CN110628819A

CN110628819A - 一种构建h13n2亚型流感病毒反向遗传操作***的方法及其应用

Info

Publication number: CN110628819A
Application number: CN201911025710.9A
Authority: CN
Inventors: 于志君; 朱彤; 吴家强
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2019-12-31

Abstract

本发明提供一种构建H13N2亚型流感病毒反向遗传操作***的方法及其应用。所述构建方法包括：将H13N2亚型流感病毒内部8个基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS共同导入宿主细胞，培养，即获得重组病毒。本发明为H13N2亚型流感病毒跨种传播机制的研究奠定了良好基础，并提供了可行的技术平台；同时有利于制备预防/治疗H13N2亚型流感病毒的相关产品；另外，本发明构建方法还具有操作简便、成本较低等优点，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种构建H13N2亚型流感病毒反向遗传操作***的方法及其应用

技术领域

本发明属于病毒反向遗传操作技术领域，具体涉及一种构建H13N2亚型流感病毒反向遗传操作***的方法及其应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

A型流感病毒一种负链分节段的RNA病毒，根据病毒表面两种糖蛋白HA和NA蛋白的不同可以分为18种HA亚型和11种NA亚型，其中H1-H16和N1-N9亚型的流感病毒可以从禽类体内分离出来。A型流感病毒基因组包括PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS共计8个基因节段。近年来流感病毒被广泛应用于流感病毒致病机制、传播机制和基因工程疫苗研发等方面，由于A型流感病毒基因组分节段的特点，因此构建流感病毒反向遗传***一般需要构建8个携带流感病毒不同基因节段的感染性克隆。流感病毒反向遗传***实现了从分子水平上对流感病毒基因组的操作，可用于分析和研究病毒基因变异与病毒表型变异之间的关系，是流感病毒研究的重要工具之一。

H13N2亚型流感病毒一般只在鸥类体内被发现，但极少在家禽体内被发现。我们课题组通过血清学监测，从鸡体内发现H13N2亚型流感病毒存在的血清学证据，提示H13N2亚型流感病毒存在由水禽跨种感染家禽的风险，因此亟待开展H13N2亚型流感病毒跨种感染家禽的分子机制研究。病毒基因组变异往往是决定流感病毒跨种传播的关键因素，而反向遗传技术可以从基因水平研究分子变异对病毒致病性和传播性变异的影响，因此构建H13N2亚型流感病毒反向遗传***可为该病毒跨种传播机制的研究奠定重要的基础。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种构建H13N2亚型流感病毒反向遗传操作***的方法及其应用。本发明首次成功构建H13N2亚型流感病毒反向遗传***，为H13N2亚型流感病毒跨种传播机制的研究及相关医疗检测制品的研究开发奠定了良好基础。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种构建H13N2亚型流感病毒的反向遗传操作***的方法，所述方法包括：

将H13N2亚型流感病毒内部8个基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS共同导入宿主细胞，培养，即获得重组病毒。

上述方法中，所述H13N2亚型流感病毒可以为A/black-tailed gull/Weihai/115/2016(简称115E1株)；

所述PB2基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列1；

所述PB1基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列2；

所述PA基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列3；

所述HA基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列4；

所述NP基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列5；

所述NA基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列6；

所述M基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列7；

所述NS基因来源于流感病毒115E1株，其核苷酸序列为序列表中序列8；

针对所述PB2基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列9和序列10所示；

针对所述PB1基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列11和序列12所示；

针对所述PA基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列13和序列14所示；

针对所述HA基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列15和序列16所示；

针对所述NP基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列17和序列18所示；

针对所述NA基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列19和序列20所示；

针对所述M基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列21和序列22所示；

针对所述NS基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列23和序列24所示；

上述方法中，所述PB2基因、PB1基因、PA基因、HA基因、NP基因、NA基因、M基因和NS基因是通过含有PB2基因的重组载体、含有PB1基因的重组载体、含有PA基因的重组载体、含有HA基因的重组载体、含有NP基因的重组载体、含有NA基因的重组载体、含有M基因的重组载体、含有NS基因的重组载体共同导入宿主细胞中；

所述含有PB2基因的重组载体为将PB2基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述含有PB1基因的重组载体为将PB1基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述含有PA基因的重组载体为将PA基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述含有HA基因的重组载体为将HA基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述含有NP基因的重组载体为将NP基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述含有NA基因的重组载体为将NA基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述含有M基因的重组载体为将M基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述含有NS基因的重组载体为将NS基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体；

所述表达载体为pFluDD，所述载体由pUC18载体(Thermo Fisher Scientific公司)改造而成，具体是将CMV启动子、鼠RNA聚合酶I终止子、人RNA聚合酶I启动子和SV40多聚腺苷酸化信号依次***到pUC18载体上构建获得。

所述宿主细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、HL-8细胞中的一种或多种，优选为293T细胞。

本发明的第二个方面，提供上述方法构建得到的重组H13N2亚型流感病毒。

本发明的第三个方面，提供上述重组H13N2亚型流感病毒的应用，包括：

1)H13N2亚型流感病毒跨种传播机制研究；

2)制备预防/治疗流感病毒产品。

进一步的，所述产品为药物或者试剂盒。

本发明的有益技术效果：

本发明基于H13N2亚型流感病毒115E1病毒株，采用反向遗传操作技术，成功拯救出重组H13N2亚型流感病毒；H13N2亚型流感病毒反向遗传***的成功构建为H13N2亚型流感病毒跨种传播机制的研究奠定了良好基础，并提供了可行的技术平台；同时有利于制备预防/治疗H13N2亚型流感病毒的相关产品；另外，本发明构建方法还具有操作简便、成本较低等优点，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明H13N2亚型流感病毒反向遗传操作***的技术路线图；

将H13N2亚型流感病毒的8个基因节段与线性化的双向转录表达载体pFluDD连接、转化、菌落PCR鉴定、摇菌和提质粒来获得8个含有病毒不同基因节段的感染性克隆；将8个感染性克隆按比例共转染293T细胞，将293T细胞悬液接种SPF鸡胚，最终获得重组H13N2亚型流感病毒。

图2为本发明拯救的重组H13N2亚型流感病毒电镜图片(40000×)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种构建H13N2亚型流感病毒反向遗传操作***的方法，所述方法包括：

(1)从含H13N2亚型流感病毒A/black-tailed gull/Weihai/115/2016(简称115E1株)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA并反转录为cDNA；

(2)通过基因扩增引物以cDNA为模板扩增H13N2亚型流感病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及NS共计8个基因节段；

(3)回收和纯化PCR扩增的PCR产物，通过同源重组酶将PCR产物分别与线性化的pFluDD载体进行连接；

(4)连接产物加入到DH5α感受态细胞中转化，挑取单菌落并用(3)中的引物对进行菌落PCR和电泳鉴定，取阳性菌落进行摇菌和提取质粒，并送测序鉴定，测序鉴定正确的含有不同基因节段的8个感染性克隆分别命名为pFluDD-H13N2-PB2、pFluDD-H13N2-PB1、pFluDD-H13N2-PA、pFluDD-H13N2-HA、pFluDD-H13N2-NP、pFluDD-H13N2-NA、pFluDD-H13N2-M和pFluDD-H13N2-NS；

(5)八个感染性克隆按比例共转染293T细胞，每种质粒加入0.6微克，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养48小时，转染后的293T细胞接种10日龄的SPF鸡胚，培养60小时，采用0.75％鸡红细胞检测鸡胚尿囊液血凝性，收获血凝阳性的鸡胚尿囊液，获得重组H13N2亚型流感病毒，将拯救的重组H13N2亚型流感病毒命名为rH13N2-115E1，测序鉴定重组病毒；

(6)采用0.75％鸡红细胞检测所拯救的重组病毒rH13N2-115E1的血凝效价，采用10日龄SPF鸡胚滴定所拯救的重组病毒rH13N2-115E1的EID₅₀。

本发明的又一具体实施方式中，扩增H13N2亚型流感病毒基因组的PCR引物满足的条件如下所示：

1)针对H13N2亚型流感病毒的8个基因节段分别设计8组引物。每组引物的上下游引物包含相应病毒基因的两端的首个碱基开始的一部分非编码区序列，且每组引物需能完整扩增相应基因的非编码区和编码区；

2)上游引物的5’端加上ACCTCCGAAGTTGGGGGGGA二十个碱基，下游引物的5’端加上TTTTGGGCCGCCGGGTTATT二十个碱基。

具体的，所述引物序列见下表1。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(3)采用商品化的试剂盒回收PCR产物，以提高PCR产物的回收速度。具体操作方法按照市售试剂盒中说明书进行操作即可。

本发明的又一具体实施方式中，为了提高连接效率，克服酶切位点的限制，采用同源重组酶来连接PCR产物与载体。市场上已经有多种同源重组酶在售。

本发明的又一具体实施方式中，转化所用的DH5α感受态细胞可以从试剂公司去购买。

本发明的又一具体实施方式中，采用商品化的质粒试剂盒来提取质粒，。

本发明的又一具体实施方式中，为保持质粒的纯度和完整性，采用脂质体3000作为转染试剂，以提高质粒转染效率。

本发明的又一具体实施方式中，采用0.75％的鸡红细胞来检测重组病毒的血凝效价，并采用10日龄SPF鸡胚来检测重组病毒的EID₅₀。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。实施例中使用的pFluDD载体由青岛擎科梓熙生物技术有限公司构建而成。

实施例1H13N2亚型流感病毒亲本病毒

H13N2亚型流感病毒亲本病毒A/black-tailed gull/Weihai/115/2016(简称115E1株)是由山东省农业科学院家禽研究所畜禽跨种病毒病监测预警团队分离鉴定和保存。

实施例2病毒RNA的提取、反转录和基因节段的PCR扩增

(1)按照试剂盒的说明来提取H13N2亚型流感病毒的RNA，用DEPC水洗脱获得病毒RNA；

(2)通过反转录来获得病毒的cDNA，反转录反应体系为50μL。反转录体系如下：5×反转录Buffer 10μL，RNA29μL，Random 9mers(50pmol/μL)4μL，dNTP(10mM)4μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)2μL，AMV反转录酶(40U/μL)1μL。反应条件为42℃反应1h30min。

(3)根据115E1株的基因序列(序列表序列1-8，MF461177-MF4611184)来设计H13N2亚型流感病毒8个基因节段的扩增引物，PCR引物的序列如下表1所示：

表1：H13N2亚型流感病毒基因节段PCR扩增引物

(4)PCR的反应体系为50μL。反应体系的成分如下所示：5×Phusion HF缓冲液10μL，dNTP(10mM)1μL，ddH₂O 34.5μL，上游、下游引物各1μL，cDNA 2μL，Phusion DNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件如下：98℃预变性30s，35个循环(98℃变性，10s；60℃复性，30s；72℃延伸，2min)，72℃总延伸10min，4℃保存∞；

(5)1％琼脂糖凝胶电泳，120V、30min，电泳鉴定PCR产物长度，鉴定正确的PCR产物待回收。

实施例3H13N2亚型流感病毒感染性克隆制备

(1)按胶回收试剂盒的说明来切胶回收H13N2亚型流感病毒的PCR产物；

(2)将线性化双向转录表达载体pFluDD与回收后的PCR产物通过同源重组的方式连接。连接体系10μL，连接体系成分如下所示：ddH₂O 4μL，PCR产物1μL，同源重组酶5μL。连接条件为：50℃，15min；

(3)连接产物的转化和摇菌：

a)将DH5α感受态置于冰上15min；

b)连接产物加入到感受态中；

c)冰上30min；

d)42℃热激90s；

e)冰上3min，而后加入1ml的LB培养基；

f)37℃、200rpm摇菌1h；

g)菌液均匀涂抹在氨苄抗性的LB平板上；

h)倒置37℃温箱12h；

i)挑取菌落PCR鉴定为阳性的单菌落摇菌；

j)37℃、200rpm摇12-14h；

k)按照QIAGEN质粒小提试剂盒说明书提取质粒并测序鉴定；

(4)测序鉴定正确的质粒即为制备完成的感染性克隆，将8个感染性克隆命名如下pFluDD-H13N2-PB2、pFluDD-H13N2-PB1、pFluDD-H13N2-PA、pFluDD-H13N2-HA、pFluDD-H13N2-NP、pFluDD-H13N2-NA、pFluDD-H13N2-M和pFluDD-H13N2-NS；感染性克隆pFluDD-H13N2-PB2携带H13N2亚型流感病毒的PB2基因，感染性克隆pFluDD-H13N2-PB1携带H13N2亚型流感病毒的PB1基因，感染性克隆pFluDD-H13N2-PA携带H13N2亚型流感病毒的PA基因，感染性克隆pFluDD-H13N2-HA携带H13N2亚型流感病毒的HA基因，感染性克隆pFluDD-H13N2-NP携带H13N2亚型流感病毒的NP基因，感染性克隆pFluDD-H13N2-NA携带H13N2亚型流感病毒的NA基因，感染性克隆pFluDD-H13N2-M携带H13N2亚型流感病毒的M基因，感染性克隆pFluDD-H13N2-NS携带H13N2亚型流感病毒的NS基因。

实施例4感染性克隆共转染293T细胞拯救重组的H13N2亚型流感病毒

(1)6孔细胞培养板加入293T细胞，37℃、5％CO₂的细胞培养箱过夜培养成单层细胞；

(2)取一个新的1.5mL的EP管，加入250μl的无血清的OPTI-MEM，并加入拯救特定重组病毒所需的8个感染性克隆pFluDD-H13N2-PB2、pFluDD-H13N2-PB1、pFluDD-H13N2-PA、pFluDD-H13N2-HA、pFluDD-H13N2-NP、pFluDD-H13N2-NA、pFluDD-H13N2-M和pFluDD-H13N2-NS，每个感染性克隆加入0.6μg，并加入10μL的P3000试剂，轻柔混匀；

(3)再一个新的取1.5mL的EP管，加入250μl的无血清的OPTI-MEM，再加入16μL的脂质体3000(Lipofectamine 3000)，轻柔混匀，静置5min；

(4)将(3)中EP管中的液体加入到(2)中的EP管中，轻柔混匀，静置30min；

(5)弃去细胞液，加入(4)中的混合液于细胞孔中；

(6)37℃、5％CO₂培养6h后换液，弃去原液，并加入新的2ml无血清OPTI-MEM(内含2μg/ml终浓度的TPCK胰酶)，37℃、5％CO₂培养48h；

(7)293T细胞悬液接种10日龄SPF鸡胚，培养60h；

(8)用0.75％鸡红细胞检测鸡胚尿囊液的血凝效价为2⁹，RT-PCR并送公司测序以确保拯救病毒的基因组序列与亲本病毒完全一致；将测序鉴定正确的重组H13N2亚型流感病毒命名为rH13N2-115E1，冷冻于-80℃冰箱中保存。

实施例5拯救的重组H13N2亚型流感病毒的电镜观察和病毒EID₅₀测定

(1)将含拯救重组H13N2亚型流感病毒rH13N2-115E1的鸡胚尿囊液经磷钨酸负染后，用透射电子显微镜观察病毒粒子的形态并照相(图2)；电镜观察结果显示，病毒粒子呈球状，且病毒囊膜的表面有纤突，符合典型的流感病毒粒子的特征；

(2)鸡胚半数感染量(50％egg infectious dose,EID₅₀)的测定：

a)用PBS将富含rH13N2-115E1病毒的鸡胚尿囊液10倍倍比稀释至10^-10；

b)将每个稀释度的稀释液各接种3枚10日龄SPF鸡胚，每枚接种100μL的稀释液，37℃孵育；

c)72h后收胚，采用血凝试验检测鸡胚尿囊液的血凝性；

d)通过Reed-Muench法计算病毒的EID₅₀：

EID₅₀＝10^X+Y/100μL；

X为阳性率刚好高于50％的病毒稀释度的对数，

Y＝(阳性率刚好高于50％的百分数-50％)/(阳性率刚好高于50％的百分数-阳性率刚好低于50％的百分数)。

e)rH13N2-115E1的EID₅₀测定结果见下表2，经Reed-muench法计算，rH13N2-115E1的病毒滴度为10^6.5EID₅₀/100μL。

表2 EID₅₀ of rH13N2-115E1

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院家禽研究所

<120> 一种构建H13N2亚型流感病毒反向遗传操作***的方法及其应用

<130>

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2341

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcaaaagca ggtcaaatat attcaatatg gagagaataa aagaactaag agatctaatg 60

tcacagtctc gcactcgcga gatactcacc aaaaccactg tggaccacat ggccataatc 120

aaaaaataca catcgggaag gcaagagaag aatcccgcac taaggatgaa atggatgatg 180

gcaatgaaat atccaatcac tgcagagaag agaataatgg aaatgattcc tgaaaggaat 240

gagcagggac aaaccctttg gagtaaaaca aacgatgccg gatcggaccg agtaatggta 300

tcgcctctcg ctgtgacgtg gtggaacagg aatggaccaa cagcaagtac agtccactac 360

ccaaaggtat acaaaactta ttttgaaaaa gttgagaggt tgaaacacgg gacctttggc 420

cctgtccact tcagaaatca agttaaaata agacggagag tcgacgtaaa cccaggccat 480

gcagacctaa atgccaaaga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtctt cccaaatgag 540

gtgggagcaa gaatactgac gtcagagtca caacttacgg taacaaagga gaaaaaagaa 600

gaactccagg actgcaaaat tgcccctttg atggttgcat acatgctaga gagggaattg 660

gtccgcaaga caaggttcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtcta tattgaggtg 720

ctgcacttaa cccaggggac atgctgggag cagatgtaca ctccaggagg agaggtgagg 780

aatgatgatg tagaccagag cttgattatt gctgccagaa acatagtgag aagagcaaca 840

gtatcagcag acccactagc atccctactg gaaatgtgcc acagcacaca gattggaggg 900

gcaaggatgg tcgacatcct tcgacaaaat ccgacagaag aacaagctgt ggacatatgc 960

aaggcagcaa tgggattgag gattagctca tctttcagct ttggtggatt cacttttaaa 1020

agaacaagtg gatcttcagt aaaaagagaa gaagaagtgc ttacgggcaa ccttcaaaca 1080

ttgaaaataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggtaggaag acgagcaact 1140

gctattatca ggaaagcaac cagaaggctg atccagctaa tagtaagtgg gagagacgag 1200

cagtcaattg ctgaagcaat aattgtggcc atggtgttct cacaagagga ctgcatgatc 1260

agggcagttc gaggtgatct gaattttgtc aatagggcga accagaggct gaacccaatg 1320

catcaactcc tgagacactt tcaaaaggat gcaaaagtgc tttttcaaaa ttggggaatc 1380

gaacccattg acagtgtgat ggggatgatt gggatattgc ccgacatgac cccaagtact 1440

gagatgtcac tgagggggat aagagtcagc aagacggggg tagatgaata ctccagcaca 1500

gaaagggttg tagtgagtat cgaccgattt ttaagagttc gagaccaaag agggaacata 1560

ctattgtcac ctgaagaagt cagcgagaca caggggacag agaaattgac aatcacttat 1620

tcgtcgtcaa tgatgtggga gatcaatggt cctgagtcgg tgctggtcaa tacttaccaa 1680

tggatcatca ggaactggga aactgtgaaa atccaatggt cacaggatcc cacaatgtta 1740

tataacaaga tggaatttga accattccaa tctcttgtcc ctaaagcagc taggggtcaa 1800

tacagtggat tcgtgaggac attattccag caaatgcggg atgtgattgg aacatttgac 1860

actgttcaga taataaaact cctcccattt gctgctgctc caccagaaca aagtaagatg 1920

cagttctcct ccatgactgt aaatgtaaga ggatcaggga tgagaatact ggtaagaggc 1980

aactccccag tgttcaatta caataaggcc accaagaggc tcactattct cgggaaagat 2040

gcaggtgcat tgaccgaaga tccagatgaa ggcacagctg gaatagaatc tgccgttcta 2100

agaggattcc tcattttggg caaagaagac aagagatatg gcccggcatt gagcatcaat 2160

gagctgagca atcttgcaaa gggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgta 2220

gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagtca gacagcgacc 2280

aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaattgttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340

t 2341

<210> 2

<211> 2341

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcaaaagca ggcaaaccat ttgaatggat gtcaatccga ctttactttt cttgaaagtg 60

ccagcgcaaa atgctataag tactacattc ccttatactg gagatcctcc atacagccat 120

ggaacaggaa caggatacac catggacaca gtcaatagaa cacatcaata ctcagagaag 180

gggaaatgga caacaaatac agagactgga gcaccccaac tcaatccaat tgatggacca 240

ctacccgagg ataacgagcc aagcggatat gcacaaacag attgtgtgtt ggaagcaatg 300

gctttccttg aagaatccca cccagggatc tttgaaaact catgccttga aacgatggaa 360

gtcgttcagc aaacaagagt ggacaaattg acccaaggcc gccagaccta tgactggaca 420

ttgaatagaa accagccggc tgcaactgct ttggccaaca ctatagaggt cttcagatcg 480

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tcaatggaca aggaagaaat ggagataaca acacacttcc agagaaagag aagagtacga 600

gataacatga ccaagaaaat ggtcacacag agaacaatag ggaagaaaaa gcagaggctg 660

tacaagagga gctacttaat aagagcatta acattgaaca caatgaccaa ggatgcagaa 720

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tactttgttg aaacattagc gaggagcatc tgtgagaaac ttgagcagtc tggactccct 840

gttggaggga atgaaaagaa ggctaaattg gcaaatgtcg taagaaagat gatgactaac 900

tcacaagaca cagagctttc ctttacaatc actggagaca ataccaaatg gaatgagaat 960

cagaatcctc ggatgtttct ggcaatgata acatacatca caagaaacca acccgaatgg 1020

tttagaaatg tcctaagcat tgctcctata atgttctcaa acaaaatggc aaggttaggg 1080

aaaggatata tgttcgagag taagagcatg aagctacgga cacaaatacc agcagaaatg 1140

cttgccaaca ttgatctgaa atatttcaat gaatcaacaa gaaagaaaat cgaaaaaata 1200

agacctctac taatagatgg cacagcctca ctgagtcctg ggatgatgat gggcatgttc 1260

aacatgctga gtacagtctt gggggtctca atcttgaatc ttggacagaa gaaatatacc 1320

aaaaccacat actggtggga tggactccaa tcctctgatg atttcgctct catagtgaat 1380

gcaccgaatc atgagggaat acaagcagga gtggataggt tctatagaac ctgcaaactg 1440

gttgggatca atatgagcaa aaagaagtct tacataaatc ggacagggac atttgagttc 1500

acaagctttt tctatcgcta tggatttgta gccaacttca gtatggagct gcctagcttt 1560

ggagtgtccg ggattaatga atcggctgac atgagcattg gagttacagt gataaagaac 1620

aatatgataa acaacgacct ggggcctgca acggctcaga tggcccttca gcttttcatt 1680

aaagactaca gatacacata tcggtgtcac aggggtgata cacaaattca aacaagaaga 1740

tcattcgaac tgaagaaact gtgggagcag acccgttcaa aggcgggact gttagtttca 1800

gatggaggac caaatttata caacatccga aatctccaca ttccagaggt ctgcttaaag 1860

tgggaattaa tggacgaaga ttaccagggt aggctgtgta atcctctgaa tccatttgtc 1920

agccataaag aaattgagtc tgtgaacaat gctgtggtaa tgccagcaca tggtccagcc 1980

aagagcatgg agtatgatgc tgttgcaact acacactcat ggattcctaa gaggaaccgc 2040

tccattctca ataccagcca aagaggaatt cttgaggacg aacagatgta tcagaagtgt 2100

tgcaatctat tcgagaaatt cttccctagt agttcataca ggaggccagt tgggatttcc 2160

agtatggtgg aggctatggt gtctagggcc cgaattgatg cacgaattga cttcgaatct 2220

gggaggatta agagagaaga gtttgctgag atcatgaaga tctgttccac cattgaagag 2280

ctcagacggc aaaaatagtg aatttagctt gtccttcatg aaaaaatgcc ttgtttctac 2340

t 2341

<210> 3

<211> 2233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcaaaagca ggtactgatc caaaatggaa gactttgtgc gacaatgctt caatccaatg 60

attgtcgagc ttgcggaaaa ggcaatgaaa gaatatgggg aagatccgaa aatcgaaacg 120

aacaaatttg ccgcaatatg cacacactta gaagtctgtt tcatgtattc ggatttccac 180

tttattgatg aacgaggcga atcaataatt gtagaatctg gcgatccgaa tgcattgttg 240

aaacaccgat ttgagataat tgaagggaga gacagaacaa tggcctggac agtggtgaat 300

agtatctgca acaccacagg agtcgaaaag cccaaattcc tccctgattt gtatgactac 360

aaagagaacc gattcattga aattggggtg acgcgaaggg aagtccacat atactatcta 420

gaaaaagcca acaagataaa atcagagaag acacacattc acatattctc attcactgga 480

gaggaaatgg ccaccaaggc ggactacacc cttgatgaag agagcagagc aagaataaaa 540

accaggctgt tcactataag acaagaaatg gccagtaggg gtttatggga ttcctttcgt 600

cagtccgaga gaggcgaaga gacaattgaa gaaagatttg aaatcacagg aaccatgcgc 660

aggcttgccg accaaagtct cccaccgaac ttctccagcc ttgaaaactt tagagcctat 720

gtggatggat tcgaaccgaa cggctgcatt gagggcaagc tttctcaaat gtcaaaagaa 780

gtgaatgcca ggattgagcc atttctgaag acaacaccac gccctctcag attacctgat 840

gggccgccct gttctcagcg gtcgaagttc ttgctgatgg atgcccttaa attaagcatc 900

gaggacccga gccatgaagg ggagggcata ccgctgtatg atgcaatcaa atgcatgaag 960

acattttttg gctggaaaga gcccaacatt gtgaaaccac atgaaaaggg catcaaccct 1020

aattatctcc tggcttggaa gcaggtgctg gcagaactcc aagatattga aaatgaggag 1080

aaaatcccaa aaacaaagaa catgaagaaa acaagccagt tgaaatgggc acttggtgag 1140

aatatggcac cagagaaagt ggactttgag gactgtaaag atgttagcga tctaagacag 1200

tacgacagcg acgaaccaga gcctagatca ctagcaagct ggatccagag tgaattcaac 1260

aaggcatgcg aattgacaga ttcgagttgg attgaacttg atgaaatagg ggaagacgtt 1320

gctccaattg aacacattgc gagtatgagg aggaactact tcacagcgga agtatcccat 1380

tgcagggcta ctgaatacat aatgaaggga gtatacataa acacagccct attgaatgca 1440

tcctgtgcag ccatggatga cttccaactg attccaatga taagcaagtg cagaaccaaa 1500

gaagggagac ggaagacaaa tctgtacgga ttcattataa aaggaagatc ccatttgagg 1560

aatgacaccg atgtggtaaa ctttgtgagt atggaattct ctctcactga cccgaggctg 1620

gagccacaca aatgggaaaa gtactgtgtt cttgagatag gggacatgct cctacggact 1680

gcaataggcc aagtgtcaag gcccatgttc ctgtatgtga gaaccaacgg gacgtccaaa 1740

atcaaaatga aatggggcat ggagatgagg cgatgccttc ttcagtccct ccaacaaatt 1800

gaaagcatga ttgaggccga gtcttctgtc aaagagaagg acatgaccaa ggaattcttt 1860

gaaaacaaat cagaaacatg gccaattgga gaatcaccta aaggggtgga agacggctcc 1920

attgggaagg tgtgcagaac attgttagca aagtctgtgt tcaacagcct atatgcatct 1980

ccacaactcg aggggttttc agctgaatcg agaaaattgc ttctcattgt tcaggcactt 2040

agggacaacc tggaacctgg aaccttcgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100

tgcctgatta acgatccctg ggttttgctt aatgcgtctt ggttcaactc cttcctcaca 2160

catgcactga aatagttgtg gcaatgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220

ccttgtttct act 2233

<210> 4

<211> 1770

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcaaaagca ggggaaatct caacaatcag aaaccaaaac aaaatggctc taaatgtcat 60

tacaatcctg acacttataa gcgtgtgtgt gcaggcagac agaatatgtg tgggttatct 120

gagcaccaat tcatcagaaa gagtcgacac actacttgaa aacggagttc cagtcaccag 180

ctccgtcgac ctggttgaaa ctaaccacac aggaacatac tgttctctaa atggagtcag 240

cccagtgcat ttaggagatt gtagctttga aggatggatt gtgggaaacc cggcatgcac 300

cagcaacttc gggatcagag agtggtcata tctaattgag gatcctgggg caccccatgg 360

gctttgttac cctggagaat taaacaacaa tggagagctc aggcatctgt tcagtggaat 420

caagtcattc agcagaacag agttgatccc acctaattct tggggagaag tacttgacgg 480

tgcgacatct gcttgcagag atgacaaggg gaccaacagt ttctatcgaa atttaatctg 540

gtttgtaaag aagaataata aatacccagt tatcagtaag acctacaaca acacaacagg 600

aagagatgta ctagttttgt ggggaatcca ccacccagta tctgtggagg agacgaagac 660

tctgtatgtc aatagtgatc cgtatacgct agtttccaca aaattatgga gtgagaagta 720

taaactagag actggagttc ggcctgggta caacggacag aggagctgga tgaaaatcta 780

ttggtcattg ctgcatccag gagagatgat tactttcgag agtaacggtg gacttttagc 840

tccaagatat gggtacataa ttgaagagta tggaaaggga aggattttcc aaagtcgcat 900

aagaatgtct aagtgcaaca ccaagtgcca gacttcggtt gggggaataa acacaaacag 960

aacgtttcaa aacatagaga aaaatgctct aggtgattgt cccaaatata taaagtctgg 1020

tcagctcaag ctagccactg ggctcagaaa tgtgccagcc atatctaaga gaggactgtt 1080

tggggcaatt gcaggattta tagagggagg atggccaggt ttaatcaatg gttggtacgg 1140

ttttcagcat caaaacgaac aaggaacagg gatagctgca gacaaggaat caacacaaaa 1200

ggccatcgac cagataacaa ccaaaataaa taacatcatt gacaaaatga atggaaacta 1260

tgattccatc agaggtgaat tcaatcaagt ggagaagcgc ataaacatgc tcgcagatag 1320

gatagatgat gctgtgacag atatttggtc atacaatgcc aaactccttg tactgctaga 1380

aaatgacaaa actttagata tgcatgatgc taatgtaagg aatttacatg agcaggtgca 1440

aagagaatta aaggacaatg cgatagacga agggaatggg tgttttgaac tccttcacaa 1500

atgtaatgac tcttgcatgg aaactataag aaatggaaca tacgaccaca ctgagtatgc 1560

ggaggagtca aaattaaaga ggcaggaaat caatggggta aaacttaaat cagaagacaa 1620

tgtttacaag gcattatcaa tatacagctg cattgcaagc agtgttgtgt tagtaggact 1680

catactctct ttcatcatgt gggcctgtag taatggaagc tgtcgattca atgtttgtat 1740

ataagtagaa aaaacaccct tgtttctact 1770

<210> 5

<211> 1565

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatcc acatcatggc gtctcaaggc 60

accaaacgat cttatgagca gatggaaact ggtggtgaac gccagaatgc cactgagatt 120

cgggcatctg tcggaaggat ggttggagga atcggaagat tctacataca gatgtgcact 180

gaactcaagc tgagtgacaa tgaaggaagg ctgatacaaa acagtatcac aatagagagg 240

atggtcctgt ccgcatttga tgagaggagg aatagatact tggaggagca tcccagcgct 300

gggagggacc ccaagaagac tggtggacca atttacagaa ggagagaggg gaaatgggtg 360

agagaattgg tcctatatga caaggaagaa ataagaagaa tctggcgaca ggcaaacaat 420

ggagaagact cgactgctgg cctcacccat ttgatgatct ggcattccaa tttaaatgac 480

gccacatatc aaaggactag agccctagtg cgcaccggga tggaccctag gatgtgctcc 540

ctcatgcagg gatcgacact cccaagaagg tctggagcgg ctggtgcagc tgtaaaaggg 600

gttgggacaa tggtgatgga gctcatcaga atgataaaaa gaggggtcaa tgaccgtaac 660

ttctggagag gggaaaatgg aagaagaaca agaattgctt atgagagaat gtgtaacatc 720

ctcaaaggga aattccaaac agcagcacaa cgagctatga tggatcaggt cagagaaagc 780

cgtaatcctg gaaatgctga aattgaagac ctcatctttc tggccaggtc tgcccttatt 840

ctgaggggag cagtagctca taaatcatgc ctgcctgcct gtgtgtatgg acttgctgta 900

gcaagtggat atgacttcga aagggaaggg tattcccttg ttgggataga ccctttccgt 960

ctgctccaga acagccaagt gttcagtcta atccgaccca atgagaatcc ggcacacaag 1020

agccaattgg tatggatggc atgtcattct gctgcatttg aggatttgag agtgtcaagc 1080

ttcatcaggg gaataagagt gttaccaaga ggacaattat ccacaagagg tgttcaaatt 1140

gcgtcaaacg agaacatgga gactatgagt tccagcaccc ttgaattaag gagcaaatac 1200

tgggcaataa ggactagaag cggaggaaac accaaccaac aaagagcatc agcaggacaa 1260

atcagtgtac aacctacttt ttcagtacaa agaaacctcc cttttgaaag agcgacaatc 1320

atggctgcat tcacaggaaa cgcagaagga agaacatccg atatgaggac tgagatcata 1380

cggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440

ctctcagacg aaaaggccac gaacccgatc gtgccttcct ttgacatgag taaagaagga 1500

tcttatttct tcggagacaa tgctgaggag tttgacagtt gaagaaaaat acccttgttt 1560

ctact 1565

<210> 6

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcaaaagca ggagtgaaaa tgaatccaaa tcagaagata ataacaattg gctctgtctc 60

tctaaccatt gcaacagtat gtttcctaat gcaaattgcc atcctagtga cgactataac 120

actgcacttc aagcagaatg aatgcagcat tccatcgaac aatcaagtag tgccatgtga 180

gccaatcata gtagacagga acataacaga gatagtgtat ttgaacaaca ccaccataga 240

aaaagaactt tgtcctaaat tgacagaata cagggattgg tcgaaaccac agtgtcagat 300

cacagggttt gctcctttct ccaaggacaa ctcaatccgg ctttctggtg gtggggacat 360

ttgggtaaca agggaacctt atgtatcatg cagtcccaat aaatgttatc agttcgcact 420

tgggcaggga accacgctag acaacaaaca ttcaaacggc acaatacatg ataggattcc 480

ccatcggact cttttgatga acgagttggg tgttccgttt catttgggaa ccaaacaagt 540

gtgtatagca tggtccagct caagctgcca tgatggaaga gcatggcttc acgtttgtgt 600

tactggggat gataggaatg caaccgccag tttcatttat aatggggtgc ttgttgacag 660

cattggttca tggtctcaga acattctcag aactcaggag tcagaatgcg tctgcatcaa 720

tggaacttgt acagtagtaa tgactgatgg aagtgcatca ggaagggctg atactagaat 780

actattcatt aaagaaggga aaattgttca tatcagccca ttatcgggaa gtgcccagca 840

tatagaggag tgttcctgtt atccccgcta tccagatgtc agatgtgtct gcagagacaa 900

ttggaaaggt tcaaataggc ccgttataga tataaatatg gcagattata gcatcgattc 960

tagttatgtg tgctcagggc ttgttggaga cacaccaaga aacgatgata gctctagcaa 1020

tagtaactgc aaggatccta ataatgagag agggaaccca ggagtgaaag gatgggcatt 1080

tgactatgga agtgatgttt ggatgggaag aacaatcagc aaggattctc gctcaggtta 1140

tgagaccttc agagtcattg gcggttggac aacagctaat tccaaatctc aagtaaatag 1200

gcaagtcata gttgacaata ataactggtc tggttattct ggcatcttct ctgttgaagg 1260

caaaagctgc atcaataggt gtttttatgt ggagttgata agaggaaggc cacaagagac 1320

tagagtatgg tggacttcaa acagtattgt cgtgttttgt ggaacttcag gtacttatgg 1380

aacaggctca tggcctgatg gggcgaatat caattttatg cctatataag ctttcgcaat 1440

tttagaaaaa aactccttgt ttctact 1467

<210> 7

<211> 1027

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60

ctctatcatt ccatcaggcc ccctcaaagc cgagatagca cagagacttg aagatgtttt 120

tgcagggaag aacacagacc ttgaagctct catggagtgg ctaaagacaa gaccgatctt 180

gtcacctctg actaagggaa ttttggggtt catttttacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240

aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa cgccctaaat gggaatggag acccaaacaa 300

catggacaga gcagtgaagc tttacagaaa gctgaagagg gagataacat tccacggagc 360

taaggaggtg gcactcagtt actcaactgg tgcactcgcc agctgcatgg gtctcatcta 420

caataggatg gggacggtaa ccacagaagt tgcttttggt ctagtgtgtg ccacttgtga 480

gcagattgct gactctcagc atcgatccca cagacagatg gtgaccacaa ccaacccact 540

aatcagacat gaaaatagaa tggtgctggc aagcactaca gctaaggcta tggagcagat 600

ggcgggatcg agtgaacaag cagcagaggc aatggaggtt gcaggtcagg ctagacagat 660

ggtgcaggca atgagaacaa ttgggaccca tcctagctcc agtgctggtc tgaaagatga 720

tcttcttgaa aatttacagg cctaccagaa acgaatggga gtgcaaatgc agcgattcaa 780

gtgatcctct cgttattgca gcaagtatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggattc 840

ttgatcgtct tttcttcaaa tgcatttatc gtcgcattaa atacgagttg aaaagagggc 900

cttctacgga aggagtgcct gagtctatga gggaagaata tcgacaggaa cagcagaatg 960

ctgtggatgt tgacgatggt cattttgtca acatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020

ttctact 1027

<210> 8

<211> 890

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcaaaagca gggtgacaaa aacataatgg attcaaayac tgtgtcaagc tttcaggtag 60

actgctttct ttggcatgtc cgcaaacgat ttgcagacca agatatgggt gatgccccat 120

tcctagatcg gcttcgccga gaccaaaagt ccctgaaagg gagaagcagc actcttggta 180

tcggcattga ggcagctact cgctctggga agcagataat agagcggatt ctggatgaag 240

aatcagacga ggcactgaaa atgaccattg cctctgtgcc tgcatcccgc tatgtaactg 300

acatgaccac tgaagaaatg tcaagggact ggtttatgct catgcccaaa cagaagtttg 360

ctggtcccct ctgcatcaaa atggatcagg caatcataga caaagacatc acactgaagg 420

caaatttcag tgtaatgttc aaccgattgg aaactctcgt gctgctgagg gctttcacca 480

atgagggagc aatagtgggc gaaatttcac aattgccttc tcttccagga catactagcg 540

aggatgtcaa aaatgcaatt ggagtcctca tcgggggact tgaatggaat gataacacag 600

ttcgaatctc tgaaactcta cagagattcg cttggggaag cagtaatgag aatgggagac 660

ctccattcgc tccagagcag aaacagaaac tggcgagaac aattgagtca gaagtttgaa 720

gaactgagat ggttgattga agaagtgaga cacaagttga agacaacaga gagtagtttt 780

gaacagataa cattcatgca agcattacaa ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840

actttctcgt ttcagcttat ttaatgataa aaaacaccct tgtttctact 890

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca ggtcaaatat a 41

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca aggtcgtttt ta 42

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca ggcaaa 36

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca aggcattttt 40

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca ggtactg 37

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca aggtactttt t 41

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca ggggaaatct c 41

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca agggtgtttt ttcta 45

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca gggtagat 38

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca agggtatttt t 41

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca ggagtgaaaa tg 42

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca aggagttttt ttctaa 46

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca ggtagatatt g 41

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca aggtagtttt ttact 45

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acctccgaag ttggggggga agcaaaagca gggtga 36

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttttgggccg ccgggttatt agtagaaaca agggtgtttt tt 42

Claims

1.一种构建H13N2亚型流感病毒的反向遗传操作***的方法，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述PB2基因核苷酸序列为序列表中序列1；

所述PB1基因核苷酸序列为序列表中序列2；

所述PA基因核苷酸序列为序列表中序列3；

所述HA基因核苷酸序列为序列表中序列4；

所述NP基因核苷酸序列为序列表中序列5；

所述NA基因核苷酸序列为序列表中序列6；

所述M基因核苷酸序列为序列表中序列7；

所述NS基因核苷酸序列为序列表中序列8。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，

针对所述NS基因进行扩增的上下游引物序列分别如序列表中序列23和序列24所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PB2基因、PB1基因、PA基因、HA基因、NP基因、NA基因、M基因和NS基因是通过含有PB2基因的重组载体、含有PB1基因的重组载体、含有PA基因的重组载体、含有HA基因的重组载体、含有NP基因的重组载体、含有NA基因的重组载体、含有M基因的重组载体、含有NS基因的重组载体共同导入宿主细胞中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，

所述含有NS基因的重组载体为将NS基因***表达载体的多克隆位点中得到的载体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pFluDD。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、HL-8细胞中的一种或多种，优选为293T细胞。

8.权利要求7所述方法构建得到的重组H13N2亚型流感病毒。

9.权利要求8所述重组H13N2亚型流感病毒的应用，包括：

1)H13N2亚型流感病毒跨种传播机制研究；

2)制备预防/治疗流感病毒产品。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述产品为药物或者试剂盒。