CN104611299B - 一种人工重组的h9n2禽流感病毒株、制备方法、疫苗组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种H9N2禽流感病毒株，所述禽流感病毒株为重组有SEQ.NO.2蛋白序列的HA蛋白和SEQ ID NO:4蛋白序列的NA蛋白的rH9N2‑2/6病毒株。利用反向遗传学技术拯救出重组的H9N2禽流感病毒rH9N2‑2/6病毒株，具有良好的免疫原性。利用该病毒株制备的灭活疫苗免疫28d后HI抗体达到11Log2。本发明的反向遗传学技术可以快速获得目的病毒，且筛选出可制备预防广谱病毒的疫苗，该疫苗免疫后对H9N2的攻击提供完全保护。

Description

一种人工重组的H9N2禽流感病毒株、制备方法、疫苗组合物及 其应用

技术领域

本发明涉及反向遗传学技术和动物传染病技术领域，具体涉及一种人工重组H9N2禽流感疫苗及其应用。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus AIV)是禽类及一些哺乳动物的呼吸***的重要病原，在分类学上属于正粘病毒科流感病毒属。

根据表面的蛋白抗原性不同，禽流感病毒被分为17种亚型血凝素(HA)和10种亚型神经氨酸酶(NA)，其中，H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛流行，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而且对人类健康造成危险。我国在1994年从广东省一个鸡场中分离到第一株H9N2亚型禽流感，此后，该亚型禽流感病毒迅速向邻近省份蔓延。

我国现有的灭活疫苗在一些省份应用后，该亚型病毒的流行并未得到有效控制，禽流感病毒由于免疫压力及病毒自身的结构，决定了流感病毒会经常发生变异，引起免疫失败和新的流行，流行病学分析发现H9N2发生了抗原变异，部分晚期分离株已获得感染哺乳动物的能力。

流感病毒反向遗传学操作技术是构建人工重组流感病毒疫苗株的直接、简单的方法，其基本原理是将禽流感病毒基因组cDNA 8个片段的mRNA和vRNA转录质粒共同转染到合适的细胞系，分别在细胞内DNA依赖的RNA聚合酶的作用下，合成PB1、PB2、PA、NP的mRNA和病毒基因组所有RNA片段，前者指导合成病毒聚合酶***和NP蛋白并与病毒基因组RNA结合形成核蛋白复合物(RNPs)后启动病毒的复制，制造出完整的病毒粒子。

然而，现有技术存在着如下问题：

H9N2亚型内部毒株差异较大，难以筛选出具有广谱保护性的H9N2病毒株作为疫苗；

传统方法获得重组毒株是通过将几个不同毒株共同感染鸡胚或者细胞，筛选重组毒株，此重组方式费时费力；而有的利用反向遗传的方式的重组病毒的HA和NA来自同一毒株，交叉保护较差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种重组H9N2禽流感病毒，该病毒制备的预防更广谱病毒的疫苗，以及该疫苗在防治禽类H9N2亚型流感的疫苗方面应用。

本发明的第一方面是一种H9N2禽流感病毒株，所述禽流感病毒株为重组有SEQ.NO.2蛋白序列的HA蛋白和SEQ ID NO:4蛋白序列的NA蛋白的rH9N2-2/6病毒株。

本发明为一株人工重组的H9N2亚型重组流感病毒，该病毒的HA和NA基因是基于生物信息学人工合成的，6个内部基因来自H1N1PR8病毒，该病毒和我国现流行的H9N2亚型流感病毒抗原决定簇一致，并具有良好的鸡胚适应性，作为防治H9亚型动物流感的疫苗株

作为本发明的一种优选实施方式，所述禽流感病毒株编码HA蛋白的基因序列为SEQ.NO.1核苷酸序列，所述禽流感病毒株编码NA蛋白的基因序列为SEQ.NO.3核苷酸序列。

本发明的另一方面是一种制备所述H9N2禽流感病毒株的方法，其中，所述方法包括：将鸡胚适应毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)的6个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS和编码SEQ.NO.2蛋白序列的HA基因和编码SEQ ID NO:4蛋白序列的NA基因进行重组，构建成H9N2禽流感基因重组株rH9N2-2/6。

本发明的另一方面是一种H9N2禽流感病毒疫苗，其中，所述禽流感病毒疫苗包括免疫量的所述的H9N2禽流感病毒抗原。

上述的人工重组的H9N2亚型流感病毒，对中国流行的H9N2禽流感病毒具有广泛的保护性，而且具有高滴度鸡胚适应性，对鸡及鸡胚无致病力。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的H9N2禽流感病毒抗原为灭活的所述rH9N2-2/6病毒全病毒抗原；所述H9N2禽流感病毒疫苗进一步包含佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的H9N2禽流感病毒抗原含量为灭活前10^9.25EID₅₀/0.1mL。

本发明进一步提供了一种HA蛋白，所述HA蛋白实质上编码SEQ.NO.2蛋白序列。

本发明进一步提供了一种NA蛋白，所述NA蛋白实质上编码SEQ.NO.4蛋白序列。

“实质上编码”意指蛋白序列通过添加、删除或替换一个或多个氨基酸残基后仍然与原蛋白具有相同或相近的功能。

本发明的另一方面提供一种亚单位疫苗，所述亚单位疫苗含有免疫量的权利要求1所述的HA蛋白抗原和免疫量的权利要求2所述的NA蛋白抗原。

本发明的另一方面提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：分别表达所述的HA蛋白和所述的NA蛋白；以及按比例混合所述表达的HA蛋白和NA蛋白。

本发明的另一方面是所述H9N2禽流感病毒疫苗在制备预防和治疗H9N2禽流感的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.抗原具有抗原广谱性，能预防多种禽流感病H9N2病毒。

2.本发明的人工重组病毒具有良好的免疫原性，免疫28d后HI抗体达到11Log2，该病毒和现流行的H9N2亚型流感病毒抗原决定簇一致，并具有良好的鸡胚适应性，作为防治H9亚型动物流感的疫苗株。

3.疫苗免疫后对H9N2的攻击提供完全保护，免疫鸡功毒后不发病，不死亡，不排毒。

附图说明

图1为PR86个基因PCR琼脂糖凝胶电泳图，从左至右，各泳道分别为：NS、M、NP、PB1、PB2和PA基因鉴定泳道，最右边的泳道为DL5000Marker；

图2为人工合成的HA和NA基因琼脂糖凝胶电泳图，从左至右，各泳道分别为NA、HA基因鉴定泳道，最右边的泳道为DL5000Marker；

图3为本发明中使用的pBD的质粒图谱；

图4为流感病毒拯救过程示意图。

序列表中：

序列1为本发明具有广谱保护性的HA基因的DNA操作层面的核苷酸序列；

序列2为本发明具有广谱保护性的HA基因的氨基酸序列；

序列3为本发明具有广谱保护性的NA基因的DNA操作层面的核苷酸序列；

序列4为本发明具有广谱保护性的NA基因的氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例一：相关基因的克隆

1、PR8流感病毒(得自St.Jude Children’s Research Hospital的保藏机构)RNA的抽提

参照Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ试剂盒(台湾旭基公司(GeneaidBiotech)制)的说明书提取禽流感病毒RNA，具体方法如下：

1)取200μL(不足的用PBS补够200μl)样品到1.5ml EP管中，加入400μL VB裂解液，用涡旋仪混匀后室温孵育10min。

2)加入450μL AD液(确保AD液中已经加入无水乙醇)，用力摇匀。

3)将VB膜装入2ml收集管中，加入600μL上述裂解混合物到VB膜中，14000-16000g离心1min。

4)弃掉收集管中的液体，将VB膜再放回收集管中，加入剩下的裂解混合物，14000-16000g离心1min。

5)弃掉收集管，将VB膜装入新的2ml收集管中。

6)加入400μL W1Buffer到VB膜中，14-16000g离心30s。

7)弃掉收集管中液体，将VB膜装回收集管中。

8)加入600μL wash buffer(确保wash buffer已经加过无水乙醇)到VB膜中，14000-16000g离心30s。

9)弃掉收集管中液体，将VB膜装入收集管，14000-16000g离心3min。

10)将VB膜装到一个新的1.5ml EP管中，加入50μL无RNA酶的水到VB膜中央，静止3min，然后14000-16000g离心1min。

2、引物设计合成

参考E.hoffman等(2001)Arch.Viraol.146:2275-2289所述，用节特异性引物，扩展所得PR8cDNA。引物合成由Invitrogen公司完成，所用的引物对核苷酸序列如下：

反转录引物uni12primer:5'AGCAAAAGCAGG3'

扩增PB2基因的引物对：

P1：5'TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTC3'

P2：5'ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT3'

扩增PB1基因的引物对：

P1：5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA3'

P2：5'ATATCGTCTCGCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT3'

扩增PA基因的引物对：

P1：5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC3'

P2：5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGSSSCAAGGTACTT3'

扩增NP基因的引物对：

P1：5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA3'

P2：5'TATACGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT3'

扩增NS基因的引物对：

P1：5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG3'

P2：5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3'

扩增M基因的引物对：

P1：5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG3'

P2：5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT3'

3、病毒RNA的反转录

在20μL l反转录体系中，依次加入以下成分：M-MLV Reverse Trascriptase(购自北京全式金生物技术有限公司)1.0μL，RNase inhibitor(购自北京全式金生物技术有限公司))0.5μL，5X M-MLV buffer4.0μL，dNTP(2.5mM)2.0μL，uni 12primers(10pmol)1μL，禽流感病毒RNA 11.5μL，混匀后置PCR仪中42℃1h进行反转录，反转录产物直接用于PCR或者4℃保存备用。

4、流感cDNA的PCR扩增

在PCR反应管中加入反转录产物2μL，primeSTAR DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)0.5μL，10X primeSTAR buffer 5μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，各基因的上下游引物各1μL(10pmol)，RNase free water调整到50μL，混匀后于PCR仪中进行扩增。PCR扩增程序为预变性95℃，5min，变性98℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，2min，运行30个循环，最后于72℃延伸10min，同时设无模板的阴性对照，反应结束后在1％琼脂糖凝胶上电泳后，切下目的条带，用于回收。

5、PCR产物回收

电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒(Omega Bio-tek)回收DNA。具有方法如下：切下含有目的DNA的凝胶，放入一无菌的1.5ml的EP管中，加入3倍体积binding buffer，于50-60℃水浴中5min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体加入到回收柱内，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，加入300μL binding buffer，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，用500ml washbuffer 10000rpm离心洗柱子两次，倒掉废液后空离1min，与柱子中央加入15-30μL ddH₂O，室温静置2min，12000rpm离心2min，收集管中即为回收的DNA片段。

6、连接反应

收回的PCR产物直接连接到pEASY-blunt vector(购自北京全式金生物技术有限公司)中，连接体系和条件为：PCR产物4μL，pEASY-blunt vector 1μL，轻轻混匀后，室温(20-37℃)反应5min，反应结束后，将离心管置于冰上准备转化。

7、连接产物的转化

加连接产物于50μL trans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀后，冰浴20-30min；42℃热激30S，立即置于冰上2min；加入250μL平衡至室温的SOB或者LB培养基，200转/分钟，37℃条件下孵育1h；取8μL，500mM IPTG，40μLμL，20mg/ml X-gal混匀后，均匀地涂于准备好的平板上，在37℃放置30min；待IPTG，X-gal被吸收后，取200μL孵育的转化产物涂布于上述平板上，在37℃条件培养。

8、PCR方法鉴定阳性重组子

挑选步骤7转化的白色克隆至10μl无菌水中，涡旋混匀；25μl反应体系中，取1μl混合液用作PCR反应的模板，用M13正向引物和反向引物鉴定重组子；PCR反应条件：94℃预变性10min(裂解细胞，失活核酸酶)，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸(根据片段的大小确定延伸时间)。30个循环，72℃后延伸10分钟，确定包含重组子的克隆。

9、质粒的小提

将步骤8中鉴定为阳性的克隆接种于3-5ml LB中过夜培养，然后用天根生化科技有限公司的质粒抽提试剂盒(货号：DP 103-03)抽提质粒，具体步骤如下：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL,12000rpm(～13400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取3-5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm(～13400g)离心1min，尽量吸除上清。

3)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液Pl(重悬菌体)(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

4)向离心管中加入500μL溶液P2(裂解液，裂解菌体)，温和地上下翻转6-8次使菌体充***解。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5)向离心管中加入700μL溶液P3(中和液，中和裂解液)，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm(～13400g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6)将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs(过滤柱放入收集管中),12000rpm(～13400g)离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中),(如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀.尽量地吸取上清)。

7)12000rpm(～13400g)离心l min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

8)向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm(～13400g)离心l min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

9)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5min，有助于更好地去除杂质。

10)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW,12000rpm(13400g)离心l min，倒掉收集管中的废液。

11)将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000rpm(～13400g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

12)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm(～13400g)离心l min将质粒溶液收集到离心管中。

10、序列测定和分析

将步骤9中抽提的阳性克隆按每个基因选择三个克隆送Invitrogen进行测序，用常用的生物软件DNAStar 4.0对测序的序列进行分析。

11、pBD系列重组质粒的构建

用BsmB I酶切pEASY-blunt vector中的PR8的6个基因片段，回收目的片段与经同样酶切的载体pBD(质粒图谱如图2所示，得自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，参考：索永兵，陈化兰等，H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/duck/FuJian/01/02株反向基因操作***的建立)进行连接并转化DH5α，用PCR的方法对每个片段的转化子进行筛选获取系列的重组质粒，即pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS，由宝生物工程(大连)有限公司按照提供的序列SEQ.NO.1和SEQ.NO.3合成HA、NA基因，克隆到转录/表达载体pBD上获取重组质粒pBD-HA和pBD-NA。

实施例二：重组H9N2禽流感病毒的拯救及生物学特性

1、去内毒素质粒的提取

按照OMEGA公司提供的试剂盒Endo-free plasmid mini kit II的步骤提取(按照试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：

(1)将带有目的质粒的大肠杆菌接种于装有5ml氨苄青霉素LB的10-20ml培养管，37℃摇床培养12-16h，以扩增质粒。用一个10-20ml培养管或培养瓶，其体积至少有培养基的4倍。

(2)取5.0ml的菌液，于室温下10000g离心1min以沉淀菌种。

(3)倒出或者吸出上述LB培养基，弃去。往沉淀里加入250μL solution I/RNase A混合液重悬细菌，涡旋振荡使细胞全完重新悬浮。

(4)往步骤3的重悬混合液中加入250μL solution II(裂解液)，轻轻颠倒混匀7-10次，如有必要，可把裂解液置于室温静置2min,避免剧烈混合裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5min。

(5)向步骤4的混合液中加入125μL冰浴Buffer N3(中和液),并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮状沉淀。

(6)室温下，12000g离心10min。

(7)小心将上清倒入一干净离心管中，加入0.1倍体积的ETR溶液(蓝色)至上清液中，颠倒试管7-10次，然后于冰浴中静置10min以去除内毒素。

(8)将上述裂解液于42℃下静置5min。裂解液又将再次出现浑浊。此时，立即于25℃，12000g离心3min，ETR溶液将在试管底部形成蓝色分层。

(9)将上清转移至另一新的1.5ml离心管中，加入1/2倍体积室温的无水乙醇，轻轻颠倒试管6-7次，室温放置1-2min。

(10)取一干净的Hibind mini columns(I)装在一个2ml收集试管上小心吸出上清，取700μL样品溶液将其转至柱子内，于室温下10000g离心1min,使裂解液完全流过柱子。

(11)加入500μL HB buffer，10000g离心1min，弃掉废液。

(12)加入700μL wash solution buffer，10000g离心1min，弃掉废液。

(13)重复步骤12一次。

(14)12000g离心2min。

(15)加入50μL elution buffer，37℃温箱放置5min，10000g离心1min。

2、脂质体介导的转染

按照Hoffman等(Eight-plasmid system for rapid generation ofinfluenzavirus vaccines,(2002)vaccine 20:3165-3170)所述，通过DNA转染产生重组病毒。

具体地讲，可以共培养293T和MDCK细胞(各细胞系含0.2-1x10⁶细胞)并用于转染实验。按设计组合的8个质粒(pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS、pBD-HA和pBD-NA)，各取1μg均匀混合，稀释至250μL无血清培养基OPTI-MEM，取20μL Lipofectamine2000Transfection Reagent(Invitrogen)按照说明书稀释到250μL无血清培养基OPTI-MEM中，室温放置5min，然后将稀释的Lipofectamine缓慢滴加至质粒混合液中，轻轻吹吸3-5次，充分混匀后，室温作用20min，同时设立缺失一个pBD-PB2质粒的阴性对照。将6孔组织培养板中已经培养约18-24h，80-90％丰度、分布均匀、生长状态良好的293T和MDCK细胞用无血清、无抗生素的DMEM洗2次后，加入质粒和Lipofectamine 2000的混合液，使其均匀覆盖于细胞上，在37℃，5％CO₂培养箱中吸附6-8h，换成含有2％BSA，1％TPCK-胰酶的DMEM2mL，培养30-48h后收集上清和细胞。

将转染的细胞和上清接种9-11日龄SPF鸡胚(购自北京梅里亚通实实验动物技术有限公司)，每个样品接种5个胚，每胚接种0.2mL，置33-35℃继续培养，每日观察鸡胚死亡的情况，适时收集鸡胚尿囊液，命名为rH9N2-2/6。

3、人工重组H9N2的生物学特性测定

3.1病毒含量将rH9N2-2/6病毒用灭菌生理盐水10倍系列稀释后，取10^-6-10^-94个稀释度，各鸡胚尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1mL，置于33-35℃继续孵育，24h内死亡的鸡胚弃去不计，在24h-96h内死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚尿囊液，同一稀释度的鸡胚尿囊液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至96h，取出所有活胚，逐个收获鸡胚尿囊液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:64着判为感染，结果rH9N2-2/6病毒含量为10^9.30EID₅₀/0.1mL。

3.2红细胞凝集价按现行《中国兽药典》附录进行，rH9N2-2/6对1％鸡红细胞凝集价2¹¹。

3.3对鸡胚的毒力用灭菌生理盐水将步骤2中收获的尿囊液rH9N2-2/6病毒按照10^-6-10^-10稀释后，尿囊腔内接种9-11日龄SPF鸡胚10枚，每枚0.1ml，接种后24-96小时内，9个鸡胚死亡。剖检观察，死亡鸡胚出现全身出血、明显水肿、肝脏坏死等病变。

3.4对雏鸡的毒力用灭菌生理盐水将步骤2中收获的尿囊液病毒rH9N2-2/6按照1:10稀释后，翅静脉接种4-8周龄SPF鸡10只，每只鸡0.1ml，接种后观察10日，鸡只无死亡或明显异常反应仅有个别鸡出现轻微的呼吸道症状。接种后第5日，采集喉拭子和泄殖腔拭子，将同一只鸡的两种拭子混合后接种9-11日龄SPF鸡胚分离病毒，10只鸡采集的拭子病毒分离为阳性。

3.5特异性用灭菌生理盐水将rH9N2-2/6稀释成4HA单位的抗原液，分别与ND、EDS、H5亚型禽流感、H7亚型禽流感阳性血清，SPF鸡血清和H9亚型禽流感阳性血清做HI试验，rH9N2-2/6病毒仅能被H9亚型禽流感阳性血清表现为血凝抑制阳性，对ND等其它阳性血清及SPF鸡血清均应为阴性。

3.6免疫原性

3.6.1制苗用毒液的制备

接种：取步骤2中收获的尿囊液rH9N2-2/6毒种，用灭菌生理盐水或者PBS作适当稀释(如10^-4或者10^-5)，接种9-11日龄易感鸡胚，每胚0.1-0.2ml，接种后密封针孔，置于36-37℃继续孵化，不必翻胚。

孵育与观察：每天检查鸡胚的生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡，应该弃去。如果鸡胚有死亡，先放置4℃，等到接种后第五天一起收集尿囊液和羊水。

收获：接种5天后每个鸡胚测HA，对于HA阳性的可以用10ml无菌移液器吸取鸡胚尿囊液至于干净的离心管中，3000rpm离心5min，去除血液和细胞后，可以立即进行后续试验或者-80℃保存备用。

病毒滴度测定同3.1，收获的病毒液滴度为10^9.25EID₅₀/0.1mL

3.6.2灭活：根据鸡胚尿囊液收获的量，用移液器吸取多聚甲醛，加入到病毒液内，边加边混匀，使多聚甲醛的终浓度为0.1％；加入多聚甲醛后，立刻充分混匀，并置于4℃放置48h；

3.6.3灭活后检验：灭活48h后，将多聚甲醛作用过的病毒液接种9-11日龄SPF鸡胚进行盲传三代，每代接种3-4枚鸡胚，盲传后收集鸡胚尿囊液，全部测HA，结果全部为阴性，说明病毒灭活完全。

3.6.4油佐剂灭活苗的制备：以进口白油为乳化剂，将经0.1％甲醛溶液灭活后安检合格的病毒，按照2:1油水比缓慢加入到油佐剂中制成油包水灭活疫苗。

3.6.5免疫原性

将上述制备的油佐剂灭活苗按以下方法进行免疫原性检验：

3.6.5.1血清学方法用21日龄SPF鸡45只，30只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另15只作对照，接种后28日，每只鸡采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型商品化抗原测定HI抗体。

表1 免疫28天后HI抗体测定结果

3.6.5.2免疫攻毒法用21日龄SPF鸡45只，30只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另15只作对照，接种后28日，取流行毒株的代表毒株(A：ck/shangdong/lc 1124/07；B:ck/Shandong/lx316/07；C:ck/beijing/3/01，参考：Yi Zhang et al.，Molecular andantigenic characterization of H9N2avian influenza virus isolates from chickenflocks between 998and 2007in china，veterinary Microbiology156(2012)285-293)进行翅静脉注射，每个病毒株攻击10只rH9N2-2/6免疫鸡，和5只对照组鸡。攻毒后连续观察14天，观察鸡只的发病情况，并于攻毒后第5日，采集每只鸡的泄殖腔拭子，每个泄殖腔拭子样品经尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚5枚，每枚0.2ml，孵育观察5日，逐胚测定鸡胚液的HA效价，每个样品接种的5枚中只要有1枚鸡胚液HA效价≥1:16(微量法)，即判定为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再判定。3个免疫组均未分离到病毒，对照组有一组为4/5阳性，其余两组对照组均为阳性。

表2 免疫组和对照组攻毒后观察和泄殖腔试子病毒分离结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种H9N2禽流感病毒株，所述禽流感病毒株为重组有SEQ.NO.2蛋白序列的HA蛋白和SEQ ID NO:4蛋白序列的NA蛋白的rH9N2-2/6病毒株。

2.根据权利要求1所述的H9N2禽流感病毒株，其中，所述禽流感病毒株编码HA蛋白的基因序列为SEQ.NO.1核苷酸序列，所述禽流感病毒株编码NA蛋白的基因序列为SEQ.NO.3核苷酸序列。

3.一种制备权利要求1所述H9N2禽流感病毒株的方法，其中，所述方法包括：将鸡胚适应毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)的6个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS和编码SEQ.NO.2蛋白序列的HA基因和编码SEQ ID NO:4蛋白序列的NA基因进行重组，构建成H9N2禽流感基因重组株rH9N2-2/6。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括：构建分别表达鸡胚适应毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)的6个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS的6个质粒和构建分别表达SEQ.NO.2蛋白序列的HA基因和表达SEQ ID NO:4蛋白序列的NA基因的2个质粒，将所述8种质粒混合，并与转染试剂加入到293T细胞中，培养后获得H9N2禽流感rH9N2-2/6病毒株。

5.一种H9N2禽流感病毒疫苗，其中，所述禽流感病毒疫苗包括免疫量的权利要求1所述的H9N2禽流感病毒抗原。

6.根据权利要求5所述的H9N2禽流感病毒疫苗，其中，所述的H9N2禽流感病毒抗原为灭活的所述rH9N2-2/6病毒全病毒抗原；所述H9N2禽流感病毒疫苗进一步包含佐剂。

7.根据权利要求5所述的H9N2禽流感病毒疫苗，其中，所述的H9N2禽流感病毒抗原含量为灭活前10^9.25EID₅₀/0.1mL。

8.一种HA蛋白，所述HA蛋白为序列SEQ.NO.2所示。

9.一种NA蛋白，所述NA蛋白为序列SEQ.NO.4所示。

10.一种亚单位疫苗，所述亚单位疫苗含有免疫量的权利要求8所述的HA蛋白抗原和免疫量的权利要求9所述的NA蛋白抗原。

11.一种制备权利要求10所述的亚单位疫苗的方法，所述方法包括：

(1)分别表达所述的HA蛋白和所述的NA蛋白；以及

(2)按比例混合所述表达的HA蛋白和NA蛋白。

12.权利要求5、6任一项所述H9N2禽流感病毒疫苗、和权利要求10所述的亚单位疫苗在制备预防和治疗H9N2禽流感的药物中的应用。