CN114460159B - 基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于photo‑ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括以下原料：电极、MPA、EDC、NHS、O‑磷酸乙醇胺、BIBB、DMSO、EY、Me6TREN、FMMA、LiClO4。本发明利用photo‑ATRP反应作为聚合反应信号放大策略显著提高了ALP活性检测的灵敏度，同时避免过渡金属催化剂的使用，具有高效、操作方便、环境友好的优点。在最佳实验条件下，该方法用于ALP活性检测的线性范围为10～150mU/mL，检测限(LOD)为2.12mU/mL，说明本发明方法具有良好的灵敏度。且本发明方法具有令人满意的选择性、抗干扰性、重现性及稳定性，该方法在临床血清样本及抑制率实验中均获得良好的实验结果。

Description

基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒及其使 用方法
技术领域
本发明涉及一种基于光介导原子转移自由基聚合反应(photo-ATRP)信号放大策略的碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒及其使用方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的同源二聚体金属蛋白酶，其结构中的锌原子和镁原子在ALP去磷酸化作用中起着至关重要的作用。在碱性条件下，ALP可催化蛋白质、核酸及小分子中磷酸单酯结构的水解。因此，ALP在细胞***、成骨、矿化、解毒等生理功能中扮演着重要的角色。研究表明，ALP活性异常与多种疾病密切相关，例如血清中ALP活性升高通常与胆道梗阻、成骨细胞骨肿瘤、骨软化、类白血病反应或淋巴瘤等疾病相关；相反，一些代谢性疾病，如威尔逊病，慢性粒细胞白血病等则会对ALP活性造成病理性抑制，使其活性低于正常范围。因此，ALP活性检测对相关疾病的诊断及治疗具有十分重要的意义。目前，ALP的检测方法主要包括色谱法、表面增强拉曼散射法、化学发光法、荧光法、比色法、电化学发光法等。随着对ALP在不同体液或细胞位置中作用的进一步了解，以及样本类型的不断扩大，对ALP检测的精密度和灵敏度提出了更高的要求。因此，开发灵敏、简单、高效的ALP检测方法是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒及其使用方法，不仅避免了过渡金属催化剂的使用，并且显著增大了电化学信号输出，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、环境友好等优点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒，包括以下原料：电极、MPA、EDC、NHS、O-磷酸乙醇胺、BIBB、DMSO、EY、Me6TREN、FMMA、LiClO4。
使用时，将部分原料配制为溶液，其中，MPA溶液浓度为10mM，EDC/NHS混合溶液中EDC浓度为20mM，NHS浓度为5mM，O-磷酸乙醇胺溶液浓度为10mM，BIBB溶液浓度为10mM，EY溶液浓度为5mM，Me6TREN溶液浓度为10mM，FMMA溶液浓度为10mM，LiClO4溶液浓度为1M。
一种ALP活性检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)MPA修饰
将金电极浸泡在MPA溶液中，在25～37℃下孵育2～8h；
(2)MPA羧基的活化与修饰磷酸乙醇胺
将步骤(1)所得电极浸泡在EDC/NHS混合溶液中，在37℃下孵育0.5～1h，之后将电极浸泡在O-磷酸乙醇胺溶液中，在37℃下孵育1～2h；
(3)ALP脱磷酸根和BIBB修饰
将待检测溶液滴在步骤(2)所得电极表面，在37℃下孵育1～2h，之后将电极浸泡在BIBB溶液中，在37℃下孵育0.5～2h；
(4)光介导ATRP反应
将步骤(3)所得电极浸泡在photo-ATRP反应液中，使用蓝光照射，25～37℃反应3～6h；
(5)SWV检测
将步骤(4)所得电极浸入LiClO4溶液中，并进行方波伏安法(SWV)电化学测量。
进一步，金电极先进行预处理，预处理方法为：
①将金电极用无水乙醇和水分别超声清洗，之后分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉打磨电极，分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤；
②洗涤之后将金电极放入水虎鱼酸溶液中浸泡，之后分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤；
③电极浸泡在0.5M硫酸溶液中，设置电位为-0.3～1.5V，扫描速率为0.1V/s，扫描段数为40，直至得到可重复的循环伏安图，超纯水超声清洗，氮气吹干，备用。
进一步，photo-ATRP反应液由5mL超纯水、3990μL DMSO、5μL EY溶液、5μL Me6TREN溶液、1mL FMMA溶液混合而成。
进一步，方波伏安法(SWV)电化学测量的扫描范围为0～0.6V电位。
一种上述试剂盒在检测ALP活性中的应用。
一种上述试剂盒在筛选ALP抑制剂中的应用。
本发明检测原理示意图如图1所示。
本发明的有益效果：
1、本发明利用photo-ATRP反应作为聚合反应信号放大策略显著提高了ALP活性检测的灵敏度。
2、本发明利用photo-ATRP反应作为信号放大策略，避免过渡金属催化剂的使用，具有高效、操作方便、环境友好的优点。
3、本发明基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测方法，首先将3-巯基丙酸(MPA)通过金-硫键自组装固定在金电极表面，使ALP底物O-磷酸乙醇胺可通过酰胺键连接在电极表面；在ALP存在条件下，O-磷酸乙醇胺中的磷酸单酯结构水解为羟基，可与ATRP引发剂BIBB连接；最终，在470nm蓝光照射下，以EY为光催化剂进行聚合反应，使甲基丙烯酸二茂铁基甲酯(FMMA)单体在电极表面发生聚合。含大量二茂铁信号标签的聚合物接枝，显著增强了电化学信号输出。在最佳实验条件下，该方法用于ALP活性检测的线性范围为10～150mU/mL，检测限(LOD)为2.12mU/mL，说明本发明方法具有良好的灵敏度。且本发明方法具有令人满意的选择性、抗干扰性、重现性及稳定性，该方法在临床血清样本及抑制率实验中均获得良好的实验结果。因此，本发明photo-ATRP信号放大策略在临床ALP相关疾病诊断及抑制剂筛选方面具有良好的应用潜力。
附图说明
图1为本发明检测原理示意图。
图2为本发明方法用于ALP活性检测的可行性图。
图3为逐步修饰电极的电化学阻抗谱(EIS)图。
图4为不同扫描速率下修饰电极的CV图(内嵌图：表示还原和氧化电流峰值与不同扫描速率之间的线性关系)。
图5为修饰电极聚合前后的原子力显微镜(AFM)图，A为photo-ATRP反应前，B为photo-ATRP反应后。
图6为逐步修饰电极的水接触角(WCA)图。
图7为BIBB反应时间的优化。
图8为EY与Me6TREN的浓度比例优化。
图9为ALP活性与电信号强度的线性关系。
图10为ALP检测的选择性研究。
图11为本发明电化学检测的抗干扰性研究。
图12为钒酸钠对ALP活性的抑制率研究。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1：试剂盒
一种基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒，包括以下原料：电极、3-巯基丙酸(MPA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、O-磷酸乙醇胺、2-溴异丁酰溴(BIBB)、二甲基亚砜(DMSO)、伊红Y(EY)、三-(N,N-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)、甲基丙烯酸二茂铁基甲酯(FMMA)、LiClO4。
使用时，将部分原料配制为溶液，其中，MPA溶液浓度为10mM，EDC/NHS混合溶液中EDC浓度为20mM，NHS浓度为5mM，O-磷酸乙醇胺溶液浓度为10mM，BIBB溶液浓度为10mM，EY溶液浓度为5mM，Me6TREN溶液浓度为10mM，FMMA溶液浓度为10mM，LiClO4溶液浓度为1M。
实施例2：ALP活性检测方法
(1)MPA修饰
将预处理的金电极浸泡在400μL 10mM MPA溶液中，37℃孵育2h；
(2)MPA羧基的活化与修饰磷酸乙醇胺
将步骤(1)所得电极浸泡在400μL EDC/NHS混合溶液(EDC浓度为20mM，NHS浓度为5mM)中，37℃孵育0.5h，之后将电极浸泡在400μL 10mM O-磷酸乙醇胺溶液中，37℃孵育1h；
(3)ALP脱磷酸根和BIBB修饰
将10μL待检测溶液(含ALP)滴在步骤(2)所得电极表面，37℃孵育1h，之后将电极浸泡在400μL 10mM BIBB溶液中，37℃孵育1h；
(4)光介导ATRP反应
将步骤(3)所得电极浸泡在photo-ATRP反应液(反应液为依次向5mL的超纯水中加入3990μL DMSO、5μL 5mM EY溶液、5μL 10mM Me6TREN溶液、1mL 10mM FMMA溶液得到)中，使用470nm蓝光照射，室温反应3h；
(5)SWV检测
将步骤(4)所得电极浸入1M LiClO4溶液中，并在扫描范围为0～0.6V电位下进行方波伏安法(SWV)电化学测量。
金电极的预处理方法为：
①将金电极用无水乙醇和水分别超声清洗1min，之后分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉打磨电极3～5min，分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤1min；
②洗涤之后将金电极放入水虎鱼酸溶液中浸泡15～20min，之后分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤1min；水虎鱼酸溶液的制备方法为：98％H2SO4和H2O2以体积比3:1的比例混合；
③电极浸泡在0.5M硫酸溶液中，设置电位为-0.3～1.5V，扫描速率为0.1V/s，扫描段数为40，直至得到可重复的循环伏安图，超纯水超声清洗，氮气吹干，备用。
实施例3：可行性研究
本研究通过一系列空白对照实验研究了本发明方法检测碱性磷酸酶(ALP)活性的可行性。各种修饰电极的SWV曲线可以在图2中看到。在不加MPA(曲线b)、O-磷酸乙醇胺(曲线c)、ALP(曲线d)、BIBB(曲线e)、FMMA(曲线f)、EY(曲线g)、Me6TREN(曲线h)及无光照(曲线i)的情况下，除了微弱的背景信号外，几乎没有电化学信号响应。当电极按照本发明方法进行逐步修饰时，可观察到明显的氧化电流信号(曲线a)，峰电位为约0.28V，与二茂铁电活性分子在LiClO4溶液中的电位范围一致。氧化电流的产生可以归因于二茂铁电活性分子的电化学氧化，证明单体FMMA通过photo-ATRP反应成功地连接到金电极上。因此，该完全修饰电极用于ALP活性检测是可行的。
实施例4：电化学表征和形态表征
1、电化学表征
电化学阻抗谱(EIS)能灵敏地检测到固-液界面的转变，用来表征电极表面的逐步修饰。在Nyquist图中，高频区半圆的直径等于电荷转移电阻(Rct)。本发明逐步修饰电极的EIS图如图3所示，由于金电极良好的导电性，裸金电极的Rct最小，约为0.29kΩ(a)。MPA自组装在电极表面阻碍了电子转移，导致Rct上升至0.44kΩ(b)。在EDC、NHS活化MPA的羧基后，带负电荷的羧基被琥珀酰亚胺酯取代，Rct下降至0.23kΩ(c)。O-磷酸乙醇胺的修饰使Rct增加至0.63kΩ(d)。修饰电极经ALP孵育后，Rct略微下降(e)。在修饰引发剂BIBB后，Rct进一步增加至1.02kΩ(f)。最后，由于聚合物链接枝在电极表面，Rct显著增加至1.99kΩ(g)。这些结果证明了完全修饰电极的构建是成功和顺利的。证明了电活性聚合物通过photo-ATRP策略成功地接枝到金电极上。
为了证明ATRP反应的成功发生，采用循环伏安法(CV)扫描不同修饰电极。在LiClO4溶液中进行对不同修饰电极CV扫描，电位范围为0～0.6V。从图4可以看出，随着扫描速率从0.01V/s增加到1.0V/s，氧化还原峰值电流呈线性变化。这证明二茂铁分子的氧化还原过程不是通过静电吸附，而是通过共价键连接在金电极表面。
2、形态表征
用原子力显微镜(AFM)观察了修饰电极的形貌，通过比较聚合前后金电极表面高度的变化，验证了单体通过目标ATRP反应成功地形成了聚合链(图5)。从图5可以看出，修饰引发剂BIBB后，金电极的高度为8.9nm(A)，photo-ATRP反应后表面高度增加到29.7nm(B)。金电极表面高度的增加证明单体通过photo-ATRP反应成功形成聚合物。
根据修饰电极表面基团亲水性的不同，用水接触角(WCA)对逐步修饰电极进行了表征。结果如图6所示，由于金电极具有很强的疏水性，裸金电极的WCA为90.6°。对金电极进行MPA修饰后，羧基的引入降低了WCA(84.7°)。随后，由于碳链的疏水性O-磷酸乙醇胺修饰后，WCA有所增加(88.2°)。ALP催化O-磷酸乙醇胺水解后，羟基的生成使得WCA降低至86.6°。接着，引发剂BIBB的修饰导致WCA的增加(90.2°)。最终，由于高分子链的高疏水性，WCA显著增加到93.6°。WCA的变化进一步表明电极的修饰成功。
实施例5：检测条件优化
为了达到检测方法的最佳性能，本发明研究了BIBB的反应(孵育)时间和EY与ME6TERN的摩尔浓度比。
(1)BIBB反应时间的优化
在本研究中，使用SWV记录了BIBB修饰时间在15～90min内的信号响应。结果如图7所示，SWV响应随反应时间的延长而逐渐增加。随后，60min后电流强度没有明显变化。因此，本方法中BIBB的最佳反应时间为60min，并应用于后续研究。
(2)EY与Me6TREN的浓度比例优化
本研究基于二茂铁分子的氧化还原反应，EY与ME6TERN的摩尔比是关键，必须对其进行优化。控制EY与ME6TERN的体积均为5μL，ME6TERN的浓度为10mM，改变EY浓度。结果如图8所示，电流信号随着EY浓度的降低而增加，在EY与ME6TERN的摩尔比为0.5：1时达到最大值。随着EY与ME6TERN的摩尔比逐渐小于0.5:1，电流信号随着EY浓度的降低而迅速下降。因此，EY与ME6TERN的最佳摩尔比为0.5:1。
综上所述，BIBB最佳反应时间为60min，EY与ME6TERN的最佳摩尔浓度比为0.5:1。
实施例6：分析性能
在实施例5所得出的最佳实验条件下，用一系列不同活性的ALP研究了本发明方法的检测性能。结果如图9所示，在ALP活性为10～150mU/mL范围内，电流强度随着ALP活性升高而增大，并且呈良好的线性关系，线性方程为I(μA)＝0.01933CALP(mU/mL)+0.19188，R2＝0.998，计算得到最低检测限LOD为2.12mU/mL。与已报道的ALP活性检测方法相比，本策略具有相对较高的灵敏度。因此，所提出的方法在临床上检测ALP活性具有良好的应用潜力。
实施例7：选择性、抗干扰能力、稳定性和重现性
为了验证本发明策略用于ALP活性检测的选择性，在实施例5所得出的最佳实验条件下，比较了相同条件下胃蛋白酶(Pepsin)、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖氧化酶(GOx)和ALP的氧化电流强度。ALP、Pepsin、GOx和BSA的浓度分别为50mU/mL、50mU/mL、50mU/mL和50μM。结果如图10所示，只有在ALP组中可观察到明显的电流响应。结果表明，该策略用于ALP的活性检测具有较高的选择性。
为了评价所构建的完全修饰电极的抗干扰能力，在实施例5所得出的最佳实验条件下，比较了不同活性ALP在Tris-HCl缓冲液与10％人血清中的电化学信号。结果如图11所示，10％人血清的电流信号是Tris-HCl缓冲液的97.5％(80mU/mL)，100.4％(100mU/mL)和97.4％(120mU/mL)。结果表明，本发明方法在血清基质中具有良好的抗干扰能力。
为了验证完全修饰电极的稳定性，将修饰电极在4℃水分饱和环境中储存3周后进行检测，发现电流强度是新制备电极信号强度的92.30％。这表明完全修饰电极具有良好的稳定性。通过组内和组间实验(n＝5)评价完全修饰电极的重现性，组内和组间的相对标准偏差分别为3.54％和4.13％。结果表明，完全修饰电极具有良好的重现性。
实施例8：在实际样品中的检测性能
利用临床人血清样本验证本发明方法的可靠性，从河南中医药大学第三附属医院获得5份临床人血清样本，用本发明方法检测血清中的ALP活性并与提供的临床数据(AMP缓冲液方法检测)进行比较。结果如表1所示，本发明方法得到的结果与临床数据的相对误差小于5％，说明本发明检测方法可靠。
表1：AMP缓冲液方法与本发明方法结果比较
实施例9：抑制率实验
为了研究本发明方法在ALP活性抑制剂筛选中的有效性，以钒酸钠Na3VO4为模型进行了抑制率实验。将不同浓度预活化的Na3VO4溶液与ALP样品混合，通过电流强度的变化，研究Na3VO4对ALP活性的抑制。结果如图12所示，随着Na3VO4浓度的增加，抑制效率也随之增大。说明Na3VO4对ALP活性的抑制呈浓度依赖性。因此证明，本发明完全修饰电极适用于碱性磷酸酶抑制剂的筛选。

Claims (6)

1.一种基于photo-ATRP信号放大策略的ALP活性检测试剂盒，其特征在于，包括以下原料：电极、MPA、EDC、NHS、O-磷酸乙醇胺、BIBB、DMSO、EY、Me6TREN、FMMA、LiClO4；其使用方法，包括以下步骤：
（1）3-巯基丙酸MPA修饰
将金电极浸泡在MPA溶液中，在25 ~ 37 ℃下孵育2 ~ 8 h；
（2）MPA羧基的活化与修饰磷酸乙醇胺
将步骤（1）所得电极浸泡在EDC/NHS混合溶液中，在37 ℃下孵育0.5 ~ 1 h，之后将电极浸泡在O-磷酸乙醇胺溶液中，在37 ℃下孵育1 ~ 2 h；
（3）ALP脱磷酸根和BIBB修饰
将待检测溶液滴在步骤（2）所得电极表面，在37 ℃下孵育1 ~ 2 h，之后将电极浸泡在BIBB溶液中，在37 ℃下孵育0.5 ~ 2 h；
（4）光介导ATRP反应
将步骤（3）所得电极浸泡在photo-ATRP反应液中，使用蓝光照射，25 ~ 37 ℃反应3 ~6h；
（5）SWV检测
将步骤（4）所得电极浸入LiClO4溶液中，并进行方波伏安法SWV电化学测量；
photo-ATRP反应液由5 mL超纯水、3990 μL DMSO、5 μL EY溶液、5 μL Me6TREN溶液和1mL FMMA溶液混合而成。
2.根据权利要求1所述的ALP活性检测试剂盒，其特征在于，使用时，将部分原料配制为溶液，其中，MPA溶液浓度为10 mM，EDC/NHS混合溶液中EDC浓度为20 mM，NHS浓度为5 mM，O-磷酸乙醇胺溶液浓度为10 mM，BIBB溶液浓度为10 mM，EY溶液浓度为5 mM，Me6TREN溶液浓度为10 mM，FMMA溶液浓度为10 mM，LiClO4溶液浓度为1 M。
3.根据权利要求1所述的ALP活性检测试剂盒，其特征在于，金电极先进行预处理，预处理方法为：
①将金电极用无水乙醇和水分别超声清洗，之后分别用0.3 μm和0.05 μm的氧化铝抛光粉打磨电极，分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤；
②洗涤之后将金电极放入水虎鱼酸溶液中浸泡，之后分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤；
③电极浸泡在0.5 M硫酸溶液中，设置电位为-0.3 ~ 1.5 V，扫描速率为0.1 V/s，扫描段数为40，直至得到可重复的循环伏安图，超纯水超声清洗，氮气吹干，备用。
4.根据权利要求1所述的ALP活性检测试剂盒，其特征在于，方波伏安法SWV电化学测量的扫描范围为0 ~ 0.6 V电位。
5.一种如权利要求1或2所述试剂盒在检测ALP活性中的应用。
6.一种如权利要求1或2所述试剂盒在筛选ALP抑制剂中的应用。
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