CN104478813A - 5-氟尿嘧啶衍生物、5-氟尿嘧啶免疫原及其抗体与5-氟尿嘧啶检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种5-氟尿嘧啶衍生物、5-氟尿嘧啶免疫原及其抗体与5-氟尿嘧啶检测试剂盒。本发明的5-氟尿嘧啶衍生物具有式(Ⅰ)所示的结构：其中，R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。具有上述结构式的5-氟尿嘧啶衍生物与特定的载体相结合，使得所制备的5-氟尿嘧啶免疫原具有高免疫原性，其免疫动物所产生的抗体具有更强的灵敏度和特异性，与5-氟尿嘧啶的特异结合能力强。通过使用均相酶免疫检测技术能够实现在全自动生化分析仪上对5-氟尿嘧啶的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低5-氟尿嘧啶检测成本，有利于临床推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种5-氟尿嘧啶衍生物、5-氟尿嘧啶免疫原及其抗体与5-氟尿嘧啶检测试剂盒。
背景技术
5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)，其结构式如式(Ⅲ)所示：
5-氟尿嘧啶是尿嘧啶的类似物，是癌症治疗中最重要的化疗药物之一。通常用于结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌等各种癌症的化疗方案中。该药疗效确切，可以使合成DNA的胸腺嘧啶合成酶失活，也可掺入RNA中导致致死合成，5-FU在体内的代谢、清除与多种因素有关，药代动力学具有非线性和易饱和性的特点，毒性反应和疗效具有高度的个体内和个体间差异。5-FU常常伴随严重的副作用，包括骨髓抑制、粘膜炎、皮炎、恶心、呕吐、腹泻、心脏毒性甚至死亡。使用5-FU进行治疗的患者血药浓度的临床监测对于5-FU剂量调整、疗效优化和减少严重不良反应都具有重要的临床意义。
目前，国内外监测5-FU血药浓度主要使用的是高效液相色谱(HPLC)法等传统方法，但是这些方法不适合临床应用，国内虽然已有使用胶乳增强免疫比浊法，可应用于生化分析仪的5-氟尿嘧啶测定试剂盒上市，但是远不能满足日益增长的临床检测需求。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的5-氟尿嘧啶检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂，因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的5-氟尿嘧啶测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种5-氟尿嘧啶衍生物、5-氟尿嘧啶免疫原及其抗体与5-氟尿嘧啶检测试剂盒，以提供一种稳定性好、特异性强，适用于全自动生化分析的5-氟尿嘧啶测定试剂。
为了达到上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种5-氟尿嘧啶衍生物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
其中，R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。具有该结构的5-氟尿嘧啶衍生物具备制备成具有免疫原性的免疫原的基本结构，为制备新的5-氟尿嘧啶检测试剂提供了结构基础。在本发明中，优选当n＝1时的5-氟尿嘧啶衍生物，此时，R为-CH2-COO-。
根据本发明的再一方面，还提供了一种5-氟尿嘧啶免疫原，具有式(Ⅱ)所示的结构式：
其中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n是1至20之间的整数，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。包括5-氟尿嘧啶衍生物分子结构和具有免疫原性的蛋白质或多肽的本发明的5-氟尿嘧啶免疫原，免疫原性高，能够刺激动物机体产生免疫应答，产生高效价的抗5-氟尿嘧啶特异性抗体，且具有很强的反应原性，适合作为体外检测5-氟尿嘧啶含量的竞争性试剂。
上述5-氟尿嘧啶免疫原上的载体，由于免疫原性载体一般是蛋白质或多肽，理论上其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但通常情况下选用蛋白质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。在本发明中，上述载体包括但不仅限于血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的任意一种。血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白作为载体，具有相对较高的免疫原性，能够使上述5-氟尿嘧啶免疫原具有较高的免疫原性。本发明中，更优选为血清蛋白，血清蛋白来源广泛、简单易得且免疫原性高。
根据本发明的又一种方面，提供了一种5-氟尿嘧啶免疫原的制备方法，该5-氟尿嘧啶免疫原由上述5-氟尿嘧啶衍生物与载体连接而成，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。通过上述方法制备得到的5-氟尿嘧啶衍生物与具有免疫原性的蛋白质或多肽连接在一起，即可得到本发明的上述5-氟尿嘧啶免疫原，操作简单，且得到的5-氟尿嘧啶免疫原的免疫原性强。
上述5-氟尿嘧啶免疫原的制备方法中，还提供了一种上述5-氟尿嘧啶衍生物的制备方法，上述5-氟尿嘧啶衍生物由5-氟尿嘧啶与Br-(CH2)n-COOH在碱性条件下发生取代反应得到。通过以5-氟尿嘧啶和Br-(CH2)n-COOH为原料，经简单的取代反应即可制备得到上述5-氟尿嘧啶衍生物，为后续得到本发明的5-氟尿嘧啶免疫原提供了物质基础。进一步地，当n＝1时，上述5-氟尿嘧啶衍生物的制备步骤如下：
上述5-氟尿嘧啶衍生物的制备过程选用2-溴乙酸为合成原料，得到连接基团R为-CH2-COO-的5-氟尿嘧啶衍生物的。2-溴乙酸与Br-(CH2)n-COOH仅是n数值的不同，两者上述制备得到5-氟尿嘧啶衍生物的方法步骤完全相同。
上述5-氟尿嘧啶免疫原的制备方法中，5-氟尿嘧啶衍生物与载体连接的步骤可以根据所连接的载体的不同进行适当调整。在本发明中，该步骤包括：步骤S1，制备载体溶液和5-氟尿嘧啶衍生物溶液；步骤S2，将5-氟尿嘧啶衍生物溶液滴加至载体溶液中，得到5-氟尿嘧啶免疫原粗品；步骤S3，对免疫原粗品进行纯化，得到5-氟尿嘧啶免疫原。本发明的制备步骤通过简单的滴加、纯化步骤即可得到目标产物，制备方法简单、工艺稳定性高、可重复性好。
在上述制备载体连接步骤中，步骤S1包括：步骤S11，将载体溶解于0.15～0.25M，pH 8.2～8.7的磷酸钠缓冲液中，得到载体溶液；步骤S12，将5-氟尿嘧啶衍生物与8～12mM，pH 4.8～5.3的磷酸钾缓冲液和有机溶剂混合，得到混合物；步骤S13，对混合物进行搅拌，得到5-氟尿嘧啶衍生物溶液。在制备载体溶液的步骤中，采用上述浓度和上述pH值范围内的磷酸缓冲液既能较彻底地溶液载体，又能保持载体的结构和性质稳定而具有免疫原性。而在制备5-氟尿嘧啶衍生物溶液的步骤中，采用浓度在8～12mM，pH在4.8～5.3范围内的磷酸钾缓冲液能够保持5-氟尿嘧啶衍生物溶液的生物稳定性；采用有机溶剂能够促进其溶解。
在上述步骤S11中，对载体与磷酸钠缓冲液的质量体积比并不特殊要求，只要根据所选择的载体的种类的不同而能够使所选载体溶解即可。在本发明中，优选载体与磷酸钠缓冲液的质量体积比(mg:ml)为3:1～5:1，在该范围内，载体溶解得较为充分；更优选为4:1，载体能更充分地溶解。
在上述步骤S12中，对有机溶剂的选择也无特殊要求，所有能够促进5-氟尿嘧啶衍生物溶解的有机溶剂均适用于本发明。在本发明中，优选上述有机溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺。上述有机溶剂相互配合，对促进5-氟尿嘧啶衍生物的溶解和激活5-氟尿嘧啶衍生物的连接基团具有协同促进作用。
在上述步骤S12中，5-氟尿嘧啶衍生物与1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为1：0.8～1.1：0.20～0.30；二甲基甲酰胺与乙醇和磷酸钾缓冲液的体积比为1：0.8～1.1：1.8～2.2；优选5-氟尿嘧啶衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇和磷酸钾缓冲液的总体积的质量体积比为95～105：6～8。
上述5-氟尿嘧啶衍生物溶液的制备步骤中，将5-氟尿嘧啶衍生物与1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比控制在1：0.8～1.1：0.20～0.30范围内，；将二甲基甲酰胺与乙醇和磷酸钾缓冲液的体积比控制在1：0.8～1.1：1.8～2.2范围内；以及将5-氟尿嘧啶衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇和磷酸钾缓冲液的总体积的质量体积比控制在95～105：6～8范围内，三者相互配合优化，能够使5-氟尿嘧啶衍生物更充分地溶解，并且将5-氟尿嘧啶衍生物的连接基团更高效地激活，使连接基团与载体连接的效率更高。
在上述步骤S13中，搅拌能够促进5-氟尿嘧啶衍生物的溶解，搅拌在室温下进行即可。具体的搅拌的时间根据所溶解的5-氟尿嘧啶衍生物的量的多少进行合理调整。在发明中，搅拌的时间为20～40min。
在本发明的上述5-氟尿嘧啶免疫原的制备方法中，对5-氟尿嘧啶衍生物与载体的质量比无特殊要求，只要能够高效地连接形成具有高免疫原性的5-氟尿嘧啶免疫原即可。在本发明中，优选两者的质量比为0.8～1.1：0.8～1.1，将两者的质量比控制在上述接近1:1的范围内，能够提高连接效率。
在本发明的上述5-氟尿嘧啶免疫原的制备方法中，上述步骤S2中包括：步骤S21，将5-氟尿嘧啶衍生物溶液滴加至载体溶液中，得到混合溶液；步骤S22，对混合溶液进行低温搅拌，得到免疫原粗品；其中，低温搅拌的温度为2～8℃，低温搅拌的时间大于等于24h。滴加能够促进5-氟尿嘧啶衍生物与载体的充分反应，而在低温下搅拌，是为了使陆续生成的目标产物保持其特有的物化活性，低温下稳定性好。
上述制备方法的步骤S3中，只要在保证5-氟尿嘧啶免疫原物化稳定性的前提下，任何能够使其纯度提高的方法都适用于本发明。在本发明中，包括但不限于采用透析的方式对5-氟尿嘧啶免疫原粗品进行纯化，得到5-氟尿嘧啶免疫原。透析的方式简单且纯化效果好。
根据本发明的再一个方面，提供了一种抗体，该抗体由免疫原免疫动物后得到，其中免疫原为上述提到的任意一种免疫原。由于上述免疫原具有很强的免疫原性，使得免疫动物后，刺激动物机体产生的抗体特异性强、敏感度高，与5-氟尿嘧啶的结合力强。
本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体蛋白质分子，也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体多肽片断或其衍生物。本发明的抗体可以是为多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过现有技术制备得到。获得多克隆抗体的典型方法是使用单一的免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制备。
根据本发明的又一方面，还提供了一种5-氟尿嘧啶检测试剂，包括抗5-氟尿嘧啶特异性抗体、5-氟尿嘧啶酶标偶联物和酶的底物，其中，抗5-氟尿嘧啶特异性抗体为上述任一种抗5-氟尿嘧啶特异性抗体；5-氟尿嘧啶酶标偶联物由酶和半抗原偶联形成，半抗原为上述5-氟尿嘧啶衍生物。本发明的上述试剂，由于抗5-氟尿嘧啶特异性抗体的特异性强，与5-氟尿嘧啶的结合力强，检测灵敏度远高于现有技术中的相应产品。优选的，上述酶标偶联物为葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物及采用葡萄糖-6-磷酸作为酶的底物的检测试剂可以方便、准确地确定样品中的5-氟尿嘧啶含量，适用于高通量的自动化检测。
根据本发明的又一方面，还提供了一种5-氟尿嘧啶检测试剂盒，含有上述抗5-氟尿嘧啶特异性抗体以及检测抗5-氟尿嘧啶特异性抗体与5-氟尿嘧啶结合而形成的复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指示试剂由5-氟尿嘧啶酶标偶联物和酶的底物所组成，可以方便、准确地确定样品中的5-氟尿嘧啶含量，适用于高通量的自动化检测。
需要说明的是，本发明的5-氟尿嘧啶衍生物和抗5-氟尿嘧啶抗体可以单独应用于5-氟尿嘧啶的检测中，也可以同时应用，具体可根据检测目的的不同进行合理选择。
应用本发明的技术方案，本发明所提供的5-氟尿嘧啶衍生物所制备得到的5-氟尿嘧啶免疫原，具有高免疫原性，所免疫诱导的动物所产生的抗体特异性高，与5-氟尿嘧啶的特异结合能力强。可以通过使用均相酶免疫检测技术实现在全自动生化分析仪上对5-氟尿嘧啶的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低5-氟尿嘧啶检测成本，有利于临床推广使用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例六中5-氟尿嘧啶的ELISA检测反应曲线；以及
图2示出了根据本发明的实施例七中5-氟尿嘧啶均相酶免疫反应曲线。
具体实施方式：
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例一：5-氟尿嘧啶衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的5-氟尿嘧啶衍生物化学结构如式(Ⅳ)所示：
该式(Ⅳ)所示5-氟尿嘧啶衍生物的合成路线如下：
式(Ⅳ)所示的5-氟尿嘧啶衍生物的合成步骤如下：
1)称取5g(38.5mmol)化合物15-氟尿嘧啶、6.95g(50.3mmol)2-溴乙酸和4.48g(80.0mmol)KOH共同溶解于50mL水中，然后将此溶液在60℃下搅拌过夜；将此反应物用HCl调节pH值至pH＝5，然后进行过滤；将过滤得到的固体物质用水洗涤后进行真空干燥，最终获得2g白色固体状的5-氟尿嘧啶衍生物，产率27.6％。
2)对上述所得纯化产物进行结构鉴定：
a.利用Varian III plus 300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用四甲基硅烷(TMS)作为内标。结果如下：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.37(s，2H)，8.09-8.11(d，1H)，11.91-11.92(d，1H)，13.23(br，1H)。表征为式(Ⅳ)所示的5-氟尿嘧啶衍生物。
b.利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的衍生物进行分析鉴定，确定该最终所得化合物为式(Ⅳ)所示的5-氟尿嘧啶衍生物。
本实施例中，是在n＝1时，选用了2-溴乙酸为合成原料，故所得的最终产物5-氟尿嘧啶衍生物的链接基团R为-CH2-COO-；当n取其他2-20间的整数时，选用其它与2-溴乙酸相对于的n的溴取代的有机酸进行实验时，除n取值不同外，合成方法完全一致。制备得到的5-氟尿嘧啶衍生物同样经过上述核磁检测和LCMS分析鉴定，均符合与n对应的5-氟尿嘧啶衍生物。
实施例二：BSA-5-氟尿嘧啶衍生物免疫原的合成
BSA-5-氟尿嘧啶免疫原由牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)与式(Ⅰ)所示的5-氟尿嘧啶衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝1为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
将牛血清白蛋白(200mg)溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；
将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的5-氟尿嘧啶衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、220mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在4℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到BSA-5-氟尿嘧啶免疫原。
实施例三：KLH-5-氟尿嘧啶衍生物免疫原的合成
KLH-5-氟尿嘧啶免疫原由血蓝蛋白(KLH)与式(Ⅰ)所示的5-氟尿嘧啶衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝2为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
将血蓝蛋白(180mg)溶解于60ml 0.15M，pH 8.7的磷酸缓冲液中；
将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的5-氟尿嘧啶衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、2.8ml乙醇、6.3ml 12mM，pH 4.8的磷酸钾缓冲液、160mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、40mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应25min；
将溶解好的溶液滴加至KLH溶液中，并在2℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到KLH-5-氟尿嘧啶免疫原。
实施例四：甲状腺球蛋白-5-氟尿嘧啶衍生物免疫原的合成
甲状腺球蛋白-5-氟尿嘧啶免疫原由甲状腺球蛋白与式(Ⅰ)所示的5-氟尿嘧啶衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝5为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
将甲状腺球蛋白(220mg)溶解于49ml 0.25M，pH 8.2的磷酸缓冲液中；
将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：180mg合成的5-氟尿嘧啶衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、3.85ml乙醇、7.7ml 8mM，pH 5.3的磷酸钾缓冲液、245mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、60mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应40min；
将溶解好的溶液滴加至甲状腺球蛋白溶液中，并在8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到甲状腺球蛋白-5-氟尿嘧啶免疫原。
类似的，n取1～20范围内的其他整数时，对上述参数进行适当调整，用同样的方法可以制备出如式(Ⅱ)所示的5-氟尿嘧啶免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。
本发明上述实施例中仅提供连接基团R为-(CH2)n-COO-，且n＝1、2和5的5-氟尿嘧啶衍生物的合成实施例并进行了相关后续实验，由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，而且本发明的连接基团结构简单，无支链，不会对小分子的5-FU造成干扰，将其连接在特定的连接位点上，与特定的载体进行连接所形成的5-氟尿嘧啶免疫原，具有免疫原性强的优点。因此，经实验验证，在n取1至20之间的任意其他整数时，实验结果并无显著差异，使用不同n值的5-氟尿嘧啶衍生物制备的5-氟尿嘧啶免疫原均具备强免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有优异性能。
实施例五：抗5-氟尿嘧啶特异性抗体的制备
将上述制得的BSA-5-氟尿嘧啶免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的BSA-5-氟尿嘧啶免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与1.0ml弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
对上述实验动物兔取血，分离纯化得到抗血清。利用常规的抗体效价测定方法，以无抗体的空白血清作为对照，将抗血清稀释一定倍数后进行ELISA检测，最终检测得到本发明的抗5-氟尿嘧啶特异性抗体的效价为1:30000-1:50000，表明本发明所制备的抗体的特异性强、灵敏度高。
实施例六：5-氟尿嘧啶ELISA检验
采用上述实施例五中所制得的抗体进行5-氟尿嘧啶的ELISA检验，该检验是利用竞争性免疫分析法来测定液体样本中的5-氟尿嘧啶含量。
样本中的5-氟尿嘧啶与偶联的式(Ⅳ)所示的5-氟尿嘧啶衍生物(HRP-5-氟尿嘧啶衍生物酶偶联物)竞争结合包被在酶联板中抗体上的有限位点。如果液体样本中几乎没有或没有5-氟尿嘧啶，HRP酶偶联的5-氟尿嘧啶衍生物就会与酶标板中的抗体结合。相反的，如果液体样本中含有大量或一定数量的5-氟尿嘧啶，那么酶-5-氟尿嘧啶衍生物偶联物就会减少与抗体的结合，从而使显色信号减弱。因此，检验产生的吸光度与液体样本中的5-氟尿嘧啶含量成反比。具体实验步骤如下：
1.5-氟尿嘧啶ELISA检测标准曲线的建立
(1)标准品的制备
将5-氟尿嘧啶粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为250.00ng/mL、200.00ng/mL、150.00ng/mL、100.00ng/mL、50.00ng/mL和0.00ng/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mM Tris，145mM NaCl和0.25％的BSA。
(2)利用5-氟尿嘧啶的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例五中所制备的抗5-氟尿嘧啶抗体稀释成1:8000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用PBS将上述包被有抗5-氟尿嘧啶抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-5-氟尿嘧啶偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μL TMB底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如附图1所示。
2.待测样品中5-氟尿嘧啶含量的检测
(1)制作待测样品
制备方法：将5-氟尿嘧啶粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1μg/mL的储存液，并将此储存液稀释于空白全血中，至终浓度分别为0.00，20.00，100.00，200.00ng/mL，形成空白、低、中、高浓度的全血样本。该空白全血为不含5-氟尿嘧啶的健康人血液。
(2)测试方法
利用上述5-氟尿嘧啶的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的全血样本代替标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的全血样本在450nm的吸光值。
(3)测试结果
对照图1中所示的5-氟尿嘧啶ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中5-氟尿嘧啶含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中5-氟尿嘧啶的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1：5-氟尿嘧啶的ELISA检测回收实验
由表1中结果可知：采用本发明5-氟尿嘧啶ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的5-氟尿嘧啶回收率都较高，均＞90％，说明本发明所述的抗5-氟尿嘧啶特异性抗体可以用于样本中5-氟尿嘧啶的检测，并且结果准确度高。而且，从抗体的稀释比例和检测样本的最低浓度值，表明本发明的抗体灵敏度高。
实施例七：5-氟尿嘧啶均相酶免疫检验
采用制得的抗体进行5-氟尿嘧啶的均相酶免疫检验(Homogeneous Enzyme Immunoassay)。
该检验是一种竞争性反应，反应体系中与抗体结合的5-氟尿嘧啶和游离的5-氟尿嘧啶不需要通过固相来分离。该检验的基本原理是，液体样本中游离的5-氟尿嘧啶与偶联在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH)上的5-氟尿嘧啶衍生物对特异性抗体的结合位点进行竞争。液体样本中的5-氟尿嘧啶竞争性的取代与抗体结合的5-氟尿嘧啶酶偶联物，并使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使酶恢复活性。因此，液体样本中5-氟尿嘧啶的含量越多，游离的5-氟尿嘧啶衍生物-G6PDH酶偶联物就越多，从而能得到更强的信号。具体实验步骤如下：
1.获得标准曲线：设置迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数(见表2)，操作过程为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图2所示。
表2：迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数
2.通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将5-氟尿嘧啶标准品溶解于人血清中，至浓度分别为0.80、5.00，15.00μg/ml。检测数据及数据分析见表3。
表3：样品测定及精密度和回收率评估
3.检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95％-105％，精密度高，CV均低于5％。
实施例八：药物干扰试验
选取62种常见化合物和药物进行干扰检测，调整浓度至10.0μg/ml，利用均相酶免疫方法进行测定，根据标准曲线得到相应物质的浓度。常见的62种化合物与药物名称以及测定结果具体参见表4。
表4：常见干扰药物测定结果
测定结果：上述62种常见化合物和药物等价于5-氟尿嘧啶的浓度均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗5-氟尿嘧啶的特异性抗体。
从以上的描述中，可以看出，本发明所提供的5-氟尿嘧啶衍生物所制备得到的5-氟尿嘧啶免疫原，具有高免疫原性，所免疫诱导的动物所产生的抗体特异性高，与5-氟尿嘧啶的特异结合能力强，在体外检测中，稳定性好且灵敏度高，使用均相酶免疫检测技术可以实现在全自动生化分析仪上对5-氟尿嘧啶的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低5-氟尿嘧啶检测成本，有利于临床推广使用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种5-氟尿嘧啶衍生物，其特征在于，具有式(Ⅰ)所示的结构式：
其中，R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
2.一种5-氟尿嘧啶免疫原，其特征在于，具有式(Ⅱ)所示的结构式：
其中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n是1至20之间的整数，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；优选所述载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的任意一种。
3.一种5-氟尿嘧啶免疫原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
制备权利要求1所述的5-氟尿嘧啶衍生物：以及
将所述5-氟尿嘧啶衍生物与载体进行连接，得到所述5-氟尿嘧啶免疫原；
其中，所述载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述5-氟尿嘧啶衍生物由5-氟尿嘧啶和Br-(CH2)n-COOH在碱性条件下经取代反应制备而成；优选地，当n＝1时，所述5-氟尿嘧啶衍生物的制备步骤如下：
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述5-氟尿嘧啶衍生物与所述载体连接的步骤包括：
步骤S1，制备载体溶液和5-氟尿嘧啶衍生物溶液；优选所述载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的任意一种；
步骤S2，将所述5-氟尿嘧啶衍生物溶液滴加至所述载体溶液中，得到5-氟尿嘧啶免疫原粗品；
步骤S3，对所述免疫原粗品进行纯化，得到所述5-氟尿嘧啶免疫原；优选所述纯化采用透析的方式进行。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
步骤S11，将所述载体溶解于0.15～0.25M，pH 8.2～8.7的磷酸钠缓冲液中，得到所述载体溶液；其中，所述载体与所述磷酸缓冲液的质量体积比为3:1～5:1，优选为4:1；
步骤S12，将所述5-氟尿嘧啶衍生物与8～12mM，pH 4.8～5.3的磷酸钾缓冲液和有机溶剂混合，得到混合物；其中，所述有机溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
优选所述5-氟尿嘧啶衍生物与所述1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为1：0.8～1.1：0.20～0.30；所述二甲基甲酰胺与所述乙醇和所述磷酸钾缓冲液的体积比为1：0.8～1.1：1.8～2.2；更优选所述5-氟尿嘧啶衍生物与所述二甲基甲酰胺、所述乙醇和所述磷酸钾缓冲液的总体积的质量体积比为95～105：6～8；
步骤S13，对所述混合物在室温下进行搅拌20～40min，得到所述5-氟尿嘧啶衍生物溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中包括：
步骤S21，将所述5-氟尿嘧啶衍生物溶液滴加至所述载体溶液中，得到混合溶液；
步骤S22，对所述混合溶液进行低温搅拌，得到所述免疫原粗品；
其中，所述5-氟尿嘧啶衍生物与所述载体的质量比为0.8～1.1：0.8～1.1；所述低温搅拌的温度为2～8℃，所述低温搅拌的时间大于等于24h。
8.一种抗5-氟尿嘧啶抗体，所述抗5-氟尿嘧啶抗体由免疫原免疫动物后得到，其特征在于，所述免疫原为权利要求2所述的5-氟尿嘧啶免疫原。
9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
10.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述抗体为完整的蛋白或者能够与所述免疫原特异性结合的多肽片段。
11.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述免疫原免疫的所述动物包括兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中任意一种。
12.一种5-氟尿嘧啶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的5-氟尿嘧啶衍生物和/或权利要求8至11中任一项所述的抗5-氟尿嘧啶抗体。
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