CN104597238A - 一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种霉酚酸检测试剂及其制备和检测方法,具体涉及一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法,包括:抗霉酚酸特异性抗体、用于检测抗霉酚酸特异性抗体-霉酚酸复合物的指示试剂;上述抗霉酚酸特异性抗体由霉酚酸免疫原免疫动物得到。本发明的有益之处在于:本发明的霉酚酸免疫原特异性强、免疫原性高,制备出的抗霉酚酸特异性抗体特异性强、效价高,并且与常见的62种药物无任何交叉反应;含有上述抗霉酚酸特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的霉酚酸含量,并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品,实现霉酚酸的高通量快速化测定,准确度高,特异性强,精确度和检测效率有了较大的提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种霉酚酸检测试剂及其制备和检测方法,具体涉及一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法。
背景技术
霉酚酸(Mycophenolic acid)结构式如式(Ⅲ)所示:
霉酚酸作为一种免疫抑制剂,临床上被广泛用于抑制肾脏、肝脏及心脏等器官移植过程中的排斥反应。霉酚酸能够非竞争性地结合次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH),而后者是T、B淋巴细胞增殖过程中鸟嘌呤核苷酸从头合成的关键酶。其临床有效血药浓度较窄(临床有效血药浓度为1.0-3.5μg/mL),低于其有效血药浓度无法起到免疫抑制作用,达不到相应疗效;高于其有效血药浓度则会产生严重的肾毒性,其他副反应还包括恶心、呕吐、胃痛、体重减轻、发热等,严重时还会导致病人免疫抑制过度而感染死亡。因此,对使用霉酚酸治疗的患者进行血药浓度监测对于指导临床安全合理用药及个体化用药具有重要意义。
国内外监测霉酚酸血药浓度主要使用高效液相色谱法、酶放大免疫测定法、化学发光法、免疫比浊法等方法,但这些方法在临床应用上都具有一定的缺陷性。西门子、罗氏诊断等国外厂家虽然已有可应用于生化分析仪的霉酚酸测定试剂盒上市,但是远不能满足日益增长的临床检测需求。目前市场上仍缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的霉酚酸检测试剂,尤其是质量好的自动化检验试剂。因此,研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高,可应用于全自动生化分析仪的霉酚酸测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。本发明的霉酚酸均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对霉酚酸的高通量、快速化检测,且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点,还能有效降低霉酚酸检测成本,有利于临床推广使用。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中霉酚酸含量的霉酚酸均相酶免疫检测试剂及其制备方法,以及可以与各种类型的自动生化分析仪联用、对检测人员要求不高的霉酚酸均相酶免疫检测方法。
本发明的另一个目的为提供一种有助于制备快速准确测定霉酚酸含量的霉酚酸均相酶免疫检测试剂的霉酚酸衍生物。
为了实现上述目标,本发明采用的技术方案是:
一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂,包括:抗霉酚酸特异性抗体、用于检测抗霉酚酸特异性抗体-霉酚酸复合物的指示试剂;上述抗霉酚酸特异性抗体由霉酚酸免疫原免疫动物得到,霉酚酸免疫原的结构式如式(Ⅰ)所示:
式中,载体为具有免疫原性的蛋白质;上述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
上述指示试剂选自酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物;上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸;
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与霉酚酸衍生物反应形成。
上述霉酚酸衍生物的结构式如式(Ⅱ)所示:
霉酚酸衍生物的合成方法,其特征在于,合成路线为:
一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)霉酚酸衍生物的合成与纯化,并进行结构鉴定;
(2)霉酚酸免疫原的合成:使霉酚酸的末端羧基与具有免疫原性的蛋白质载体连接;
(3)用霉酚酸免疫原免疫动物,制备并纯化抗霉酚酸特异性抗体;
(4)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备:制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液,激活霉酚酸衍生物,使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与霉酚酸的末端羧基连接,纯化连接产物;
(5)霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备:
试剂A的制备:由抗霉酚酸特异性抗体和均相酶底物混合而成;
试剂B的制备:由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
前述的一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,所述的步骤(2)中,蛋白质载体为BSA,具体合成步骤如下:
a.称取2.72g磷酸二氢钾、4.26g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至7.4,制成缓冲溶液A;
b.称取3mg BSA,室温下溶解于3mL上述缓冲溶液A中,制成BSA溶液;
c.称取3mg霉酚酸衍生物,溶解于300ul上述缓冲溶液A中,制成霉酚酸衍生物溶液;
d.当上述霉酚酸衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述BSA溶液中,然后将此混合溶液在2-8℃下搅拌1小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为霉酚酸免疫原溶液,在霉酚酸免疫原溶液中加入质量分数0.1%的NaN3,于-20℃下储存。
前述的一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,所述的步骤(4)具体过程为:
a.称取1.09g磷酸二氢钾、1.70g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至7.4,制成缓冲溶液B;
b.称取3mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,室温下溶解于3mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3mg霉酚酸衍生物,溶解于300ul上述缓冲溶液B中,制成霉酚酸衍生物溶液;
d.当上述霉酚酸衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在2-8℃下搅拌1小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液中加入质量分数0.5%的BSA和质量分数0.1%的NaN3,于2-8℃下储存。
前述的一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,步骤(5)的具体过程如下:
试剂A的制备:将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)用1L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将制备的抗霉酚酸特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000;
试剂B的制备:将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
利用霉酚酸均相酶免疫检测试剂的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将待测样本与抗霉酚酸特异性抗体接触;
2)根据待测样本中霉酚酸与抗霉酚酸特异性抗体的结合情况,
利用指示试剂判断样本中霉酚酸的含量;
所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液;
所述的指示试剂选自酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物;上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与霉酚酸衍生物反应形成。
本发明的有益之处在于:本发明的霉酚酸免疫原特异性强、免疫原性高,制备出的抗霉酚酸特异性抗体特异性强、效价高,并且与常见的62种药物无任何交叉反应;含有上述抗霉酚酸特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的霉酚酸含量,并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品,实现霉酚酸的高通量快速化测定,准确度高,特异性强,精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高,同时实现了检测过程的全自动化,对检测人员的要求不高,易于实现和推广使用。
附图说明
图1是霉酚酸均相酶免疫反应标准曲线图;
图2是霉酚酸均相酶免疫相关性分析图。
具体实施方式
本发明所采取的技术方案是:
霉酚酸免疫原,其结构式如式(Ⅰ)所示:
式中,载体具有免疫原性,优选的,载体为具有免疫原性的蛋白质。虽然其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体,但通常情况下选用蛋白质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白,血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。
一种抗霉酚酸特异性抗体,由式(Ⅰ)所示的霉酚酸免疫原免疫动物得到。
本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子,也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体,优选为多克隆抗体。
获得多克隆抗体的方法是使用式(Ⅰ)所示的霉酚酸免疫原,在加或者不加佐剂后,在动物的一个或者多个部位进行免疫,宿主动物包括:兔,山羊,小鼠,绵羊,豚鼠或马。持续免疫一直进行,直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清,抗血清可以纯化。
单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制作。
一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂,包括:上述抗霉酚酸特异性抗体、用于检测抗霉酚酸特异性抗体-霉酚酸复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的,指示试剂为酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物。其中,酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物,其可通过化学合成方法得到。
上述霉酚酸均相酶免疫检测试剂的使用方法,包括以下步骤:
1)将待测样本与上述抗霉酚酸特异性抗体接触;
2)根据待测样本中霉酚酸与上述抗霉酚酸特异性抗体的结合情况,利用指示试剂判断样本中霉酚酸的含量。
待测样本为各种生理样本,例如血清、血浆、尿液、唾液等。优选的,待测样本为血清或血浆。
下面结合具体的实施例,进一步说明本发明。
实施例一:霉酚酸衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的霉酚酸衍生物化学结构如式(Ⅱ)所示:
该霉酚酸衍生物的合成路线如下:
具体的合成步骤如下:
化合物2的合成
称取5.0g化合物1,溶解于50mL的MeOH中,0℃下逐滴加入4.0g(34.1mmol)SOCl2,然后将此反应混合液在70℃下搅拌过夜,通过减压方法使溶剂蒸发,将残留物通过200mL的DCM和200mL的NaHCO3饱和水溶液进行分离,将有机相用卤水冲洗,然后通过Na2SO4进行干燥,并进行浓缩得到4.9g白色固体化合物2,产率91%。
化合物3的合成
称取4.9g化合物2,溶解于100mL的MeOH中,0℃下分多次加入1.3g(33.3mmol)NaBH4,然后将此反应混合液在室温下搅拌过夜,将反应后的混合物进行浓缩,浓缩后得到的残渣通过硅胶干燥柱(DCM:MeOH=10:1)进行纯化,得到4.4g无色油状的化合物3,产率95%。
霉酚酸衍生物的合成
称取2.2g化合物3,溶解于40mL的THF中,在0℃和氮气保护条件下加入1.2g(12.6mmol)马来酰亚胺、3.8g(14.56mmol)PPh3及2.9g(14.56mmol)DIAD,然后将此反应混合液在70℃下搅拌过夜,将反应后的混合物进行浓缩,浓缩后得到的残渣通过硅胶干燥柱(DCM:MeOH=50:1)进行纯化,最终得到400mg黄褐色固体化合物4,产率12%。该化合物4即为式(Ⅱ)所示的霉酚酸衍生物。
实施例二:BSA-霉酚酸免疫原的合成
BSA-霉酚酸免疫原由牛血清白蛋白(BSA)与式(Ⅲ)所示的霉酚酸的末端羧基连接而成,该免疫原的具体合成步骤如下:
a.称取2.72g磷酸二氢钾、4.26g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至7.4,制成缓冲溶液A;
b.称取3mg BSA,室温下溶解于3mL上述缓冲溶液A中,制成BSA溶液;
c.称取3mg霉酚酸衍生物,溶解于300ul上述缓冲溶液A中,制成霉酚酸衍生物溶液;
d.当上述霉酚酸衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述BSA溶液中,然后将此混合溶液在2-8℃下搅拌1小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为霉酚酸免疫原溶液,在霉酚酸免疫原溶液中加入0.1%的NaN3,于-20℃下储存。0.1%的NaN3是指加入量占最终所得的免疫原溶液的质量百分比,具体的加入量根据透析后所得的免疫原溶液的具体质量而定。
实施例三:抗霉酚酸特异性抗体的制备
将上述制得的BSA-霉酚酸免疫原采用常规方法接种实验动物兔,加强免疫后取抗血清,具体步骤如下:
用PBS将上述合成的BSA-霉酚酸免疫原稀释至1.0mg/ml,得到抗原溶液,然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物兔进行注射。
2~3周后,再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次,之后每隔四周注射一次,共计注射4次。
对上述实验动物兔取血,分离纯化得到效价为1∶30000-1∶50000的抗霉酚酸特异性抗体。
实施例四:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
a.称取1.09g磷酸二氢钾、1.70g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至7.4,制成缓冲溶液B;
b.称取3mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,室温下溶解于3mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3mg霉酚酸衍生物,溶解于300ul上述缓冲溶液B中,制成霉酚酸衍生物溶液;
d.当上述霉酚酸衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在2-8℃下搅拌1小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液中加入0.5%的BSA和0.1%的NaN3,于2-8℃下储存。0.5%的BSA和0.1%的NaN3是指加入量占最终所得的偶联物溶液的质量百分比,具体的加入量根据透析后所得的偶联物溶液的具体质量而定。
实施例五:霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备
霉酚酸均相酶免疫检测试剂,包括:上述抗霉酚酸特异性抗体,用于检测抗霉酚酸特异性抗体-霉酚酸复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的,指示试剂为酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物。其中,酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物,其通过上述化学合成方法得到。
霉酚酸均相酶免疫检测试剂在使用之前,为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应,酶标偶联物和酶的底物是分开放置的,不混合,所以将酶的底物与上述抗霉酚酸特异性抗体混合在一起。也就是说,霉酚酸均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂,具体如下:
1.试剂A的制备:将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于烧杯D中,用1L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将上述制备的抗霉酚酸特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比可以为1:100~1:10000,在本实施例中具体的比例为1:400。
2.试剂B的制备:将上述制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比可以为1:100~1:10000,在本实施例中具体的比例为1:1500。
上述霉酚酸均相酶免疫检测试剂的使用方法,包括以下步骤:
1)将待测样本与上述抗霉酚酸特异性抗体接触;
2)根据待测样本中霉酚酸与上述抗霉酚酸特异性抗体的结合情况,利用指示试剂判断待测样本中霉酚酸的含量。
具体的,检测时,将待测样本加到试剂A中,待测样本中的霉酚酸与试剂A中的抗霉酚酸特异性抗体发生特异性结合,生成抗霉酚酸特异性抗体-霉酚酸复合物;再加入试剂B,此时试剂B中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与试剂A中的酶的底物混合、接触,发生酶促反应,构成检测抗霉酚酸特异性抗体-霉酚酸复合物的指示试剂,指示试剂根据待测样本中霉酚酸与上述抗霉酚酸特异性抗体的结合情况判断待测样本中霉酚酸的含量。
由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与待测样本中的霉酚酸竞争性结合抗霉酚酸特异性抗体,所以,待测样本中霉酚酸的量越多,均相酶溶液中游离的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的量越多,酶促反应越快,导致OD340上升。
上述待测样本为生理样本,例如血清、血浆、尿液、唾液等。
作为一种优选的方案,上述待测样本为血清或血浆。
实施例六:霉酚酸均相酶免疫检验
1、获得标准曲线:设置迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数(见表1),操作过程为:先加试剂A,再加入标准品,最后加入试剂B。加入试剂B后,测定不同时间点的OD340吸光值,算出不同标准品浓度时的反应速率,实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例,同时调整测光点,最后得出较理想的反应标准曲线图,如图1所示。
表1 迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数
通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线,重复测定低、中、高浓度质控样本10次,上述质控样本为:将霉酚酸标准品溶解于人血清中,至浓度分别为1.00、5.00、20.00μg/ml。检测数据及数据分析见表2。
表2 样品测定及精密度和回收率评估
血液样品 | 低 | 中 | 高 |
样品浓度(μg/ml) | 1.00 | 5.00 | 20.00 |
1 | 0.96 | 5.16 | 19.90 |
2 | 0.95 | 5.21 | 20.45 |
3 | 1.04 | 4.96 | 20.16 |
4 | 0.97 | 5.27 | 19.79 |
5 | 1.03 | 5.15 | 20.73 |
6 | 1.05 | 4.89 | 20.52 |
7 | 0.98 | 5.12 | 19.25 |
8 | 1.03 | 4.88 | 19.90 |
9 | 1.00 | 5.14 | 21.33 |
10 | 1.02 | 4.83 | 19.41 |
平均值(μg/ml) | 1.00 | 5.06 | 20.14 |
标准差(SD) | 0.0359 | 0.1560 | 0.6296 |
精密度(CV%) | 3.59 | 3.08 | 3.13 |
回收率% | 100.0 | 101.2 | 100.7 |
检测结果:本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高,回收率达到95%-105%,精密度高,CV均低于5%。
实施例七:药物干扰试验
选取62种常见药物,调整浓度至10.0μg/ml,进行干扰试验测定。常见的62种药物以及测定结果具体参见表3。
表3 常见干扰药物及测定结果
测定结果:上述62种常见药物等价于霉酚酸的浓度均小于0.1μg/ml。可见,本发明的抗体是抗霉酚酸的特异性抗体。
实施例八:相关性分析
对100例临床标本分别使用西门子医学诊断产品(上海)有限公司的霉酚酸检测试剂(采用酶放大免疫测定法)和本发明的均相酶免疫试剂进行相关性分析,测定的数据参见表4。
表4 临床样本测定值
对上述数据作图,参见图2,得到的线性方程为:y=0.9882x+0.0399,相关系数R2=0.9994,表明本发明的检测试剂测定霉酚酸临床标本的准确度高。
由于本发明的检测过程是由仪器全自动化完成,所以对检测人员的要求不高,易于实现和推广使用。
需要说明的是,以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂,包括:抗霉酚酸特异性抗体、用于检测抗霉酚酸特异性抗体-霉酚酸复合物的指示试剂;上述抗霉酚酸特异性抗体由霉酚酸免疫原免疫动物得到,霉酚酸免疫原的结构式如式(Ⅰ)所示:
式中,载体为具有免疫原性的蛋白质;上述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
2.根据权利要求1所述的一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂,其特征在于,上述指示试剂选自酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物;上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与霉酚酸衍生物反应形成。
3.根据权利要求2所述的霉酚酸均相酶免疫检测试剂,其特征在于,上述霉酚酸衍生物的结构式如式(Ⅱ)所示:
4.霉酚酸衍生物,结构式如式(Ⅱ)所示:
5.根据权利要求4所述的霉酚酸衍生物,其特征在于,合成路线为:
6.一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)权利要求3、4或5所述的霉酚酸衍生物的合成与纯化,并进行结构鉴定;
(2)霉酚酸免疫原的合成:使霉酚酸的末端羧基与具有免疫原性的蛋白质载体连接;
(3)用霉酚酸免疫原免疫动物,制备并纯化抗霉酚酸特异性抗体;
(4)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备:制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液,激活霉酚酸衍生物,使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与霉酚酸的末端羧基连接,纯化连接产物;
(5)霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备:
试剂A的制备:由抗霉酚酸特异性抗体和均相酶底物混合而成;
试剂B的制备:由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
7.根据权利要求6所述的一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的步骤(2)中,蛋白质载体为BSA,具体合成步骤如下:
a.称取2.72g磷酸二氢钾、4.26g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至7.4,制成缓冲溶液A;
b.称取3mg BSA,室温下溶解于3mL上述缓冲溶液A中,制成BSA溶液;
c.称取3mg霉酚酸衍生物,溶解于300ul上述缓冲溶液A中,制成霉酚酸衍生物溶液;
d.当上述霉酚酸衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述BSA溶液中,然后将此混合溶液在2-8℃下搅拌1小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为霉酚酸免疫原溶液,在霉酚酸免疫原溶液中加入质量分数0.1%的NaN3,于-20℃下储存。
8.根据权利要求6所述的一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的步骤(4)具体过程为:
a.称取1.09g磷酸二氢钾、1.70g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁,共同溶解于1L去离子水中,调节pH至7.4,制成缓冲溶液B;
b.称取3mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,室温下溶解于3mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3mg霉酚酸衍生物,溶解于300ul上述缓冲溶液B中,制成霉酚酸衍生物溶液;
d.当上述霉酚酸衍生物溶液刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在2-8℃下搅拌1小时;
e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液中加入质量分数0.5%的BSA和质量分数0.1%的NaN3,于2-8℃下储存。
9.根据权利要求6所述的一种霉酚酸均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,步骤(5)的具体过程如下:
试剂A的制备:将4.036g 11.25mM的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.711g 11.25mM的葡萄糖-6-磷酸用1L 55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;将制备的抗霉酚酸特异性抗体加到上述均相酶底物中,抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000;
试剂B的制备:将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中,上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
10.利用权利要求1至3任意一项所述的霉酚酸均相酶免疫检测试剂的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将待测样本与抗霉酚酸特异性抗体接触;
(2)根据待测样本中霉酚酸与抗霉酚酸特异性抗体的结合情况,利用指示试剂判断样本中霉酚酸的含量;
所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液;
所述的指示试剂选自酶试剂,包括:酶标偶联物和酶的底物;上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物;上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与霉酚酸衍生物反应形成。
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