PT96224A - Producao de factor de crescimento derivado de plaquetas biologicamente activas a partir de sistema de celulas hospedeiras de elevada expressao - Google Patents

Description

"PRODUÇÃO DE FACTOR DE CRESCIMENTO DERIVADO DE PLAQUETAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS A PARTIR DE SISTEMAS DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE ELEVADA EXPRESSÃO"

Este pedido de patente é, em parte, uma continuação do pedido de patente de invenção americana com ο ηδ de série 451 485 a 15 de Dezembro de 1989. Os avanços registados na tec nologia do ADN recombinante nos últimos anos tornaram possível a produção de quantidades significativas de proteínas estranhas com interesse nas células hospedeiras. Produzem-se as proteínas recombinantes nos sistemas celulares hospedeiros pela transfec-ção das células hospedeiras com ADN que codifica a proteína com interesse e depois efectua-se o desenvolvimento das células hoss pedeiras transfectadas em condições que favorecem a expressão das novas proteínas recombinantes pela célula hospedeira. Nos casos em que a proteína recombinante com interesse é altamente expres- .· sa por um sistema celular hospedeiro específico, estas proteínas exógenas precipitam-se de um modo típico no interior da célula hospedeira, sob a forma de corpos de inclusão.

Será mais provável que ocorram níveis elevados de expressão e a consequente deposição de proteína recombinante sob a forma de corpos de inclusão quando se utilizam células hospedeiras procarióticas.

Selecciona-se habitualmente a E. coli procariõtica para utilização nos sistemas de alta expressão, em parte devido ao facto das células hospedeiras de E, coli tenderem a serem mais aconselháveis para a produção de quantidades extremamente grandes

de proteína recombinante. Os sistemas celulares hospedeiros de menor expressão, habitualmente aqueles que utilizam células hoss pedeiras procarióticas e células hospedeiras de levedura , não são capazes de produzir proteína recombinante nas grandes quantidades geradas nos sistemas celulares hospedeiros de alta expressão. Apesar de expressas numa quantidade relativamente menor, as proteínas recombinantes destas células hospedeiras de menor expressão são contudo provavelmente mais recuperáveis na sua forma biológica activa, devido à tendência das células hospedeiras de baixa expressão de segregarem a proteína recombinan te exógena num meio aquoso que circunda a célula hospedeira do que de depositarem a proteína nos corpos de inclusão de alta den sidade. A contra partida dos sistemas de elevada expressão, reside no facto de, em troca de se obterem elevados rendimentos de produtos recombinantes, a proteína recombinante tem que ser isolada a partir dos corpos de inclusão. Esta operação necessi ta habitualmente da reactivação da proteína desnaturada no sentido de se originar um produto biologicamente activo. Tanto a dificuldade como o sucesso nos esforços produzidos no sentido de se reactivarem proteínas recombinantes variam significativamente com a proteína específica a ser produzida.

Uma proteína recombinante que se tornou de particular interesse à luz dos recentes avanços na tecnologia do ADN recombinante, consiste num factor de crescimento conhecido como o fac K.

tor do crescimento derivado de plaquetas (PDGF). 0 facto PDGF foi inicialmente descrito por Ross et al,[Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71, 1207-1210 (1974)], como um factor que se descobriu em todos os soros sanguíneos (mas não no soro pobre em plaquetas)

que é capaz se suportar o crescimento dos fibroblastos em cultura. Cre-se actualmente que o PDGF humano seja a principal pro teína mitogénica presente no soro.

Isolou-se PDGF a partir de plaquetas e a partir de so ro. Identificou-se o PDGF original não reduzido como uma proteí^ na dimérica de 27-35 kd de peso molecular. A variação no número de bandas observadas nalguns geles de separação pode dever-se a diferenças de glicosilação, à acção de proteases ou à presença de mais de uma espécie molecular. A redução de PDGF produz duas ou mais bandas menores sobre os geles, num intervalo de peso molecular compreendido entre 10-18 kd. Pensa-se que estas bandas menores representem duas sub-unidades monomiricas diferentes menores de aproximadamente 18 kd e 16 kd de peso molecular designa das respectivamente por sub-unidades "A" e "B" ou, alternativamente, como a cadeia A de PDGF e a cadeia B de PDGF. Foram descritas as sequências aminoãcidas das duas sub-unidades de PDGF , tendo sido identificada a sequência aminoãcida da cadeia B de PDGF como possuindo uma homologia superior a 90% com a proteína prevista para v-sis, ou oncogene contido no vírus oncogénico do sarcoma simiano (SSV). [Doolite et al, Science, 221, 275-276 (1983), e Waterfield et al, Nature, 304, 2810-2814 (1983)]. Descobriu- -se que a cadeia A possuía uma homologia de aproximadamente 60% com a cadeia B.

Crê-se que o PDGF só seja biologicamente activo na sua forma dimérica. Estes dímeros biologicamente activos de PDGF podem tomar a forma de um heterodímero de PDGF-AB, de um homodímero de PDGF-BB ou de um homodímero de PDGF-AA. Hannink et al, Mol.

Cell. Biol. , 61, 1304-1314 (1986). Cada sub-unidade monomérica do dímero biologicamente activo, independentemente de se tratar de um monómero da cadeia A ou de um monõmero da cadeia B, contém oito resíduos de cisteína. Alguns destes resíduos de cisteí na formam ligações de dissulfureto inter-cadeias, que mantêm o dímero húmido. A dificuldade inerente à obtenção de proteínas recom binantes biologicamente activas a partir de sistemas celulares hospedeiros de alta expressão reside, no caso de PDGF, posteri-ormente exacerbado por: (1) um grande número de resíduos de cisteína livres em cada mo nómero de PDGF; (2) na forma dimérica de PDGF natural biologicamente activa; e (3) na extrema hidrofobicidade de PDGF.

Tal como se esperava nos sistemas de alta expressão, o PDGF recombinante (rPDGF) produzido na E. coli encontra-se pre dominantemente nos corpos de inclusão como monómeros desnaturados. Devido à solubilidade limitada deste rPDGF desnaturado em soluções aquosas, ele tende a agregar-se antes de ser reactiva-do na sua conformação biologicamente activa, originando uma reacti vação fracamente eficaz e por isso mesmo fracas produções de ma terial de rPDGF biologicamente activo. A maioria do material iso lado pode ser parcialmente desnaturado e parcialmente desactiva do devido quer à desactivação original na célula hospedeira bacte riana e/ou ãs condições de isolamento dos corpos de inclusão.

Expressou-se PDGF recombinante, produto genético de v-sis e seus análogos nas células eucarióticas transformadas com vectores incluindo genes exógenos, com vários graus de sucesso. Patente de invenção norte-americana NQ 4 766 073 ("Murray e outras I") (células hospedeiras de levedura); Hannink e outros, ibid: (células hospedeiras COS-1); Hannink e outros: "Mol. Cell.

Biol."; 6, 1986, p. 1343-1348 (células hospedeiras COS-1); King e outros, Proc. Int.l Acad. Sei.USA; 82; 1985; p.5295-5299 (célu las hospedeiras do rato NIH 3T3; Clarke e outros: "Nature"; 308; 1984; p. 464 (células hospedeiras do rato NIH 3T3); e gazit e outros: "Cell"; 39; 1984; p. 89-97 (células hospedeiras do rato NIH 3T3). No entanto, nenhuma destas referências descreve a expressão de mais do que 50 ng/ml de PDGF activo em meios de cultura. Mais recentemente, referiram-se rendimentos de aproximada mente 200 a 1000 ng/ml de sistemas celulares hospedeiros de levedura. U.S. Patente NQ 4 845 075 ("Murray et ain") . O pedido de patente internacional NQ PCT/US88/00701 revela a produção de PDGF nas células do ovário do "Hamster" chinês (CHO) em quantidades aproximadas de l^ig/ml. São pouco frequentes as referências ã expressão dos produtos do gene v-sis nos procariotas. Por exemplo, Devare e ou tros; "Proc. Natl. Acad. Sei. USA"; 79; 1982; p. 3179-3182, referiram a expressão de p28sis na E. coli e que detectaram imuno logicamente. Este p28sis produzido na E. coli não foi referido como biologicamente activo. Wang e outros; "J. Biol. Chem."; 259; 1984; p. 10645-10648, referiram a observação de que p28sis, expresso como uma proteína de fusão na E. coli, competia com o PDGF iodado das plaquetas humanas ligando-se ao receptor de PDGF. No entanto, a proteína recombinante produzida pela E. coli nestas circunstâncias foi isolada a partir de uma fraeção solúvel contendo aproximadamente 10% de proteína recombinante total expre_s sa e não se demonstrou que possuísse actividade mitogénica ouqui miotáctica. Pôs-se de parte a forma largamente predominante (90%) dos corpos de inclusão insolúveis da proteína recombinante e pre sumiu-se que eram biologicamente inactivas* Mais recentemente,

Hoppe e outros: "Biochemistry"; 28; 1989; p. 2956-2960, descre- veram a expressão do produto de clivagem da proteína de fusão de rPDGF B a partir de E. coli com reactivação subsequente originando um rendimento de aproximadamente 0,7 mg do análogo homodi mérico de rPDGFB reactivado, por litro de caldo de fermentação.

No entanto, com finalidades comerciais, tem-se verificado ser aconselhável obter rPDGF a partir de sistemas de células hospedeiras de baixo nível de expressão, devido ao facto de se prever a secreção de rPDGF a partir destes sistemas nas suas formas correctamente activas, biologicamente activas e di-méricas. Esta linha de pensamento prevaleceu apesar de se esperar a obtenção de apenas pequenas quantidades de proteína recom binante a partir destes sistemas. Por outro lado, não se espera va que os hospedeiros procariõticos fossem capazes de produzir rPDGF activo. Kelly et al, Embo J., £(13A) , 3399-3405 (1985). Me^ mo quando se obteve rPDGF que exibia uma actividade de ligação específica para a E. coli (Wang e outros, ibid), o sistema celu lar hospedeiro de E. coli utilizado não era o sistema específico de alta expressão e apenas se recuperou uma pequena fracção solúvel de aproximadamente 10% da proteína recombinante total re cuperada. Para além disso, não foi demonstrado que este rPDGF produzido pela E. coli possuísse a actividade mitogênica ou quj. miotãctica necessária para uma utilização terapêutica eficaz dá proteína recombinante.

Contudo, no que se refere ãs proteínas recombinantes, de um modo geral, utilizaram-se métodos de reactivação para se transformar proteínas recombinantes desnaturadas, na sua forma activa. Nas patentes de invenção norte-americanas NQS 4 5H 503 e 4 518 256, por exemplo, descrevem-se três procedimentos de reactivação que são geralmente aplicáveis, apenas com pequenas modificações para a recuperação de proteínas recombinantes bio- logicamente activas, a partir dos corpos de inclusão. Nestes pro cedimentos reconhece-se que a estrutura terciária ou reactivada das proteínas fica estabilizada por uma ligação de hidrogénio, interacções hidrofóbicas e ligações iõnicas entre os radicais aminoãcidos da proteína. Quando presente, é a ligação dissulfu-reto entre os radicais de cisteína que "trava" a estrutura terciária, mantendo-a no seu lugar. Estes métodos tentam por isso eliminar aliatoriamente a ligação dissulfureto antes de trazer a proteína recombinante para a sua conformação biologicamente activa através das suas outras forças de estabilização.

Numa das abordagens, a proteína desnaturada com inte resse é posteriormente purificada, em condições redutoras, que mantêm os radicais de cisteína da proteína como grupos sulfidri lo livres, fornecendo um agente de redução ao longo de todos os passos da purificação. Isto permite que a proteína se reactive a si própria em condições de purificação, na ausência da formação de ligações dissulfureto incorrectas. Depois dilui-se o agen te de redução numa solução aquosa de modo a possibilitar que a proteína reactivada forme as ligações dissulfureto adequadas na presença de ar ou de outro agente oxidante. Isto possibilita a incorporação fácil da reactivação na totalidade do processo de purificação. Este método é mais eficaz para as proteínas recom-binantes que possuem estruturas terciárias relativamente pouco complicadas nas suas formas biologicamente activas.

Numa outra abordagem, a reactivação da proteína recom binante surge na presença de formas reduzidas (R-SH) e oxidadas (R-S-S-R) de um composto de sulfidrilo. Isto possibilita a formação constante de grupos sulfidrilo e de grupos dissulfureto ao longo do processo de purificação. Proporcionam-se as formas reduzidas e oxidadas do composto sulfidrilo num tampão que possui um poder de desnaturação suficiente para fazer com que todas as conformações intermédias da proteína permaneçam solúveis no decurso das operações de desactivação e de reactivação. A ureia tem vindo a ser sugerida como um meio tampão adequado devido ã sua capacidade aparente para actuar como: (1) um agente de desnaturação suficientemente fraco para permi tir que a proteína se aproxime da sua correcta conformação; e (2) um desnacurante suficientemente poderoso que permita que os intermediários reactivados conservem a sua solubilidade.

Esta abordagem é também melhor conseguida quando as proteínas recombinantes dos corpos de inclusão com interesse possuem estruturas activas relativamente pouco complicadas.

Uma terceira abordagem, que se utiliza nas situações de reactivação mais difíceis, tem como objectivo, em primeiro lu gar, quebrar qualquer ligação dissulfureto que se possa ter for mado de modo incorrecto durante o isolamento dos corpos de inclu são e para depois derivar os grupos sulfidrilo livres disponí veis da proteína recombinante. Atinge-se este objectivo sulfonan do a proteína de modo a formar uma ligação proteína-S-S03. Depois dilui-se a solução de proteína-S-sulfonato resultante numa solu ção aquosa onde pode ocorrer uma reactivação adequada na ausência da formação de ligações de dissulfureto incorrectas. Adicio na-se então ã solução aquosa um sistema que contém um composto de sulfidrilo (R-SH) e uma pequena percentagem da sua forma ox_i dada correspondente (R-S-S-R) . Ajusta-se o pH (subindo) para um valor tal que o composto de sulfidrilo (R-SH) se encontre pelo menos numa forma parcialmente ionizada (R-S-) de modo a que a deslocação nucleofílica do sulfonato se efectue de modo intenso. Embora o composto sulfidrilo seja suficiente para efectuar a con versão da proteína-S-sulfonato na ligação dissulfureto adequada correspondente, é necessário a presença de uma forma oxidada pa ra assegurar que as ligações dissulfureto adequadas permanecerão intactas.

Hoppe e outros referiram algum sucesso na reactivação do análogo de rPDGF utilizando um método baseado nesta última abordagem. No entanto, devido ao número extraordinariamente ele vado de grupos sulfidrilo de PDGF, designadamente oito por mono mero, torna-se difícil, na melhor das hipóteses, controlar a reactivação de rPDGF de tal modo que a formação da ligação dissulfureto se efectue apenas depois de rPDGF ter assumido a sua conformação biologicamente activa. Hoppe e outros, por exemplo, descobriram que era necessário adicionar ureia para solubilizar o produto de clivagem da proteína de fusão rPDGF sulfonada no sen tido de se atingir um rendimento de 0,7 mg/1.

De acordo com o anteriormente exposto, constitui vim objectivo da presente invenção proporcionar um método aerodinâmico para o isolamento e purificação de rPDGF recombinante biologicamente activo a partir de sistemas de células hospedeiras de elevada expressão.

Sumário da Presente Invenção A presente invenção proporciona um método para a reactí. vação de rPDGF reduzido a partir de um sistema de células hospe deiras de alta expressão, tais como os de E. coli. Forma-se uma ligação dissulfureto mista entre os grupos sulfidrilo livres de PDGF monomérico reduzido e um agente de bloqueio de dissulfureto de fórmula geral R-S-S-R, para se formar um novo intermediário de rPDGF monomérico bloqueado. Depois traz-se o monómero de rPDGF bloqueado para a sua conformação biologicamente activa após o que se podem destruir as ligações de dissulfureto mistas de RPDGF bloqueado de modo a formarem-se as ligações dissulfureto designadas entre os resíduos de cisteina de rPDGF reduzido para tratar rPDGF na sua conformação monomérica ou dimérica biologicamente activa. A presente invenção proporciona, para além disso, novos monõmeros de PDGE biologicamente activos.

Breve Descrição das Figuras A figura 1 representa um diagrama da sequência de códigos utilizada para se expressar rPDGF B^g no vector de expres^ são de E. coli pCFM1156, tal como se indica no Exemplo 1. A figura 2 consiste num gráfico em que se indica a acti vidade mitogénica de rPDGF B^g produzido na E. coli e que foi reactivado de acordo com as técnicas da presente invenção. A figura 3 consiste num gráfico em que se indica a actividade quimiotáctica sobre os fibroblastos de rPDFG B^g produzido na E. coli reactivado de acordo com as técnicas da presente invenção. A figura 4 consiste num gráfico em que se indica a actividade quimiotáctica sobre os monõcitos de rPDGf produ zido na E. coli reactivado de acordo com as técnicas da presente invenção. A figura 5 representa um diagrama da sequência de cõdjL gos utilizada para expressar rDGF AL no vector de expressão pCFM1156 de E. coli, tal como se indica no exemplo 5. A figura 6 representa um gráfico em que se indica a actividade mitogénica de rPDGF A^ produzido na E. coli e que foi reactivado de acordo com as técnicas da presente invenção. A figura 7 representa um gráfico em que se indica a separação cromatogrãfica de fracções agregadas e purificadas da solução do heterodimero rPDGF A-B, reactivada de acordo com a presente invenção. A figura 8A representa a reprodução de uma coloração de gel SDS-PAGE com azul brilhante de Coomassie de amostras tomadas ao longo dos picos da solução do heterodimero rPDGF A-B reactiva do tal como se indica na figura 7. A figura 8B consiste numa reprodução de um gel SDS-PAGE a partir da figura 8A corado com prata. A figura 9 demonstra o tempo de retenção do heterodíme-ro de rPDGF A-B reactivado a partir de uma das fracções agregadas do exemplo 8, relativamente aos tempos de retenção do homo-dímero rPDGF B^.^ e rPDGF A^. A figura 10 consiste num diagrama da sequência de códigos , , 43 52 utilizada para expressar o analogo de rPDGF [Ser , Ser , 53 99

Ser , Ser ] no vector de expressão de E. coli pCFM1156, tal como se indica no exemplo 9. Os codões de paragem na posição 110 de PDGF B e a jusante em pCFM1156 encontram-se indicados, simulta neamente com os produtos de transferência que resultam da leitura através do primeiro codão de paragem ou da não leitura através do primeiro codão de paragem. A figura 11 demonstra a actividade dos intermzdiãrios monoméricos de dissulfureto mistos de PDGF B^9 e de PDGF A^ em comparação com o homodímero PDGF B^^. A figura 12 demonstra a actividade do intermediário de - - 43 dissulfureto numérico misto do analogo de PDGF B^Q9 [Ser , 525399 43

Ser , Ser , Ser ] e do análogo desbloqueado de PDGF B1Q9 [Ser , 52 53 99 ~ τ

Ser , Ser , Ser ] em comparaçao com o homodímero PDGF B^^.

As figuras 13 e 14 indicam as sensibilidades relativas do intermediário de dissulfureto monomérico misto do análogo de PDGF -1 43 52 53 99 Β109 ^ Ser ' Ser ' Ser ' Ser ^ e analoÇT° desbloqueado de 43 52 53 99 PDGF B.rtQ [ Ser , Ser , Ser , Ser ], em comparaçao com o ho iuy ~ modímero PDGF , quando expostos a diversos agentes.

Descrição pormenorizada da presente invenção A presente invenção proporciona um novo método para o isolamento, reactivação e purificação de rPDGF a partir de E. coli ou de outros sistemas de células hospedeiras de alta pressão. 0 método da presente invenção aumenta extraordinariamente a eficácia da reactivação para a obtenção de rPDGF dimérico ou mo nomirico biologicamente activo originando rendimentos muito mais elevados de rPDGF activo a partir dos corpos de inclusão que se obtêm a partir de métodos da técnica anterior.

Utiliza-se um agente de bloqueio de dissulfureto no processo de purificação, no sentido de se reactivar o PDGF mono mérico reduzido obtido a partir da E. coli ou de outros organijs mos procariótidos na sua conformação activa. 0 agente de bloqueio da presente invenção forma um novo intermediário de dissul^ fureto monomêrico misto com os grupos sulfidrilo livres dos radicais de cisterna, de PDGF monomêrico inactivado ou reduzido. Este intermediário de dissulfureto misto liga substancialmente todos os grupos sulfidrilo livres de PDGF reduzido evitando assim a formação prematura ou extemporânea de ligações dissulfureto iri ternas durante o isolamento e purificação de rPDGF reduzido. Ao mesmo tempo, esta modificação também torna o intermediário de rPDGF solúvel em soluções aquosas.

No sentido de se proporcionar uma melhor precepção da presente invenção, os termos que se seguem, tal como são utilizados na presente invenção, possuem as definições que a seguir se referem. -13

Salvo especificação em contrário, PDGF consiste em qualquer combinação de monómeros e/ou dimeros de PDGF, incluindo os seus análogos reduzidos ou não reduzidos, biologicamente acti vos ou inactivos, recombinantes ou de qualquer outra espécie. 0 termo "PDGF" pretende englobar os análogos de PDGF que possuem uma ou mais modificações no número e/ou na identidade de sequên cias aminoácidas do PDGF natural.

Os termos "monómero de PDGF" e "PDGF monomérico" refere-se a uma molécula única monomérica de PDGF que não se encontra ligada por uma ligação dissulfureto a qualquer outra molécula de PDGF. Considerar-se-à que "PDGF reduzido" se refere ne cessariamente a PDGF monomérico.

Os termos "dímero de PDGF" ou "PDGF dimérico" refere -se a uma molécula de PDGF que compreende duas sub-unidades mo noméricas de PDGF que se encontram ligadas por uma ligação dissulfureto uma ã outra.

Os termos "Dímero de PDGF biologicamente activo" refere-se a PDGF dimérico que possui substancialmente a mesma acti vidade mitogénica e/ou a mesma actividade quimiotáctica do PDGF natural.

Os termos "monómero de PDGF biologicamente activo" re fere-se a PDGF monomérico que possui uma actividade mitogénica específica de pelo menos cerca de 1 para 1000 da actividade mitogénica no PDGF dimérico natural.

Os termos "conformação biologicamente activa", tal como se utilizam na presente invenção, referem-se ã conformação de um dímero de PDGF biologicamente activo ou de um monómero de PDGF biologicamente activo. O termo "reactivação", tal como se utiliza na presen te invenção, refere-se â transformação de PDGF reduzido ou par- cialmente reduzido na sua conformação biologicamente activa. A reactivação inclui as circunstâncias em que rPDGF se produziu nu ma forma desnaturada e é trazido realmente para uma conformação biologicamente activa pala primeira vez. 0 termo "reactivação" pode ser utilizado alternadamente com o termo "activação". 0 ter mo "reactivado" refere-se a PDGF que é trazido para a sua conformação biologicamente activa.

Os termos "agente de bloqueamento", tal como se utiliza na presente invenção, refere-se a um composto de dissulfu-reto de fórmula geral R-S-S-R, que é susceptível de formar deri vados dissulfureto com os grupos sulfidrilo livres dos radicais de cisteína de PDGF reduzidos ou desactivados. 0 termo "dissulfureto misto" refere-se a uma ligação dissulfureto formada entre um radical de cisteina reduzida de PDGF monomêrico e um dos radicais representados pelo símbolo R do agen te de bloqueamento. 0 termo "dissulfureto misto" inclui especi-ficamente a situação em que o símbolo R representa cisteína e por esse motivo os radicais cisteína aparecem em qualquer lado da ligação dissulfureto. 0 termo "intermediário de dissulfureto misto" refere -se a um derivado do monómero de PDGF em que substancialmente to dos os grupos sulfidrilo do monómero de PDGF foram derivados pa ra um radical representado pelo símbolo R do agente de bloqueamento através de uma ligação dissulfureto mista. Por outras palavras, existe um numero insuficiente de grupos sulfidrilo livres disponíveis para a formação de ligações dissulfureto inter nas.

Tal como se utiliza na presente invenção, os termos "ligação dissulfureto intercadeia" refere-se a uma ligação dissulfureto formada entre dois radicais de cisteína de um dímero de PDGF, em que os radicais de cisteína que formam a ligação dis-sulfureto pertencem a sub-unidades monoméricas diferentes.

Em contraste, o termo "ligação dissulfureto interca-deia" refere-se a uma ligação dissulfureto formada entre dois ra dicais de cisteína de um dlmero ou de um monómero de PDGF em que os radicais de cisteína que formam a ligação dissulfureto perten cem à mesma sub-unidade monomérica. 0 método de reactivação da presente invenção utiliza um agente de bloqueamento que bloqueia os grupos sulfidrilo livres de PDGF monomérico reduzido de tal modo que estes grupos se tornam incapazes de formar ligações dissulfureto intercadeias e intercadeias. Uma vez bloqueadas as porções sulfidrilo do monõ-mero PDGF, reactiva-se rPDGF na sua conformação biologicamente activa. A isto pode seguir-se a eliminação do agente de bloquea mento de tal modo que se favoreça a formação de ligações dissul fureto intercadeias e intercadeias de modo a manter o PDGF na sua conformação biologicamente activa. Na maioria dos casos, ijs to origina um dímero biologicamente activo. No entanto, quando se utiliza um análogo de PDGF para se omitir os resíduos de cis^ teína necessários para se construírem as ligações dissulfureto in tercadeias a eliminação do agente de bloqueamento origina um mo nõmero biologicamente activo. 0 método de reactivação da presen te invenção é especialmente útil para a reactivação de rPDGF a partir dos corpos de inclusão.

Geralmente os agentes de bloqueamento da presente in venção são compostos de dissulfureto de fórmula geral R-S-S-R na qual o símbolo R representa um grupo orgânico solúvel. Os grupos orgânicos solúveis representativos incluem, mas não se limitam, a ^-glutamil-cisteinil-lisina (R-S-S-R representa glutationa oxi^ dada), cisteína (R-S-S-R representa cisteína oxidada) e ácido

glicõlico. 0 importante na selecção do composto de dissulfureto para utilização como agente de bloqueamento na presente invenção é que o composto de dissulfureto seja capaz de formar ligações dissulfureto mistas com os radicais de cisteina de PDGF. De um modo preferencial selecciona-se o agente de bloqueamento entre o grupo que consiste em cisteina oxidada (Cys-S-S-Cys) e em glutationa oxidada (G-S-S-G). Dá-se preferência a que o agente de bloqueamento seja glutationa oxidada. O agente de bloqueamento da presente invenção modifica ou bloqueia substancialmente todos os grupos sulfidrilo livres de PDGF reduzido, por oxidação destes grupos sulfidrilo de modo a formar uma ligação dissulfureto mista entre o agente de bloqueamento (R-S-S-R) e PDGF (PDGF-SH), originando um novo interme diário monomérico (rPDGF-S-S-R) da presente invenção. As ligações dissulfureto mistas podem formar-se por exemplo entre o monómero rPDGF reduzido e a cisteina oxidada (para formar um intermediário de rPDGF-S-S-Cys) ou entre o monómero de rPDGF reduzido e a gluta tiona oxidada (para formar um intermediário de rPDGF-S-S-G). A luz do sucesso limitado dos métodos da técnica anterior na reac-tivação de rPDGF activo a partir dos corpos de inclusão, descobriu-se, de modo surpreendente, que o bloqueio dos grupos sulfidrilo livres de rPDGF reduzido, de acordo com a presente invenção, é capaz de evitar com sucesso a formação prematura ou extern porânea de ligações dissulfureto internas durante o isolamento, purificação e reactivação de rPDGF derivado dos corpos de inclusão, tornando, ao mesmo tempo, o derivado do monómero de rPDGF solúvel em soluções aquosas.

Uma vez bloqueado o rPDGF (isto ê, uma vez formado o intermediário de dissulfureto misto monomérico da presente inven- -1

ção) seleccionam-se especificamente as condições para promover a reactivação do intermediário de PDGF-S-S-R na sua conformação biologicamente activa. Devido ao facto de o intermediário de dis_ sulfureto misto da presente invenção, contrariamente a PDGF reduzido desbloqueado, ser solúvel em soluções aquosas, crê-se que é possível tirar vantagem das forças presentes num meio aquoso não desnaturante, de modo a induzir o intermediário monomérico ou rPGF bloqueado e adquirir a sua conformação biologicamente activa sem a interferência da formação de ligações dissulfureto aleatórias. Na altura em que se consegue obter a conformação bio logicamente activa, desbloqueia-se o PDGF-S-S-R bloqueado.

Descobriu-se, de um modo surpreendente, que o intermediário monomérico bloqueado de PDGF da presente invenção exibia uma actividade biológica, apesar de ser necesária uma quantidade significativamente grande de monómeros para se atingir a actividade máxima observada para o dímero de PDGF natural isto é, a actividade especifica do monómero é inferior à do dímero). Não é credível que o monómero de PDGF exista naturalmente na sua forma monomérica e como tal não foi isolado a partir da natureza. Pôs-se a hipótese de que a forma dimêrica de PDGF seja necessária para a actividade biológica com base em modelos corren tes de funcionamento, uma vez que se sabe que o PDGF transmite um sinal via interacção com os receptores de superfície celular de PDGF. 0 modelo predominante para a interacção necessária com os receptores da superfície celular sugere que dois recepto res de PDGF têm de interactuar um com o outro no sentido de trans mitir o sinal. Isto origina uma reacção mútua designada por fojs forilação cruzada: isto é, cada receptor catalisa a adição de um grupo fosfato ao outro. Crê-se que cada sub-unidade monomérica X: de um dimero de PDGF se ligue a uma única molécula receptora, associando assim dois receptores e permitindo a fosforilação cru zada que algumas vezes se designa como a dimerização do receptor. Williams, Science, 243, 1564-1570 (1989); Haitunacher et al, Embo, 8_, 2489-2495 (1989) . Apesar de se ter sugerido como consequência que a forma monomirica de PDGF podia, nalguns casos, exibir acti vidade biológica (Pedido de Patente de invenção Internacional NQ 89/04460), não se demonstrou até agora, existir qualquer activi dade deste tipo no monómero de PDGF. Para além disso, não foi fornecida qualquer explicação para o modo como o monómero pode induzir a dimerização necessária do receptor. 0 desbloqueamento do intermediário monomérico de PDGF -S-S-R da presente invenção pode originar um dimero de PDGF bio logicamente activo ou um monómero de PDGF biologicamente activo. Este último pode ser obtido através de um análogo de PDGF, em que um ou mais dos resíduos de cisteína necessários para a formação de ligações dissulfureto intercadeias foram substituídas por ou tros aminoãcidos. Quando se pretende um análogo deste tipo, os aminoãcidos substituídos pelos resíduos de cisteína são preferen cialmente aminoãcidos não carregados. De um modo a que se dá maior preferência, os aminoãcidos não carregados são resíduos de serina.

Tal como o intermediário de dissulfureto monomérico misto bloqueado da presente invenção, o análogo monomérico não bloqueado obtido a partir do desbloqueamento de um análogo mono mérico de dissulfureto misto adequadamente seleccionado, origina um monómero de PDGF biologicamente activo. Apesar de se ter observado que eram necessárias quantidades substancialmente superiores quer destas formas de PDGF monomérico (isto é, o inter mediãrio dissulfureto misto ou o análogo desbloqueado) para exi^ bir a actividade biológica máxima observada atingível com as for mas diméricas de PDGF, também se descobriu que estes monómeros são de facto capazes de atingir um nível de "superactividade", isto i, uma actividade de pelo menos cerca de 3 a 3,5 vezes aproximadamente superior à actividade atingida com qualquer quan tidade do dímero.

De um modo preferencial, leva-se a efeito o desblo-queamento pondo em contacto o intermediário de PDGF-S-S-R bloqueado com o composto sulfidrilo reduzido. De um modo a que se dá maior preferência o composto de sulfidrilo reduzido consiste em cisteína. A adição de compostos sulfidrílicos reduzidos inicia o intercâmbio de dissulfureto que origina o desbloqueamento das ligações dissulfureto mistas e por sua vez a consequente for mação das ligações dissulfureto intercadeias e/ou intercadeias. A formação destas ligações dissulfureto que definem a estrutura terciária de PDGF (ligações intercadeias e ligações intercadeias) e que suportam conjuntamente a forma dimérica (ligações interca deias), encontra-se retardada ou impedida até ao momento em que rPDGF possa ser manipulado para a sua conformação biologicamente activa.

Descobriu-se, de um modo surpreendente, que o método da presente invenção pode ser utilizado para formar um tipo de rPDGF dimérico, também referido como um "dímero misto" em que as sub-unidades monoméricas das moléculas de rPDGF dimérico derivam de diferentes células hospedeiras de elevada expressão. Apresen te invenção torna possível, por exemplo, a produção do heterodí. mero de rPDGF-AB a partir de proteínas de corpos de inclusão. Pa ra além disso, existem possibilidades ilimitadas para a prepara ção de dímeros mistos de rPDGF que se constroem a partir de sub -unidades monoméricas diferentes, tais como cadeias diferentes (por exemplo, cadeias A e B), cadeias de formas diferentes (por exemplo, PDGF B109 e PDGF B119) e análogos diferentes. Cada uma das duas diferentes sub-unidades monomiricas seleccionadas para se construir o dímero misto desejado, foram isoladas a partir das respectivas proteínas de diferentes corpos de inclusão e de pois bloqueadas de acordo com a presente invenção. Depois combi naram-se as quantidades relativas de duas sub-unidades monoméri cas diferentes bloqueadas numa proporção que se determinou favo recer a formação do desejado dímero misto. As proporções favorã veis serão evidentes para o especialista. Após ter-se permitido que as sub-unidades monoméricas bloqueadas atingissem a sua con formação biologicamente activa, desbloquearam-se as sub-unidades monoméricas o que originou a formação de um dímero misto.

De um modo mais específico, pode utilizar-se o método da presente invenção para reactivar rPDGF derivado de E. co-li tal como se segue. Isola-se em primeiro lugar a proteína do corpo de inclusão a partir da E. coli ou da pasta celular de ou tras células hospedeiras de elevada expressão, de acordo com qualquer um dos diversos métodos conhecidos na especialidade. De um modo preferencial, efectua-se em primeiro lugar a ruptura das células hospedeiras que contêm rPDGF com um homogenizador, tal como o homogenizador "Menton-Gualin" ou "microfluidizer", a uma pressão compreendida entre 10 000 e 14 000 psi, de preferência a 14 000 psi. No sentido de se manter o rPDGF dos corpos de inclu são no seu estado monomérico reduzido durante o processo de iso lamento a partir dos corpos de inclusão, efectua-se a lise das células hospedeiras preferencialmente a um pH inferior ou igual a aproximadamente 6 e a uma temperatura inferior ou igual a apro ximadamente 12°C. Depois pode efectuar-se a centrifugação do li sado resultante, ccm .grandes partículas, incluindo corpos de inclu

são que, devido ao movimento rotativo, se agregarão constituindo um sedimento. Depois deita-se fora o sobrenadante e guarda--se o sedimento contendo rPDGF reduzido dos corpos de inclusão.

Os corpos de inclusão do sedimento tem de ser solubi lizados. Pode efectuar-se esta operação de acordo com qualquer um dos diversos métodos da técnica anterior. Alguns métodos uti lizam um meio de desnaturação poderoso tal como guanidina-HCl 4 a 6,5 M. Solubilizam-se os corpos de inclusão, de um modo prefe rencial, com um desnaturante mais moderado tal como ureia 4 a 9 M, de preferência ureia 8M, ajustando-se depois o pH por adição de HCl. Ajusta-se preferencialmente o pH de modo a situar-se en tre aproximadamente 3,0 e 4,0 e de um modo a que se dá melhor preferência a cerca de 3,0.

As proteínas de rPDGF dos corpos de inclusão isoladas a partir da pasta das células hospedeiras purificam-se de um mo do preferencial antes de se efectuar a derivação dos grupos suJL fidrilo. Após ter-se ajustado o pH para um nível inferior, pode isolar-se e purificar-se parcialmente o rPDGF monomérico reduzi do e solubilizado resultante utilizando qualquer uma das diversas técnicas de purificação de proteínas conhecidas na especialidade. De um modo preferencial, purifica-se o rPDGF monomérico utilizando uma cromatografia de permuta de iões efectuando-se de preferência os passos cromatogrãficos na presença de ureia 8 M. No sentido de se efectuar a separação do monõmero de rPDGF dos outros componentes contidos no sedimento, pode adicionar-se "SE

D II -Sefarose (Pharmacia, Uppsala, Suécia) ou qualquer outro permu tador catiónico adequado, lote a lote, uma mistura de corpos de inclusão solúvel. A SE-Sefaros^liga o rPDGF reduzido, sendo mui tos dos restantes componentes solúveis e insolúveis arrastados pela lavagem. Pode depois ajustar-se o pH para um nível supe- -22-

rior, de preferência para cerca de 7,6 com hidróxido de sódio (NaOH) desde que se utilizem condições de redução anaeróbicas no sentido de se conservar rPDGF no seu estado monomérico reduzido. A subida do pH elimina as proteínas adicionais de contaminação e permite que o monómero de rPDGF seja facilmente eliminado da resina. Submete-se a solução alcalina resultante a uma cromato-grafia em gradiente novamente em condições anaeróbicas para se isolar o monómero de rPDGF não reactivado.

Depois protegem-se os grupos sulfidrilo livres de rPDGF reduzido bloqueando estes grupos através da formação do interme diário de dissulfureto misto monomérico rPDGF-S-S-R da presente invenção. De um modo preferencial, também se efectuam estes pa^ sos na presença de ureia 8M. Os agentes de bloqueamento adequados para a presente invenção, tais como a cisterna oxidada ou a glutationa oxidada, adicionam-se à mistura de corpos de inclusão solubiliáada numa quantidade compreendida entre aproximadamente 0,1 e 0,2 M e de preferência numa quantidade aproximada de 0,1 M. Podem utilizar-se quantidades molares equivalentes de outros agentes de bloqueamento. Depois deixa-se a solução em agitação em condições anaeróbicas durante aproximadamente 18 horas a apro ximadamente 24 horas, de preferência aproximadamente 18 horas, entre cerca de 22°C e 26°C, de preferência a 22°C. Os níveis pre cisos de concentrações e de temperatura que são mais eficazes de penderão do agente bloqueador específico seleccionado para ser utilizado na presente invenção.

Depois submete-se a solução monomérica protegida resultante de rPDGF-S-S-R a um tampão de permuta num tampão não desnaturante. Isto pode ser levado a efeito permutando em primeiro lugar a solução que contém o intermediário monomérico prote-

gido de rPDGF-S-S-R com uma solução contendo ureia (de preferên cia a aproximadamente 8,0 M) e ácido acético (de preferencia aproximadamente 0,1 M), depois apenas com ácido acético (de pre ferencia aproximadamente 0,1 M) antes de ser diluída para cerca de 0,5 e 0,2 mg/ml, com um tmapão aquoso não desnaturante, Crê--se que o tampão aquoso não desnaturante conduza a uma reactiva ção adequada devido ãs forças presentes no meio aquoso, sob as quais o intermediário de rPDGF monomérico bloqueado tenderia a adquirir a sua conformação biologicamente activa. Devido ao fac to dos grupos sulfidrilo livres de rPDGF reduzido se encontrarem protegidos no intermediário monomérico rPDGF-S-S-R, a proteína não pode ser prematuramente travada na sua conformação inactiva pela formação aleatória de ligações dissulfureto incorrectas.

Se se utilizar Tris como tampão aquoso não desnaturante, as con centrações apropriadas encontrar-se-ão compreendidas entre 10 e 30 mM, de preferência a 20 mM. Conserva-se o pH a aproximadamen te 7,5 e 8,5, mediante a adição de um ácido ou de uma base adequa dos. De um modo preferencial o ácido será HC1 e a base será NaOH. A permuta de dissulfureto inicia-se depois com a eliminação da porção do agente de bloqueamento a partir do dissulfureto misto que se formou entre o agente de bloqueamento e o monóme-ro de rPDGF. De um modo preferencial, põe-se em contacto um com posto sulfidrilo reduzido (R-DH) com o intermediário monomérico bloqueado de rPDGF para se iniciar o desbloqueamento.

Os compsotos de sulfidrilo reduzidos adequados incluem, mas não se limitam aβ-mercaptoetanol, glutationa reduzida e cij[ teína. O que é importante na selecção de um composto sulfidrílico reduzido é que o composto sulfidrílico reduzido seja capaz de substituir a porção do agente de bloqueamento do dissulfureto misto. O sulfidrilo reduzido consistirá, de um modo preferencial, em cisteína

reduzida (Cys-SH). Quando se adiciona cisterna reduzida ao sul-fidrilo reduzido, a concentração final de cisterna encontrar-se -ã compreendida entre aproximadamente 0,5 e 3,0 mM. Incuba-se a mistura a uma temperatura compreendida entre aproximadamente 0°C e 37°C, de preferência a 30°C, dependendo do agente de bloquea mento, durante 4 a 24 horas aproximadamente, de preferência, du rante aproximadamente 16 horas. Depois pode efectuar-se a solução aproximadamente 0,1 M em ácido acético antes de se efectuar a purificação final.

Na aplicação terapêutica dos dímeros de PDGF biologicamente activos e/ou dos monómeros de PDGF biologicamente acti-vos, produzidos de acordo com a presente invenção, poderão ser utilizados pelos médicos e/ou veterinários no tratamento de diversos tipos de feridas de espécies de mamíferos. A quantidade biologicamente activa de PDGF utilizada em tais tratamentos dependerá, como é evidente, da gravidade do ferimento a ser trata do, da via de administração seleccionada e da actividade especí fica ou pureza de PDGF e será determinada pelo médico ou veterjL nário assistente. O termo quantidade "terapeuticamente eficaz de PDGF" refere-se a uma quantidade de PDGF que, na ausência de ou tros factores de crescimento aplicados por via exógena, se de terminou produzir uma resposta terapêutica num mamífero. Estas quantidades terapeuticamente eficazes serão facilmente determinadas pelo especialista.

Pode administrar-se o PDGF produzido de acordo com a presente invenção segundo qualquer uma das vias adequadas para o ferimento ou situação a ser tratada.

As situações que podem ser beneficamente tratadas com a(s) aplicação (aplicações) terapêutica (terapêuticas) de PDGF incluem feridas expostas da derme, feridas incisivas da derme e

feridas incisivas gastro-intestinais. Também se pode utilizar PDGF na regeneração de ossos, cartilagens, tendões, ligamentos e epitélios (por exemplo, os revestimentos intestinais e o r e vestimento estomacal) e na reparação da glia.

De um modo preferencial, aplica-se PDGF exogenamente sobre a ferida. A aplicação exógena pode consistir numa única aplicação ou dose ou pode consistir numa dose repetida a determinados intervalos múltiplos. As composições para aplicação exó gena de PDGF da presente invenção são facilmente determinadas p_e lo especialista. Será evidente para o especialista que as vias preferenciais variarão com o ferimento ou situação a ser tratada. Embora seja possível administrar-se PDGF como um composto puro ou substancialmente puro, é preferível apresenta-lo sob a forma de uma preparação ou formulação farmacêutica.

As formulações da presente invenção, quer para utilj. zação em veterinária quer para utilização em seres humanos, con sistem numa quantidade terapeuticamente eficaz de PDGF, tal como anteriormente se descreveu, conjuntamente com umou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e eventualmente com outros ingre dientes terapêuticos. 0(s) veículo(s) devem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não serem perigosos para o seu receptor. seria deseja vel que a formulação não incluísse agentes oxidantes ou redutores e outras substâncias com as quais se sabe que os péptidos são incompatíveis. Podem apresentar-se as formulações de um modo conveniente sob a forma de dosagem unitária e podem preparar -se de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos na especia lidade. Todos os métodos incluem o passo de associar o ingrediente activo com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. De um modo geral, preparam-se as formulações as[ -26-

sociando uniforme e infimamente o PDGF com os veículos líquidos ou os veículos sólidos finamente divididos ou ambos.

Proporcionam-se os exemplos que se seguem tendo em vista auxiliar a uma melhor percepção da presente invenção cujo verdadeiro âmbito se encontra indicado nas reivindicações em anexo. Considera-se que podem efectuar-se modificações aos procedimentos indicados sem alterar o espírito nem o âmbito da pre sente invenção.

Exemplo 1 Produção de rPDGF

Pode reactivar-se qualquer forma de rPDGF B a partir de corpos de inclusão utilizando o método da presente invenção. A forma de 109 aminoãcidos, comummente reconhecida como a forma humana natural de PDGF B, pode, por exemplo, ser reactivada a partir das células hospedeiras da E. coli, num seu dímero bio logicamente : activo, ou um seu monómero biologicamente activo. Seleccionou-se um gene que codifica uma forma de 119 aminoãcidos de PDGF B humano, indicado na fig.. 1, para a expressão das células hospedeiras de E. coli devido à substituição do codão de paragem no aminoãcido 120 aliviar um codão de paragem "de leitu ra através de", problema observado quando o codão de paragem se encontra colocado no aminoãcido 110, tal como se descreve mais pormenorizadamente no pedido de patente de invenção norte-ameri cana conjuntamente pendente séries NQS 454 794 e que aqui se engloba como referência. A forma de 119 aminoãcidos de PDGF B ou qualquer outra forma de PDGF B pode ser construída sinteticamente, tal como se descreveu no que se refere a PDGF A e que se indica no -27- exemplo 5. Também se pode derivar PDGF B utilizando o gene v-sis do vírus do sarcoma simiano, estreitamente homólogo, como material inicial. Neste exemplo construiu-se PDGF a Partir do material inicial v-sis.

Conversão dos aminoácidos 101 e 107

Efectuou-se a digestão de lyig do plasmídeo pC60, um clone do genoma retrovírico do vírus do sarcoma simiano (Wong--Staal e outros; "Science"; 213; 1981; p. 226-228 com endonucla se de restrição Sall e Xbal, sendo depois purificado o fragmento de 1183 pares de bases resultante por separação electroforê-tica, sobre gel de agarose de baixo ponto de fusão, de acordo com os procedimentos descritos por Maniatis e outros, Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Depois excisou-se o fragmento purificado do gel. Simultaneamente também se efectuou a digestão de 0,2 jxg de ADN de M13mpl9 com Sall e Xbal, isolando-se de modo idêntido a grande faixa de 7245 pares de bases a partir de um gel de baixo ponto de fusão. Fundiram-se os fragmentos excisados do gel a 65°C e depois arrefeceram-se para 37°C. Misturou-se a totalidade do gel com o fragmento M13mpl9 de 7245 pares de bases e um quarto do gel com o fragmento v-sis de 1183 partes de bases e ligou-se de acordo com Struhl, Biotechnigues, .3, 452-453 (1985) . Transfor-mou-se o ADN ligado na E. coli K12 estirpe TG1 e seleccionou-se uma placa límpida que se desenvolveu numa cultura líquida. Con firmou-se a presença do fragmento v-sis de 1183 pares de bases no vector M13mpl9 por preparação da forma RF do ADN do bacterió fago e análise do mapa de restrição. Messing et al, Nucl. Acids Res., 9, 309-321 (1981).

Desenvolveu-se o bacteriófago M13mpl9/v-sis assim obti-do numa cultura líquida e isolou-se o ADN de cordão único. Messing e outros, ibid. Utilizou-se este ADN como uma matriz para a mu tagenese in vitro dirigida de um oligonucleotido para converter os aminoácidos dos resíduos 101 e 107 nos aminoácidos correspon dentes de PDGF B. Isto ê, converteu-se o codão ATA que codifica a isoleucina 101 no codão ACA (que codifica a treonina) e o codão GCT que codifica a alanina 107 foi convertido no codão CCT { que codifica a prolina).

Complementarizou-se 10 jig de ADN de codão único de M13mpl9/v-sis com 8 pmol de um oligonucleotido fosforilado que possuia a sequência: 5' GGTCACAGGCCGTGCAGCTGCCACTGTCTCACAC 31

Esta sequência é homóloga dos nucleotidos 4283 e 4316 do gene v-sis (sistema de numeração de Devare e outros, ibid).

As bases sublinhadas do oligonucleotido indicam as alterações de v-sis para a sequência de PDGF B humano. Iniciou-se a síntese do ADN no oligonucleotido mutante, sendo o cordão mutante comple to sintetizado com o fragmento "Klenow" de ADN-polimerase I de E. coli utilizando trifosfatos tionucleotidico seguindo-se-lhe a ligação com ADN ligase T4. Eliminou-se alguma matriz de cordão único de ADN de M13mpl8/v-sis por filtração com filtros de nitrocelulose. Cortou-se o cordão não-mutante por incubação com endonucleases III de restrição. Depois repolimerizou-se o cordão não-mutante cortado com trifosfatos desoxinucleotídicos utilizando como matriz o cordão mutante. Como resultado, ambos os cordões de ADN no produto final continham as mutações desejadas . Transformou-se o ADN na E. coli K12 estirpe TG1. Selecionaram-se as placas, desenvolveram-se numa cultura líquida e isolou-se o ADN de cordão único. Efectuou-se a sequenciação do ADN de acordo com o método de Sanger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 29- 5463-5467 (1977) , para se confirmar que se tinham obtido os mu-tantes desejados.

Conversão dos aminoãcidos 6 e 7

No passo seguinte, a porção 5 do gene v-sis submetido a mutação foi substituída por um fragmento de ADN de síntese que alterou os aminoãcidos 6 e 7 de v-sis para as formas de PDGF B humano. Este fragmento de síntese também proporcionou um codão ATG de início de transferência que precedia imediatamente o codão para a serina 1 de PDGF B humano, assim como proporcionava sequên cias para ligação aos ribossomas de E. coli e um sítio de restrição para ligação no vector de expressão E. coli desejado (descrito adiante). Ligou-se o fragmento de ADN de síntese ao sítio BG1II localizado no nucleotido 4061 do gene v-sis (sistema de nu meração de Devare e outros, ibid). Devido ao facto do sítio BglII se encontrar presente no vector Ml3mpl9 poder complicar e interfe rir neste passo, moveu-se em primeiro lugar o gene v-sis submetido a mutação para o vector plasmídico pUCl8, comercialmente dispo nível, que não contém o sítio BglII. Efectuou-se a restrição do ADN RF mutante de Ml3mpl9/v-sis com Sall e BamHl e isolou-se o fragmento de 1193 pares de bases resultantes, por electroforese, utilizando um gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se este fragmento ao plasmídeo pUC18 que também tinha submetido a ac-ção dos enzimas de restrição Sall e BamHl. Transformou-se o ADN ligado na E. coli K12 estirpe DH5 comercialmente disponível e seleccionaram-se os transformantes desenvolvendo-os na presença de ampicilina. Seleccionaram-se as colónias, desenvolveram-se em cultura líquida e analisou-se o ADN plasmídico isolado efectuando

um mapa de restrição quanto ã presença da inserção v-sis.

Efectuou-se a restrição do ADN mutante de pUC18/v-sis com HindIII que corta na região de ligação múltipla de pUC18 exactamente a montante da inserção v-sis submetida a mutação e com BglII que efectua o corte no ADN de v-sis no nucleotido 4061 (sistema de numeração de Devare e outros, ibid) que corresponde ao aminoácido número 24 da proteína madura. Isolou-se o grande fragmento de 3565 pares de bases resultante desta reacção, por electroforese, sobre um gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se este fragmento a um fragmento de ADN de cordão duplo de síntese que possuía a seguinte sequência: 5' AGCTTCTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTCTGGGTTCGTTAACCATTGCG-3' AGATCTTCCTCCTTATTGTATACAGAGACCCAAGCAATTGGTAACGC- -GAACCGGCTATGATTGCCGAGTGCAAGACACGAACCGAGGTGTTCGA 3' -CTTGGCCGATACTAACGGCTCACGTTCTGTGCTTGGCTCCACAAGCTCTAG 5 '

Este fragmento de ADN contém uma extremidade coesiva HindIII na sua extremidade a montante (esquerda) e uma extremidade coesiva BglII na sua extremidade a jusante (direita). Para além disso, encontra-se presente no sítio Xbal (TCTAGA) no ADN de síntese exactamente a jusante da extremidade coesiva HindIII que permite a subsequente restrição com Xbal para ligação no sj. tio Xbal do vector de expressão que se descreve adiante. Transformou-se o ADN ligado na E. coli K12 estirpe DH5, sendo os tranj[ formantes seleccionados por crescimento num meio contendo ampici-lina. Analisaram-se os ADNs plasmídicos das colónias resultantes efectuando um mapa de restrição para se observar a presença de fragmentos de ADN de síntese. Nesta altura, a construção pUC18/ .3^ /v-sis continha o gene v-sis mutado com os aminoácidos números 6, 7, 101 e 107 alterados para a forma PDGF B humana e a sua extremidade 5' encontrava-se alterada para dar inicio à transferência com um codão ATG imediatamente antes da serina 1.

Conversão do Aminoácido 114 e Colocagão de um Codão de Paragem no Aminoácido 120

No passo seguinte, alterou-se o codão para o aminoácido 11 4 de ACT para GGT resultando a substituição da glicina pela treonina na proteína final. Para além disso, o codão número 120 no qual GCC codifica a alanina em v-sis , foi alterado para TAA, um codão de terminus de transferência. A proteína resultan te desta construção termina com a arginina no resíduo 119. Efec-tuaram-se as duas alterações num sõ passo por inserção de um fraç[ mento de ADN de síntese num sítio Smal localizado no codão número 112.

Efectuou-se a restrição do ADN mutante da pUC18/v-sis anteriormente criado com Smal, que corta no nucleotido 4324 na sequência de v-sis (sistema de numeração de Devare e outros, ibid) e com EcoRl que efectua o corte na região de poli-ligação de pUC18 imediatamente a jusante da inserção de v-sis. Eliminou-se um pequeno fragmento (510 pares de bases) entre os sítios Smal e EcoRl, que codifica a porção C-terminal da proteína v-sis e uma sequência não transferida da extremidade 3', por electroforese sobre gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se o grande fragmento (de aproximadamente 3530 pares de bases) a um fragmento de ADN de síntese que possuía a seguinte sequência: 3

5 * GGGGGGTTCCCAGGAGCAGCGATAAG 31CCCCCCAAGGGTCCTCGTCGCTATTCTTAA 5'

Encontram-se sublinhados, na sequência anterior, o codão GGT que codifica o novo resíduo de glicina na posição 114 e o codão de terminus TAA introduzido na posição 120. Este fragmento de ADN de síntese, indicado na fig. 1, contém uma extremidade com plementar na sua extremidade a montante (esquerda) para ligação da extremidade complementar criada pela restrição da sequência mutante v-sis, com Smal e com uma extremidade "coesiva" EcoRl na sua extremidade a jusante (direita) para ligação da extremidade EcoRl criada pela restrição da região de poli-ligação de pUC18 com EcoRl. O ADN ligado foi transformado no interior da E. coli K12 estirpe DH5 sendo os transformantes seleccionados os. crescimento num meio com ampicilina. Analisaram-se os ADN's plasmídi-cos das colónias resultantes quanto à presença do fragmento de ADN de síntese por mapa de restrição.

Expressão de PDGF

No passo final, a forma completa do gene v-sis mutado foi eliminada de pUC18 e ligada no vector de expressão pCFM1156 de E. coli. Preparou-se o plasmídeo pCFM1156PL a partir do plajs mídeo já conhecido pCFM836. A preparação do plasmídeo pCFM836 encontra-se descrita na patente de invenção norte-americana NQ 4 710 473 cujas partes mais relevantes da memória descritiva, especialmente os exemplos 1 a 7 são aqui englobados como referên. cia. Para se preparar o plasmídeo pCFM1156 a partir do plasmídeo pCFiyL836, cortaram-se os dois sítios de restrição endógena Ndel, complementarizaram-se as extremidades expostas com polime- 3- rase e ligaram-se de modo complementar as extremidades complementares .

Depois digeriu-se o plasmideo resultante com Ciai e Hpnl e substituiu-se o fragmento de ADN excisado por um oligonucleoti do de ADN com a seguinte sequência: CLal Hpnl 5'CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' 3’ TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTCTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' 0 vector pCFMH56 contém a região para a inserção de genes estranhos entre o sitio Xbal a montante e um de diversos sítios de restrição a jusante. Neste caso, utilizou-se o sítio EcoRl a jusante. Efectuou-se a restrição do ADN mutante de pUC18/ /V-sis anteriormente gerado com Xbal e com EcoRl, sendo isolado o pequeno fragmento de 383 pares de bases por electroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se este fragmento ao ADN de pCFMH56 que tinha sido submetido a restrição com Xbal e com EcoRl. Transformou-se o ADN ligado na estirpe de FM5 de E. coli (ATCC$ 67545) tendo-se seleccionado os transformantes por crescimento num meio contendo canamicina. Analisaram-se os ADN's plasmídicos das colónias resultantes quanto à presença do fragmento de ADN inserido de acordo com o mapa de restrição. 0 plasmideo de expressão final continha uma sequência de ADN inserida que codificava uma proteína que se iniciava com uma metionina de iniciação seguida dos aminoácidos de 1 a 119 da sequência da cadeia B de PDGF humano. As células hospedeiras procarióticas de E. coli eliminaram a metionina N-terminal após a síntese, pelo que a proteína final produzida correspondia aos aminoácidos de 1 a 119 de PDGF B humano.

Confirmou-se a expressão dos 119 aminoãcidos da protejL na de PDGF B desenvolvendo células bacterianas contendo o plas-mideo de expressão a 28°-30°C ate se atingir a densidade õptica desejada da cultura e depois desenvolvendo a cultura a 42°C durante diversas horas. Recolheram-se amostras das células em cul tura antes de se alterar a temperatura para 42°C e em diversas alturas depois disso. Observou-se, por análise electroforêtica sobre gel SDS-poliacrilamida das proteinas bacterianas, que se encontrava presente uma banda predominante de peso molecular apa rente de 14,6 Kd nas células bacterianas induzidas pela tempera tura mas nao nas células bacterianas previamente induzidas pela temperatura. Esta proteína encontrava-se presente num nível apro ximado de 30-40 mg por litro de uma cultura bacteriana desenvo_l vida a uma densidade óptica de 600 nm de 1,0. A purificação e se quenciação aminoãcida subsequente desta proteína confirmou que possuía a sequência prevista para os aminoãcidos de 1-119 da ca deia B de PDGF humano.

Exemplo 2

Reactivação do Homodímero da Cadeia B de rPDGF a partir dos Corpos de Inclusão da E. coli Utilizando Glutationa como Agente de Bloqueamento

Removeram-se aproximadamente 1,5 a 1,6 Kg de pasta de E. coli recolhida (isto é, concentrada) do exemplo 1 contendo rPDGF B^g. Efectuou-se uma suspensão da pasta E, coli em 9 volumes (v/p) de ácido etileno-diamino-tetra-acético dissõdico (EDTA), conservando-se a temperatura a 4°C. Efectuou-se a lise da pasta celular em suspensão utilizando um homogeneizador "Men ton-Gaulin" a uma pressão de 14 000 psi e a uma temperatura de 12°C. Centrifugou-se imediatamente o lisado a 3 600 x G durante 60 minutos a 4°C e põs-se de lado o sobrenadante conservando-se o sedimento que continha o rPDGF dos corpos de inclusão.

Efectuou-se a suspensão do sedimento em 14 volumes (v/p) de ureia 8,5 M, glicina 0,1 M, a um pH de 3,0 e agitou-se duran te 30 minutos. Entretanto drenou-se a resina de cromatografia SE SefaroseR(PHarmacia) colocando a resina comercialmente disponível num funil de vidro adequado permitindo a drenagem da resina por acção da gravidade, lavou-se a resina com água desionizada e drenou-se novamente a resina. Continuando a agitar o sedimento submetido a nova suspensão, adicionou-se 2,4 Kg de resina drenada ao sedimento em suspensão. Decorridos 30 minutos, pôs--se termo à agitação. Deixou-se a resina depositar-se e pôs-se de parte o sobrenadante. Adicionou-se à resina depositada cinco litros de ureia 8,5 M e de glicina 0,1 M, a um pH de 3,5. Agitou-se a mistura durante mais 5 minutos deixando-se novamente pousar a resina e pondo-se de lado o sobrenadante.

Adicionaram-se à resina em repouso cinco litros de ureia 8,5 M, ácido fosfórico 20 mM, a um pH de 3,C. Agitou-se a mistura resultante novamente durante 5 minutos, deixando-se pou sar novamente a resina e pondo-se o sobrenadante de parte. Adicionou-se à resina em repouso um segundo volume de 5 litros de ureia 8,5 M e de ácido fosfórico 20 mM, a um pH de 3,0. Submeteu -se esta mistura, com agitação, a um vácuo igual a 635 mm de mer cúrio durante 30 minutes. Depois interrompeu-se o vácuo e tratou-se a mistura com ditiotreitol (DTT) 5 mM, ajustando-se o pH para 7,7 com .hidróxido de sódio (HaOH) 10 M. Restaurou-se novamen te o vácuo e agitou-se a mistura durante 30 minutos. Ainda em vácuo, com agitação descontínua, deixou-se pousar a resina epÔ£ -se de lado 90% do sobrenadante. Misturou-se imediatamente a re sina com o liquido residual e verteu-se numa coluna de 25 cm de diâmetro (coluna em lotes) ligou-se o adaptador de fluxo e carregou-se a resina a 100 cm/hora durante 10 minutos com ureia 8,5 M e fosfato de sódio 20 mM (Na2HPO^), a um pH de 7,7 e manteve-se a aspersão com azoto gasoso (tampão A). Baixou-se o adaptador de fluxo para a superfície da resina e lavou-se a coluna com tampão A adicional a um débito de 25 cm/ hora até que a absorvância efluente a 280 mM fosse constante.

Depois efectuou-se a conexão do orifício de descarga da coluna de lote com o orifício de admissão de uma segunda coluna de 25 cm x 20 cm (coluna de resolução) embalada com SE Sefarose (Phar macia) recentemente preparada e equilibrada com tampão A. Depois efectuou-se o tratamento das colunas de lote e de resolução a um débito de 25 cm/hora com um gradiente linear de 80 litros a par tir de tampão A a 100% a tampão B a 100% (ureia 8,5 M, Na^PO^ 20 mM, NaCl 0,4 M, pH 7,7) que se tinha aspergido com azoto gasoso. Agregaram-se imediatamente as fracções adequadas e coloca ram-se em vácuo â medida que saíam da coluna. O rendimento situ ou-se entre 0,45 e 0,90 g por litro de caldo de fermentação.

Dilui-se, se necessário, a solução contendo rPDGF B^ig monomérico desnaturado, até a uma absorvância compreendida entre 0,4 e 0,5 D.O. Tornou-se então a solução proteica 0,1 M em glutationa oxidada e ajustou-se o pH para 8,0 com NaOH 10 M. Co locou-se novamente a solução em vácuo e agitou-se durante 18 a 24 horas. Interrompeu-se o vácuo e baixou-se o pH do intermediá rio de dissulfureto misto derivado de rPDGF monomérico para 3,0 com HC1. Concentrou-se a solução resultante para 1/2 do volume inicial e depois diafiltrou-se em primeiro lugar com quatro volumes de ureia 8,5 M, ácido acético 0,1 Μ o depois com' quatro

volumes de ácido acético 0,1 M utilizando uma membrana de ultra filtração "Amicon YMR10 (Amicon Inc.,. Danvers, Massachusètts). concentração final de proteínas encontrava-se compreendida en- 1% tre 1,5 e 2,0 mg/ml 280nm = com uraa outra pureza do mo nõmero de rPDGF-S-S-G superior a 85% e um rendimento compreendido entre 0,45 e 0,90 g por litro de caldo de fermentação.

Efectuou-se a reactivação diluindo a solução de rPDGF-S--S-G para 0,1 mg/ml com Tris 20 mM. Depois adicionou-se, sucesi-vamente, cisteína 1M em ácido acético 0,1 M a esta solução até a uma concentração final de 1 mM e ajustou-se o pH para 8,0 com NaOH. Deixou-se a solução em agitação durante 16 horas no senti do de se desbloquear o intermediário monomérico derivado de rPDGF--S-S-G e dar inicio á formação das ligações dissulfureto intraca-deia e intercadeia e depois tornou-se 0,1 M com ácido acético. O rendimento foi de 0,32 a 0,63 g por litro de caldo de fermentação.

Carregou-se a solução do dlmero de rPDGF reactivado a um débito de 100 cm/hora, numa coluna de 11,3 x 5 cm de vidro poroso

controlado (CPG, pg-350-400, 96 m /g, diâmetro médio dos poros O 382 A, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri), equilibrada quer com glicina 0,05 M, a um pH de 3,5 (tampao C) , quer com gljl cina 0,05 M, NaCl 0,4 M, a um pH de 3,5 (tampao D). Após se ter carregado a solução pos-oxidada de PDGF na coluna, lavou-se a coluna com tampao de equilíbrio a um débito de 40 cm/hora. Depois eluiu-se o dimero de PDGF purificado a partir da coluna, novamen te a um débito de 40 cm/hora, aplicando um gradiente de 5 litros iniciando-se a operação com qualquer tampão C ou D e terminando com guanidina-HCl 2M em tampão C ou ureia B M em tampao D.

Agregaram-se as fracções adequadas de PDGF puro. O rendimento situou-se entre 0,25 e 0,5 g por litro de caldo de fermen taçao.

Exemplo 3

Actividade Mitogênica do Homodimero da Cadeia B de rPDGF reac-tivado

Ensaiou-se o homodimero de rPDGF reactivado do exemplo 2 quanto à sua actividade mitogênica de acordo com um en saio de incorporação de timidina utilizando células de rim de ra tazana, Clone 49F, ATCC í^CRL-1570 (NRK) , de acordo com a modificação do método descrito por Pierce et al., J. Exp. Med., 176 974-987 (1988) , utilizando rPDGF B de mamíferos a partir de cêlu las CHO como um padrao. Desenvolveram-se as células NRK num meio de crescimento (SFB-DMEM) que consistia em: 1) - Meio de Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, contendo 1 g/ /litro de glicose, uma solução de penicilina/estreptomicina a 1% (peso/v) (100 x 10,00 unidades de penicilina, 10 000 jxq de estrep-tomicina/ml) e uma solução de L-glutamina a 1% (v/v) a 100 x x 200 mM; e 2) - Soro de Feto de Bovino a 7,5% (SFB) (Whitaker Ma Bioproducts, Walkersville, Maryland).

Colocaram-se as células em placas de microtitulação de 4 24 tubos a uma densidade de 2 x 10 cêlulas/tubo em SFB-DMEM. De corridos 5 dias, aspirou-se o meio SFB-DMEM e substituiu-se por 1 ml de DMEM sem SFB, no sentido de "submeter as células a um regime de fome" de modo a que elas pudessem responder significativamente apos exposição a PDGF. Incubaram-se as células neste meio durante 24 horas, apos o que se adicionou, a cada tubo, 50^il de uma amostra contendo PDGF. Apos mais 18 horas de incubação , aspirou-se a amostra contendo PDGF e substituiu-se por 1 ml de um -39

.% meio de marcação que consistia em DMEM, SFB a 5% e 2 jiCi/ml de H-timidina. Incubaram-se as placas durante um período adicio nal de 1 hora a 37°C. Separaram-se as células a partir dos tu bos em triplicado, com uma solução de sacarose/EDTA e recolheram-se, com um aparelho de micro recolha automatizado, sobre su perfícies de filtros de fibra de vidro. Fixaram-se as células sobre essas superfícies com etanol e, apôs secagem, efectuou-se a contagem desses filtros com um contador de cintilação. 0 valor médio dos tubos de controlo que não tinham recebido PDGF foi subtraído das contagens médias triplas de cada amostra experimental. Efectuou-se o diagrama logarítmico da con centraçao de PDGF em ng/ml em função de cpm incorporada por cada amostra. Indicam-se os resultados na Fig. 2. Estes resultados demonstram que o homodímero de rPDGF reactivado do exemplo 2 possuía substancialmente a mesma actividade mitogénica do díme ro de rPDGF B das células hospedeiras eucariõticas de CHO.

Exemplo 4

Actividade Quimiotáctica do Homodímero da Cadeia B de rPDGF Reac-tivado

Ensaiou-se o homodímero rPDGF B^^ reactivado do exemplo 2 quanto à sua actividade quimiotáctica sobre os fibroblas-tos e monocitos de acordo essencialmente com o método descrito em J. Cell. Biol., 96, 382-385 (1983); Deuel et al., J. Clin. In-vest., 69, 1046-1049 (1982) . Ensaiou-se o homodímero de rPDGF B119 exeraPl° 2 em câmaras Boyden, tal como descrito nos artigos em referência, utilizando rPDGF B dimérico de mamíferos obti do a partir de células CHO, utilizado como padrão. Neste ensaio, as células migraram através do filtro para uma outra câmara sem o agente quimiotáctico e para outra câmara com o agente quimio-táctico. Decorrido um dado período de tempo, efectuou-se a con tagem do número de células num campo microscópio com o apoio de um agente químio-captor.

Obtiveram-se os fibroblastos a partir de amostras de esécimes cirúrgicos da pele de adultos normais. Efectuou-se a cultura das células num meio de Eagle modificado (DMEM) da Dul-becco, enriquecido com L-glutamina 2 mM, aminoãcidos não essenciais e soro de feto de bovino a 10% (KC Biological, Inc., Lene xa, Kansas). Utilizaram-se as células para ensaios após seis passagens. Obtiveram-se as células mononucleares do sangue humano (monocitos) utilizando gradientes "Ficoli/Hypaque" e suspen dendo-se em UNEM enriquecido com albumina humana a 2%, a densi-dades de 2,5 x 10 células por ml.

Determinou-se a quimiotaxia num aparelho de tubos multi--protegidos que possuíam 30 tubos. Utilizou-se a técnica da mem brana dupla, utilizando uma membrana de policarbonato (Nucleopo-re Corporation, Pleasanton, Califórnia) com poros de 8 ^am (fibro blastos) ou poros de 5 ^im (monocitos) no topo de uma membrana de nitrato de celulose (Millipore Corporation, Bedford, Massa-chusetts) que possuía poros de 0,45 ^um, separando cada tubo num com partimento superior e num compartimento inferior. Encheu-se o com partimento inferior quer com uma solução de pDGF a ser ensaiada, quer com meio de controlo, cobrindo-se depois com membranas, de acordo com a ordem apropriada, após o que se adicionou ao compartimento superior uma suis pensão celular contendo fibroblastos ou monocitos. Após preenchimento de ambos os compartimentos dos tubos, colocou-se o aparelho de quimiotaxia num incubador humidificado a 37°C, em atmosfera com 5% -41 \

de dióxido de carbono e 95% de ar, durante 6 horas. Depois abriu--se o aparelho, eliminou-se cada par de membranas e corou-se.

Determinou-se a migração celular por contagem com amplificação elevada de energia (x 400) das células que se tinham movido para a interface entre as duas membranas e aquelas que se tinham movi. do para a membrana inferior. Contaram-se cinco campos de alta energia (cae) por par de membrana. Expressou-se a migração celu lar como o número rigoroso de células que migraram por cae, isto e, o número de células por cae menos o número de células por cae que migraram como resposta ao meio de controlo. Na fig. 3 indicam-se os resultados para o ensaio de quimiotaxis para os fibro-blastos e na fig. 4 encontram-se os resultados para o ensaio de quimiotaxia para os monocitos. Estes resultados indicam que o homodímero de rPDGF reactivado do Exemplo 2 possui substan cialmente a mesma actividade quimiotãctica de rPDGF B dimérico das células hospedeiras eucariõticas CHO.

Exemplo 5

Produção de rPDGF A

Existem pelo menos duas formas de PDGF A natural com pequenas variações da sequência aminoácida. A forma longa, PDGF A_ , também conhecida como PDGF A de glioma, possui 125 aminoãci dos de extensão. A forma mais curta, PDGF A,., também conhecida como PDGF A endotelial, possui 110 aminoãcidos de extensão. Qual^ quer forma de PDGF A, ou dos seus análogos, pode ser reactivada utilizando o processo da presente invenção. No entanto, selec-cionou-se PDGF Ampara se demonstrar o método de reactivação de^ coberto ou revelado pela presente invenção e sintetizou-se, de r-4 • .% acordo com a sequência de código indicada na fig. 5. Sintetizou--se, de um modo específico, a sequência que codifica PDGF AL utilizando um procedimento consitutuido por quatro passos com diversas lavagens intermédias, tal como se indica adiante.

Efectuaram-se as sínteses num sintetizador automatizado da Applied Biosystem, Inc. (Foster City, Califórnia), modelo 380, utilizando reagentes comercialmente disponíveis.

Em primeiro lugar, estripou-se em colunas de suporte o nucleosido protegido por dimetoxiltritil ligado ao polímero (pri meiro acido nucleico na sequência) do seu grupo de protecção dd^ metoxiltritil da extremidade 5', fazendo passar uma solução de ácido tricloroacêtico a 3% em diclorometano através da coluna, du rante um minuto. Depois lavou-se o polímero com acetonitrilo, se guindo-se a sua lavagem com acetonitrilo anidro. Depois colocou--se o polímero, que continha o nucleosido desprotegido, em atmosfera de argon, antes de se proceder ao passo seguinte (condensação) .

Efectuou-se o passo de condensação tratando em primeiro lugar o polímero com tetrazol em acetonitrilo. O nucleosido de^ protegido ligado ao polímero reagiu depois com uma cianoetil-nu-cleosidofosforamidite (segundo ácido nucleico na sequência: Applied Biosystems, Inc.), em acetonitrilo. Deixou-se prosseguir a reacçáo de condensação durante 2,0 minutos, sendo os reagentes subsequentemente eliminados por filtração. Ã condensação seguiu-se o tamponamento dos grupos que não reagiram de hidroxilo de extremidade 5' dos nucleosidos, fazendo fazendo passar uma solução que se preparou misturando uma parte de uma mistura adquirida na Applied Bisystems, Inc., con tendo anidrido acético e 2,6-lutidina em THF (tetra-hidrofurano) -4 e uma parte de 1-metilimidazol em THF (também adquirível na Applied Biosystems, Inc.), através da coluna, durante um minuto. A seguir ã eliminação da solução tamponante tratou-se o polímero, durante 1,5 minutos, com uma solução de oxidação (l2 0,1 M em H20/2,6-lutidina/THF, numa proporção de 1:10:40). A esta operação seguiu-se uma lavagem com acetonitrilo. E o ciclo iniciou-se novamente com uma desprotecção com ácido tricloroacitico/ /cloreto de metileno e repetiu-se até se obter a sequência que co difica PDGF A .

Tratou-se a sequência que codifica PDGF ligado ao polímero com amónia recentemente concentrada ã temperatura ambiente durante 2,0 horas. Após decantação da solução do polímero, aqueceu-se a solução de amónia concentrada a 60 C durante 16 horas num tubo se lado.

Extraíu-se a solução que continha a sequência de código de PDGF A com 1-butanol e éter etílico, determinando-se a concen

Jj tração da solução de extracção espectrofotometricamente medindo a absorção a 260 nm. Concentrou-se uma aliquota da solução extraída que continha 5,0 unidades de D.O. do oligonucleotido sintetizado, para electroforese preparatória e verteu-se sobre um gel de poliacrilamida a 15% e ureia 7 M. Após ter-se efectuado a electroforese, visualizou-se a banda do produto por U.V., excisou--se do gel, extraíu-se com tampão de eluição (acetato de sódio 300mM (NaAOc) EDTA 2,5 mM, Tris-HCl 100 mM, a pH 8,0) e depois

R dessalinizou-se numa coluna G-50 Sephaden (Pharmacia LKB Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey) utilizando como eluente TEAB (bicarbonato de trietil-amónio) , para se produzir o oligonucleotido puri^ ficado. %

Expressão de PDGF A

Ligou-se a sequência, que codifica PDGF AT na sua for-ma completa, no vector de expressão pCFMH56 de E. coli. Neste caso, utilizaram-se os sítios Ndel a montante e o sítio BamHl a jusante. Efectuou-se a restriçã do ADN do pCFMH56 anteriormen te descrito com Ndel e BamHl e ligou-se o grande fragmento vector ao gene de PDGF AL sintetizado, que continha as extremidades coexíveis Ndel e BamHl. Transformou-se o ADN ligado na E. coli K12 estirpe FM5 (ATCC$ 67545 sendo so transformantes selecciona-dos por crescimento num meio contendo canamicina. Analisaram-se • 4 por mapa de restrição os ADNs plasmidicos das colonias resultantes quanto ã presença do fragmento de ASDN inserido. 0 plasmídeo de expressão final continha uma sequência de ADN inserida que codificava a sequência da cadeia AT de PDGF huma .Li “ no. As células bacterianas eliminaram a metionina N terminal apõs a síntese, pelo que a proteína final produzida correspondia ã forma humana de PDGF AL de 125 aminoácidos de extensão.

Confirmou-se a expressão da proteína de PDGF A_ tal como se descreveu para PDGF B-^^ no exemplo 1. Observou-se, apôs análise electroforética sobre gel SDS-poliacrilamida das proteínas bacterianas, que uma banda predominante de peso molecular aparen te de 18 kd se encontrava presente nas células bacterianas induzi, das pelo calor, mas não nas pré-induzidas pelo calor. Esta proteína encontrava-se presente num nível aproximado de 25 mg por litro de cultura bacteriana desenvolvida a uma densidade õptica de 600 nm de 1,0. A purificação e a sequenciação aminoácida sub sequente desta proteína confirmaram que ela possuía a sequência esperada para a cadeia AL de PDGF humano.

Exemplo 6

Reactivagão do Homodimero de cadeia A^de rPDGF a partir dos Corpos de Inclusão de E. coli utilizando Glutationa como Agente de Bloqueamento

Reactivou-se o rPDGF do exemplo 5 no seu homodimero biologicamente activo, de modo idêntico ao que se indica no exem pio 2, com excepção da fase de reactivagão ser efectuada por di luigão de uma solugão do monómero de rPDGF-S-S-G de 0,05 mg/ml, com Tris 20 mM. Depois, adicionou-se a esta solugão, cisteina 1M em ácido acético 0,1M, até a uma concentração final de 1 mM e ajustou-se o pH para 7,5 com NaOH. Deixou-se a solução em agita, çâo durante 16 horas e depois tornou-se 0,1 M em ácido acético. 0 rendimento situou-se entre 0,19 e 0,38 g por litro de caldo de fermentagão.

Verteu-se a solugão do dimero de rPDGF reactivado a um débito de 100 cm/hora numa coluna de 10,0 x 5 cm de vidro poroso controlado (CPG pg-350-400, 96 M /g , diâmetro médio dos poros o 382 A, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri), equilibrada quer com glicina 0,05 M a um pH de 3,5 (tampão C) quer com glici^ na 0,05 M, NaCl 0,4 M, a um pH de 3,5 (tampão D). Após ter-se carregado a solução de PDGF, apõs oxidação na coluna, lavou-se a coluna com tampão de equilíbrio a um débito de 40 cm/hora. Eluiu--se o dimero de PDGF purificado da coluna, novamente a um débito de 40 cm/hora aplicando o gradiente linear de 4 litros inciando--se com tampão C ou D e terminando com guanidina, HC1 2M em tampão C ou ureia BM em tampão D.

Agregaram-se as fracções adequadas do dimero PDGF puro. 0 rendimento encontrava-se situado entre 0,15 e 0,3 g por litro de caldo de fermentação.

Exemplo 7

Actividade Mitogénica do Homodímero da Cadeia A de rPDGF reacti-vado

Efectuou-se o ensaio de mitogenese tal como se indica no exemplo 3. As concentrações menores e na ausência de outros fac-tores de crescimento, a actividade homodímero de PDGF A nas células NRK ê consideravelmente inferior ao do homodímero de PDGF B. Indicam-se os resultados na fig. 6

Exemplo 8

Reactivação do Heterodímero da Cadeia A-B de rPDGF a partir dos Corpos de Inclusão de E. coli utilizando Glutationa como Agente de Bloqueamento

Reactivou-se o heterodímero recombinante PDGF A-B do mesmo modo indicado no exemplo 6, com excepção de 2/3 da protei_ na total, a 0,1 mg/ml, ter sido fornecido pelo monõmero de rPDGF B119“S“S"G' sendo 1/3 restante da proteína total proporcionado pe lo monõmero rPDGF A^-S-S-G. Seleccionaram-se estas concentrações relativas de modo a favorecer a formação do heterodímero por desencorajamento da formação do homodímero rPDGF A-A. A cromato-grafia do heterodímero reactivado de PDGF A-B efectuou-se por cro matografia de afinidade de imobilização de iões metálicos (IMAC) e por CLEP de fase inversa, seguindo essencialmente os procedimen tos referidos por, A. Hammacher e outros, J. Biol. Chem., 263 , 16493-16498.

Em primeiro lugar efectuou-se a cromatografia da solução do dímero de rPDGF reactivado sobre vidro poroso controlado, tal como se indicou no exemplo 6, agregando-se as fracções apro priadas e depois diafiltrando o rPDGF reactivado e agregado con tra ácido acético 0,1 M, através de uma membrana Amicon 10K, Ajustou-se o pH do PDGF agregado para 7,4 com NaOH e depois car regou-se uma coluna de 2,6 x 10 cm de Sefarose Chelating (Phar-macia), carregada com iões Cu e equilibrada com Na PO. 20 mM , X ΤΓ imidazol 1 mM. NaCl 1M, a um pH de 7,4 (tampão A). Depois eluíu-se a coluna com um gradiente linear de 1 litro ente tampão A e Na PO. 20 mM, imidazol 10 mM, NaCl 0,7 mM, a um pH de 7,4 (tampão B) . Depois agregaram-se as fracções adequadas.

Trouxeram-se essas fracções agregadas até 25 mM com fosfato dissõdico e imidazol 1 mM antes de se efectuar a filtração R 2+ através de uma coluna de Superose quelada com 1,6 ml de Cu (Pharmacia) equilibrada com imidazol 1 mM/NaCl lM/NaPO^ 20 mM, a um pH de 7,5 (tampão A). Nestas condições, o homodímero PDGF B não se liga. Depois, lavou-se a coluna com 95% de tampão A e com 5% de tampão B (imidazol 30 mM NaCl 0,7 M/NaPO^ 20 mM, a um pH 7,5) seguindo-se um gradiente linear de 405 em tampão B. Tornaram-se evidentes componentes múltiplos em sobreposição, tal como se indica na fig. 7. A anãlise SDS-PAGE de amostras dos pi. cos proporcionou padrões idênticos que, por redução, produziram duas bandas de intensidades comparáveis apõs coloração com azul de Coomassie (fig. 8A). Corou-se subsequentemente o gel com pra ta estanhada e encontra-se representada na fig. 8B uma reprodução desse gel.

Examinaram-se os picos principais e os picos inferiores 2+ R da coluna de Cu -Superose quelante (Pharmacia) independente- -48-

mente por análise CLEP numa coluna "Vydac C4 utilizando um gra diente de 2-propanol em cloridrato de guanidina 2 M, ácido acético 1 M. Os tempos de retenção para os diversos polipéptidos estão indicados no quadro 1, adiante. As características dadas 2+ por CLEP, de uma das fracçoes da coluna quelante-Cu relativa-mente ao honodimero de PDGF a que se eluiu em primeiro lugar e ao homodímero de PDGF B que se eluiu em último lugar, encontram-se indicados na fiS· 9 Quadro 1

Tempos de Retenção de Diversas Formas de rPDGF RT (minutos) 27.5 - 27,9 41.8 26.5 - 27,2 33.9 - 35,0 _rPDGF_

rPDGF Al-S-S-G rPDGF B-S-S-G honodimero A-A de rPDGF honodimero B-B de rPDGF A partir dos resultados aqui apresentados, ambas as frac: 2+ çoes da coluna quelante-CU representam os heterodimeros A-B de PDGF. A fracção principal desta coluna possuia uma absorvãncia máxima a 268 nm, enquanto que o pico inferior possuia uma absor vância máxima a 280 nm (figuras 10A e 10B).

Exemplo 9

Produção de um Análogo de PDGF B-^qq com Resíduos de Cisteína Alterados 43 52 53

Concebeu-se um analogo de PDGF [Ser , Ser , Ser , 99 ✓

Ser ] para a produção do monomero biologicamente activo desbloqueado, de acordo com o processo da presente invenção. IdentifjL -49

caram-se os resíduos de cistelna nas posições dos aminoãcidos 43, 42, 52, 53 e 99 para substituição com resíduos de serina , com base no estudo prévio de Giese e outros que sugeria que os resíduos correspondentes no gene v-sis podiam não ser necessários para a dimerização da molécula v-sis . Giese e outros, Science, 236, 13-15 (1987). Referiu-se que a alteração dos re siduos de cisteína correspondentes a v-sis provoca a rotura da dimerização mas não a actividade transformante de v-sis. Giese e outros, ibid.

Construiu-se um gene para expressão de E. coli do análo 4-¾ ςο si 99 go de PDGF [Ser , SerD , Ser , Ser3 ] indicado na fig. 10 utilizando estratégias idênticas ãs descritas para a construção da forma PDGF B-q^/ tal como se indica no exemplo 1. No caso do análogo , concebeu-se o gene de modo a expressar uma forma de 109 aminoãcidos de PDGF B. O material inicial consistiu no próprio gene v-sis que se utilizou no exemplo 1, com as quatro diferenças aminoãcidas entre a proteína v-sis e o PDGF B humano (isto é, os resíduos 6, 7, 100 e 107) substituídos pela forma humana de PDGF B tal como se indica no exemplo 1. Estas alterações envolve ram a mutagenese in vitro dos aminoãcidos 100 e 107 e a substituição da extremidade 51 do gene por um fragmènto de ADN de síntese alterando os aminoãcidos 6 e 7. O fragmento de ADN de sintjs se também proporcionou um cõdão ATG de iniciação de transferência que precedia o codão de serina 1 assim como um sitio xbal a montante para ligação ao vector de expressão E. coli desejado.

Utilizou-se o ADN resultante com uma matriz para posteriores reacções de mutagenese para se introduzirem quatro substituições de cistelna por serina e um codão de paragem na posição 110. Tal como anteriormente se referiu, os quatro resíduos de cistelna que se alteraram são os resíduos das posições dos amino- -50-

ácidos 43, 52, 53 e 99. Utilizaram-se quatro oligonucleotidos para se efectuarem estas alterações. 0 oligonucleotido 1, que possuía a sequência: 3' CACCGGCGGGAGGCACCTCCA 5', utilizou-se para se alterar a cisteína 43. 0 oligonucleotido 2, que possuía a sequência: 3 ' CGCGACGAGGCCGAGAAGGTTGTTGGCGTTGC 5 ' foi utilizado para alterar a cisteína 52 e a cisteína 53. O oligo nucleotido 3, que possuía a sequência: 3' CGTACGTTCAGACTCTGTCAC 5', foi utilizado para alterar a cisteína 99 e o oligonucleotido 4, que possuía a sequência: 3' GGACACTGGACTTCGGGCC 5' foi utilizado para alterar:, o codão para a arginina 110 no codão de paragem TGA. Os nucleotidos sublinhados indicam as alterações de v-sis para a sequência de PDGF B humano. Efectuou-se a mutage nese in vitro, tal como se descreveu para a construção do gene de PDGF B-Qg/ com excepção de se terem misturado os quatro oligonucleotidos e de se terem introduzido as cinco mutações simultânea mente numa única reacção. Também se utilizou em vez das estirpes não mutantes cortadas com um enzima Ncil, o enzima alternativo Pvul devido ao facto do oligonucleotido 4 (anteriormente referido) conter um sítio de reconhecimento de Ncil. Isolou-se uma pia ca M13mpl8/PDGF B resultante, purificou-se o ADN e sequenciou-se. A sequência de ADN indicou que todas as mutações desejadas foram introduzidas tal como se esperava.

Preparou-se ADN RF de cordão duplo de M13mpl8/PDGF a par tir deste bacteriofago e efectuou-se a restrição com Sall e SamI. -st 0 enzima Sall efectuou o corte a montante da sequência de PDGF B e o enzima Smal efectuou o corte na sequência de PDGF numa po sição cinco nucleotidos a montante do codão de paragem introduzido na posição 110. Ligou-se este fragmento ao vector pUC18 , que também tinha sido submetido a restrição com Sall e SamI. Ejs ta fase originou a eliminação da grande região não transferida da extremidade 3' de v-sis entre os sitios Smal e Xbal a jusante.

Eliminou-se o gene mutante PDGF B que continha as quatro alterações de cisteína em serina desejadas e o codão de para gem a seguir ã treonina 109, por restrição de pUC18 com Xbal e EcoRl. (Existe um sitio EcoRl em pUC18 imediatamente a jusante do sitio Smal ). Ligou-se este fragmento na E. coli estir pe FM 5 (ATCC NQ 53911) e seleccionaram-se as colónias recombinan tes resultantes. Analisou-se posteriormente uma destas colónias seleccionadas tal como se descreve adiante.

Demonstrou-se que a célula hospedeira transformada FM5/ 4.-3 R9 RR QQ _ /pCFM1156/PDGF B1Q9 [ Ser , Ser , Ser , Ser 1 produzia pro teinas PDGF B utilizando métodos idênticos aos descritos no exem pio 1. A análise SDS-PAGE revelou existirem duas bandas muito próximas que indicavam a presença de duas proteínas. A banda menor correspondia à forma esperada de 109 aminoácidos do análogo 43 52 53 99 de PDGF [ Ser , Ser , Ser , Ser ] , enquanto que a ban da superior correspondia ao produto de leitura através de 129 ami noãcidos de PDGF B que continha mais 20 aminoácidos na sua extremidade carboxi. Estes aminoãcidos adicionais derivavam de pCU18 e do vector pCFM1156. Este produto de "leitura através de" origina a paragem de transferência no codão de paragem presente no vector pCFM1156. A seguir a purificação , tal como se descreveu no exem 43 53 99 pio 1, o PDGF B^09 ^ ^er ' ^er527 ^er ' ®er ^ reduzido mono mérico da pasta celular foi depois reactivado de modo idêntico ao do homodlmero do PDGF B-^g tal como se indica no exemplo 2. No , 43 52 53 99 caso do analogo de PDGF B10g [ Ser , Ser Ser , Ser ] a reac tivação originou um monõmero de PDGF B, em vez da forma dimêrica de PDGF B-^g do exemplo 2.

Exemplo 10

Actividades Mitogénicas Comparativas do Homodlmero de PDGF B-^g reactivado do Monõmero do Análogo PDGF ^g e de PDGF B^^g_e dos Intermediários Monoméricos de Dissulfuretos Mistos de PDGF A^ Reactivados

Efectuou-se o ensaio para se observar a actividade do 43 52 53 99 analogo de PDGF B^g [ Ser , Ser , Ser , Ser ] , monomeri

co do exemplo 10, do intermediário monomérico bloqueado de PDGF B, -Q do exemplo 2 e do intermediário de PDGF AT monomérico blo íiy ±j — queado do exemplo 6, tal como indicado no exemplo 3. Utilizou--se como padrão o homodlmero de PDGF B^ig exeroplo 2. De um mo do surpreendente, as três formas monoméricas de PDGF exibiram actividade mitogénica apesar de terem tido muito mais êxito os monômeros do que os dimeros (500 a 1000 vezes mais) para atingjl rem a mesma actividade máxima atingível com o homodlmero PDGF B119 3ue se utilizou como padrão. Ainda mais surpreendente foi o facto de a actividade máxima que se podia atingir com os três monômeros ensaiados ser 3 a 3,5 vezes superior à actividade atin gível com qualquer quantidade do homodlmero de PDGF B^g.

Nos ensaios que se seguem, os três monômeros anterior- -5 mente identificados e o homodímero de PDGF B^i9 s^° ^esignaâ°s tal como se indica no quadro que se segue.

Quadro II e Dimeros

mA-g mB-g mB(4cys)-g mB(4cys)-f BB ou PDGF-BB

Identificação de Monomeros

rPDGF Al-S-S-G rPDGF b119-S-S-G análogo -S-S-G de rPDGF análogo de rPDGF B homodímero de rPDGF

Actividade Mitogénica de Monomeros Derivados de PDGF

Ensaiaram-se os os monomeros mB-g e mA-g quanto ã sua actividade mitogénica nas células NRK, tal como se indica no Exem pio 3, utilizando como controlo o homodímero PDGF B^9 (BB) como padrão. Os resultados encontram-se indicados na fig. 11. Enquan to que a actividade máxima atingível pelo dímero efectua o pico -3 a aproximadamente 30 cpm x 10 (apos atingir uma concentração de aproximadamente 4 ng/ml), os monomeros necessitaram de 300 a 1000 ng/ml para atingir uma actividade comparável. Contudo, mesmo a concentrações mais elevadas, a actividade dos monomeros excedeu largamente o máximo observado para o dímero.

Actividade Mitogénica do Monõmero Análogo de PDGF B^Q^

Efectuou-se o ensaio para se observar a actividade mito -55- génica das versões derivadas do intermediário de dissulfureto misto ((mB(4cys)-G e de (mB(4cys)-f do análogo de PDGF B^g 43 52 53 99 [ Ser , Ser , Ser , Ser ]tal como se indica no exemplo 3, utilizando o homodimero de PDGF B^g de controlo (BB) como padrão. Os resultados encontram-se indicados na fig. 12. Obti veram-se resultados idênticos aos observados no que se refere aos monõmeros derivados mA-g e mB-g.

Exemplo 11

Verificação das Formas Monoméricas de rPDGF

No sentido de se verificar que as actividades observadas no exemplo 11 eram realmente resultado da presença de formas monoméricas de rPDGF (isto é, em vez da presença de contaminação da amostra com algum grau de formas dimiricas residuais efectua-ram-se as seguintes análises.

Análise SDS-PAGE

Efectuou-se a análise SDS-PAGE de mB(4cys)-g e mB(4-cys)-f para se analisar o peso molecular de composições destas amostras de monõmeros. Efectuou-se a electroforese de cada uma das duas proteínas monoméricas sobre um gel de SDS-poliacrilamida a 12% utilizando amostras de 0,25 e 0,5 jiq de cada um dos monõmeros. Nenhuma das amostras dos monõmeros foi tratada com o agente de redução 2-mercaptoetanol antes de ser submetida a electroforese . Trataram-se paralelamente padrões de peso molecular e corou-se o gel resultante com prata. Não se verificou a presença de qualquer dimero. -56-

Sensibilidade Diferencial para Agentes Identificados

Também se esperava que as formas monoméricas e dimêri-cas de PDGF exibissem diferentes sensibilidades em relação a diversos agentes quando se encontrassem em contacto com esses agen tes. No primeiro caso; expuseram-se mB (4cys) -g, mB(4cys)-f e PDGF--BB ao calor, SDS, e a condições de redução moderadas, comparan-do-se os efeitos resultantes das actividades relativas destas pro teínas. No segundo caso, efectuou-se a comparação das actividades relativas das mesmas formas de PDGF a seguir a uma exposição a SDS e a condições fortemente redutoras. A. Efeito do Calor, SDS e de Condições de Redução Moderadas

Tratou-se cada proteína de acordo com cada uma das seguintes três vias: 1) - ebulição durante 10 minutos ("H"); 2) - ajustou-se para SDS 0,1% ("S"); e incubou-se com ditiotrei- tol 10 mM (DTT) durante 10 minutos a 37°C ("D").

Diluíram-se os monõmeros mB(4cys)-g e mB(4cys)-f para 5 000 ng/ml tendo-se diluído PDGF-BB até 50 ng/ml antes de se ensaiar quanto à sua actividade mitogénica tal como se descreveu no exemplo 3. Os resultados encontram-se indicadqs na fig. 13 , tendo-se designado a amostra não tratada por "0". Tal como se confirma na fig. 13 ambas as formas monoméricas indicaram a sensi bilidade esperada a SDS, tendo o intermédio de dissulfureto misto mB (4cys)-g perdido quase toda a sua actividade na presença de SDS. A forma dimérica de PDGF-BB não perdeu a actividade apõs ex posição a SDS. -57-

5. Efeitos de SDS e de Condições Fortemente Redutoras

Tratou-se cada uma das proteínas de acordo com cada um dos três passos que se seguem: 1) - ajustou-se para SDS 0,1% ("s'); 2) - efectuou-se a ebulição em DTT 10 mM durante 10 minutos ("D"); e

3) - efectuou-se a ebulição numa combinação de SDS 0,1% e de DTT 10 mM durante 10 minutos ("S+D").

Diluíram-se os monômeros mB(4cys)-g e mB(4cys)-f até 5 000 ng/ml, tendo-se diluído PDGF-BB até 50 ng/ml antes de se efectuar o ensaio para a actividade mitogénica, tal como se de£ creveu no exemplo 3. Os resultados encontram-se indicados na fig. 14, tendo-se designado a amostra não tratada por "0". Obtiveram--se os mesmos resultados no que se refere a exposição a SDS, tal como se indica na fig. 13 a partir da experiência anterior. Para alem disso, ambas as formas monoméricas mostraram uma sensibilida de significativamente superior à combinação de SDS e de DTT ã observada para as formas diméricas de PDGF-BB.

Em resumo, as propriedades diferenciais das actividades dos monômeros de PDGF e dos dímeros de PDGF anteriormente descri, tas demonstram que a actividade mitogénica dos monômeros não se deve a pequenas quantidades de dímero que se encontram presentes nas amostras. Em primeiro lugar, não se encontrava visível na análise SDS-PAGE qualquer dímero. Em segundo lugar, os monõme-ros pareciam exibir uma superactividade que não se observou com o dímero. Finalmente, a actividade mitogénica dos monômeros ê sensível ao aquecimento e a SDS enquanto que a actividade mitogénica do dímero não o é.

Claims (29)

1. R Ε I V I N DICAÇÕES 1.— Método para redobrar, o factor de crescimento reduzido derivado de plaquetas, caracterizado pelo facto: a) de se formar uma ligação de dissulfureto mista entre os grupos sulfidrilo livres do referido factor de crescimento reduzido derivado de plaquetas e um agente ce bloqueio de fórmu la geral R-S-S-R para formar um factor de crescimento derivado de plaquetas monoméricas bloqueadas; e b) de se induzir o referido factor de crescimento derivado de plaquetas monoméricas bloqueadas numa conformação biolo gicamente activa. -59-
2. 2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo facto de adicionalmente: c) se quebrar as referidas ligações de dissulfureto mis tas do referido factor de crescimento derivado de plaquetas mo-noméricas bloqueadas depois de este último ter sido induzido nu ma conformação biologicamente activa, de modo a poder formar-se ligações de dissulfureto desejadas para fixar.o factor de crescimento derivado.de plaquetas na referida conformação, biclogica mente activa.
3. 3. - Método de acordo, com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo facto de o agente de bloqueio ser seleccionado entrê o grupo constituído por glutationa oxidada e cisteína oxidada. 4. -' Método de acordo.com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo facto de o agente.de bloqueio.ser glutationa oxidada.
4. 5. - Método de acordo, com a reivindicação 2, caracteri-zado pelo. facto de o agente de bloqueio ser seleccionado. entre o grupo constituído por glutationa oxidada e cisteína· oxidada.
5. 6. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracteri-zado pelo facto de o agente de bloqueio ser glutationa oxidada. -60-
6. 7. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo facto de o factor de crescimento derivado de plaquetas bloqueadas ser induzido na referida conformação biologicamente activa colocando o referido factor de crescimento derivado de plaquetas bloqueadas num meio aquoso não desnaturado.
7. 8. - Método de acordo com a reivindicação.7, caracteri-zado pelo facto de o meio aquoso não desnaturado ser um tampão aquoso não desnaturado.
8. 9. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracteri-zado pelo facto de o referido tampão aquoso não desnaturado ser Tris.
9. 10..- Método de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado pelo facto de o factor de crescimento derivado de plaquetas bloqueadas ser induzido na referida conformação biologicamente activa colocando o referido factor de crescimento derivado de plaquetas bloqueadas em um meio aquoso não desnaturado.
10. 11. - Método de acordo com a reivindicação. 10, caracte-rizado pelo facto de o meio aquoso não desnaturado ser um tampão aquoso não desnaturado.
11. 12. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracte- rizado pelo facto de o tampão aquoso não desnaturado ser Trio.
12. 13.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo facto de se quebrarem as ligações de dissulfureto mistas fazendo contactar o referido factor de crescimento derivado de plaquetas bloqueadas com um composto de sulfidrilo reduzido.
13. 14. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado pelo facto de o referido composto de sulfidrilo reduzido sercisteína reduzida.
14. 15. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizado pelo facto de.se. quebrarem.as ligações de dissulfureto mistas fazendo contactar o referido factor de crescimento deri vado de plaquetas bloqueadas com um composto de sulfidrilo reduzido .
15. 15.- Método de acordo com a reivindicação 15, caracte rizado pelo facto de o composto de sulfidrilo reduzido ser eis teína reduzida.
16. 17.- Processo para a preparação de ura composto de dijs sulfureto misto de fórmula, geral PDGF-S-S-R, caracterizado pelo facto de R representar um grupo orgânico solúvel, PDGF ser

    um factor de crescimento derivado de plaquetas e substancialmen te todos os grupos sulfidrilo de PDGF serem derivados.
17. 18. - Processo de acordo com a reivindicação 17/ carac-terizado pelo facto de o grupo orgânico solúvel ser selecciona-do entre o grupo constituído por y -glutamil-cisteinil-lisina, cisteina e ácido glicólico.
18. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac-terizado pelo facto de o grupo orgânico solúvel ser y -glutamil--cisteinil-lisina.
19. 20. - Processo de acordo com a reivindicação 19, carac-terizado pelo facto de o grupo orgânico solúvel ser cisteina.
20. 21. - Monómero de factor de crescimento, caracterizado pelo facto de ser derivado de plaquetas biologicamente activas.
21. 22. - Monómero. de factor de crescimento, caracterizado pelo facto de ser derivado de plaquetas biologicamente activas de acordo com a reivindicação 21 e ser seleccionado a partir do grupo constituído por: 1) um composto de dissulfureto misto de fórmula geral PDGF-S-S-G, na qual G representa -glutamil- cisteimil-lisina, PDGF representa o factor de crescimento derivado de plaquetas, e substancialmente todos os grupos sulfidrilo de PDGF serem derivados; e, 2) um análogo de factor de crescimento derivado de plaquetas possuindo pelo menos um resíduo de cisteína substituído por um aminoácico neutro.
22. 23. - Monõmero de factor de crescimento derivado de plaquetas biologicamente activas de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o referido análogo de factor de crescimento derivado, de plaquetas possuir resíduos de cisteína 43, 52, 53 e 99 substituídos por resíduos de-serina.
23. 24. - Processo .para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade terapeuticamen.te..eficaz de um monõmero de- factor de crescimento derivado de plaquetas biologicamente activas com um veículo eficaz sob.o ponto de vista farmacêutico.
24. 25. - Método, para tratar um paciente animal ou humano, caracterizado pelo facto-de se administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um monõmero.de factor de crescimento derivado de plaquetas biologicamente activas.
25. 26. - Factor de crescimento derivado de plaquetas recom binantes diméricas mistas, caracterizado pelo facto de as sub--unidades monoméricas do referido factor de crescimento deriva-

    άο de plaquetas recombinantes diméricas mistas serem derivadas a partir de células hospedeiras diferentes de elevada expressão.
26. 27. - Factor de crescimento derivado de plaquetas re-combinantss diméricas mistas de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de as células hospedeiras de elevada expressão serem células hospedeiras de E. coli.
27. 28, - Factor de crescimento derivado, de plaquetas recombinantes diméricas mistas de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de uma das referidas sub-unidades mo-noméricas ser uma cadeia A do factor de crescimento derivado de plaquetas e a outra das· referidas sub-unidades. monoméricas ser uma cadeia B do factor.· de .crescimento derivado .de plaquetas.
28. 29.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantida de terapeuticamente. eficaz do factor de crescimento derivado de plaquetas recombinantes diméricas mistas de acordo com a rei vindica.ção 26 com um veículo, aceitável sob o ponto de vista far macêutico.
29. 30.- Método para tratar um paciente animal ou humano, aciente caracterizado pelo facto de se administrar ao referido o uma quantidade terapeuticamente eficaz de uiz factor de c mento derivado de plaquetas reccmbinantes diméricas mist acordo ccm a reivindicação 26. Q Agente Oficial da Propriedade Industrial esci-.5 de

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