CN105131105A - 皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法。本发明制备的皮质醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗皮质醇特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的皮质醇检测试剂，可以精确快速地确定尿液、血清、血浆等生物样品中的皮质醇含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低皮质醇检测成本，有利于临床大规模推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法。
背景技术
皮质醇(Hydrocortisone)，其结构式如式(Ⅲ)所示：
皮质醇又称氢化可的松，是肾上腺在应激反应中产生的一种甾体类激素。皮质醇是主要的糖皮质激素，参与人体内性激素代谢，并能影响机体糖、脂肪、蛋白质的代谢以及调节机体中水、电解质平衡等一系列生命活动。人体每日分泌皮质醇总量约为200mg，且分泌量根据每日时辰(24h)呈现明显的周期性变化。皮质醇分泌进入血液后，绝大部分与类固醇激素结合球蛋白(CBG)结合。血液中游离的皮质醇只占皮质醇总量的1％-3％，但只有游离的皮质醇才具有生物活性。通常游离皮质醇与结合皮质醇保持相对平衡，但在机体创伤、感染、运动、情绪激动等情况下其含量均有显著升高，肾上腺分泌皮质醇机能亢进或者低下也会产生特征性的临床表现。因此，在当前临床医学和药物学研究及实践中，测定皮质醇的水平已成为一项重要的指标。
目前，皮质醇的检测方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱联用法(LC/MS/MS)，放射免疫分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和酶联免疫分析法(ELISA)等。这些检测方法各有其优劣之处，但是在临床大规模应用上都有一定的局限性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的皮质醇检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂，因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的皮质醇测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的皮质醇衍生物制备免疫原性强的皮质醇免疫原及其抗体，用该抗体制备的皮质醇均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对皮质醇高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低皮质醇检测成本，有利于临床推广使用。
本发明的一个目的在于提供一种免疫原性强的皮质醇免疫原。
本发明的又一个目的在于提供一种用于形成皮质醇免疫原的皮质醇衍生物。
本发明的另一个目的在于提供一种皮质醇免疫原的制备方法。
本发明的又一个目的在于提供使用本发明皮质醇免疫原制备得到的特异性强的抗皮质醇特异性抗体。
本发明的再一个目的在于提供一种皮质醇检测试剂及其制备方法。
本发明的皮质醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗皮质醇特异性抗体。该抗体特异性高，与皮质醇的结合力强。由该抗体制备得到的皮质醇检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的皮质醇含量。本发明是通过以下技术方案实现的：
一种皮质醇免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：
载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白的一种。更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。
所述的皮质醇免疫原由皮质醇衍生物与上述载体连接而成。一种皮质醇衍生物，其化学结构如式(Ⅱ)所示：
皮质醇免疫原的制备方法，包括以下步骤：
(1)将载体蛋白100～300mg溶解于25～75ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；
(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg皮质醇衍生物、1.75～5.25ml二甲基甲酰胺、1.75～5.25ml乙醇、3.5～10.5ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、25～75mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；
(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到皮质醇免疫原。
一种抗皮质醇特异性抗体，为由皮质醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与皮质醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。
所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的皮质醇免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。优选为兔。
所述的抗皮质醇特异性抗体由上述制得的皮质醇免疫原采用常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清。抗皮质醇特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)用PBS将上述合成的BSA-皮质醇免疫原稀释至0.1～3.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
(2)2～3周后，再用0.5～5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3～6次；
(3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000～1:50000的抗皮质醇特异性抗体。
一种皮质醇检测试剂，含有所述的抗皮质醇特异性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种；所述的酶试剂由皮质醇酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
一种皮质醇检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2L55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将所述的抗皮质醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
(2)试剂B：将皮质醇酶标偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，皮质醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
所述的抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物的体积比优选为1:500；
所述的皮质醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1:2500。
所述的皮质醇酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：
(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgCl2和100mgNaCl的溶液中，pH＝9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇；再逐滴加入1～3mL二甲基亚砜；
(2)皮质醇衍生物的激活：在无水状态下称取5～15mg皮质醇衍生物，溶解于300～900μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2～-8℃；加入1.5～4.5μL三丁胺；加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；-2～-8℃搅拌30～60分钟；
(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与皮质醇衍生物的连接：将步骤(2)激活的皮质醇衍生物溶液逐滴加入到步骤(1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；
(4)纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
皮质醇均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置，所以将酶的底物与上述抗皮质醇特异性抗体混合在一起。
本发明的皮质醇免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗皮质醇特异性抗体特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗皮质醇特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定尿液、血清、血浆等生物样品中的皮质醇含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现皮质醇的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高，同时实现了检测过程的全自动化，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
附图说明
图1是皮质醇的ELISA检测反应曲线；
图2是皮质醇的均相酶免疫反应曲线；
图3是皮质醇均相酶免疫相关性分析图。
具体实施方式
实施例一皮质醇免疫原的合成
皮质醇免疫原由牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin，BSA)与式(Ⅱ)所示的皮质醇衍生物的基团连接而成，具体步骤如下：
1.将牛血清白蛋白200mg溶解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；
2.将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg皮质醇衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
3.将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到皮质醇免疫原。
实施例二：抗皮质醇特异性抗体的制备
将实施例一制备得到的皮质醇免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
1.用PBS将上述合成的皮质醇免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2.2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
3.对步骤2的实验动物兔取血，分离纯化得到效价为1:30000～1:50000的抗皮质醇特异性抗体。
实施例三：皮质醇的ELISA检验
1.皮质醇的ELISA检测标准曲线的建立
(1)标准品的制备
将皮质醇粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mmol/L的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为500.00nmol/L、250.00nmol/L、125.00nmol/L、62.50nmol/L、31.25nmol/L和0.00nmol/L的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mMTris，145mMNaCl和0.25％的BSA。
(2)利用皮质醇的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例二中所制备的抗皮质醇特异性抗体稀释成1:8000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用PBS将上述包被有抗皮质醇抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-皮质醇偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μLTMB底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如附图2所示。
2.待测样品中皮质醇含量的检测
(1)制作待测样品
制备方法：将皮质醇粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1mmol/L的储存液，并将此储存液稀释于空白尿液中，至终浓度分别为0.00，50.00，250.00，450.00nmol/L，形成空白、低、中、高浓度的尿液样本。该空白尿液为不含皮质醇的健康人尿液。
(2)测试方法
利用上述皮质醇的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的尿液样本代替标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的尿液样本在450nm的吸光值。
(3)测试结果
对照图1中所示的皮质醇的ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中皮质醇含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中皮质醇的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1皮质醇的ELISA检测回收实验
由表1中结果可知：采用本发明皮质醇的ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的皮质醇回收率都较高，均＞90％，说明本发明所述的抗皮质醇特异性抗体可以用于样本中皮质醇的检测，并且结果准确度高。
实施例四：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
(1)准确称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mgMgCl2(3.3mM)和100mgNaCl的溶液中，该溶液pH＝9.0，本步骤在烧杯C中进行。
(2)在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇(Carbitol)。
(3)在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethysulfoxide，DMSO)。
2.皮质醇衍生物的激活：
(1)在无水状态下称取10mg上述皮质醇衍生物，溶解于600μLDMF中。
(2)使上述溶液温度降到-2～-8℃。
(3)加入3μL三丁胺(tributylamine)。
(4)加入1.5μL氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate)。
(5)-2～-8℃搅拌30分钟。
3.G6PDH与皮质醇衍生物的连接：
(1)将上述激活的皮质醇衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。
(2)2-8℃搅拌过夜。
4.纯化产物：
通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3中的溶液，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
实施例五：皮质醇均相酶免疫检测试剂的制备
1.试剂A的制备：将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于烧杯D中，用1L55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将上述制备的抗皮质醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:500。
2.试剂B的制备：将实施例四制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:2500。
实施例六：皮质醇均相酶免疫检验及结果
1.获得标准曲线：
(1)设置迈瑞BS-480全自动生化分析仪反应参数(见表2)。
(2)操作步骤为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图3所示。
表2迈瑞BS-480全自动生化分析仪反应参数
2.样本检测：通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将皮质醇标准品溶解于人尿液中，至浓度分别为50.00，250.00，450.00nmol/L。检测数据及数据分析见表3。
表3样品测定及精密度和回收率评估
检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95％-105％，精密度高，CV均低于5％。
实施例七：药物干扰试验
选取62种常见药物进行干扰检测，调整浓度至1.00nmol/L，采用实施例六的均相酶免疫方法进行测定：
1.将待测干扰药物与实施例五制备的试剂A接触反应，再加入试剂B；
2.检测上述混合溶液的OD340吸光值，根据实施例六的标准曲线得到相应物质的浓度。
常见的62种药物名称以及测定结果具体参见表4。
表4常见干扰药物测定结果
测定结果显示：上述62种常见药物等价于皮质醇的浓度均小于0.01nmol/L。由此可见，本发明的抗体是抗皮质醇的特异性抗体，与其它药物无交叉反应。
实施例八：相关性分析
对100例临床标本分别使用Beckman(化学发光法)试剂和本发明的均相酶免疫试剂进行相关性分析，测定的数据参见表5。
表5临床样本测定值
对上述数据作图，参见图3，得到的线性方程为：y＝0.9835x+3.2603，相关系数R2＝0.9799，表明本发明的检测试剂测定皮质醇临床标本的准确度高。需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种皮质醇免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：
载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种。
2.一种皮质醇衍生物，其特征在于，其化学结构式如式(Ⅱ)所示：
3.一种如权利要求1所述的皮质醇免疫原的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将载体蛋白100～300g溶解于25～75ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；
(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg权利要求2所述的皮质醇衍生物、1.75～5.25ml二甲基甲酰胺、1.75～5.25ml乙醇、3.5～10.5ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、25～75mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，将上述化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；
(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到皮质醇免疫原。
4.一种抗皮质醇特异性抗体，为由权利要求1所述的皮质醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与皮质醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。
5.根据权利要求4所述的一种抗皮质醇特异性抗体，其特征在于所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的皮质醇免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。
6.一种如权利要求4-5中任一项所述的抗皮质醇特异性抗体的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)用PBS将皮质醇免疫原稀释至0.1～3.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
(2)2～3周后，再用0.5～5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3～6次；
(3)对步骤(2)的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000～1:50000的抗皮质醇特异性抗体。
7.一种皮质醇检测试剂，含有权利要求4或5所述的抗皮质醇特异性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种；所述的酶试剂由皮质醇酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
8.一种如权利要求7所述的皮质醇检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2L55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将权利要求4或5所述的抗皮质醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
(2)试剂B：将皮质醇酶标偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，皮质醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
9.根据权利要求8所述的皮质醇检测试剂的制备方法，其特征在于所述的皮质醇酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：
(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgCl2和100mgNaCl的溶液中，pH＝9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇；再逐滴加入1～3mL二甲基亚砜；
(2)皮质醇衍生物的激活：在无水状态下称取5～15mg皮质醇衍生物，溶解于300～900μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2～-8℃；加入1.5～4.5μL三丁胺；加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；-2～-8℃搅拌30～60分钟；
(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与皮质醇衍生物的连接：将步骤(2)激活的皮质醇衍生物溶液逐滴加入到步骤(1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；
(4)纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
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| CN107365342B (zh) * | 2017-07-17 | 2019-08-06 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法、试剂盒 |
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