CN104076025B - 一种抗菌肽电化学发光传感器及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗菌肽电化学发光传感器，所述抗菌肽电化学发光传感器包括裸金电极、以及依次层叠设置在所述裸金电极表面的L‑半胱氨酸层、纳米金层和抗菌肽抗体层，所述抗菌肽抗体层与所述纳米金层通过静电吸附作用结合在一起。所述抗菌肽电化学发光传感器体积小、成本低，可以灵敏、快速地在线检测抗菌肽；本发明提供了一种抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，所述抗菌肽电化学发光传感器的制备方法简单易操作。本发明还提供了所述抗菌肽电化学发光传感器的应用，该电化学发光传感器稳定性、重现性和特异性良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术和电化学技术领域，特别涉及一种抗菌肽电化学发光传感器及其制备方法和检测方法。
背景技术
抗菌肽是一种广泛存在于生物体内的具备多种生物活性的小分子多肽，它具有热稳定性、广谱抗菌以及潜在的抗肿瘤特性等优点，因而广泛应用于临床医学、医药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂和动植物抗病基因工程等领域。抗菌肽的活性、作用机制、抗菌肽生产以及抗菌肽产品的质量控制已经成为抗菌肽研究的热点问题，而这些问题的研究都急需准确、灵敏、简便的抗菌肽定量检测方法，尤其是能够实现在线分析的检测方法。
目前抗菌肽的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱法和毛细管电泳法。但应用这些方法时，样品预处理繁琐，所需仪器昂贵且体积较大，检测耗时长，而且对操作人员要求高，难以实现在线分析。
因此，如何实现低成本、灵敏和快速地在线检测抗菌肽成为目前研究的重点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗菌肽电化学发光传感器及其制备方法和应用，所述抗菌肽电化学发光传感器成本低，可以灵敏、快速地在线检测抗菌肽；所述抗菌肽电化学发光传感器的制备方法简单易操作。
第一方面，本发明提供了一种抗菌肽电化学发光传感器，所述抗菌肽电化学发光传感器包括裸金电极、以及依次层叠设置在所述裸金电极表面的L-半胱氨酸层、纳米金层和抗菌肽抗体层，所述抗菌肽抗体层与所述纳米金层通过静电吸附作用结合在一起。
优选地，所述裸金电极和L-半胱氨酸层通过Au-S键结合在一起。
所述抗菌肽抗体层采用的抗菌肽来源于昆虫、植物、哺乳动物、两栖动物、海洋动物、鸟类、细菌和病毒等。
优选地，所述抗菌肽抗体层采用的抗菌肽抗体为天蚕素B抗体。
L-半胱氨酸(Cys)是一种含有巯基的氨基酸，所述裸金电极和L-半胱氨酸层通过结合能很强的Au-S键连接，在裸金电极表面形成了稳定的L-半胱氨酸层；L-半胱氨酸本身具有良好的电化学活性，可以促进电子转移，增大了裸金电极面积，明显增强所述抗菌肽电化学发光传感器的电化学发光效果。同时，L-半胱氨酸具有良好的生物相容性。
纳米金具有高比表面积、生物相容性及高导电活性，不仅可以降低电化学发光的初始电位，还能加快电极与免疫分子间的电子传递并增强电化学发光强度，提高电化学发光检测的灵敏度及稳定性。
优选地，所述L-半胱氨酸层和纳米金层通过静电吸附作用结合在一起，纳米金层可以增加抗菌肽抗体的固定量，改善生物分子微环境，具有最大量保持生物分子活性和活性分子定向固定等优点。
所述纳米金层和抗菌肽抗体层通过静电作用结合在一起，纳米金的引入不仅牢固的固定了抗菌肽抗体，加快了电子转移速率。同时使固定的抗菌肽抗体达到定向排列、取向规则的目的，进一步提高生物分子的活性。所述纳米金和抗菌肽之间是静电吸附作用，因此多种抗菌肽抗体都可以和纳米金通过静电作用结合在一起形成电化学发光免疫传感器，可以制备出不同种类的电化学发光免疫传感器以定量检测不同种类的抗菌肽。
优选地，采用所述牛血清白蛋白封闭纳米金层上的剩余位点。
所述牛血清白蛋白和抗菌肽抗体没有特殊的要求，均可经过市售得到。
所述抗菌肽电化学发光传感器成本低，特异性强，抗干扰能力强，可简化样品的前处理过程，可以灵敏、快速地在线检测抗菌肽含量。
第二方面，本发明提供了一种抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供裸金电极，将所述裸金电极置于浓度为15～25mmol/L的L-半胱氨酸溶液中，采用循环伏安法在所述裸金电极表面电镀L-半胱氨酸层，得到L-半胱氨酸层修饰的电极；所述循环伏安法的电压范围为-0.5～1.0V，扫描速度为5～15mV/s，电镀时间为20～30min；
(2)在所述L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加纳米金分散液，在4℃下静置20～24h，在所述L-半胱氨酸层表面制备纳米金层，得到纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极；
(3)在所述纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加浓度为4～8μg/mL的抗菌肽抗体溶液，并在4℃下反应12～24h，在所述纳米金层表面制备抗菌肽抗体层，所述抗菌肽抗体层与所述纳米金层通过静电吸附作用结合在一起，得到所述抗菌肽电化学发光传感器。
优选地，将步骤(1)提供的裸金电极进行预处理，所述裸金电极预处理方法为：将裸金电极在3000目的金相砂纸上打磨，再用0.5μm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，再用去离子水冲洗干净后，分别在去离子水和无水乙醇中充分超声清洗；在浓度为0.5mol/L的H2SO4溶液中，1.5V～-0.2V电位范围内循环扫描约20圈，直到得到稳定的循环伏安图，取出电极用去离子水冲洗干净备用。
优选地，步骤(1)中，将所述裸金电极置于5mL浓度为15～25mmol/L的L-半胱氨酸溶液中。
优选地，步骤(1)中，所述L-半胱氨酸溶液中含有0.1mol/L的盐酸。
优选地，步骤(1)电镀结束后，用水浸泡、清洗所述L-半胱氨酸层修饰的电极，以除去电极表面未反应的L-半胱氨酸分子。
优选地，步骤(2)中在所述L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40μL的纳米金分散液，所述纳米金分散液中的纳米金颗粒的粒径为7～10nm。
优选地，所述纳米金分散液在滴加前超声混匀。
优选地，步骤(2)中，所述纳米金分散液的制备方法为：
取1～2mL浓度为0.02～0.03mol/L氯金酸溶液加入到45～49mL蒸馏水中，加热至沸腾，然后在搅拌下快速加入3～6mL浓度为0.025～0.035mol/L的柠檬酸三钠溶液，保持微沸，并连续搅拌，当溶液由浅黄色逐渐变成无色、灰色，直至变成酒红色时，停止加热，冷却至常温，定容至50mL，得到所述纳米金分散液。
优选地，步骤(3)中，在所述纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40～60μL的抗菌肽抗体溶液。
更优选地，步骤(3)中，在所述纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40～60μL浓度为5μg/mL抗菌肽抗体溶液。
优选地，步骤(3)中，所述抗菌肽抗体溶液为抗菌肽抗体溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到。
优选地，步骤(3)中在所述纳米金层表面制备得到抗菌肽抗体层后进行清洗，清洗操作为：将含有抗菌肽抗体层的电极置于浓度为0.01mol/L的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡5～8min，再用所述磷酸盐缓冲溶液清洗电极2～3次，以除去未被吸附的抗菌肽抗体。
优选地，将步骤(3)得到的所述抗菌肽电化学发光传感器采用所述牛血清白蛋白封闭纳米金层上的剩余位点，具体包括以下步骤：
将步骤(3)得到的所述抗菌肽电化学发光传感器置于牛血清白蛋白溶液中，室温下反应30～60min后，将所述抗菌肽电化学发光传感器取出，再置于pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡5～8min，然后用所述磷酸盐缓冲溶液清洗2～3次，以除去多余的牛血清蛋白分子，最后将所述抗菌肽电化学发光传感器在4℃冰箱中保存待用。
更优选地，所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为1％。
更优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L。
所述裸金电极和L-半胱氨酸层通过结合能很强的Au-S键连接，在裸金电极表面形成了稳定的电化学组装膜；Cys本身具有良好的电化学活性，可以促进电子转移，增大了裸金电极面积，明显增强所述抗菌肽电化学发光传感器的电化学发光效果。Cys的存在还可以避免抗菌肽抗体与裸金电极的直接接触，避免对抗菌肽抗体活性的减弱。
纳米金具有高比表面积、生物相容性及高导电活性，不仅可以降低电化学发光的初始电位，还能加快电极与免疫分子间的电子传递并增强电化学发光强度，提高电化学发光检测的灵敏度及稳定性。
所述Cys层和纳米金层通过静电吸附作用相连，纳米金层可以增加抗菌肽抗体的固定量，改善分子微环境，实现最大量保持其活性和活性分子定向固定等优点。
所述纳米金和抗菌肽抗体通过静电作用结合在一起，纳米金的引入不仅牢固的固定了抗菌肽抗体，加快了电子转移速率。同时使固定的抗菌肽抗体达到定向排列、取向规则的目的，进一步提高生物分子的活性。所述纳米金和抗菌肽之间是吸附作用，因此多种类型的抗菌肽抗体都可以和纳米金通过静电作用结合在一起形成电化学发光免疫传感器，本发明电化学发光免疫传感器的制备方法通用性良好，按照本发明制备方法可以制备出不同种类的电化学发光免疫传感器以定量检测不同种类的抗菌肽。
采用本发明方法制备抗菌肽电化学发光传感器，方法简单易行，且制备的抗菌肽电化学发光传感器体积小，成本低，抗干扰能力强，可简化样品的前处理过程，适用于小体积生物环境中抗菌肽的检测，可实现对抗菌肽的在线分析。
第三方面，以上所述的抗菌肽电化学发光传感器应用于抗菌肽的定量检测方法，包括以下步骤：
将所述抗菌肽电化学发光传感器置于抗菌肽样品中，在36～38℃下反应1.5～4h，取出所述抗菌肽电化学发光传感器并清洗，将清洗后的抗菌肽电化学发光传感器与电化学发光仪相连后，将所述抗菌肽电化学发光传感器置于浓度为0.08～0.12mol/L的过硫酸钾溶液中，采用循环伏安法，测试得到过硫酸钾的电化学发光强度，所述循环伏安法的电压范围为-2.0～0.0V，扫描速度为80～120mV/s，根据电化学发光强度和抗菌肽浓度的标准曲线，得到抗菌肽样品中的抗菌肽含量。
优选地，所述标准曲线的制作方法为：
将所述抗菌肽电化学发光传感器置于系列浓度的抗菌肽标准溶液中，在36～38℃下反应1.5～4h，取出所述抗菌肽电化学发光传感器并清洗，将清洗后的抗菌肽电化学发光传感器与电化学发光仪相连后，将所述抗菌肽电化学发光传感器置于浓度为0.08～0.12mol/L的过硫酸钾溶液中，采用循环伏安法，测试得到过硫酸钾的电化学发光强度，所述循环伏安法的电压范围为-2.0～0.0V，扫描速度为80～120mV/s，根据电化学发光强度和抗菌肽标准溶液浓度对数的线性关系，绘制标准曲线。
优选地，所述抗菌肽标准溶液为抗菌肽溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到。
优选地，所述过硫酸钾溶液的pH值为7.4。
更优选地，所述过硫酸钾溶液为过硫酸钾溶于磷酸盐缓冲溶液中制备得到，所述过硫酸钾溶液中磷酸盐的浓度为0.1mol/L。
优选地，步骤(1)将所述抗菌肽电化学发光传感器作为工作电极，采用铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极构成三电极***测试电致发光强度。
优选地，所述抗菌肽电化学发光传感器应用于天蚕素B的定量检测。
本发明采用L-半胱氨酸和纳米金修饰裸金电极，过硫酸钾为一种电化学发光试剂，在给该修饰电极施加一定的电压下，电子传递时，L-半胱氨酸和过硫酸钾通过氧化还原反应，产生发光信号，当固定在电极表面的抗菌肽抗体与溶液中抗菌肽抗原发生特异性免疫反应后，形成的免疫复合物会导致电极界面电子传递性能减弱，引起过硫酸钾电化学发光强度减弱，根据待测物(即抗菌肽抗原)浓度对数对电化学发光强度变化的线性关系，可实现对抗菌肽的免疫检测。
本发明以过硫酸钾为电化学发光试剂，直接添加在检测体系中，无需将其标记在抗体或抗原上，避免了标记可能带来的对抗体或抗原活性减弱及标记过程，即制备的是无标记电化学发光传感器。
本发明的传感器的表现出了优良的准确性、高灵敏性，高度特异性，稳定性和重现性，免疫分析检测迅速、方便，可用于实际样品的检测。
综上，本发明有益效果包括以下几个方面：
(1)本发明抗菌肽电化学发光传感器体积小、成本低、灵敏度高和稳定性好，适用于小体积生物环境中抗菌肽的检测，可实现在线分析；
(2)本发明抗菌肽电化学发光传感器的制备方法简单易行。
附图说明
图1为裸金电极表面电镀L-半胱氨酸层的电化学发光效果图；
图2为纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面扫描电镜图；
图3为抗菌肽电化学发光传感器在检测天蚕素B时的电化学发光强度变化与抗菌肽浓度对数关系图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
一种抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
1.提供裸金电极，将裸金电极置于5mL浓度为20mmol/L的Cys溶液(含0.1mol/LHCl)中，采用循环伏安法在裸金电极表面电镀L-半胱氨酸层，电压为-0.5～1.0V，扫描速度为10mV/s，电镀时间为20min；然后用水浸泡、清洗电极，以除去表面未反应的Cys分子，得到L-半胱氨酸层修饰的电极；
2.在上述L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40μL粒径约为10nm的纳米金分散液，并在4℃下反应20h，在L-半胱氨酸层表面制备纳米金层，得到纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极；
纳米金分散液的制备方法具体如下：
取2mL浓度为0.025mol/L氯金酸溶液加入到盛有45mL蒸馏水的三口烧瓶中，加热至沸腾，然后在搅拌下快速加入3mL浓度为0.030mol/L的柠檬酸三钠溶液，保持微沸，并连续搅拌，当溶液由浅黄色逐渐变成无色、灰色，直至变成酒红色时，停止加热，冷却至常温，定容至50mL，于4℃避光保存待用；
3.在纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40μL浓度为5μg/mL天蚕素B抗体溶液(天蚕素B抗体购自abcam公司，货号为ab27571)，并在4℃下反应12h，在纳米金层表面制备抗菌肽抗体层，然后将电极置于0.01mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡5min，再用该缓冲溶液清洗电极2次，以除去未被吸附的抗体，得到抗菌肽电化学发光传感器；
4.将上述抗菌肽电化学发光传感器浸入质量浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液中，室温下反应30min后，将抗菌肽电化学发光传感器取出，再置于0.01mol/L PBS(pH＝7.4)中浸泡5～8min，然后用0.01mol/L PBS(pH＝7.4)溶液清洗2次，以去除多余的BSA分子。
将裸金电极和L-半胱氨酸层修饰的电极分别与电化学发光仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司，型号为MPI-E型)相连，测试裸金电极和L-半胱氨酸层修饰的电极的电化学发光强度(ECL强度)，图1中a曲线为裸金电极在0.1mol/L PBS溶液(pH＝7.4)中的电化学发光状况；曲线b为裸金电极在含有0.1mol/L K2S2O8的磷酸盐(pH＝7.4)溶液中的电化学发光状况；曲线c为L-半胱氨酸层修饰的电极在含有0.1mol/L K2S2O8的PBS(pH＝7.4)溶液中的电化学发光状况。从图中的曲线a、b、c可以看出，在不含K2S2O8的PBS溶液中，裸金电极表面并没有明显的发光现象(曲线a所示)；当溶液中加入0.1mol/L K2S2O8的PBS溶液时，立即出现较明显的电化学发光现象，但发光仍然较弱(曲线b所示)；而进一步在金电极表面镀上Cys后得到L-半胱氨酸层修饰的电极，该电极在pH为7.4的含有0.1mol/L K2S2O8的PBS溶液中电化学发光明显增强(曲线c所示)。从而可知，K2S2O8具有电化学发光特性，另外，金电极上的Cys对溶液中K2S2O8电化学发光行为具有非常明显的增强效果。这是由于Cys本身具有良好的电化学活性，并且能够促进其他物质的电子转移，增大电极面积，增强发光效果，同时可以说明Cys成功地修饰在裸金电极表面。
图2为纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面扫描电镜图；从图2中可以看出，L-半胱氨酸层修饰的电极表面均匀分布着纳米金颗粒，说明步骤(2)在L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加纳米金分散液后，在L-半胱氨酸层表面制备得到纳米金层。
实施例2
一种抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
1.提供裸金电极，将裸金电极置于5mL浓度为15mmol/L的Cys溶液(含0.1mol/LHCl)中，采用循环伏安法在裸金电极表面电镀L-半胱氨酸层，电压为-0.5～1.0V，扫描速度为5mV/s，电镀时间为30min；然后用水浸泡、清洗电极，以除去表面未反应的Cys分子，得到L-半胱氨酸层修饰的电极；
2.在上述L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40μL粒径约为10nm的纳米金分散液，并在4℃下反应22h，在L-半胱氨酸层表面制备纳米金层，得到纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极；
3.在纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加60μL浓度为4μg/mL天蚕素B抗体溶液，并在4℃下反应24h，在纳米金层表面制备抗菌肽抗体层，然后将电极置于0.01mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡8min，再用该缓冲溶液清洗电极2次，以除去未被吸附的抗体，得到抗菌肽电化学发光传感器；
4.将上述抗菌肽电化学发光传感器浸入质量浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液中，室温下反应30min后，将抗菌肽电化学发光传感器取出，再置于0.01mol/L PBS(pH＝7.4)中浸泡5min，然后用0.01mol/L PBS(pH＝7.4)溶液清洗3次，以去除多余的BSA分子。
实施例3
一种抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
1.提供裸金电极，将裸金电极置于5mL浓度为25mmol/L的Cys溶液(含0.1mol/LHCl)中，采用循环伏安法在裸金电极表面电镀L-半胱氨酸层，电压为-0.5～1.0V，扫描速度为15mV/s，电镀时间为25min；然后用水浸泡、清洗电极，以除去表面未反应的Cys分子，得到L-半胱氨酸层修饰的电极；
2.在上述L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40μL粒径约为7nm的纳米金分散液，并在4℃下反应24h，在L-半胱氨酸层表面制备纳米金层，得到纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极；
3.在纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40μL浓度为8μg/mL天蚕素B抗体溶液，并在4℃下反应20h，在纳米金层表面制备抗菌肽抗体层，然后将电极置于0.01mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡7min，再用该缓冲溶液清洗电极3次，以除去未被吸附的抗体，得到抗菌肽电化学发光传感器；
4.将上述抗菌肽电化学发光传感器浸入质量浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液中，室温下反应30min后，将抗菌肽电化学发光传感器取出，再置于0.01mol/L PBS(pH＝7.4)中浸泡8min，然后用0.01mol/L PBS(pH＝7.4)溶液清洗2次，以去除多余的BSA分子。
应用实施例
一种抗菌肽电化学发光传感器应用于抗菌肽的定量检测方法，包括以下步骤：
(1)将天蚕素B(购自abcam公司)溶于磷酸盐缓冲溶液中得到天蚕素B标准溶液(pH＝7.4)，将实施例1制得的抗菌肽电化学发光传感器置于不同浓度的天蚕素B标准溶液中，在37℃下反应4h，取出抗菌肽电化学发光传感器并清洗，除去未反应的抗菌肽，将清洗后的抗菌肽电化学发光传感器与电化学发光仪相连后，然后将其置于浓度为0.1mol/L的过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，采用循环伏安法，记录过硫酸钾的电化学发光强度，电压为-2.0～0.0V，扫描速度100mV/s；根据电化学发光强度和天蚕素B标准溶液浓度对数的线性关系，绘制标准曲线；
图3为抗菌肽电化学发光传感器在检测不同浓度天蚕素B时(浓度分别为x＝0.1,0.2,0.4,0.8,1.2,2,4,6,8,10ng/mL)的电化学发光强度与天蚕素B标准溶液浓度对数关系图，从图中可以看出，抗菌肽浓度越高，发光强度越低，发光强度和抗菌肽标准溶液的浓度对数成线性关系，线性方程为Y＝1352.0-520.54lgx，R＝0.996，该传感器在0.1～10ng/mL的范围内对抗菌肽有良好的线性响应，检出限LOD＝30pg/mL(S/N＝3)；
(2)由于目前抗菌肽的应用还处于初期阶段，商品化的纯药物产品还少有上市。市售产品多为成分及含量均不明确的抗菌肽混合物或者含抗菌肽混合物的饲料类产品，无法针对某种抗菌肽定量检测。因此本发明自制了含天蚕素B的鱼饲料样品，并检测该样品中天蚕素B的含量。
样品自制方法：准确称取0.25g天蚕素B，加入到50g普通鱼饲料中，充分搅拌，制得含天蚕素B均匀鱼饲料样品。
检测方法：准确称取1g鱼饲料样品，加入1000mL蒸馏水，搅拌，静置。去除上层悬浮物，取20mL中间液，放入离心管，离心10min(10000r/min)，取上清液1mL，用pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)定容至250mL容量瓶中，制得含有天蚕素B的样品溶液。取该样品溶液5mL，用PBS定容至50mL，混匀，制得待测液。将待测液倒入烧杯中，***实施例1制得的抗菌肽电化学发光传感器，在37℃水浴中反应4h，取出并清洗传感器。将清洗后的传感器与电化学发光仪相连，然后将其置于浓度为0.1mol/L的过硫酸钾的PBS溶液中，采用循环伏安法，在电压范围为-2.0～0.0V，扫描速度100mV/s条件下，记录过硫酸钾的电化学发光强度信号峰值Y，将峰值Y带入线性方程Y＝1352.0-520.54lgx中，求得x值(x的单位为ng/mL)，即天蚕素B在待测液中的浓度。再根据以下公式计算出鱼饲料中天蚕素B百分含量。
对自制的3个样品进行连续5次测定，结果见表1。
表1 鱼饲料中天蚕素B含量测定结果(n＝5)
本发明检测样品中的天蚕素B时，实际含量和测定值的相对误差较小，由此可见，本发明抗菌肽电化学发光传感器可以精确地检测饲料样品中抗菌肽的含量。
效果实施例
1、抗菌肽电化学发光传感器的重现性
用实施例1制得的抗菌肽电化学发光传感器对3个不同浓度天蚕素B标准样品(浓度依次为0.5、2.0、5.0ng/mL)进行检测，每个样品浓度平行测定5次，浓度相对标准偏差(RSDs)分别为4.4％，4.0％，3.2％。再用实施例1制得的5支平行的抗菌肽电化学发光传感器分别对浓度为0.5、2、5ng/mL的天蚕素B标准样品进行检测，相对标准偏差分别为6.1％，5.4％，4.8％。由此可见，抗菌肽电化学发光传感器批内及批间差异均较小，即重现性较好。
2、抗菌肽电化学发光传感器的稳定性
将实施例1制得的抗菌肽电化学发光传感器存放于4℃冰箱中，每隔1天测定一次其电化学发光强度，以观察传感器的稳定性。实验结果表明，15天后，电化学发光强度(ECL)响应仅下降6.6％，变化不大，说明传感器具有较好的稳定性。
3、抗菌肽电化学发光传感器的特异性
将浓度为天蚕素B浓度100倍的BSA、100倍的大豆蛋白、100倍的玉米蛋白以及20倍的鲎素作为干扰物混合，然后共同加入到6.0ng/mL的天蚕素B中形成干扰样，用实施例1制得的抗菌肽电化学发光传感器对标准样(单独天蚕素B)和干扰样分别进行测定，结果见表2。由表2可见，干扰物对天蚕素B的测定干扰较小。
表2 标准样与干扰样结果对比(n＝5)
| 序号 | 标准样信号值 | 干扰样信号值 | 相对误差(％) |
| 1 | 949.84 | 907.35 | -4.5 |
| 2 | 948.25 | 896.23 | -5.5 |
| 3 | 924.77 | 884.12 | -4.4 |
| 4 | 953.81 | 901.03 | -5.5 |
| 5 | 918.69 | 876.72 | -4.6 |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供裸金电极，将所述裸金电极置于浓度为15～25mmol/L的L-半胱氨酸溶液中，采用循环伏安法在所述裸金电极表面电镀L-半胱氨酸层，得到L-半胱氨酸层修饰的电极；所述循环伏安法的电压范围为-0.5～1.0V，扫描速度为5～15mV/s，电镀时间为20～30min；
(2)在所述L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40μL的纳米金分散液，所述纳米金分散液中的纳米金颗粒的粒径为7～10nm，在4℃下静置20～24h，在所述L-半胱氨酸层表面制备纳米金层，得到纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极；
(3)在所述纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加浓度为4～8μg/mL的抗菌肽抗体溶液，并在4℃下反应12～24h，在所述纳米金层表面制备抗菌肽抗体层，所述抗菌肽抗体层与所述纳米金层通过静电吸附作用结合在一起，得到所述抗菌肽电化学发光传感器。
2.如权利要求1所述的抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纳米金分散液的制备方法为：
取1～2mL浓度为0.02～0.03mol/L氯金酸溶液加入到45～49mL蒸馏水中，加热至沸腾，然后在搅拌下快速加入3～6mL浓度为0.025～0.035mol/L的柠檬酸三钠溶液，保持微沸，并连续搅拌，当溶液由浅黄色逐渐变成无色、灰色，直至变成酒红色时，停止加热，冷却至常温，定容至50mL，得到所述纳米金分散液。
3.如权利要求1所述的抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，在所述纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40～60μL的抗菌肽抗体溶液。
4.如权利要求3所述的抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，在所述纳米金层和L-半胱氨酸层修饰的电极表面滴加40～60μL浓度为5μg/mL抗菌肽抗体溶液。
5.如权利要求1所述的抗菌肽电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，将步骤(3)得到的所述抗菌肽电化学发光传感器置于牛血清白蛋白溶液中，室温下反应30～60min，将所述抗菌肽电化学发光传感器取出，再置于pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡5～8min，然后用所述磷酸盐缓冲溶液清洗2～3次，最后将所述抗菌肽电化学发光传感器在4℃冰箱中保存待用。
6.如权利要求1～5任一项所述的制备方法制得的抗菌肽电化学发光传感器应用于抗菌肽的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述抗菌肽电化学发光传感器置于抗菌肽样品中，在36～38℃下反应1.5～4h，取出所述抗菌肽电化学发光传感器并清洗，将清洗后的抗菌肽电化学发光传感器与电化学发光仪相连后，将所述抗菌肽电化学发光传感器置于浓度为0.08～0.12mol/L的过硫酸钾溶液中，采用循环伏安法，测试得到过硫酸钾的电化学发光强度，所述循环伏安法的电压范围为-2.0～0.0V，扫描速度为80～120mV/s，根据电化学发光强度和抗菌肽浓度的标准曲线，得到抗菌肽样品中的抗菌肽含量。
7.如权利要求6所述的抗菌肽电化学发光传感器应用于抗菌肽的定量检测方法，其特征在于，所述抗菌肽电化学发光传感器应用于天蚕素B的定量检测。
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