CN104661671A - 麸质相关病症 - Google Patents

Abstract

本发明特别描述了用于治疗麸质相关病症的组合物和方法。我们描述了包含由国际保藏登记号LMG P-24778的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CBA L74产生的、可减少麦醇溶蛋白肽进入细胞的一种或多种代谢产物的组合物。所述组合物可包含生理上可接受的载体，例如食物制品或药用载体。所述组合物可施用给具有麸质相关病症的受试者，例如乳糜泻或麸质敏感的受试者。

Description

麸质相关病症

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2012年6月18日提交的美国临时专利申请No.61/661,105和2012年11月13日提交的美国临时专利申请No.61/725,693的优先权益，为了可要求美国临时专利申请No.61/661,105和美国临时专利申请No.61/725,693的优先权益的任意美国专利申请，上述在先提交的专利申请的全部内容在此以引用方式全文纳入本文。

技术领域

本发明涉及益生菌有机体和含有由益生菌有机体产生的代谢产物的组合物。所述组合物有益于或者可治疗麸质相关病症例如乳糜泻。

背景技术

麸质和麸质相关的多肽发现于许多谷物例如小麦、黑麦和大麦中。对于具有麸质相关病症例如乳糜泻和麸质敏感的个体，消耗含麸质的食物可产生严重并且持久的健康后果。乳糜泻是在具有遗传倾向的人群中由麸质的消耗引发的小肠的自身免疫病症。麸质的某些片段(“麦醇溶蛋白”)可刺激能够永久性损伤小肠并阻碍营养吸收的免疫应答。乳糜泻可产生广泛的症状。最常见的包括腹泻、腹胀、体重减轻和发育迟缓(儿童)。乳糜泻还可与缺铁性贫血、骨质疏松症、身材矮小症、关节炎、不育、周围神经病变和肝功能衰竭相关。乳糜泻患者还具有增加的患某些种类肿瘤例如小肠癌和非霍奇金淋巴瘤的风险。欧洲血统人群中乳糜泻的发病率据估计介于0.5％和1.5％之间。美国和欧洲以及亚洲发病率的增加部分地是由于采用了欧化的膳食结构。乳糜泻通常于婴儿期或儿童期被诊断出，虽然成年期被诊断出的数量也在上升。目前尚无法治愈乳糜泻，并且标准治疗是终生限定于不含麸质饮食。

麸质敏感与乳糜泻相比较少被很好地表征。其产生许多相同的症状，但不包括对小肠的损伤。诊断倾向于基于排除标准作出，并且一旦给予受试者不含麸质饮食即可改善症状。

坚持不含麸质饮食需要严格避免小麦、黑麦和大麦制品。这会成为挑战，由于通常缺乏对于食物中麸质含量的标志信息；食物加工和制备过程中可能的污染，特别是对于那些在室外制备的食物；不含麸质制品的经济负担以及严格地坚持所需的意志力。也可通过教育和咨询、家庭和社会支持以及心理因素影响顺应性。此外，严格坚持不含麸质饮食可导致微量营养物缺乏。所述缺乏尤其是B族维生素(维生素B6、维生素B12和叶酸)以及某些微量元素例如铁、锌和铜的缺乏，可潜在地导致显著的健康问题，尤其是儿童。持续地需要治疗剂以治疗麸质相关的病症。

发明内容

本发明提供了组合物，其含有由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CBAL74(国际保藏登记号LMG P-24778)产生的一种或多种代谢产物。所述代谢产物可减低具有麸质相关的病症的受试者的麦醇溶蛋白肽毒性。所述代谢产物，其对于高于标准生理温度的温度基本上稳定，可减少麦醇溶蛋白肽的细胞进入。所述麦醇溶蛋白肽可不同并且可包括含有由T-细胞识别的一种或多种表位的肽例如P57-68和由先天免疫***识别的肽例如P31-43。示例性肽包括α-麦醇溶蛋白肽例如具有选自由LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:1)、QLQPFPQPQLPY(SEQ ID NO:2)、LGQQQPFPPQQPYPQPQPF(SEQ ID NO:3)和LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)组成的组的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述代谢产物部分地或者基本上不含副干酪乳杆菌CBA L74(国际保藏登记号LMG P-24778)细胞。所述组合物还可包括生理上可接受的载体例如食物制品或药物载体。

还提供了用于治疗具有麸质相关的病症的受试者的方法，所述方法包括鉴别需要治疗的受试者并且施用有效量的含有由副干酪乳杆菌CBA L74(国际保藏登记号LMG P-24778)产生的代谢产物的组合物，其中所述代谢产物可减低麦醇溶蛋白肽毒性。所述方法和组合物可用于治疗任意麸质相关病症包括乳糜泻包括多种亚型，例如典型乳糜泻、非典型乳糜泻、潜伏乳糜泻和沉默乳糜泻、疱疹样皮炎、麸质共济失调和麸质敏感。所述方法和组合物可与麸质相关病症的普通治疗例如饮食治疗一起施用。

附图说明

本发明的这些及其他特征和优点将通过对下述本发明优选实施方案的详细描述更充分地公开或明显地展现，其应当与附图一起考虑，其中相同的数字表示相同的部分并且进一步地其中：

图1是副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。

图2是示出不同浓度的副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图3是示出不同浓度的副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图4是副干酪乳杆菌菌株CBA L74DNA对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。

图5a是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图；图5b是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。

图6a是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图；图6b是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响检测。

图7a是示出热处理副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图；图7b是热处理副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。

图8是来自发酵的稻的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。

图9是示出来自发酵的稻和发酵的燕麦的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图10是示出来自发酵的稻和发酵的燕麦的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对葡聚糖-得克萨斯红进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图11是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对Alexa偶联的EGF进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图12是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对Alexa偶联的EGF进入CaCo2细胞的影响检测。

图13a、13b、13c和13d是副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。图13a示出了未处理的对照细胞；图13b示出了用10⁴cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图13c示出了用10⁶cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图13d示出了用10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞。

图14是示出不同浓度副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图15a、15b、15c和15d是副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响检测。图15a示出了未处理的对照细胞；图15b示出了用10⁴cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图15c示出了用10⁶cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图15d示出了用10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞。

图16是示出不同浓度副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图17是示出10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43^liss和P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图18a、18b和18c是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。图18a示出了未处理的对照细胞；图18b示出了用10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图18c示出了用从10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74收集的上清处理的CaCo2细胞。

图19是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞和副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图20a、20b和20c是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响检测。图20a示出了未处理的对照细胞；图20b示出了用10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图20c示出了用从10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74收集的上清处理的CaCo2细胞。

图21是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞和副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P57-68^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图22a和22b是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对EGF-Alexa 488进入CaCo2细胞的影响检测。图20a示出了未处理的对照细胞；图20b示出了用从10⁸cfu/ml当量的副干酪乳杆菌CBA L74中收集的上清处理的CaCo2细胞。

图23是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对EGF-Alexa 488进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图24a、24b和24c是去除副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。图20a示出了未处理的对照细胞；图20b示出了用副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的CaCo2细胞；图20c示出了用被移除的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的CaCo2细胞。

图25是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清处理然后将其移除对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

图26a、26b、26c和20d是热处理的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响检测。图26a示出了未处理的对照细胞；图26b示出了用副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的CaCo2细胞；图26c示出了用煮沸过的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的CaCo2细胞；图26d示出了用80℃加热过的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的CaCo2细胞。

图27是示出热处理的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43^liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。

具体实施方式

应结合附图来理解对优选实施方案的描述，附图应被认为是本发明整个说明书的一部分。为清楚和简洁的目的，附图不一定按比例，并且本发明的某些特征可在比例上以夸大的形式示出，或者某些特征可能是以略带示意性的形式示出的。本说明书中，相对性术语例如“水平”、“垂直”、“上”、“下”、“顶部”和“底部”及其派生词(例如“水平地”、“向下地”、“向上地”等)应被理解为涉及其后所描述的或者下文中附图所示的方向。这些相对性术语是为描述方便并且通常不意图要求具体的方向。如果适当，包括“向内地”相对于“向外地”、“纵向的”相对于“横向的”等术语应相对于彼此或相对于延长轴、旋转轴或旋转中心来解释。除非另有说明，关于附接、联接及类似情形的术语，例如“连接的”和“互连的”，是指其中的结构通过中间结构直接或间接地相互紧固到一起或附接在一起的关系，并且这些术语还指活动的或刚性的附接或关系。术语“可操作地连接”是指能使相关结构根据其连接关系按预定方式运行的附接、联接或连接。当仅示出单个装置时，术语“装置”也应包括单独地或共同地执行一套(或多套)指令以实现本文所讨论的任何一种或多种方法的装置的任意集合。权利要求书中，装置加功能的写法(如果使用的话)意在覆盖由说明书或附图描述、暗示或由于说明书或附图而变得明显的用于执行所述功能的结构，这些结构不仅包括结构等同物而且还包括等同的结构。

本发明是部分地基于发明人发现益生菌有机体副干酪乳杆菌菌株CBA L74能够减少麸质的某些组分进入人肠细胞。更具体地，发明人发现分离的副干酪乳杆菌CBA L74以及来自副干酪乳杆菌CBA L74的培养物上清可减少α-麦醇溶蛋白肽进入培养的人肠上皮细胞。此外，还检测到由副干酪乳杆菌CBA L74发酵的食物可减少肽进入。即使当培养物上清热处理后也检测到对肽进入的影响。相应地，本发明特别描述了可缓解麦醇溶蛋白肽的毒性效应的组合物。所述组合物可包括副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞、由副干酪乳杆菌菌株CBA L74产生的代谢产物或者副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞和由副干酪乳杆菌菌株CBAL74产生的代谢产物的组合。

副干酪乳杆菌菌株CBA L74是由发明人分离并且根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约于2008年9月9日保藏在比利时、根特的比利时微生物协作保藏中心(BCCM)微生物实验室(Laboratorium voor Microbiologie,LMG)。由所述国际保藏单位提供的保藏登记号为LMG P-24778。为便于阅读，我们不会每次都重复短语“保藏登记号LMG P-24778”。但是应理解的是当我们提及副干酪乳杆菌菌株CBA L74时，我们是指具有保藏登记号LMG P-24778的保藏菌株。

虽然我们认为我们理解了施用含有副干酪乳杆菌CBA L74的组合物或由其发酵产生的组合物后发生的必然事件，但是本发明的组合物不限于通过影响任意具体的细胞机制起作用的组合物。我们的工作假设是含有副干酪乳杆菌CBAL74、来自副干酪乳杆菌CBA L74培养物或发酵物的上清以及由副干酪乳杆菌CBA L74产生的代谢产物的组合物可提供对于麸质和麸质相关的多肽穿过肠粘膜的增强的屏障，从而缓解具有麸质相关病症例如乳糜泻或麸质敏感的个体中麸质和麸质相关的肽的效应。发明人发现副干酪乳杆菌CBA L74、上清可减少通过不同内吞途径进入细胞的分子的细胞摄取，所述内吞途径例如吞噬、巨胞饮、网格蛋白介导的内吞作用(也称作受体介导的内吞作用)和细胞膜穴样内陷(caveolae)。例如，副干酪乳杆菌CBA L74、上清可减少葡聚糖和表皮生长因子(EGF)的细胞进入，葡聚糖已知是通过巨胞饮进入细胞、表皮生长因子通过受体介导的内吞作用进入细胞。本发明所述组合物的有利效应可来自例如发酵过程产生的代谢产物例如有机酸例如乳酸、丁酸或乙酸。可选择地或者另外的，细菌细胞壁碎片和其他亚细胞细菌组分例如蛋白质、碳水化合物、核酸片段和脂类可影响细胞对麸质和麸质相关的多肽的应答。

相应地，本发明特别描述了用于保护细胞免受麸质和麸质相关的肽的可能的毒性效应的组合物和方法。所述组合物可包括副干酪乳杆菌CBA L74在其中生长的介质或者经副干酪乳杆菌CBA L74发酵的食物制品例如乳制品或谷类制品。在一些实施方案中，所述介质或食物制品可进行处理，例如通过物理化学方法例如离心，以去除在介质或食物制品中培养的全部或基本上全部副干酪乳杆菌CBA L74细胞。在一些实施方案中，所述组合物可包括分离的副干酪乳杆菌CBA L74以及生理学载体。所述载体可以是食物制品，但是本发明不限于此并且在一些实施方案中所述载体可以是药理学载体。

还提供了制备和使用所述组合物的方法。本发明的方法包括生产含副干酪乳杆菌CBA L74的组合物的方法、用副干酪乳杆菌CBA L74发酵食物制品的方法和将所述组合物施用给具有麸质相关病症的受试者的方法。所述方法可用于人受试者或者兽医学。无论何种受试者(人或非人)，任意现有方法可包含鉴定受试者的步骤。例如，所述方法可包括确定受试者是否需要治疗的步骤。

组合物

副干酪乳杆菌CBA L74

本发明的组合物可包括益生菌有机体副干酪乳杆菌CBA L74。世界卫生组织已将益生菌定义为：“当施用足够量时可对宿主健康有利的活性微生物”。在一些实施方案中，可将所述副干酪乳杆菌CBA L74进行处理例如暴露至热、γ-辐照或者紫外辐照，以使其无复制性。无复制性副干酪乳杆菌CBA L74可以是死细胞或已不具有细胞***能力的活细胞。无复制性副干酪乳杆菌CBA L74可以是完整的细胞或者已被部分或完全裂解的细胞。在一些实施方案中，无复制性细胞可包括完整细胞和裂解的细胞的混合物。

在一些实施方案中，所述组合物可包括副干酪乳杆菌CBA L74的发酵物，其中的副干酪乳杆菌CBA L74细胞已被全部或基本上全部移除。将细胞从生长介质中分离的方法是本领域公知的，并且可依赖物理方法例如离心以产生细胞沉淀物和培养物上清、过滤、超滤、切向流过滤、正常流过滤或反渗透。可选择地或者另外的，所述分离方法可以是基于配体的并且包括例如特异地结合到副干酪乳杆菌CBA L74的抗体。可将所述抗体偶联到固相支持物例如磁珠。

所述组合物包括一种或多种副干酪乳杆菌CBA L74代谢产物，即由副干酪乳杆菌CBA L74产生的任意物质。所述代谢产物可由一种或多种基因编码或者其可由一种或多种基因产物的酶活性产生。代谢产物包括例如小分子例如氨基酸、核苷、核苷酸以及较大的聚合结构例如多肽、碳水化合物、核酸、蛋白聚糖和脂类。所述代谢产物可以是初级代谢产物例如例如直接参与正常细胞功能的代谢产物，或者次级代谢产物例如基础细胞功能通常不需要的代谢产物。代谢产物还可包括初级代谢产物或次级代谢产物合成过程中产生的任意代谢中间产物。中间产物可包括但不限于恩布登-迈耶霍夫途径(Embden-Meyerhofpathway)、戊糖磷酸(戊糖-P)途径、恩特纳-杜德洛夫途径(Entner-Doudoroffpathway)、柠檬酸循环和氨基酸生物合成的中间产物。

示例性初级代谢产物包括但不限于醇类例如乙醇、甲醇、丁醇；氨基酸例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、瓜氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；核苷酸例如5'鸟苷酸；抗氧化剂例如异抗坏血酸(isoasorbic acid)；有机酸例如乙酸、乳酸、柠檬酸、甲酸；维生素例如维生素B12；糖、脂肪酸例如短链脂肪酸；多胺；肽例如细菌素例如羊毛硫抗生素(lantibiotic)例如乳酸链球菌素或者非羊毛硫抗生素(nonlantibiotic)例如肠道菌素(enterocin)、植物乳杆菌素W、植物乳杆菌素S。

代谢产物也可以是次级代谢产物。次级代谢产物通常是基础细胞功能不需要的。次级代谢产物变化范围大，示例性的次级代谢产物包括抗生素、激素、黄酮类、萜类、生物碱、类苯基丙烷、苯衍生物、己醇衍生物、香豆素类、二苯乙烯类、羟腈、硫代葡糖酸盐类、甾醇类和皂苷类。

乳酸杆菌在乳制品发酵过程中典型地产生以下代谢产物：乳制品发酵过程中产生乳酸/乳酸盐、乙酸盐、乙醇、甲酸盐、乙醛、α-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰以及2,3-丁二醇(丁二醇)。发酵可以是微生物引起或促成将复杂有机物分解为简单物质的任意过程。

副干酪乳杆菌CBA L74代谢产物可包含在介质、发酵物或培养物的上清中。在一些实施方案中，可将所述代谢产物从介质、发酵物或培养物的上清中部分地分离或充分地分离。因此。功能性代谢产物即可减少麦醇溶蛋白肽的细胞进入的代谢产物可包含或不含上述任意代谢产物。依据具体代谢产物的结构和化学性质，分离代谢产物的方法可不同。部分地或充分地分离的代谢产物将保持介质、发酵物或培养物上清的功能活性，即减少麦醇溶蛋白肽的细胞进入的能力。因此，如果副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清能够减少麦醇溶蛋白肽进入细胞，那么可预测从副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清中部分地或充分分离的代谢产物也将减少麦醇溶蛋白肽进入细胞。标准的本领域公知的方法可用于分离和鉴定副干酪乳杆菌CBA L74代谢产物。示例性方法包括例如稳定性分析例如对热、pH和/或酶活性的稳定性；色谱分析例如尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法、薄层色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相色谱法；质谱法。在一些实施方案中，代谢产物是热稳定的，也就是说暴露至超过正常生理范围的温度例如50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃后其可保持功能活性，即阻止麦醇溶蛋白肽进入细胞的能力。

麸质和麸质相关的多肽

与具体形式无关，本发明的组合物可减少麸质和麸质相关的多肽的细胞摄取。麸质和麸质相关的多肽是谷物饮食中主要的储藏蛋白(storage protein)。麸质发现于小麦中。紧密关联的蛋白大麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白分别发现于大麦和黑麦中。已发现了数百种编码麸质和麸质相关的蛋白质的基因。除营养属性外，麸质通过影响面团的水吸收力、内聚性、粘度和弹性在决定小麦特有的烘焙质量中起重要作用。麸质实质上是两种多肽组分的复合物，基于其在含水乙醇中的溶解度分为：可溶的麦醇溶蛋白和难溶的麦谷蛋白。两种组分都是由以高谷氨酰胺和脯氨酸含量为特征的多种关联蛋白成分组成。

麦醇溶蛋白是分子量(MW)约28,000-55,000的单体蛋白，其等电点约pH3.0-4.0。有4种类型的麦醇溶蛋白多肽：α-麦醇溶蛋白、β-麦醇溶蛋白、γ-麦醇溶蛋白和ω-麦醇溶蛋白。α-麦醇溶蛋白的示例性氨基酸序列可见于GenBank：Gl:7209265(小麦(Triticum aestivum)290氨基酸，SEQ ID NO:7)；Gl:7209263(小麦269氨基酸，SEQ ID NO:8)；Gl:376341626(小麦210氨基酸，SEQ ID NO:9)；Gl:282721198(小麦，313氨基酸，SEQ ID NO:10)。

麦谷蛋白是较大的多聚体蛋白，MW范围从约100,00到大于10,000,000，平均MW约3,000,000。麦谷蛋白的等电点范围约6.5-7.0。二硫键还原后，产生的麦谷蛋白亚基显示出在含水乙醇中的溶解度与麦醇溶蛋白相似。基于初级结构，将麦谷蛋白亚基分为高分子量(HMW)亚基(MW＝67,000-88,000)和低分子量(LMW)亚基(MW＝32,000-35,000)。麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白具有高脯氨酸含量和谷氨酰胺含量。高脯氨酸含量使这些蛋白不能被人肠中的胃酶、胰酶和刷状缘酶完全蛋白水解消化，由于这些酶缺少脯氨酰内肽酶活性。这导致在小肠中积累具有高脯氨酸含量和谷氨酰胺含量的相对大的肽段(长度达到50个氨基酸)。

麦醇溶蛋白的具体氨基酸序列可不同，但是它们都含有可启动参与乳糜泻发病机制的免疫应答的T-细胞表位。小肠中的这些麸质特异的T细胞应答在产生最终导致小肠绒毛标志性萎缩和隐窝增生的炎性应答中起重要作用。特异的天然麸质肽可结合到HLA-DQ2/8，该HLA类型与乳糜泻的相关性最大。所述HLA结合可诱导固有层CD4T细胞应答，继而损伤小肠粘膜。组织损伤启动分泌伤口愈合酶组织转谷氨酰胺酶(tTG)。但是，tTG还可使麸质肽脱酰胺基。脱酰胺作用将中性的谷氨酰胺残基转变为带负电荷的谷氨酸残基。这些脱酰胺基的肽相对于未脱酰胺基的肽具有显著增加的对HLA-DQ2/8的结合亲和力。所述过程导致增强的麦醇溶蛋白的抗原递呈。脱酰胺基的肽的结合进一步活化固有层中麸质特异的CD4+T-辅助细胞1(Th1)，其继而增进上皮内淋巴细胞增多、隐窝增生、导致绒毛萎缩的细胞因子的产生以及产生麦醇溶蛋白和tTG的抗体的B细胞的扩张。

在α-麦醇溶蛋白和γ-麦醇溶蛋白以及麦谷蛋白中已鉴定了多个T细胞表位基序。其中多数在脱酰胺基后显示出增强的T细胞识别。此外，乳糜泻患者通常对超过一种麸质肽敏感。虽然DQ2/8相互作用表示迄今为止鉴定的与乳糜泻最显著的相关性，但是非免疫原性麸质肽对固有免疫***也有影响。

麦醇溶蛋白肽P31-43和P31-49通常不被T细胞识别。这些肽可诱导腹腔粘膜中的固有免疫应答。P31-43肽可延缓内吞膜泡成熟，因此减少表皮生长因子受体(EGFR)降解并延长EGFR激活。延长的EGFR激活已显示出可促进腹腔隐窝肠上皮细胞和培养的细胞系中的细胞增殖和肌动蛋白修饰。一旦进入肠的肠上皮细胞或人肠细胞系CaCo2，P31-43即与早期内吞膜泡相互作用，降低其流动性并延缓其成长为晚期内体。

不同的麸质肽参与到乳糜泻过程中。来自α-麦醇溶蛋白的生物活性肽有两组。含丝氨酸的肽组显示出实质的细胞毒性，而含苏氨酸的组具有启动乳糜泻患者中免疫反应的能力。含丝氨酸肽的活性与PSQQ和QQQP基序的存在相关。含苏氨酸肽例如QQPY和/或QPYP与免疫活性有关。

麦醇溶蛋白肽的序列变化范围大。具有与麦醇溶蛋白肽序列的部分相同的序列且起作用(例如为本发明的一种或多种目的)的多肽为麦醇溶蛋白肽。全长麦醇溶蛋白包括麦醇溶蛋白肽序列，并且本发明的一种或多种肽可部分地或全部地存在于所述麦醇溶蛋白序列中。序列与已发现于天然产生的麦醇溶蛋白的序列存在一定程度的差异但保留了其功能(例如保留了充分的麦醇溶蛋白肽毒性的活性)的肽是麦醇溶蛋白肽的生物活性变体。本文使用术语“麦醇溶蛋白”意指全长的天然产生的麦醇溶蛋白，使用术语“多肽”和“肽”意指其片段(即麦醇溶蛋白的片段)及其生物活性变体。因为所述多肽或肽可具有与麦醇溶蛋白中发现的序列相同的序列，所以所述多肽或肽是来自麦醇溶蛋白的片段。

虽然本发明的多肽的序列可不同，但是有用的多肽可包含SEQ ID NO:7-10的片段。所述多肽可包含植物细胞中天然表达的麦醇溶蛋白的氨基酸序列或由其组成。生物活性变体可包含例如与麦醇溶蛋白的野生型片段不同的氨基酸序列，由于其含有一种或多种保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体中至少50％的氨基酸残基与相应的麦醇溶蛋白野生型片段是相同的。生物活性变体还可包含与麦醇溶蛋白的野生型片段不同的氨基酸序列，由于非保守的氨基酸取代、添加和/或缺失。

将某些氨基酸序列称为“多肽”意在表示其为氨基酸残基的线性聚合物，并有助于将其与全长蛋白质相区别。因此，应理解多肽只包含麦醇溶蛋白(或其生物活性变体)的片段，但是还可包含另外的残基。本发明的多肽长度可变。例如，所述多肽可以具有8-40(例如12、14、16、18或20)个氨基酸或更长(例如达到约40个残基)。

麦醇溶蛋白的生物活性变体多肽可以其序列与相应的麦醇溶蛋白片段的相似或相同的程度进行表征。例如，生物活性变体的序列可与相应的野生型麦醇溶蛋白残基具有至少或约60％同一性。例如，麦醇溶蛋白多肽的生物活性变体的氨基酸序列可与麦醇溶蛋白(例如，SEQ ID NO:7-10示出的氨基酸序列)或本文所述的其他多肽(例如，SEQ ID NO:1-6所示的多肽)或其同源物(homolog)或直系同源物(ortholog)具有至少或约60％的序列同一性(例如至少或约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性)。

麦醇溶蛋白多肽的生物活性变体可保持充分的生物学活性以在具有麸质相关的病症的受试者中产生毒性。所述生物活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，其包括但不限于细胞摄取测定、基因表达测定或体内动物模型。生物活性变体可以鉴定，例如通过比较变体多肽与麦醇溶蛋白肽活性片段的相对活性。所述测定可包括无关的对照多肽(例如可在任意给定的测试中包含具有随机分布的相同氨基酸含量的肽，以及仅载体对照)。某些生物活性变体甚至比其同源的天然产生的麦醇溶蛋白的片段或全长具有更强的生物活性。更具体地，生物活性变体可具有天然形式多肽生物学活性的至少或约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更高。

可在乳糜泻中起作用的示例性α-麦醇溶蛋白肽包括P31-43,LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO.:1)；P31-49，LGQQQPFPPQQPYPQPQPF(SEQID NO:3)；P44-55，PQQPFPSQLP(SEQ ID NO.:5)；P57-68，QLQPFPQPQLPY(SEQ ID NO.:2)；P56-88,LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)和P63-76，QPQLPYPQPQLPYP(SEQ ID NO.:6)。

食物制品

本发明的组合物可包括生理上可接受的载体。所述生理上可接受的载体可以是食物制品或药用载体。术语“生理上可接受的”(“药学上可接受的”)是指当适量施用至动物或人时不产生相反的、变应性的或其他不良反应的分子实体和组合物。因此，本发明的组合物包括通过益生菌有机体副干酪乳杆菌CBA L74发酵的食物制品。所述食物制品可包括活性的或无复制性的副干酪乳杆菌CBAL74细胞。在一些实施方案中，可将所述食物制品加工以移除全部或基本上全部的副干酪乳杆菌CBA L74细胞。可使用可由副干酪乳杆菌CBA L74发酵的任意食物制品。所述食物制品可以是乳制品例如乳或以乳为基础的制品。示例性的乳源包括但不限于牛、绵羊、山羊、犁牛、水牛、马、驴、鹿和骆驼。无论来源如何，所述乳或乳制品可以是适于被副干酪乳杆菌CBA L74发酵的任意形式。例如，乳可以是全乳或者已被加工除去部分或全部乳脂的乳例如2脂肪％乳(2％milk)、1脂肪％乳(1％milk)或无脂乳。可选择地或另外的，可将乳预先消毒和或同质化、干燥并进行重构、浓缩或脱水。也可使用乳制品的成分包括酪蛋白、乳清蛋白或乳糖。在一些实施方案中，所述乳制品可以是从约1％到约30％重构的脱脂乳粉末，例如约2％、约5％、约7％、约9％、约10％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％重构脱脂乳粉末。乳制品发酵之前可将其与下述一种或多种组合：a)碳水化合物(例如二糖例如葡萄糖或淀粉)；b)脂质；c)维生素和d)矿物质。例如，脱脂乳粉末可与葡萄糖组合至约2％，例如约0.25％、约0.50％、约0.75％、约1.0％、约1.5％或约2.0％。

所述食物制品可以是谷物制品，例如稻、燕麦、玉米、蜀黍或稷。在一些实施方案中，谷物制品可以是小麦、大麦、黑麦或黑小麦。谷物制品可以是谷类整体或者被磨成粉。所述食物制品可以是单一种类的谷类或两种或更多种谷类的混合物例如燕麦粉加稻粉。谷物制品可以是适合人类食用的等级和类型或者可以是适合家养动物食用的制品。一般地，所述谷物制品在发酵之前是含水的。谷物的浓度可以变化，但有利的范围包括从约5％到约50％重量/体积，例如约8％重量/体积、约10％重量/体积、约12％重量/体积、约15％重量/体积、约18％重量/体积、约20％重量/体积、约22％重量/体积、约25％重量/体积、约30％重量/体积、约35％重量/体积、约40％重量/体积、约45％重量/体积或约50％重量/体积。示例性的浓度包括15％重量/体积稻或者18.5％重量/体积燕麦粉加5％重量/体积麦芽粉的混合物。可使用任意适于食用的酸调节含水谷物的pH。例如，所述酸可以是有机酸。可用的有机酸包括乙酸、柠檬酸、乳酸、脂肪酸、苹果酸以及酒石酸。可以使用任意两种或更多种酸的组合。在一些实施方案中，可使用柠檬酸将pH调节至约4.0。

所述食物制品也可以是蔬菜或水果制品，比如汁、泥、浓缩物、糊、酱、腌渍品或番茄酱。示例性的蔬菜和水果包括但不限于南瓜类(squashes)，例如西葫芦、黄色南瓜、笋瓜、南瓜；马铃薯、芦笋、西兰花、抱子甘蓝；豆类如菜豆、蜡豆、利马豆、蚕豆、大豆、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、黄瓜、大头菜，韭、韭葱、洋葱、糖豌豆、英国豌豆(English pea)、辣椒、红萝卜、芜菁甘蓝、番茄、苹果、梨、桃、李、草莓、覆盆子、黑莓、蓝莓、越橘、波森莓、醋栗、葡萄、葡萄干、橘子、柠檬、葡萄柚、香蕉、芒果、猕猴桃和杨桃。

所述食物制品也可以是由树的坚果或豆类制成的“乳状物”，例如豆浆或杏仁乳。

所述食物制品还可以包含动物蛋白，例如肉例如香肠、干肉、鱼和干鱼制品。

无论所用食物制品的类型，将所述制品与副干酪乳杆菌CBA L74组合并在一定温度共孵育一段足以使发酵发生的时间。可使用本领域已知的任意标准的发酵方法。具体发酵条件将根据许多因素而变化，包括例如食物制品的类型、食物制品的浓度、所用的装置、样品体积、副干酪乳杆菌CBA L74接种物的初始浓度、如果有的话共接种物的存在、发酵食品的感官特征以及发酵食品的预期用途。

用副干酪乳杆菌CBA L74接种之前将装置和底物(即将被发酵的食物制品)消毒以减低活细菌和/或真菌和/或感染性病毒的水平或将其消除。可使用标准方法或依据生产商的操作说明将所述装置消毒。用于底物消毒的具体方法的选择部分依赖于底物对消毒方法的稳定性。例如，可通过蒸气和压力消毒底物，例如通过高压灭菌法(autoclaving)、暴露至高压(例如超高压灭菌法(pascalization))的重复加热和制冷循环(例如间歇灭菌法(tyndalization))、超滤或辐照(例如暴露至γ-、x-、电子-束和/或紫外线(波长10nm到320nm，例如50nm到320nm、100nm到320nm、150nm到320nm、180nm到320nm或200nm到300nm))。处理结束后可取所述底物的等份并将其铺板至适合的介质上以确定不存在细菌和/或真菌污染。如果所述底物是通过暴露至高温来消毒的，那么应在用副干酪乳杆菌CBA L74接种之前将其冷却至至少37℃。

可通过标准方法将所述底物与副干酪乳杆菌CBA L74接种，所述副干酪乳杆菌CBA L74例如来自新鲜的液体培养物或接种前短时间内在水性介质中重悬的冻干培养物。一般而言，以约0.5×10⁶的浓度将副干酪乳杆菌CBA L74加入至约1×10⁶cfu/ml的底物，例如约1×10⁶cfu/ml、约2×10⁶cfu/ml、约5×10⁶cfu/ml、7×10⁶cfu/ml、8×10⁶cfu/ml。应将所述培养物充分搅拌以产生相对均匀的细菌和底物分布，但是不可过度因为副干酪乳杆菌CBA L74是厌氧菌。例如，5升培养物可以约150rpm搅拌。发酵温度一般是37℃。多种参数例如pH、O₂分压、搅拌速率、温度、气体混合、发泡级和底物浓度可在发酵过程中检测并相应地调整。可使用标准微生物学方法检测副干酪乳杆菌CBA L74的生长。至副干酪乳杆菌CBA L74的浓度介于约10⁸/ml和约10⁹/ml之间时进行发酵。依赖于底物和其他条件，可在接种后约10小时至约30小时，例如约12小时、约15小时、约18小时、约24小时、约30小时，达到该浓度。

发酵前、发酵过程和发酵后可使用标准微生物学方法测定底物样本以保证质量。示例性方法包括但不限于在Rogosa琼脂上培养副干酪乳杆菌CBA L74、在平板计数琼脂(PCA)上培养总需氧菌、在McConkay琼脂上培养大肠杆菌类、在强化梭菌琼脂(RCM)上培养梭菌。此外，可检测菌落数、菌落形态并与对照样本比较。

在一些实施方案中，可与副干酪乳杆菌CBA L74一起加入共接种物以帮助起始发酵。可用于乳制品发酵的共接种物包括但不限于例如嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、德氏乳酸杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌或肠膜样明串珠菌。一般来说，共接种物的浓度低于副干酪乳杆菌CBA L74的浓度，例如约1×10⁴/ml×10⁵/ml。嗜热链球菌的终浓度从约0.5×10⁸/ml到约2.5×10⁸/ml。

达到适合浓度的副干酪乳杆菌CBA L74后，可将所发酵的食物进一步加工利用。在一些实施方案中，可将所发酵的食物分解以移除全部或基本上全部副干酪乳杆菌CBA L74细胞。在一些实施方案中，可通过加入NaOH或KOH调节发酵食物的pH，例如从约3.0到接近中性例如6.5。在一些实施方案中，可将发酵的食物干燥。可通过本领域公知的能够保留发酵食物的免疫调节属性的任意方法将发酵的食物制品干燥。示例性干燥方法包括喷雾干燥法、冷冻干燥法例如冻干或转鼓式干燥。发酵食物制品的最终含水量可不同，但是其介于约1％和10％约之间或更高。在一些实施方案中，干燥过程可使副干酪乳杆菌CBA L74无复制性。

可在使用前将干燥的发酵食物水合。依据水合所用液体的量，所述发酵食物制品可含有约10²、约10³、约10⁴、约10⁵、约10⁶、约10⁷、约10⁸、约10⁹、约10¹⁰、约10¹¹和约10¹²cfu/ml当量的副干酪乳杆菌CBA L74。干燥的副干酪乳杆菌CBA L74不形成菌落，因此应理解所述量是基于干燥步骤之前存在于所述发酵食物中的活细菌数计算所得。在一些实施方案中，发酵食物制品可含有约10⁷到约10¹²cfu/g干重当量，例如约5×10⁷cfu/g、约1×10⁸cfu/g、约5×10⁸cfu/g、约1×10⁹cfu/g、约5×10⁹cfu/g、约1×10¹⁰cfu/g、约5×10¹⁰cfu/g、约1×10¹¹cfu/g、约5×10¹¹cfu/g干重当量。

可将两种或多种本发明方法制备的发酵食物制品在施用之前组合。例如，可将发酵的乳制品与发酵的谷物制品组合。可选择地，所述发酵食物制品可与其他食物制品例如非发酵的食物制品或使用其他细菌菌株发酵的食物制品组合。任意组合都可使用，只要能够保留所述发酵食物对麦醇溶蛋白肽的效应。示例性食物制品包括但不限于乳制品，例如牛奶、酸奶、凝乳、奶酪、干酪型制品、发酵乳、基于乳的发酵制品、基于乳的粉剂、婴儿配方奶、基于乳的糊状婴幼儿食品(strained infant food)、冰淇淋、意式冰淇淋(gelato)、布丁、汤、酱汁、原浆或调味品、老年人营养配方奶；谷物制品例如婴儿麦片食品(pablum)、基于谷物的糊状婴幼儿食品、燕麦片、谷粉(farina)、粗面粉(semolina)、玉米粉(polenta)、意大利面、饼干、薄脆饼干、能量棒；蔬菜制品例如蔬菜泥、基于蔬菜的糊状婴幼儿食品、腌制蔬菜包括黄瓜、白菜、胡萝卜、豆角、辣椒或开胃菜；水果制品例如基于水果的糊状婴幼儿食品、番茄制品、果泥、果酱、膏、番茄酱、水果泥；基于蛋白的制品例如豆类、香肠、午餐肉、热狗或肉类泥。在一些实施方案中，所述发酵食物可与宠物食品或动物饲料组合。

药物组合物

本发明的组合物可以与药学上可接受的载体组合。本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括可用作药学上可接受物质的介质的任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。

因此，本发明还包括药用组合物，其包含作为有效成分的本文所述副干酪乳杆菌CBA L74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物与一种或多种药学上可接受的载体组合。在一些实施方案中，可在副干酪乳杆菌CBAL74与所述药学上可接受的载体组合之前或其后使用常规消毒技术将其消毒。制备本发明的组合物时，通常将副干酪乳杆菌CBA L74或者由副干酪乳杆菌CBAL74产生的一种或多种代谢产物与赋形剂混合，通过赋形剂稀释或者包被在例如胶囊、片剂、囊剂(sachet)、纸剂(paper)或其他储存器形式的载体中。当赋形剂作为稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料(例如生理盐水)作为有效成分的媒介、载体或介质。因此，所述组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或者在液体介质中)、软膏剂、软和硬胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装的粉剂的形式。本领域公知的，稀释剂的类型可依据预期施用途径而不同。所得的组合物可包含另外的试剂例如防腐剂。赋形剂或载体是基于施用方式和施用途径选择的。可用于药物配方的适合的药用载体以及药用辅料见Remington'sPharmaceutical Sciences(E.W.Martin)，本领域非常知名的参考文本以及USP/NF(美国药典和国家处方)。适合的赋形剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。所述配方还可包括：润滑剂例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如甲基苯甲酸酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂和调味剂。所述药用组合物可按配方制造以在通过本领域公知的步骤施用给患者后提供迅速、持久或延迟释放的有效成分。

可用于本发明方法的药学上可接受的组合物，包括将副干酪乳杆菌CBAL74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物包埋至胶体中用于口服递送的那些，可依据标准技术制备。可将副干酪乳杆菌CBA L74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物干燥以及通过研磨或磨碎使其致密，并且充入胶囊中用于口服施用。在一些实施方案中，副干酪乳杆菌CBAL74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物可与一种或多种赋形剂例如崩解剂、填充剂、助流剂或防腐剂组合。适合的胶囊包括硬壳胶囊或软壳胶囊。任意基于脂质的胶体或者基于聚合物的胶体可用于形成胶囊。可用于胶体制备的示例性聚合物包括明胶、植物多糖或其衍生物例如卡拉胶和改良形式的淀粉和纤维素例如羟丙甲纤维素。可任选地，其他成分可加入胶凝剂溶液中，例如增塑剂例如甘油和/或山梨醇以减小胶囊的硬度、着色剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂和表面处理。在一些实施方案中，胶囊不包括明胶。在另一些实施方案中，胶囊不包括植物多糖及其衍生物。

不考虑初始来源或获得方式，可将副干酪乳杆菌CBA L74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物依据其用途按配方制造。所述组合物可以制药领域公知的方式制备，并且依据需要局部或全身治疗以及治疗的区域可通过多种途径施用。可经口服或通过局部施用(包括经眼和粘膜包括经鼻内、***和直肠递送)。在一些实施方案中，施用可以是经肺(例如通过吸入或喷入粉末或气雾剂，包括经雾化器、气管、鼻内、表皮和经皮)或者经眼睛。经眼睛递送的方法可包括局部施用(滴眼剂)、结膜下施用、眼周或玻璃体内注射或者通过手术置于结膜囊内的球囊导管或眼科植入体。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或者经颅内例如鞘内或脑室施用。肠胃外施用可以单次灌注剂方式或者可通过例如持续灌注泵。用于局部施用的药用组合物和配方可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉末等。常规药物载体，水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或需要的。

所述组合物可以单位剂型配制，每一剂量包含例如从约0.005mg到约2000mg副干酪乳杆菌CBA L74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物，每日的剂量。在一些实施方案中，所述组合物可含有约10²、约10³、约10⁴、约10⁵、约10⁶、约10⁷、约10⁸、约10⁹、约10¹⁰、约10¹¹和约10¹²cfu/ml当量的副干酪乳杆菌CBA L74。术语“单位剂型”是指适于作为用于人受试者或其他哺乳动物单一剂量的物理离散单位，每一单位含有经计量可产生需要的治疗效果的预定量的活性物质与适合的药用赋形剂组合。为制备固态组合物例如片剂，将主要有效成分与药用赋形剂混合以形成含有本发明化合物的均一化混合物的固态预制组合物。将所述预制组合物称为均一的时，所述有效成分通常均匀的分散在整个组合物中以使得组合物可被容易地再分为等效的单位剂型例如片剂、丸剂和胶囊。然后将所述固态预制剂再分为含有例如从0.005mg到约1000mg本发明的副干酪乳杆菌CBA L74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物的上述类型的单位剂型。

所述组合物可以单位剂型配制，每剂含有例如从约0.1mg到约50mg、从约0.1mg到约40mg、从约0.1mg到约20mg、从约0.1mg到约10mg、从约0.2mg到约20mg、从约0.3mg到约15mg、从约0.4mg到约10mg、从约0.5mg到约1mg、从约0.5mg到约100mg、从约0.5mg到约50mg、从约0.5mg到约30mg、从约0.5mg到约20mg、从约0.5mg到约10mg、从约0.5mg到约5mg、从约1mg到约50mg、从约1mg到约30mg,、从约1mg到约20mg、从约1mg到约10mg、从约1mg到约5mg、从约5mg到约50mg、从约5mg到约20mg、从约5mg到约10mg、从约10mg到约100mg、从约20mg到约200mg、从约30mg到约150mg、从约40mg到约100mg、从约50mg到约100mg有效成分。

在一些实施方案中，可将本发明的片剂或丸剂包衣或否则地复合(compound)以提供有利于长期作用的剂型。例如，所述片剂或丸剂可包括内剂和外剂组分，后者包被前者。所述2种组分可通过肠衣层(enteric layer)分隔，肠衣层在胃中可抗崩解并保障所述内层组分完整地进入十二指肠或者延缓释放。多种材料可用于所述肠衣层或包衣层，所述材料包括多种聚合酸和聚合酸与材料例如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。

可将本发明的组合物纳入其中以用于口服施用或通过注射施用的液态剂型包括水溶液、适当的调味糖浆、水性或油性悬液和含有食用油例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的调味乳剂以及酏剂和类似的药用载体。

本发明的组合物在药用组合物中的比例或浓度可依据多种因素，包括剂量、化学特性(例如疏水性)和施用途径而变化。例如，本发明的副干酪乳杆菌CBAL74或者由副干酪乳杆菌CBA L74产生的一种或多种代谢产物可提供于胶囊中，含量约0.005mg到约1000mg用于口服施用。

使用方法

麸质相关的病症

本发明的组合物广泛地并且多方面地用于治疗麸质相关的病症。所述治疗对其有利的受试者包括在消化麸质和麸质相关的多肽时产生毒性效应或具有毒性效应的风险的受试者。所述毒性效应包括大范围的症状，包括但不限于炎症、自身免疫反应、胃肠道症状例如腹泻、脂肪泻、腹胀、体重减轻、贫血、骨质疏松症、关节炎、不育、周围神经病变、肝功能衰竭和抑郁症。麦醇溶蛋白肽毒性可起源于细胞毒性或免疫机制或者细胞毒性与免疫机制的组合。麦醇溶蛋白肽毒性症状可包括炎症、自身免疫反应、胃肠道症状例如腹泻、脂肪泻、腹胀、体重减轻、贫血、骨质疏松、关节炎、不育、周围神经病变、肝功能衰竭和抑郁症。麸质相关的病症包括乳糜泻，包含多种亚型例如典型乳糜泻、非典型乳糜泻、潜伏乳糜泻和沉默乳糜泻、疱疹样皮炎、麸质共济失调和麸质敏感。

乳糜泻的亚型包括典型乳糜泻、非典型乳糜泻、潜伏乳糜泻和沉默乳糜泻。与乳糜泻相关的典型症状是腹泻、腹胀和发育不良。这些症状最常见于6到24个月的儿童。非典型乳糜泻的特征是较轻的胃肠道症状。其与肠外临床表现相关，例如诊断时发现缺铁性贫血、骨质疏松症、身材矮小症、关节炎、不育、周围神经病变、高转氨酶血症(hypertransaminasemia)以及在某些情况下肝功能衰竭。潜伏乳糜泻用于指携带HLA-DQ2和/或HLA-DQ3的患者，有或无血清学阳性以及尚未发生绒毛萎缩但可能具有轻度炎症或免疫激活的患者。该亚型的患者可能无症状或者可能具有肠外临床表现。沉默乳糜泻的特征是血清学阳性和绒毛萎缩且其他方面无症状的患者。实施不含麸质饮食后，一些无症状患者在其身体和精神的不同生活方面显著改善，例如食欲改善、疲劳减轻或者行为异常减少。不考虑亚型，许多乳糜泻病例未被诊断，这将患者置于长期并发症，例如不育和恶性肿瘤例如淋巴瘤和肠癌的风险中。

乳糜泻的表现可存在很大差异。乳糜泻通常存在于儿童中，是一种发育迟缓的疾病并伴随着吸收不良的典型症状：显著地体重减轻、脂肪泻及多种缺陷，尽管可存在其他肠外临床症状例如身高发育停滞并且女孩可能出现***延迟。

在危险状态下乳糜泻患病率增加，例如乳糜泻家族史、自身免疫疾病、IgA缺乏、某些遗传性综合征(唐氏综合征、特纳综合征和William综合征)以及1型糖尿病和甲状腺炎。

遗传素质在乳糜泻中起重要作用。乳糜泻与位于染色体6p21的具体人白细胞抗原(HLA)II类基因，HLA-DQ2和HLA-DQ8密切相关。多数乳糜泻患者(约95％)表达编码主要组织相容性复合体(MHC)II类蛋白HLA-DQ2的基因。另外的患者通常是HLA-DQ8阳性。HLA-DQ2单倍体是常见的并且约30％的高加索人携带，这意味着HLA-DQ2和/或HLA-DQ8的存在对于疾病发展是必要的但并不是充分的，由于其经评估的风险效应仅为36％到53％。非HLA基因也有助于乳糜泻易感性。

乳糜泻的诊断通常依赖于多方面的标准，包括：1)存在典型的乳糜泻症状；2)血清学试验阳性，包括例如tTG的高滴度IgA抗体(anti-tTG)、脱酰氨基a-麦醇溶蛋白肽的高滴度抗体；3)HLA-DQ2和/或HLA-DQ8基因型；4)小肠活检发现乳糜性肠病；和5)对不含麸质饮食反应。乳糜泻表象的广泛变异性致使一些医生采纳了定量方法，定义为“五分之四法则”。即，如果满足5个标准中的至少4个即可确诊为乳糜泻。

疱疹样皮炎是乳糜泻的皮肤症状，伴随着水疱疹和特异病征性皮肤IgA沉积。主要的症状是强烈的瘙痒和灼烧感。所述疹具有独特的对称分布。在超过90％的患者中，肘及其以上的前臂受到影响。通常受影响的其他部位包括臀部、膝盖、双肩、骶骨、面部、头皮、颈部及躯干。65％到75％的疱疹样皮炎患者中发现了上部小肠粘膜中的乳糜型绒毛萎缩。即使在具有明显正常的活组织检查的患者中，粘膜层细微的改变例如上皮内淋巴细胞数目增加也指示麸质敏感性。疱疹样皮炎患者可能表现出与具有乳糜泻患者相同的一系列症状、相关病症和并发症(自身免疫疾病、缺铁性贫血、骨质疏松症和恶性肿瘤)。疱疹样皮炎患者通常采用不含麸质饮食，因为疱疹样皮炎患者的疹是麸质敏感的。

麸质共济失调还被定义为自发性偶发性共济失调与麸质致敏的阳性血清学标记。与乳糜泻类似，其是自身免疫疾病特征是小脑损伤导致共济失调。麸质共济失调患者典型地具有高滴度抗麦醇溶蛋白抗体。转谷氨酰胺酶抗体的广泛沉积已在麸质共济失调患者的脑血管周围发现。麸质共济失调通常只呈现小脑性共济失调，较少地会同时发生肌阵挛、上腭震颤或视性眼阵挛共济失调。麸质共济失调通常起病隐袭，平均发病年龄为53岁。许多患者在肠活组织检查中发现肠病变。抗麦醇溶蛋白抗体或抗tTG抗体阳性且无其他共济失调诱因的患者通常采取严格不含麸质的饮食并定期随访。

麸质敏感，也称作非乳糜性麸质敏感或麸质不耐受，通常的特点是功能的、形态学的和免疫学的病症，不具有乳糜泻的所有特征但是仍然对麸质排除产生反应。麸质敏感与乳糜泻不同，其不伴随抗tTG自身抗体或其他自身免疫并发症。麸质敏感患者的小肠通常是正常的。麸质敏感的症状可能类似于乳糜泻相关的症状，但通常具有肠外症状例如行为改变、骨或关节痛、肌肉痉挛、腿麻木、体重减轻和长期疲劳。没有对麸质敏感特异的实验室生物标记。通常的诊断是基于排除标准；排除食用含麸质食物后的开放性挑战最常用于评估从患者饮食中排除或减少麸质能否改善健康。

治疗方法

当临床有利的效果产生时，受试者被有效地治疗。这可能意味着例如与麸质相关病症有关的症状完全消退、与麸质相关病症有关的症状的严重程度下降或者与麸质相关病症有关的症状的进程趋缓。所述方法还可包括以下步骤a)鉴定具有麸质相关病症的受试者(如患者以及更具体地人类患者)；以及b)对受试者提供含有本发明的副干酪乳杆菌CBA L74或者一种或多种副干酪乳杆菌CBA L74代谢产物的组合物，例如任意发酵的食物制品，或者生理上可接受的载体中含副干酪乳杆菌CBA L74的组合物。提供给受试者的导致与麸质相关病症有关的症状完全消退、与麸质相关病症有关的症状的严重程度下降或者与麸质相关病症有关的症状的进程趋缓的此类组合物的量则被认为是治疗有效量。本发明的方法还可包括检测步骤以帮助优化剂量和进程以及预测效果。

本发明的方法可被应用于广泛范围的物种，如人类、非人类灵长类(如猴)、马、猪、牛或其它家畜、狗、猫或其他作为宠物饲养的哺乳动物、大鼠、小鼠，或其它实验动物。本发明的组合物在治疗组合物和治疗方案中是有用的或者对于制造可用于治疗本文所述病况(如麸质相关病症)的药剂是有用的。

本发明的组合物可以作为受试者普通日常饮食的一部分口服施用。所述食物组合物可作为儿童和成人的营养支持施用。当配制成药物时，所述组合物可施用到宿主身体的任何部位以供随后递送至靶细胞。组合物可被递送到，但不限于，脑、脑脊液、关节、鼻粘膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或哺乳动物的腹腔。对于递送途径，组合物可以通过静脉内、颅内、腹膜内、肌内、皮下、肌肉内、直肠内、***内、鞘内、气管内、皮内或经皮注射施用，通过口服或鼻粘膜施用或者随时间推移的逐步灌注。在另外的实例中，组合物的气雾剂可通过吸入施用宿主。

无论将组合物配制为食物制品还是药物，所需的剂量都将依赖于施用途径、制剂性质、受试者的自身状况例如免疫***不成熟或胃肠道病症，受试者身高、体重、体表面积、年龄和性别，施用的其它药物，以及主治临床医师的判断。适合的剂量在0.01至1,000mg/kg范围内。典型的剂量范围从约1μg/kg体重至约1g/kg体重每天。在一些实施方案中，剂量范围是从约0.01mg/kg体重到约100mg/kg体重每天。在一些实施方案中，剂量可以是例如1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或100mg/kg。剂量可能取决于这样的变量，例如疾病或病症的类型和发展程度、具体患者的总体健康状况、所选化合物的相对生物效能、赋形剂的成分以及施用途径。

有效剂量可从体外或动物模型测试***得到的剂量-反应曲线推断。例如，在基于细胞的测定中，分析麦醇溶蛋白肽进入细胞的效应可能是有用的。还可测定组合物对抗体应答、细胞因子产生和T-细胞应答的效应。

鉴于与麸质相关病症有关的症状范围、细胞靶的多样性以及不同施用途径的差异效应，所需的剂量可预期有很多变化。可使用标准实验方法调整这些剂量水平的变化以使其最优化，如本领域公知的。施用可以是单次的或多次的(例如，2-或3-、4-、6-、8-、10-、20-、50-、100-、150-或更多倍)。所述化合物在适合的递送载体(例如聚合微粒或可植入装置)中的胶囊化可增加递送的效率。

使用本发明提供的任意组合物治疗的持续时间可以是从短至1天到长至宿主的生存期(例如许多年)的任意时间段。例如，可这样施用组合物：每周1次(例如4周至数月或多年)、每月1次(例如3到12个月或多年)或者每年1次持续5年、10年或更长时间。还需要注意的是，治疗的频率可不同。例如，所述组合物可被每天、每周、每月或者每年1次(或者2次、3次等)地施用。

本领域技术人员公知的任意方法可用于确定具体的应答是否被诱导。能够测定具体疾病等级的临床方法可用于确定应答是否被诱导。例如，可检测受试者是否症状缓解，例如腹泻、腹痛、腹部绞痛、腹胀缓解以及耐受麸质挑战的能力。可选择地或另外的，可使用血清标记物、成像技术例如超声、x-射线以及内窥镜检查方法。

所述组合物还可与其他治疗方式相结合施用。所述治疗方式将依据具体病症而不同，但是可包括例如饮食疗法例如不含麸质的饮食。在一些实施方案中，饮食疗法可包括引入小麦制品，其来自已通过选择育种或重组技术加工可表达毒性T细胞表位数量减少的麦醇溶蛋白形式的小麦株。在一些实施方案中，饮食疗法可包括施用益生元，即可刺激一种或多种对宿主健康有利的肠道微生物生长或活性的试剂。示例性益生元包括反式低聚半乳糖、菊粉、低聚果糖和乳果糖。

其他治疗方式包括施用治疗试剂。治疗试剂可以是酶，例如可通过靶向对体内天然存在的蛋白酶具有抗性并且含有高免疫原性肽的富含脯氨酸的肽来降解麸质的内肽酶(也称作麸质酶(glutenase))。示例性内肽酶包括脯氨酰内肽酶和ALV003，来自发芽的大麦种子的半胱氨酸内肽酶和来自荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas capsulate)的脯氨酰内肽酶的组合。

其他治疗试剂包括乳糜泻典型的肠通透性增强的抑制剂例如AT-1001(拉雷佐肽(larazotide))，一种八肽的细胞旁通透性抑制剂，其可抑制麦醇溶蛋白诱导的肠上皮细胞的细胞骨架重排、紧密连接分解以及峰值F-肌动蛋白增加。其他治疗试剂包括tTG抑制剂、免疫***调节剂以及使用肽为基础的疫苗(Nevvax2)的脱敏疗法。

两种或更多种治疗剂的并行施用不需要在相同时间或通过相同途径施用，只要在制剂发挥它们的疗效期间存在时间的重叠。还涉及同时或相继施用，其是在不同天或不同周施用。

制品

本发明的组合物也可以组装在试剂盒中，和使用说明书一起。例如，所述试剂盒可包含测定量的含有一种或多种由副干酪乳杆菌CBA L74发酵的食物制品组合物。所述使用说明书可通过任意适合的媒介传达。比如，可将其印刷在纸上***一种或多种语言或者可听地或可视地(例如在一个光盘中)提供。包装材料可包括例如瓶、包、箱的包装材料。在一些实施方案中，所述试剂盒可包含测定量的含有生理上可接受载体中的副干酪乳杆菌CBA L74的组合物，以及任意形式或上述形式的包装材料和使用说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒可包含测定量的含有副干酪乳杆菌CBA L74的一种或多种代谢产物的组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包含副干酪乳杆菌CBA L74细胞，即代谢产物可与副干酪乳杆菌CBA L74细胞部分地或充分地分离。所述试剂盒的组分可适合于直接使用。但是，本发明包括含有可能要在使用前稀释的浓缩成分和/或材料的试剂盒。

实施例

实施例1:材料和方法

肽:α-麦醇溶蛋白P31-P43(SEQ ID NO.:1)和P57-68(SEQ ID NO.:2)是体外合成并结合到由意大利那不勒斯Inbios制造的荧光染料丽丝胺。色谱分析表明所述肽是99％纯度。

Caco2肽进入测定：将Caco2细胞(一种人上皮结肠癌细胞系)的培养物与标记的肽共孵育15分钟。通过反复洗涤除去所述标记的肽并在共焦显微镜下检查细胞。形态学分析显示：孵育15分钟后，标记的肽已进入细胞并定位于内吞囊泡形成小色斑。使用评估多个显微视野荧光强度的专用软件包进行定量分析。

Caco2细胞培养：CaCo-2细胞生长在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(GIBCO，圣朱利亚诺米兰(San Giuliano Milanese)，意大利)、10％胎牛血清(FBS)(GIBCO，圣朱利亚诺米兰，意大利)和1mM谷氨酰胺(GIBCO，圣朱利亚诺米兰，意大利)中，在37℃、5％的CO₂浓度的培养箱中。

副干酪乳杆菌CBA L74培养：副干酪乳杆菌CBA L74(国际保藏登记号LMGP-24778)的分离如WO 2012/177556(其以引用方式全文纳入本文)中所述。将细胞在补充胎牛血清和谷氨酰胺的50ml DMEM中，在37℃以每分钟160转振荡培养过夜。细菌浓度在Beckman DU-7分光光度计中600nm波长下通过分光光度法测定。光密度(OD)读数用于按如下公式计算细菌浓度：OD2＝1.5×10⁹CFU/ml。用于实验的不同的细菌浓度通过将细菌培养物在无抗生素的新鲜培养基中稀释获得。对于单独使用上清液的实验，将细菌培养物在室温以3000rpm离心10分钟。将上清液回收并通过0.2微米孔径的过滤器过滤。

麦醇溶蛋白肽和EGF-Alexa-488：合成肽(Inbios，95％纯度，MALDI-toff测定如预期)是通过Ultrasart-D20(赛多利斯，哥廷根，德国)过滤得到。P31-43肽具有氨基酸序列：LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO：1)。P57-68肽具有氨基酸序列：QLQPFPQPQLPY(SEQ ID NO：1)。将肽与丽丝胺偶联，通过HeNel激光(543nm)用610nm长波段发射激发红色荧光。EGF-Alexa-488来自Molecular Probes公司，圣朱利亚诺米兰，意大利。

荧光测定：我们测试了副干酪乳杆菌CBA L74对麦醇溶蛋白肽或EGF-Alexa进入Caco-2细胞的影响。将Caco2细胞于无菌玻璃盖玻片上生长，转移到24孔板中，并使用不同浓度的副干酪乳杆菌CBA L74处理，其浓度范围从10⁴到10⁸cfu/ml。对于使用不含细胞的上清的实验，Caco2细胞是使用从浓度达到10⁸cfu/ml的副干酪乳杆菌CBA L74培养物收集的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的。使用新鲜的或者加热后的上清。在一些实验中，将上清在80℃加热15分钟。在另外的实验中，将上清煮沸5分钟。Caco2细胞使用不同的细菌制剂在5％CO₂气氛中37℃处理30分钟，然后与麦醇溶蛋白肽P31-43-丽丝胺(liss)或P57-68^liss或者EGF-Alexa-488共孵育。肽浓度如下：P31-43^liss和P57-68^liss为20μg/ml；未标记的肽使用50μg/ml；EGF-Alexa-488为10μg/ml。加入所述肽后，将细胞在5％CO₂气氛中37℃孵育30分钟。然后使用PBS 1×(Gibco)洗涤3次去除培养基。将盖玻片使用多聚甲醛3％(Sigma-Aldrich)室温下短暂固定(5分钟)，然后包埋并使用共聚焦显微镜(LSM 510Zeiss)观察。生成图像并考虑用AISZeiss软件分析图像以评价显微视野中的荧光强度。所有展示的显微照片的放大倍数是相同的(63×物镜)。内吞囊泡中标记的肽和EGF-Alexa呈现为红色(肽)或绿色(EGF)小点。

统计分析：通过GraphPad Prism进行统计分析并产生图表。计算平均值和标准差。通过学生t检验进行评价。p<0.05的结果认为是显著的。

实施例2:活的副干酪乳杆菌CBA L74对α-麦醇溶蛋白肽进入的影响

活的副干酪乳杆菌CBA L74可减少P31-43和P57-68进入CaCo2细胞。共聚焦荧光图像见图1所示。对照细胞(左图)在不存在副干酪乳杆菌CBA L74条件下与丽丝胺标记的P31-43共孵育，显示出与含P31-43的内吞小泡(白色箭头)对应的清晰的荧光模式。相反地，在存在副干酪乳杆菌CBA L74条件下与丽丝胺标记的P31-43共孵育的细胞中荧光减少(右图)。

定量分析显示，副干酪乳杆菌CBA L74对P31-43进入的影响是剂量依赖的，并且是统计学显著的。图2示出了对平行双样的5次独立实验的结果。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。如图2所示，使用10⁴、10⁶和10⁸副干酪乳杆菌CBA L74处理CaCo2细胞，得到统计学显著的剂量依赖的P31-43进入的降低。

P57-68肽检测到类似的效应。除使用P57-68代替P31-43之外，图3中实验与图2中实验完全相同地实施。如图3所示，使用10⁴、10⁶和10⁸副干酪乳杆菌CBA L74处理CaCo2细胞，得到统计学显著的剂量依赖的P57-68进入的降低。

实施例3:副干酪乳杆菌CBA L74分离的DNA对α-麦醇溶蛋白肽进入的影响

通过标准方法提取并纯化副干酪乳杆菌CBA L74的DNA。如图4所示，存在副干酪乳杆菌CBA L74DNA的量等价于10⁸个细胞时用P31-43处理CaCo2细胞未阻止肽进入。

实施例4:副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清对α-麦醇溶蛋白肽进入的影响

通过离心收集副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清，并将所得培养物上清过滤以除去活的细菌和细胞碎片。存在P31-43肽时，将等价于10⁸个细胞的上清施用于CaCo2细胞。对照CaCo2细胞用10⁸个活的副干酪乳杆菌CBA L74细胞处理。图5示出了对平行双样的4次独立实验的结果。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。

如图5a中柱状图所示，用活的副干酪乳杆菌CBA L74细胞处理CaCo2细胞也导致统计学上显著降低的P31-43肽进入。用副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清处理CaCo2细胞导致类似量度的降低。图5b示出了该实验的共聚焦图像。所示图像清晰地显示，副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清可减少P31-43肽进入。

使用P57-68代替P31-43的类似实验的结果见图6。使用活的副干酪乳杆菌CBA L74细胞处理CaCo2细胞也导致统计学上显著降低的P57-68肽进入(图6a)。用副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清处理CaCo2细胞导致类似量度的降低。图6b示出了该实验的共聚焦图像。所示图像清晰地显示，副干酪乳杆菌CBAL74培养物上清可减少P57-68肽进入。

实施例5:热处理的副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清对α-麦醇溶蛋白肽进入的影响

依据实施例4的方法收集副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清，然后在37℃或80℃加热30分钟。然后将加热的上清冷却，并于存在P31-43肽条件下应用于Caco2细胞。图7示出了未用上清处理的对照细胞平行双样的5次独立实验的结果、用未加热(“37℃”)的上清处理的对照细胞平行双样的5次独立实验的结果和用加热(“80℃”)的上清处理的细胞平行双样的2次独立实验的结果。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。如图7所示，加热到80℃的上清保留了未加热上清阻止P31-43肽进入Caco2细胞的能力。该实验的共聚焦图像见图7中右图所示。所示图像清晰地显示出，经加热处理的副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清与未加热处理的副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清减少P31-43肽进入的程度相同。总之，所述数据显示副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清的效应并非来自于酶活性。

实施例6:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻和燕麦对α-麦醇溶蛋白肽进入的影响

制备了副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻。发酵的稻、稻发酵的上清或者加热处理的稻发酵的上清于存在P31-43肽的条件下应用至CaCo2细胞，并依据实施例2的方法检测肽进入。如图8所示，发酵的稻、稻发酵的上清或者加热处理的稻发酵的上清所有三个处理相对于未处理的CaCo2细胞都减少了肽进入。如图9所示，存在发酵的稻的条件下，P31-43肽进入的减少是统计学显著的(右侧柱)。存下发酵的燕麦的条件下检测到类似的统计学显著的效应(左侧柱)。

实施例7:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻和麦对葡聚糖-得克萨斯红进入Caco2细胞的影响

制备副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻和发酵的燕麦。如图10所示，将Caco2细胞与副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻或副干酪乳杆菌CBA L74发酵的燕麦共孵育，导致与分别使用未发酵的稻和燕麦处理的细胞相比统计学显著下降的葡聚糖-得克萨斯红细胞进入。由于葡聚糖通常是由细胞通过巨胞饮摄取的，所以这些数据表明副干酪乳杆菌CBA L74的代谢产物可阻止巨胞饮途径。

实施例8:副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清对表皮生长因子(EGF)进入Caco2细胞的影响

依据实施例4的方法收集副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清，并于存在AlexaEGF(Invitrogen)的条件下将其应用于Caco2细胞。如图11的柱状图所示，使用副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清处理Caco2细胞，导致统计学显著下降的EGF细胞进入。该实验的共聚焦图像见图12。由于EGF摄取需要特异性受体的结合例如结合到EGF受体，所以这些数据表明副干酪乳杆菌CBA L74的代谢产物可阻止网格蛋白介导的内吞途径。

实施例9:副干酪乳杆菌CBA L74对P31-43和P57-68进入Caco2细胞的浓度依赖性影响

将Caco2细胞使用浓度逐步增加的副干酪乳杆菌CBA L74处理，然后与麦醇溶蛋白肽P31-43^liss或P57-68^liss共孵育，如实施例1所示。随着细胞内分布，曝光30分钟后含有标记的P31-43或标记的P57-68的胞吞囊泡显示为红色的点。副干酪乳杆菌CBA L74处理导致剂量依赖地减少P31-43和P57-68进入Caco-2细胞。如图13b、13c和13d所示，对于P31-43，使用10⁴、10⁶和10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的细胞相对于未处理的细胞中分别出现荧光强度下降(图13a)。白色箭头指示含P31-43^liss的囊泡。这些结果定量地显示于图14中。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。图14中数据代表5次独立实验。图14中柱状图比较了未处理对照细胞(“UN”)与存在10⁴、10⁶或10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74细胞条件下暴露至P31-43^liss的细胞的荧光强度。使用副干酪乳杆菌CBA L74处理产生统计学显著的荧光强度下降，10⁴、10⁶或10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74细胞分别产生50％、70％和75％的荧光强度下降(^***＝p<0,001)。

如图15b、15c和15d所示，对于P57-68^liss，使用10⁴、10⁶和10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的细胞相对于未处理的细胞中分别出现荧光强度下降(图15a)。白色箭头指示含P57-68^liss的囊泡。这些结果定量地显示于图16中。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。图16中数据代表5次独立实验。图16中柱状图比较了未处理对照细胞(“UN”)与存在10⁴、10⁶或10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74细胞条件下暴露至P57-68^liss的细胞的荧光强度。使用副干酪乳杆菌CBA L74处理产生统计学显著的荧光强度下降，10⁴、10⁶或10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74细胞分别产生25％、25％和50％的荧光强度下降。如图15B，15C和15D所示，对于P57-68，用10⁴、10⁶和10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理，相对于未处理的对照细胞，分别导致25％、25％和50％的荧光强度下降(^***＝p<0,001)。

如图17所示，使用10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理，对于P31-43荧光强度减少75％和对于P57-68荧光强度减少50％。这些数据表明，副干酪乳杆菌CBA L74减少P41-43进入可能比减少P57-68进入更有效，可能反映了不同的内吞途径。

实施例10:副干酪乳杆菌CBA L74上清对P31-43和P57-68进入Caco2细胞的浓度依赖性影响

用副干酪乳杆菌CBA L74上清或副干酪乳杆菌CBA L74DNA处理Caco2细胞，如实施例1所述。将Caco2细胞在来自10⁸cfu/ml当量的上清或DNA中孵育30分钟。如图18b和18c所示，分别用副干酪乳杆菌CBA L74细胞或副干酪乳杆菌CBA L74上清处理，导致暴露至P31-43^liss的细胞中的荧光强度比未处理的对照细胞中的荧光强度减少(图18a)。这些结果定量地呈现于图19中。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。图19中数据代表5次独立实验。图19中柱状图比较了未处理对照细胞(“UN”)与存在10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBAL74细胞(“LP 10⁸”)或来自10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74培养物的副干酪乳杆菌CBA L74上清(“Sup LP 10⁸”)条件下暴露至P31-43^liss的细胞的荧光强度。如图19所示，与未处理的对照细胞相比，副干酪乳杆菌CBA L74上清显著减少P31-43进入Caco2细胞，经计算得出荧光强度减少约25％(^***＝p<0.001)。

如图20b和20c所示，分别用副干酪乳杆菌CBA L74细胞或副干酪乳杆菌CBA L74上清处理，导致暴露至P57-68^liss的细胞中的荧光强度比未处理的对照细胞中的荧光强度减少(图20a)。这些结果定量地呈现于图21中。图21中柱状图比较了未处理对照细胞(“UN”)的荧光强度与存在10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74细胞(“LP 10⁸”)或来自10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74培养物的副干酪乳杆菌CBA L74上清条件下暴露至P57-68^liss的细胞(“Sup LP 10⁸”)的荧光强度。如图21所示，与未处理的对照细胞相比，副干酪乳杆菌CBA L74上清显著减少P31-43进入Caco2细胞，经计算得出荧光强度减少约40％(^***＝p<0.001)。

相反地，使用来自副干酪乳杆菌CBA L74的纯化的DNA处理不影响P31-43或P57-68进入Caco2细胞。总之，这些数据表明，负责减少肽进入的代谢产物可能被分泌到细菌培养物上清中。

实施例11:副干酪乳杆菌CBA L74上清对EGF-Alexa 488进入Caco2细胞的影响

Caco2细胞用来自10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74的培养物的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理，然后与EGF-Alexa 488共孵育30分钟，如实施例1所述。如图22b所示，用副干酪乳杆菌CBA L74上清处理，导致暴露至EGF-Alexa 488的细胞中的荧光强度比未处理的对照细胞中的荧光强度减少(图22a)。这些结果定量地呈现于图23中。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。图23中数据代表5次独立实验。图23中柱状图比较了未处理对照细胞(“UN”)与存在副干酪乳杆菌CBA L74上清条件下暴露至EGF-Alexa 488的细胞(“Sup LP10⁸”)的荧光强度。如图23所示，与未处理的对照细胞相比，副干酪乳杆菌CBA L74上清显著减少EGF-Alexa 488进入Caco2细胞，经计算得出荧光强度减少约50％。EGF-ALexa 488的进入似乎被阻止在细胞膜(^***＝p<0,001)。

实施例12:副干酪乳杆菌CBA L74上清在移除上清后对P31-43进入Caco2细胞的影响

将Caco2细胞与来自10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74的培养物的副干酪乳杆菌CBA L74上清共孵育30分钟，如实施例1所示。然后将副干酪乳杆菌CBA L74上清移除并用DMEM替换。如实施例1所述，加入P31-43^liss并检测肽进入。如图24c所示，相对于未处理的对照细胞(图24a)，即使在将副干酪乳杆菌CBA L74上清移除并用DMEM替换后P31-43-liss的进入也显著减少。图24b示出了用未被移除的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的Caco2细胞。图25中柱状图比较了未处理对照细胞(“UN”)与存在副干酪乳杆菌CBA L74上清条件下暴露至P31-43-liss的细胞(“Sup LP 10⁸”)以及移除副干酪乳杆菌CBA L74上清后暴露至P31-43-liss的细胞(“MEM”)的荧光强度(^***＝p<0.001)。

实施例13:热处理的副干酪乳杆菌CBA L74上清对P31-43进入Caco2细胞的影响

将Caco2细胞与通过煮沸5分钟或者在80℃孵育15分钟加热处理的副干酪乳杆菌CBA L74上清(来自10⁸cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74的培养物)共孵育。如实施例1所述测定P31-43-liss进入。如图26d所示，相对于未处理的对照细胞(图24a)，即使在将副干酪乳杆菌CBA L74上清加热至80℃后P31-43^liss的进入也减少。相反地，相对于未处理的对照细胞(图24a)，将副干酪乳杆菌CBA L74上清在95℃-100℃加热后，P31-43-liss进入未显著减少(图26c)。图26b示出了用未被加热的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的Caco2细胞。图27中柱状图比较了未处理对照细胞(“UN”)、存在未被加热处理的副干酪乳杆菌CBA L74上清条件下暴露至P31-43-liss的细胞(“Sup LP 10⁸”)、存在已被煮沸的副干酪乳杆菌CBA L74上清条件下暴露至P31-43-liss的细胞(“95°-100°”)以及存在已在80℃加热的副干酪乳杆菌CBA L74上清条件下暴露至P31-43-liss的细胞(“70°-80°”)的荧光强度。总之，这些数据表明，副干酪乳杆菌CBA L74上清的生物学效应可能不是酶，由于酶活性通常会被80℃的温度破坏(^***＝p<0.001)。

Claims (33)

1.一种组合物，其含有由国际保藏登记号LMG P-24778的副干酪乳杆菌CBAL74产生的代谢产物，其中所述代谢产物可减轻具有麸质相关病症的受试者的麦醇溶蛋白肽毒性症状。

2.权利要求1的组合物，其中所述代谢产物是热稳定的。

3.权利要求1的组合物，其中所述代谢产物基本上不含国际保藏登记号LMGP-24778的副干酪乳杆菌CBA L74细胞。

4.权利要求1的组合物，其中所述代谢产物可减少麦醇溶蛋白肽的细胞进入。

5.权利要求1的组合物，其中所述麦醇溶蛋白肽是α-麦醇溶蛋白肽。

6.权利要求5的组合物，其中所述α-麦醇溶蛋白肽的氨基酸序列选自由LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:1)、QLQPFPQPQLPY(SEQ ID NO:2)、LGQQQPFPPQQPYPQPQPF(SEQ ID NO:3)和LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)组成的组。

7.权利要求1的组合物，其中所述麸质相关病症是乳糜泻或麸质敏感。

8.权利要求1的组合物，其还包含生理上可接受的载体。

9.权利要求8的组合物，其中所述生理上可接受的载体是食物制品或药用载体。

10.一种治疗具有麸质相关病症的受试者的方法，其包括：

a)鉴别需要治疗的受试者；

b)施用有效量的含有由国际保藏登记号LMG P-24778的副干酪乳杆菌CBAL74产生的代谢产物的组合物，其中所述代谢产物可减轻麦醇溶蛋白肽毒性症状。

11.权利要求10的方法，其中所述代谢产物是热稳定的。

12.权利要求10的方法，其中所述代谢产物基本上不含国际保藏登记号LMGP-24778的副干酪乳杆菌CBA L74细胞。

13.权利要求10的方法，其中所述代谢产物可减少麦醇溶蛋白肽的细胞进入。

14.权利要求10的方法，其中所述麦醇溶蛋白肽是α-麦醇溶蛋白肽。

15.权利要求14的方法，其中所述α-麦醇溶蛋白肽的氨基酸序列选自由LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:1)、QLQPFPQPQLPY(SEQ ID NO:2)、LGQQQPFPPQQPYPQPQPF(SEQ ID NO:3)和LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)组成的组。

16.权利要求10的方法，其中所述麸质相关病症是乳糜泻或麸质敏感。

17.权利要求10的方法，其中所述麦醇溶蛋白肽毒性症状包括炎症、自身免疫反应、胃肠道症状、体重减轻、贫血、骨质疏松症、关节炎、不育、周围神经病变或肝功能衰竭。

18.权利要求10的方法，其中所述受试者年龄不超过21岁。

19.权利要求10的方法，其还包括对麸质相关病症施用第二治疗的步骤。

20.权利要求19的方法，其中所述第二治疗是饮食治疗或药物治疗。

21.权利要求20的方法，其中所述饮食治疗是不含麸质的饮食。

22.由国际保藏登记号LMG P-24778的副干酪乳杆菌CBA L74产生的代谢产物用于制备可减轻具有麸质相关病症的受试者的麦醇溶蛋白肽毒性症状的组合物的用途。

23.权利要求22的用途，其中所述代谢产物是热稳定的。

24.权利要求22的用途，其中所述代谢产物基本上不含国际保藏登记号LMGP-24778的副干酪乳杆菌CBA L74细胞。

25.权利要求22的用途，其中所述代谢产物可减少麦醇溶蛋白肽的细胞进入。

26.权利要求22的用途，其中所述麦醇溶蛋白肽是α-麦醇溶蛋白肽。

27.权利要求26的用途，其中所述α-麦醇溶蛋白肽的氨基酸序列选自由LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:1)、QLQPFPQPQLPY(SEQ ID NO:2)、LGQQQPFPPQQPYPQPQPF(SEQ ID NO:3)和LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)组成的组。

28.权利要求22的用途，其中所述组合物包含食物制品。

29.权利要求22的用途，其中所述组合物包含药用载体。

30.权利要求22的用途，其中所述麦醇溶蛋白肽毒性症状包括炎症、自身免疫反应、胃肠道症状、体重减轻、贫血、骨质疏松症、关节炎、不育、周围神经病变或肝功能衰竭。

31.一种试剂盒，其含有实测量的包含由国际保藏登记号LMG P-24778的副干酪乳杆菌CBA L74产生的代谢产物的组合物，其中所述代谢产物可减轻麦醇溶蛋白肽毒性症状，以及选自由包装材料、包含使用说明的包装***物、无菌流体、注射器和无菌容器组成的组的一种或多种物品。

32.权利要求31的试剂盒，其中所述组合物还包括食物制品。

33.权利要求31的试剂盒，其中所述组合物还包含药用载体。