001％w/v，或 0.015％w/v和0.003％w/v；优选0.005％w/v和0.01％w/v。
本发明所述试剂盒中还包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、反应缓冲液、标准阳性模板、采样 棒(例如，一次性口腔拭子)、样品收集管等中的至少一种。
优选地，所述DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。
与本发明所述试剂盒配套的荧光定量PCR反应体系中各组分的终浓度为：0.5-1.5×PCR反应缓 冲液、Taq DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs 0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、 野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、Mg2+1-2.5mM和细胞裂解液。其中，所述反应体系 中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.0005-0.015％w/v和0.001-0.03％w/v。
本发明中，基因型CYP2C19*2和基因型CYP2C19*3是在各自独立的反应体系中进行检测。
优选地，所述反应体系的总体积为23.5μL，各组分的终浓度或用量为：1.1×PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚合酶1.25U、dNTPs 0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.5μM、突 变型探针0.5μM、Mg2+2.5mM和细胞裂解液。其中，所述反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛 基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％w/v，或0.009％w/v和0.01％w/v，或0.005％w/v和0.02％w/v， 或0.005％w/v和0.001％w/v，或0.015％w/v和0.003％w/v；优选0.005％w/v和0.01％w/v。
优选地，与本发明所述试剂盒配套的荧光定量PCR反应程序为：95℃5min；95℃8s，55℃35s， 50个循环。
将本发明的试剂盒应用于实际样本检测，所述检测样本可以来自口腔内壁、舌头、手掌、耳朵 等部位，来自上述位置的脱落细胞经裂解液裂解后释放出的DNA均可用于该试剂盒的基因检测， 由于刮取口腔内壁样本方法简便快捷，且样本量适中，因此选取口腔样本为最优。一般情况下在20 秒内即可完成取样和加样步骤。
(1)取样前准备
取样前患者须用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾 液。取样者须穿戴手套、口罩。待上述准备完成后，方可进行取样。
(2)取样与加样
采样工具为一次性口腔拭子。具体采样过程如下：
1)分别从试剂盒与拭子包装袋中取出反应液与拭子，然后拔掉试剂塞(图1-a)；
2)取下拭子端盖,该过程中注意勿接触试剂塞(图1-b)；
3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜(图 1-c)；
4)取样后立即将拭子***反应液中，按压使其与试剂管密封，避光暂存(如1-d)。
检测结果分析：反应结束后经过分析***可直观准确地对检测结果进行分析和解读，一共可 产生以下三种结果。
①野生纯合型
该检测结果在分析***中表现为有且仅有绿色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有绿色 荧光通道产生Ct值(cycle threshold，指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环 数)。(图2和图5)
②突变纯合型
该检测结果在分析***中表现为有且仅有红色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有红色 荧光通道产生Ct值。(图3和图6)
③杂合型
该检测结果在分析***中表现为绿色荧光曲线和红色荧光曲线均呈指数增长趋势，并且绿色 荧光通道和红色荧光通道均产生Ct值。(图4和图7)
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，1小时内即 可得到对应基因位点的检测信息；故可在第一时间给医生提供用药依据，从而避免患者用药错误。
(二)在试剂反应体系中加入了细胞裂解液，可直接裂解细胞并释放出细胞核中DNA，使样 本加入、DNA提取与PCR反应在同一支试剂管里闭管进行。
(三)本试剂盒样本(DNA或口腔细胞)检测准确率达99％以上。
(四)本发明检测方法，取样过程无痛无创，操作简便，单次取样加样20s内即可完成。
(五)检测灵敏度高，可以准确检测低至0.125ng的基因组DNA。对于保存时间过长以及口腔 拭子等DNA含量较低的样本能准确检测。
(六)本试剂盒在常温下至少可放置72h，2-8℃至少可放置15天，-20℃至少可放置12个月。
(七)本发明采用了新颖的加样至结果一步化的操作方式，免去了繁琐的中间环节，1小时内 即可出检测结果，解决了紧急病人治疗迫切的问题。单一步骤，单管试剂，闭管操作，大幅度降低 了环境污染的可能性。
(八)本发明还配套使用了智能分析程序，可直接对数据进行自动分析，即刻得出无偏性的 基因型检测结果和用药指导报告，摆脱了实验室束缚，对环境和操作人员没有特殊要求。
(九)本发明采用了具有MGB(minorgroovebinding)和LNA(locknucleicacid)双重修饰的 Taqman探针(检测方法不仅限于Taqman探针，还包括分子信标的方法)，不仅大大降低了本底信 号强度，并且进一步提高了探针的特异性、灵敏度和准确性。
(十)本发明还采用了热启动酶，通过优化试剂体系，使其能够包容口腔杂质和环境温度变 化带来的风险。
附图说明
图1为利用本发明试剂盒进行检测过程中取样及加样操作流程图。
图2为本发明CYP2C19*2等位基因野生纯合子检测结果图。
图3为本发明CYP2C19*2等位基因突变纯合子检测结果图。
图4为本发明CYP2C19*2等位基因杂合子检测结果图。
图5为本发明CYP2C19*3等位基因野生纯合子检测结果图。
图6为本发明CYP2C19*3等位基因突变纯合子检测结果图。
图7为本发明CYP2C19*3等位基因杂合子检测结果图。
图8为本发明实施例1中CYP2C19*2位点加裂解液和不加裂解液三种基因型Ct值统计柱状图。
图9为本发明实施例1中CYP2C19*2位点加裂解液和不加裂解液三种基因型EPF值统计柱状 图。
图10为本发明实施例1中CYP2C19*3位点加裂解液和不加裂解液三种基因型Ct值统计柱状图。
图11为本发明实施例1中CYP2C19*3位点加裂解液和不加裂解液三种基因型EPF值统计柱状 图。
图12为本发明实施例2中CYP2C19*2位点探针经LNA修饰与不修饰的三种基因型的Ct值统计 柱状图。
图13为本发明实施例2中CYP2C19*2位点探针经LNA修饰与不修饰的三种基因型EPF值统计 柱状图。
图14为本发明实施例2中CYP2C19*3位点探针经LNA修饰与不修饰的三种基因型的Ct值统计 柱状图。
图15为本发明实施例2中CYP2C19*3位点探针经LNA修饰与不修饰的三种基因型EPF值统计 柱状图。
图16为本发明实施例3中CYP2C19*2位点三种引物浓度的Ct值柱状图
图17为本发明实施例3中CYP2C19*2位点三种引物浓度的EPF值柱状图
图18为本发明实施例3中CYP2C19*2位点两种探针浓度的Ct值柱状图
图19为本发明实施例3中CYP2C19*2位点三种基因型终点荧光值(EPF)柱状图
图20为本发明实施例3中CYP2C19*3位点三种引物浓度的Ct值柱状图
图21为本发明实施例3中CYP2C19*3位点三种引物浓度的EPF值柱状图
图22为本发明实施例3中CYP2C19*3位点两种探针浓度的Ct值柱状图
图23为本发明实施例3中CYP2C19*3位点三种基因型终点荧光值(EPF)柱状图
图24为本发明实施例7中不同检测环境对CYP2C19*2位点试剂盒检测正确率的影响数据统计。
图25为本发明实施例7中不同检测环境对CYP2C19*3位点试剂盒检测正确率的影响数据统计。
图26A-图26C分别为本发明实施例8中CYP2C19*2位点A、B、C组三种基因型Ct值统计图。
图27A-图27C分别为本发明实施例8中CYP2C19*3位点A、B、C组三种基因型Ct值统计图。
图28A-图28C分别为本发明实施例8中CYP2C19*2位点A、B、C组三种基因型终点荧光值(EPF) 统计图。
图29A-图29C分别为本发明实施例8中CYP2C19*3位点A、B、C组三种基因型终点荧光值(EPF) 统计图。
图30A-图30D分别为本发明实施例9中4对引物pair1、pair2、pair3、pair4的PCR扩增结果。
图31A-图31C为本发明实施例9中探针P1WP1M的qPCR检测结果；其中，A为野生纯合子检测 结果，B为突变纯合子检测结果，C为杂合子检测结果。
图32A-图32C为本发明实施例9中探针P2WP2M的qPCR检测结果；其中，A为野生纯合子检测 结果，B为突变纯合子检测结果，C为杂合子检测结果。
图33A-图33C为本发明实施例9中探针P3WP3M的qPCR检测结果；其中，A为野生纯合子检测 结果，B为突变纯合子检测结果，C为杂合子检测结果。
图34为本发明实施例9中6对引物pair1、pair2、pair3、pair4、pair5、pair6的PCR扩增结果。
图35A-图35C为本发明实施例9中探针P1WP1M的qPCR检测结果；其中，A为野生纯合子检测 结果，B为突变纯合子检测结果，C为杂合子检测结果。
图36A-图36C为本发明实施例9中探针P2WP2M的qPCR检测结果；其中，A为野生纯合子检测 结果，B为突变纯合子检测结果，C为杂合子检测结果。
图37A-图37C为本发明实施例9中探针P3WP3M的qPCR检测结果；其中，A为野生纯合子检测 结果，B为突变纯合子检测结果，C为杂合子检测结果。
图8-图23和图26-图29中，“*”表示与对照组相比，该组数据差异显著(P≤0.05)；“**” 表示差异极显著(P≤0.01)；未标示的表示与对照组相比，该组数据差异不显著(P＞0.05)。“G” 表示绿色荧光通道，“R”表示红色荧光通道。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规 实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的基于POCT模式的CYP2C19*2及*3基因型快速检测试剂盒，至少含有SEQ ID NO:1-4或SEQ ID NO:5-8所示引物和探针以及细胞裂解液，此外还可包括dNTPs、DNA聚合酶、 Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板、一次性口腔拭子、样品收集管等。
本发明中，涉及的野生型探针对应的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为MGB，突变型探针对 应的荧光报告基团为Texas Red，淬灭基团为MGB。
实施例1细胞裂解液性能测试
PCR是一种极其灵敏的微量DNA检测技术。目前临床上无痛无创检测方法的主要样本有口腔 拭子、毛发、指甲、口腔唾液及体腔液等，这些样本均需专业人员在专业实验室使用专业的仪器设 备，通过复杂的操作流程将其中所含的DNA提取纯化后，才可加入PCR反应体系进行反应，需要 耗费大量的人力、物力、财力。为了解决这个问题，同时考虑到直接加入细胞后扩增效果不理想， 不适合临床检测，发明人尝试加入了一定浓度的细胞裂解液。并且进行加细胞裂解液与不加细胞裂 解液的比较实验。(注：以脱落细胞为模板)
试剂配方见表1-1和表1-2，3种不同表型各配制100支重复，反应程序见表1。
表1-1不同样本实验PCR反应总体系配方表
表1-2 CYP2C19*3不同样本实验PCR反应总体系配方表
| 组成 | 浓度一 | 浓度二 |
| 5×Promega Colorless Reaction Buffer | 1.1× | 1.1× |
| dNTP(10mM) | 0.2mM | 0.2mM |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 2.5mM | 2.5mM |
| 细胞裂解液 | 1× | - |
| CYP2C19*3上游引物(100μM) | 0.5μM | 0.5μM |
| CYP2C19*3下游引物(100μM) | 0.5μM | 0.5μM |
| CYP2C19*3野生型探针 | 0.5μM | 0.5μM |
| CYP2C19*3突变型探针 | 0.5μM | 0.5μM |
| DNA聚合酶(5U/μL) | 1.25U | 1.25U |
| 口腔细胞 | + | + |
| 补加超纯水至总体积 | 23.5μL | 23.5μL |
上述PCR反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％ w/v。
表1两步法反应程序
实验结果：
1.CYP2C19*2位点结果
(1)Ct值统计结果见表1-3和图8：
表1-3 Ct值统计表
(2)EPF值统计结果见表1-4和图9：
表1-4三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
(3)准确率统计如下：
加裂解液与否对三种基因型检测准确率影响的统计见表1-5。
表1-5加裂解液与否对三种基因型检测准确率影响的统计表
2.CYP2C19*3位点结果
(1)Ct值统计结果见表1-6和图10：
表1-6 Ct值统计表
(2)EPF值统计结果见表1-7和图11：
表1-7三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
(3)准确率统计如下：
加裂解液与否对三种基因型检测准确率影响的统计见表1-8。
表1-8加裂解液与否对三种基因型检测准确率影响的统计表
比较加细胞裂解液与不加细胞裂解液的Ct值可以看出，CYP2C19*2、*3两个位点，不加细胞 裂解液的试剂阳性通道Ct值极显著大于加入细胞裂解液的阳性通道Ct值(P≤0.01)；从两者荧光值 比较结果可以看出，CYP2C19*2、*3两个位点，加入细胞裂解液后荧光值极显著高于不加细胞裂 解液荧光值(P≤0.01)。从两者的准确率来看，加入裂解液后准确率可以达到99％以上，而未加裂 解液检测结果的准确率低于90％。说明加入细胞裂解液后，细胞裂解液裂解了细胞，使其释放了更 多的DNA，从而使结果中Ct值显著降低，荧光值升高，因此PCR反应体系中，使用裂解液更优，避 免了需要专业人员及特定实验室对DNA进行抽提和纯化的问题。
实施例2LNA修饰探针提高分型正确率
LNA是一种寡核苷酸衍生物，与DNA/RNA具有相似的结构，因此能够对DNA和RNA进行有力 的识别和结合。LNA用于寡核苷酸的修饰后，能够增加引物或探针的热稳定性，提高其退火温度 3～8℃。本试剂盒开发的探针采用LNA修饰，经软件预测，修饰后的野生型探针和突变型探针与模 板结合的Tm值均提高了4℃左右。为了充分表明LNA修饰探针和未经LNA修饰探针的差异，进行下 列对比实验，PCR体系分别见表2-1和表2-2，分别检测野生纯合子、杂合子和突变纯合子，每个基 因型做三支重复，反应程序见表1。
检测CYP2C19*2位点所用引物和探针序列如下：
上游引物：5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATCTATA-3’
下游引物：5’-CGAGGGTTGTTGATGTCCATC-3’
野生型探针：5’-FAM-TTTCCCGGGAACC-MGB-3’
突变型探针：5’-F2-Texas Red-TTCCCAG+GAACCC-MGB-3’
野生型未经LNA修饰探针：5’-FAM-TTTCCCGGGAACC-3’
突变型未经LNA修饰探针：5’-Texas Red-TTCCCAGGAACCC-MGB-3’
检测CYP2C19*3位点所用引物和探针序列如下：
上游引物：5’-CAGCAATTTCTTAACTTGATGGA-3’
下游引物：5’-CAATATAGAATTTTGGATTTCCCAG-3’
野生型探针：5’-FAM-CCCCTGG+ATCCAG-MGB-3’
突变型探针：5’-F2-Texas Red-ACCCCCTG+AATCCA-MGB-3’
野生型未经LNA修饰探针：5’-FAM-CCCCTGGATCCAG-MGB-3’
突变型未经LNA修饰探针：5’-Texas Red-ACCCCCTGAATCCA-MGB-3’
其中，+表示LNA修饰碱基。
表2-1 CYP2C19*2位点PCR反应体系
| 配方1 | 配方2 | 反应组分终 |
| 5×Promega Colorless Reaction Buffer | 5×Promega Colorless Reaction Buffer | 1.1× |
| dNTP(10mM) | dNTP(10mM) | 0.2mM |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 2.5mM |
| 细胞裂解液(200×) | 细胞裂解液(200×) | 1× |
| CYP2C19*2上游引物(100μM) | CYP2C19*2上游引物(100μM) | 0.5μM |
| CYP2C19*2下游引物(100μM) | CYP2C19*2下游引物(100μM) | 0.5μM |
| CYP2C19*2野生型LNA修饰探针 | CYP2C19*2野生型未经LNA修饰探针 | 0.5μM |
| CYP2C19*2突变型LNA修饰探针 | CYP2C19*2突变型未经LNA修饰探针 | 0.5μM |
| DNA聚合酶(5U/μL) | DNA聚合酶(5U/μL) | 1.25U |
| DNA(10ng/μL) | DNA(10ng/μL) | 1μL |
| 补加超纯水至总体积 | 23.5μL | 23.5μL |
表2-2 CYP2C19*3位点PCR反应体系
| 配方1 | 配方2 | 反应组分终 |
| 5×Promega Colorless Reaction Buffer | 5×Promega Colorless Reaction Buffer | 1.1× |
| dNTP(10mM) | dNTP(10mM) | 0.2mM |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 2.5mM |
| 细胞裂解液(200×) | 细胞裂解液(200×) | 1× |
| CYP2C19*3上游引物(100μM) | CYP2C19*3上游引物(100μM) | 0.5μM |
| CYP2C19*3下游引物(100μM) | CYP2C19*3下游引物(100μM) | 0.5μM |
| CYP2C19*3野生型LNA修饰探针 | CYP2C19*3野生型未经LNA修饰探针 | 0.5μM |
| CYP2C19*3突变型LNA修饰探针 | CYP2C19*3突变型未经LNA修饰探针 | 0.5μM |
| DNA聚合酶(5U/μL) | DNA聚合酶(5U/μL) | 1.25U |
| DNA(10ng/μL) | DNA(10ng/μL) | 1μL |
| 补加超纯水至总体积 | 23.5μL | 23.5μL |
上述PCR反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％ w/v。
实验结果：
1.CYP2C19*2位点结果
(1)Ct值统计结果见表2-3和图12：
表2-3三种基因型Ct值统计
(2)三种基因型终点荧光值统计结果见表2-4和图13：
表2-4三种基因型的终点荧光值(EPF)统计
从表2-3和图12可以看出，CYP2C19*2位点未经LNA修饰探针组的野生纯合子和杂合子的绿色 荧光通道无Ct值，软件判定为分型失败，而经LNA修饰探针组有相应的Ct值，软件可以根据此进行 很好的分型，得出准确的实验结果。因此经过LNA修饰后的探针更确保了结果的正确性。
从表2-4和图13可以看出，CYP2C19*2位点经LNA修饰探针组三种基因型检测结果中EPF值极 显著大于未经LNA修饰探针组，(P≤0.05)。表明，当探针经LNA修饰后，有利于探针与靶序列 的结合，提高了探针检测准确性。
2.CYP2C19*3位点结果
(1)Ct值统计结果见表2-5和图14：
表2-5三种基因型Ct值统计
(2)三种基因型终点荧光值统计结果见表2-6和图15：
表2-6三种基因型的终点荧光值(EPF)统计
从表2-5和图14可以看出，CYP2C19*3位点未经LNA修饰探针组的野生纯合子和杂合子的绿色 荧光通道无Ct值，软件判定为分型失败，而经LNA修饰探针组有相应的Ct值，软件可以根据此进行 很好的分型，得出准确的实验结果。因此经过LNA修饰后的探针更确保了结果的正确。
从表2-6和图15可以看出，CYP2C19*3位点经LNA修饰探针组三种基因型检测结果中EPF值极 显著大于未经LNA修饰探针组，(P≤0.05)。表明，当探针经LNA修饰后，有利于探针与靶序列 的结合，提高了探针检测准确性。
实施例3引物探针最佳比例优化实验
特异的引物和探针筛选确认后，需对引物和探针在PCR反应体系中的浓度进行优化(以口腔细 胞为模板)。引物探针浓度对应的PCR反应体系如表3-1所示。
表3-1 CYP2C19*2位点引物探针浓度实验PCR反应总体系配方表
表3-2 CYP2C19*3位点引物探针浓度实验PCR反应总体系配方表
上述PCR反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％ w/v。
实验结果：
1、CYP2C19*2
(1)引物浓度梯度实验(浓度一、浓度二、浓度三)
a.Ct值统计结果见表3-3和图16：
表3-3 CYP2C19*2位点三种引物浓度的Ct值统计
b.EPF值统计结果见表3-4和图17：
表3-4 CYP2C19*2位点三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
c.杂合型绿通道终点荧光值和红通道终点荧光值的比值(G/R ratio)统计结果见表3-5：
表3-5 CYP2C19*2位点杂合型G/R ratio
| 终浓度 | G/R ratio(杂合型) |
| 浓度一 | 0.79 |
| 浓度二 | 0.88 |
| 浓度三 | 0.94 |
(2)探针浓度梯度实验
考虑到杂合型G/R ratio尽量接近于1(杂合型G/R ratio越接近于1，杂合分型错误的机会越低)， 故对探针浓度进行了调整。
a.Ct值统计结果见表3-6和图18：
表3-6 CYP2C19*2位点Ct值统计表
b.终点荧光值(EPF)统计结果见表3-7和图19：
表3-7 CYP2C19*2位点三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
c.杂合型绿通道终点荧光值和红通道终点荧光值的比值(G/Rratio)统计结果见表3-8：
表3-8 CYP2C19*2位点杂合型G/Rratio
通过引物三个浓度梯度配制的试剂CT值比较发现，浓度三Ct值均显著小于浓度一和浓度二的 Ct值(p≤0.05)，说明相较于浓度一和浓度二来说，浓度三的引物扩增效率更高。
通过三个浓度梯度配置的试剂终点荧光值可看出，浓度三的终点荧光值显著高于浓度一和二的 终点荧光值(p≤0.05)。说明在相同探针浓度条件下，浓度三扩增的可参与PCR反应的有效产物 量最高。探针正确匹配的量越多，试剂也就越稳定。
由绿红通道终点荧光值比值(G/R ratio)可看出，浓度三的绿红通道终点荧光值比值(G/Rratio) 更接近于1，说明检测杂合子基因型时，结果更准确可靠。
通过探针两个浓度梯度配制的试剂终点荧光值和绿红通道荧光比值(G/R ratio)比较发现，浓 度四的终点荧光值显著高于浓度五的终点荧光值(p≤0.05)，浓度四绿红通道荧光比值(G/Rratio) 更接近于1，检测结果准确。
2、CYP2C19*3
(1)引物浓度梯度实验(浓度一、浓度二、浓度三)
a.Ct值统计结果见表3-9和图20：
表3-9 CYP2C19*3位点三种引物浓度的Ct值统计
b.EPF值统计结果见表3-10和图21：
表3-10 CYP2C19*3位点三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
c.杂合型绿通道终点荧光值和红通道终点荧光值的比值(G/R ratio)统计结果见表3-11：
表3-11 CYP2C19*3位点杂合型G/R ratio
| 终浓度 | G/R ratio(杂合型) |
| 浓度一 | 0.76 |
| 浓度二 | 0.82 |
| 浓度三 | 0.93 |
(2)探针浓度梯度实验
考虑到杂合型G/R ratio尽量接近于1(杂合型G/R ratio越接近于1，杂合分型错误的机会越低)， 故对探针浓度进行了调整。
a.Ct值统计结果见表3-12和图22：
表3-12 CYP2C19*3位点Ct值统计表
b.终点荧光值(EPF)统计结果见表3-13和图23：
表3-13 CYP2C19*3位点三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
c.杂合型绿通道终点荧光值和红通道终点荧光值的比值(G/Rratio)统计结果见表3-14：
表3-14 CYP2C19*3位点杂合型G/Rratio
| 终浓度 | G/R ratio(杂合型) |
| 浓度四 | 0.96 |
| 浓度五 | 1.22 |
通过引物三个浓度梯度配制的试剂CT值比较发现，浓度三Ct值均显著小于浓度一和浓度二的 Ct值(p≤0.05)，说明相较于浓度一和浓度二来说，浓度三的引物扩增效率更高。
通过三个浓度梯度配置的试剂终点荧光值可看出，浓度三的终点荧光值显著高于浓度一和二的 终点荧光值(p≤0.05)。说明在相同探针浓度条件下，浓度三扩增的可参与PCR反应的有效产物 量最高。探针正确匹配的量越多，试剂也就越稳定。
由绿红通道终点荧光值比值(G/R ratio)可看出，浓度三的绿红通道终点荧光值比值(G/Rratio) 更接近于1，说明检测杂合子基因型时，结果更准确可靠。
通过探针两个浓度梯度配制的试剂终点荧光值和绿红通道荧光比值(G/R ratio)比较发现，浓 度四的终点荧光值显著高于浓度五的终点荧光值(p≤0.05)，浓度四绿红通道荧光比值(G/Rratio) 更接近于1，检测结果准确。
实施例4准确性测试
本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞作为扩增样本，由于被检测人员生活习惯及个体基因序列的多 样性可能造成试剂在分型时受到干扰，为了验证本试剂盒分型的准确度，本实验采用三个基因型不 同人员的口腔黏膜脱落细胞进行测试(其中测试人员的基因型均经过测序法确证)，操作方法参照 图1操作流程，样本总数为300例，试剂配方分别如表4-1和表4-2所示。
表4-1 CYP2C19*2位点PCR反应总体系配方表
表4-2 CYP2C19*3位点PCR反应总体系配方表
上述PCR反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％ w/v。
CYP2C19*2位点实验结果见表4-3：
表4-3三种基因型的正确率统计
从表4-3可以看出，在300例的样本测试中，本试剂盒的检测准确率可以达到99％以上。初步表 明在按照图1操作流程进行测试的情况下，该试剂具有一定的准确度，可以达到99.3％。
CYP2C19*3位点实验结果见表4-4：
表4-4三种基因型的正确率统计
从表4-4可以看出，在300例的样本测试中，本试剂盒的检测准确率可以达到99％以上。初步表 明在按照图1操作流程进行测试的情况下，该试剂具有一定的准确度，可以达到99.7％。
实施例5检测灵敏度测试
验证CYP2C19*2或*3基因型快速检测试剂盒的灵敏度，将样品DNA(杂合型)加入总量分别以： 1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng和0.1ng五个浓度梯度按照上述方法进行检测，以上每次检测至少进行 两次以上重复，结果如表5-1和表5-2所示：
表5-1用CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒检测不同样品浓度的检测结果
| DNA加入量 | 1ng | 0.5ng | 0.25ng | 0.125ng | 0.1ng | 合计 |
| 检测数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 400 |
| 正确数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 99 | 399 |
| 准确率 | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 99％ | 100％ |
以上结果显示，样品DNA浓度分别以1ng、0.5ng、0.25ng和0.125ng四个浓度梯度用CYP2C19*2 基因型检测试剂盒进行检测，其准确率均达到100％，当DNA浓度为0.1ng时，正确率为99％。因此 可以判断本发明的CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒只需35个拷贝数的DNA模板量就能确保正确 分型。
表5-2用CYP2C19*3基因型快速检测试剂盒检测不同样品浓度的检测结果
| DNA加入量 | 1ng | 0.5ng | 0.25ng | 0.125ng | 0.1ng | 合计 |
| 检测数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 400 |
| 正确数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 99 | 399 |
| 准确率 | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 99％ | 100％ |
以上结果显示，样品DNA浓度分别以1ng、0.5ng、0.25ng和0.125ng四个浓度梯度用CYP2C19*2 基因型检测试剂盒进行检测，其准确率均达到100％，当DNA浓度为0.1ng时，正确率为99％。因此 可以判断本发明的CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒只需35个拷贝数的DNA模板量就能确保正确 分型。
实施例6抗干扰能力检测
由于本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞直接扩增的方式进行检测，因此口腔进食后的残留物是否 会干扰试剂检测结果，急需进行研究。本实验在取样操作前对被取样人员(其基因型经测序法确证) 进行要求，以取样前30min禁食后取样作为标准，以吃甜食、喝碱性茶、吃酸性食物、麻辣食品和 喝中药以后立即取样作为处理组，用同一批试剂对所有样品进行分别检测，每组样品中野生纯合子 120例，杂合子120例，突变纯合子60例，试剂配方如表4-1和表4-2所示，检测结果如表6-1和表6-2 所示：
表6-1 CYP2C19*2位点试剂抗干扰能力正确率测试结果
表6-2 CYP2C19*3位点试剂抗干扰能力正确率测试结果
以上结果可以看出，和禁食取样的检测正确率相比，吃甜食、喝碱性茶、吃酸性食物、麻辣食 品和喝中药以后的正确率都有降低趋势，说明食用以上食物后对PCR反应有一定的抑制作用。吃甜 食、碱性茶和中药后，检测的正确率均在80％-90％范围，与禁食相比，正确率下降范围在10％以内， 说明吃甜食、碱性茶和喝中药后，降低了检测的准确率；吃酸性食物和麻辣食物后，检测的正确率 均在70％-80％范围，与禁食相比，正确率下降范围在10％-20％范围，说明吃酸性食物和麻辣食物后， 与以上方式比最大程度的降低了检测准确率。因此为了提高试剂盒的检测准确性，吃完这些食物后， 最好在30min后进行漱口取样。由于本实验取样有限，在进行临床检测时仍应该在禁食30min后进 行取样检测。
实施例7环境对检测试剂盒的影响试验
由于本发明试剂盒旨在应用于临床检测，因此为了验证CYP2C19*2或*3基因型快速检测试剂 盒的检测结果是否受环境因素的影响，分别在日常办公区(总面积为200平方米，共容纳50人，不 限制他们的活动(可随意走动或说话等)，环境温度为27℃，湿度为77％)和空气洁净度等级为一 百万级的洁净室对多个受试者(其基因型经测序法确证)进行取样，每个受试者在两个区域分别进行 两次重复实验，试剂配方参照表4-1和表4-2，检测结果统计如表7-1和图24、表7-2和图25所示。
表7-1两个取样区CYP2C19*2位点的基因型检测结果正确率统计
以上结果可以看出，办公区和洁净区取样的检测正确率均能达到97％以上，表明环境因素对检 测的结果没有较大影响。此次试验为试剂盒在医院的应用便利性提供了数据，为以后在医院的推广 和使用提供了有力数据支撑。
表7-2两个取样区CYP2C19*3位点的基因型检测结果正确率统计
以上结果可以看出，办公区和洁净区取样的检测正确率均能达到97％以上，表明环境因素对检 测的结果没有较大影响。此次试验为试剂盒在医院的应用便利性提供了数据，为以后在医院的推广 和使用提供了有力数据支撑。
实施例8试剂盒在不同温度条件下(常温、2-8℃、-20℃)放置的稳定性检测
本试剂盒是基于POCT模式开发的，用于医院床旁检测的。由于，低温操作、储存难以实现， 因此，检测试剂在常温下放置一定时长后，是否会对检测结果产生不良影响。对CYP2C19*2和 CYP2C19*3分别配制大批试剂，随机分成3个温度条件组共24个处理组，分组情况见表8-1，其中对 照组为：配置后立即上机检测(2-8℃配制，30min内完成108支样品的取样上样上机程序)，每个 处理组共108支试剂，每种基因型检测36支。待完成试剂处理后，按照SOP操作，采集被取样者(其 CYP2C19基因型经测序法确证)的口腔样品，野生纯合子、突变纯合子、杂合子各取36支。统一 按照表1进行荧光PCR反应。
表8-1试剂放置条件和放置时长分组情况表
实验结果：
CYP2C19*2、*3位点Ct值均值统计结果分别见图26A-图26C和图27A-图27C。
CYP2C19*2、*3位点终点荧光值(EPF)均值统计结果分别见图28A-图28C和图29A-图29C。
三种基因型分型正确率统计结果见表8-2。
表8-2三种基因型分型正确率统计表
由图26-图29可以看出，不同处理组的Ct值、EPF值与对照组分别相比较，各放置条件下，所列 出处理时间范围内，Ct值和EPF值的水平稳定。但从表8-2可以看出，各处理组108例数据，A/B/C 三个温度条件的1～7组分型正确率为100％，到A/B/C三个温度条件的第8组时，出现分型错误的情况。 说明常温条件下放置试剂至少7天，不会影响试剂的分型结果；2-8℃条件下放置试剂至少15天，不 会影响试剂的分型结果；-20℃条件下放置试剂至少12个月，不会影响试剂的分型结果。综上所述， 可证明本试剂盒的CYP2AC19试剂有良好的稳定性，在医院进行检测使用时，短暂(常温5天内) 的非低温环境放置，不会影响分型准确性，完全可以满足POCT的床旁检测模式。
实施例9荧光定量PCR引物和探针的筛选
1、CYP2C19*2(rs4244285)位点
(1)引物筛选
根据GenBank公布的SNP位点所在核酸序列，设计如下4对引物：
Pair1 456-592
上游引物：CTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCAC
下游引物：TGATGTCCATCGATTCTTGGT
Pair2 459-596
上游引物：TTAGATATGCAATAATTTTCCCACTA
下游引物：TTGTTGATGTCCATCGATTCTT
Pair3 392-602(SEQIDNO:1-2)
上游引物：CAGAGCTTGGCATATTGTATCTATA
下游引物：CGAGGGTTGTTGATGTCCATC
Pair4 459-547
上游引物：TTAGATATGCAATAATTTTCCCACT
下游引物：CACTTTCCATAAAAGCAAGGTT
PCR反应体系：
表9-1 CYP2C19*2反应体系
上述PCR反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％ w/v。
PCR反应程序：
表9-2反应程序
按照以上反应体系和反应程序进行普通PCR反应。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图 30A-图30D所示：
根据4对引物各自对应的扩增产物条带的亮度来筛选最佳的引物，可见，引物Pair3扩增效果最 佳。因此，将Pair3作为qPCR的引物。
(2)探针筛选
以上述筛选的Pair3为qPCR引物，分别设计如下3对探针：
P1WP1M:
野生型探针：5’-FAM-TTTCCCGGGAACC-MGB-3
突变型探针：5’-Texas Red-TTCCCAG+GAACCC-MGB-3’
(SEQIDNO:3-4)
P2WP2M：
野生型探针：5’-FAM-TTTCCCGGGAACCC-MGB-3’
突变型探针：5’-Texas Red-ATTTCCCAGGAACCCA-MGB-3’
P3WP3M：
野生型探针：5’-FAM-TTCCCG+GGAACCC-MGB-3’
突变型探针：5’-Texas Red-TTTCCCAGGAACCC-MGB-3’
qPCR反应体系：
表9-1 CYP2C19*2反应体系
qPCR反应程序：
表9-2反应程序
按照以上反应体系和反应程序进行qPCR反应。3对探针对应的检测结果分别如图31A-图31C、 图32A-图32C、图33A-图33C所示。
从图31-图33可以看出，P1WP1M三种基因型分型均正确，且曲线平滑，增量高，杂合红绿通 道终点荧光值接近。其余两组探针均不能正确分型。另外，对探针进行LNA修饰既能够提高反应 Tm值，增强反应特异性，又可有效地防止发卡结构的形成。由此，最终将引物Pair3和探针P1WP1M 组合作为检测rs4244285位点的qPCR引物和探针。
(3)引物Pair3设计所依据的DNA模板信息如下：
CAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCG/ACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCG
其中，灰色区域分别为上游引物和下游引物所在位置，G/A加粗的大写字母为待测SNP位点。 该扩增区域内不含有其他SNP位点，因此检测时不会产生旁侧SNP的干扰。
2、CYP2C19*3(rs4986893)位点
(1)引物筛选
根据GenBank公布的SNP位点所在核酸序列，设计如下6对引物：
Pair1439-581
上游引物：CAGCAATTTCTTAACTTGATGGA
下游引物：CAATATAGAATTTTGGATTTCCCAG
(SEQIDNO:5-6)
Pair2412-544
上游引物：AGCAATTTCTTAACTTGATGGAAA
下游引物：ACTGTAAGTGGTTTCTCAGGA
Pair3412-558
上游引物：AAAAATTGAATGAAAACATCAGGA
下游引物：TCAAAAATGTACTTCAGGGC
Pair4439-541
上游引物：TTGAATGAAAACATCAGGATTG
下游引物：AAATGTACTTCAGGGCTTGG
Pair5439-544
上游引物：TTGAATGAAAACATCAGGATTGTA
下游引物：GTACTTCAGGGCTTGGTCAAT
Pair6439-558
上游引物：AAAATTGAATGAAAACATCAGGATTG
下游引物：GACTGTAAGTGGTTTCTCAGGAAGC
PCR反应体系：
表9-3 CYP2C19*3反应体系
PCR反应程序：
表9-4反应程序
按照以上反应体系和反应程序进行普通PCR反应。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图34：
根据6对引物各自对应的扩增产物条带的亮度来筛选最佳的引物，结果显示引物Pair1扩增效果 最佳。因此，将Pair1作为qPCR的引物。
(2)探针筛选
以上述筛选的Pair8为qPCR引物，分别设计如下3对探针：
P1WP1M:
野生型探针：5’-FAM-CCCCTGG+ATCCAG-MGB-3
突变型探针：5’-Texas Red-ACCCCCTG+AATCCA-MGB-3’
(SEQIDNO:7-8)
P2WP2M：
野生型探针：5’-FAM-CCCTGGA+TCCAGG-MGB-3’
突变型探针：5’-Texas Red-CCCTGA+ATCCAGG-MGB-3’
P2WP3M
野生型探针：5’-FAM-CCCTGG+ATCCAGG-MGB-3’
突变型探针：5’-Texas Red-CCTGAATCCAGG-MGB-3’
qPCR反应体系：
表9-5 CYP2C19*2反应体系
qPCR反应程序：
表9-6反应程序
按照以上反应体系和反应程序进行qPCR反应。3对探针对应的检测结果分别如图35A-图35C、 图36A-图36C、图37A-图37C所示。
从图35-图37可以看出，P1WP1M三种基因型分型均正确，且曲线平滑，增量高，杂合红绿通 道终点荧光值接近。其余两组探针均不能正确分型。另外，对探针进行LNA修饰既能够提高反应 Tm值，增强反应特异性，又可有效地防止发卡结构的形成。由此，最终将引物Pair1和探针P1WP1M 组合作为检测rs4244285位点的qPCR引物和探针。
(3)引物Pair1设计所依据的DNA模板信息如下：
4、引物Pair1设计所依据的DNA模板信息如下：
CAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGG/AATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTC TATATTG
其中，灰色区域分别为上游引物和下游引物所在位置，G/A加粗的大写字母为待测SNP位点。 该扩增区域内不含有其他SNP位点，因此检测时不会产生旁侧SNP的干扰。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础 上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发 明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 重庆京因生物科技有限责任公司
<120> 基于POCT模式的CYP2C19*2或*3基因型快速检测试剂盒
<130> KHP181110934.8
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagagcttgg catattgtat ctata 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgagggttgt tgatgtccat c 21
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcccggga acc 13
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcccaggaa ccc 13
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcaatttc ttaacttgat gga 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caatatagaa ttttggattt cccag 25
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccctggatc cag 13
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accccctgaa tcca 14
Claims (10)
1.用于检测CYP2C19*2及*3基因型的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，包括上游引物、下游引物、野生型探针和突变型探针，它们的核苷酸序列分别如下：
用于检测CYP2C19*2基因型的荧光定量PCR引物和探针：
上游引物：5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATCTATA-3’
下游引物：5’-CGAGGGTTGTTGATGTCCATC-3’
野生型探针：5’-F1-TTTCCCGGGAACC-Q-3’
突变型探针：5’-F2-TTCCCAGGAACCC-Q-3’
用于检测CYP2C19*3基因型的荧光定量PCR引物和探针：
上游引物：5’-CAGCAATTTCTTAACTTGATGGA-3’
下游引物：5’-CAATATAGAATTTTGGATTTCCCAG-3’
野生型探针：5’-F1-CCCCTGGATCCAG-Q-3’
突变型探针：5’-F2-ACCCCCTGAATCCA-Q-3’
其中，F1和F2为不同的荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针如下：
CYP2C19*2探针：
野生型探针：5’-F1-TTTCCCGGGAACC-Q-3’
突变型探针：5’-F2-TTCCCAG+GAACCC-Q-3’
CYP2C19*3探针：
野生型探针：5’-F1-CCCCTGG+ATCCAG-Q-3’
突变型探针：5’-F2-ACCCCCTG+AATCCA-Q-3’
其中，+表示LNA修饰碱基。
3.含有权利要求1或2所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。
4.用于荧光定量PCR检测CYP2C19*2或*3基因型的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1或2所述引物和探针、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和细胞裂解液；
其中，所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成。
5.根据权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系中各组分的终浓度为：0.5-1.5×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs 0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、Mg2+1-2.5mM和细胞裂解液；
其中，所述反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.0005-0.015％w/v和0.001-0.03％w/v。
6.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系的总体积为23.5μL，各组分的终浓度或用量为：1.1×PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶1.25U、dNTPs 0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.5μM、突变型探针0.5μM、Mg2+2.5mM和细胞裂解液；
所述反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.005％w/v和0.01％w/v，或0.009％w/v和0.01％w/v，或0.005％w/v和0.02％w/v，或0.005％w/v和0.001％w/v，或0.015％w/v和0.003％w/v；优选0.005％w/v和0.01％w/v。
7.基于POCT模式的CYP2C19*2或*3基因型快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少含有权利要求1或2所述引物和探针以及细胞裂解液；
其中，所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成，且在配制的PCR反应体系中十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.0005-0.015％w/v和0.001-0.03％w/v。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 +、反应缓冲液、标准阳性模板、采样棒、样品收集管中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。
10.根据权利要求7-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，与所述试剂盒配套的荧光定量PCR反应程序为：95℃5min；95℃8s，55℃35s，50个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810152076.4A CN109251975A (zh) | 2018-02-14 | 2018-02-14 | 基于poct模式的cyp2c19*2或*3基因型快速检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810152076.4A CN109251975A (zh) | 2018-02-14 | 2018-02-14 | 基于poct模式的cyp2c19*2或*3基因型快速检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109251975A true CN109251975A (zh) | 2019-01-22 |
Family
ID=65051448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810152076.4A Pending CN109251975A (zh) | 2018-02-14 | 2018-02-14 | 基于poct模式的cyp2c19*2或*3基因型快速检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109251975A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109251973A (zh) * | 2018-02-14 | 2019-01-22 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | 基于poct模式的hla-b*5801基因型快速检测试剂盒 |
| CN112921082A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-08 | 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 | 用于检测cyp2c19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒 |
| CN113789375A (zh) * | 2021-10-14 | 2021-12-14 | 联合基因生物科技(上海)有限公司 | 一种基于硅基微流片的cyp2c19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104673915A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-03 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | 基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其方法 |
| CN107227361A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-10-03 | 庄江兴 | 用于检测cyp2c19基因多态性的引物、探针及检测试剂盒 |
-
2018
- 2018-02-14 CN CN201810152076.4A patent/CN109251975A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104673915A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-03 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | 基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其方法 |
| CN107227361A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-10-03 | 庄江兴 | 用于检测cyp2c19基因多态性的引物、探针及检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JONG-YOON CHUN等: "Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109251973A (zh) * | 2018-02-14 | 2019-01-22 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | 基于poct模式的hla-b*5801基因型快速检测试剂盒 |
| CN112921082A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-08 | 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 | 用于检测cyp2c19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒 |
| CN112921082B (zh) * | 2021-03-31 | 2022-02-18 | 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 | 用于检测cyp2c19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒 |
| CN113789375A (zh) * | 2021-10-14 | 2021-12-14 | 联合基因生物科技(上海)有限公司 | 一种基于硅基微流片的cyp2c19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法 |
| CN113789375B (zh) * | 2021-10-14 | 2024-05-24 | 联合基因生物科技(上海)有限公司 | 一种基于硅基微流片的cyp2c19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101890466B1 (ko) | 고도의 다중 ｐｃｒ 방법 및 조성물 | |
| CN101684497B (zh) | 一种耳聋易感基因筛查试剂盒 | |
| CN104212904B (zh) | 一种用于快速检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒及其使用方法 | |
| US20040229231A1 (en) | Compositions and methods for inferring ancestry | |
| US20070037182A1 (en) | Multiplex assays for inferring ancestry | |
| CN102534031B (zh) | 一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒及其应用 | |
| CN110452984A (zh) | 一种用于***甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法 | |
| CN106591473B (zh) | 一种人mthfr和mtrr基因多态性检测引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN109251975A (zh) | 基于poct模式的cyp2c19*2或*3基因型快速检测试剂盒 | |
| WO2006089238A2 (en) | Multiplex assays for inferring ancestry | |
| CN106755360A (zh) | 用于检测人类cyp2d6基因多态性的核酸、试剂盒及方法 | |
| CN111118138A (zh) | 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法 | |
| CN107227371A (zh) | Cyp2c9*3基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法 | |
| CN105420361A (zh) | 基于酶切灵敏检测人类egfr基因突变的方法及试剂盒 | |
| AU2009225275A1 (en) | Compositions and methods for inferring ancestry | |
| CN104711345A (zh) | Cyp2c19*2基因型快速检测试剂盒及其方法 | |
| CN111944912B (zh) | 一种肤质基因检测方法 | |
| JP2005524388A (ja) | パクリタキセル応答性予測の一塩基多型及びそれらの組合せ | |
| CN108913766A (zh) | 一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒 | |
| CN109251974A (zh) | 基于poct模式的apoe2和apoe4基因型快速检测试剂盒 | |
| CN109251972A (zh) | 基于poct模式的cyp3a5*3基因型快速检测试剂盒 | |
| CN102534030B (zh) | 4个聋病易感基因联合检测试剂盒及其应用 | |
| CN109251973A (zh) | 基于poct模式的hla-b*5801基因型快速检测试剂盒 | |
| CN101671736A (zh) | 一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒 | |
| CN109251981A (zh) | 基于poct模式的aldh2基因型快速检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190122 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |