CN103760348B - 一种甘胆酸免疫检测试剂及其制备和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种甘胆酸检测试剂及其制备和检测方法，具体涉及一种甘胆酸免疫检测试剂及其制备和检测方法，包括：抗甘胆酸特异性抗体、用于检测抗甘胆酸特异性抗体-甘胆酸复合物的指示试剂；上述抗甘胆酸特异性抗体由甘胆酸免疫原免疫动物得到。本发明的有益之处在于：本发明的甘胆酸免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗甘胆酸特异性抗体特异性强、效价高，并且与常见的45种药物无任何交叉反应；含有上述抗甘胆酸特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的甘胆酸含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现甘胆酸的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。

Description

一种甘胆酸免疫检测试剂及其制备和检测方法
技术领域
本发明涉及一种甘胆酸检测试剂及其制备和检测方法，具体涉及一种甘胆酸均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法。
背景技术
甘胆酸(Cholylglycine，CG)结构式如（III）所示：
式(III)
甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，由肝细胞合成，同胆汁进入肠道，经门静脉再回肝脏，当肝细胞受损时，肝细胞摄取甘胆酸能力下降，致使血中含量增加，因此，甘胆酸是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。研究显示，肝硬化、肝癌、急性肝炎和慢性活动性肝炎等肝病患者的甘胆酸含量明显高于正常人，甘胆酸也是检测胆汁郁积和早期酒精肝损伤的重要指标，同时甘胆酸的检测对孕妇妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）的诊断具有重要的临床意义。
目前，体外定量测定甘胆酸主要使用放射免疫分析法（RIA），化学发光免疫分析法（CLIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。放射免疫法需要有专业放免设施，普通实验室难以开展，且放免法准确度低，放射性射线还会对操作人员的健康产生极大的危害，国际上已很少使用。化学发光法灵敏度较高，但是测定速度较慢，测试结果的准确度和试剂稳定性较差，而且需要昂贵的专用化学发光检测设备，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。酶联免疫法一般用于半定量测定，且操作繁琐，检测时间长，自动化程度低，重复性较差，不利于广泛应用于临床检验。
目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强的甘胆酸检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。
均相酶免疫检测法，以其检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，开始得到越来越多的关注。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中甘胆酸含量的甘胆酸均相酶免疫检测试剂及其制备方法，以及可以与各种类型的自动生化分析仪联用、对检测人员要求不高的甘胆酸均相酶免疫检测方法。
为了实现上述目标，本发明采用的技术方案是：
一种甘胆酸免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗甘胆酸特异性抗体、用于检测抗甘胆酸特异性抗体-甘胆酸复合物的指示试剂；上述抗甘胆酸特异性抗体由甘胆酸免疫原免疫动物得到，甘胆酸免疫原的结构式如式（I）所示：
式(I)
式中，R为连接基团-(CH2)n-O-CH2-COO-，n为1至20之间的任意整数，载体具有免疫原性的蛋白质，载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；上述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
前述的甘胆酸免疫检测试剂，R为-(CH2)2-O-CH2-COO-。
前述的甘胆酸免疫检测试剂，上述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
前述的甘胆酸免疫检测试剂，上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与甘胆酸衍生物偶联形成，上述甘胆酸衍生物的结构式如式（II）所示：
式(II)
上述R为-(CH2)n-O-CH2-COO-，n为1至20之间的整数。
前述的甘胆酸免疫检测试剂，上述R为-(CH2)2-O-CH2-COO-。
一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）甘胆酸衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定；
（2）甘胆酸免疫原的合成：使甘胆酸衍生物的-(CH2)n-O-CH2-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，n为1至20之间的整数；
（3）用甘胆酸免疫原免疫动物，制备并纯化抗甘胆酸特异性抗体；
（4）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活甘胆酸衍生物，使G6PDH与甘胆酸衍生物连接，纯化连接产物；
（5）甘胆酸均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂A的制备：由抗甘胆酸特异性抗体和均相酶底物混合而成；
试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
前述的一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，所述的步骤（2）中，蛋白质载体为BSA，n=2，具体合成步骤如下：
1）将20mg BSA溶解于5ml0.2M、pH8.5的PBS中，上述溶液置于烧杯A中；
2）将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg甘胆酸衍生物、0.35ml二甲基酰胺DMF、0.35ml乙醇、0.7ml10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液、40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
3）将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-甘胆酸免疫原，储存于-20℃。
前述的一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，所述的步骤（4）具体过程为：
1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）溶液的制备：
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg（0.05M）Tris、8mg MgCl2（3.3mM）和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH=9.0；
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇；
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜；
2)甘胆酸衍生物的激活
a）在无水状态下称取10mg甘胆酸衍生物，溶解于600μL DMF中；
b）使上述溶液温度降到-2～-8℃；
c）加入3μL三丁胺；
d）加入1.5μL氯甲酸异丁酯；
e)-2～-8℃搅拌30分钟；
2)G6PDH与甘胆酸衍生物的连接
a)将上述激活的甘胆酸衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；
b)2-8℃搅拌过夜；
4）纯化产物
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
前述的一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，步骤（5）的具体过程如下：
试剂A的制备：将4.036g（11.25mM）氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g（11.25mM）葡萄糖-6-磷酸G6P用1L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将制备的抗甘胆酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
利用甘胆酸免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将待测样本与抗甘胆酸特异性抗体接触；
2）根据待测样本中甘胆酸与抗甘胆酸特异性抗体的结合情况，
利用指示试剂判断样本中甘胆酸的含量；
所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。
本发明的有益之处在于：本发明的甘胆酸免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗甘胆酸特异性抗体特异性强、效价高，并且与常见的45种药物无任何交叉反应；含有上述抗甘胆酸特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的甘胆酸含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现甘胆酸的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高，同时实现了检测过程的全自动化，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
附图说明
图1是甘胆酸均相酶免疫反应标准曲线图；
图2是甘胆酸均相酶免疫相关性分析图。
具体实施方式
本发明所采取的技术方案是：
甘胆酸免疫原，其结构式如式（I）所示：
式(I)
式中，R为连接基团，可以是-(CH2)n-O-CH2-COO-，n为1至20之间的整数，特别的，R为-(CH2)2-O-CH2-COO-；载体具有免疫原性，优选的，载体为具有免疫原性的蛋白质。虽然其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但通常情况下选用蛋白质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。
一种抗甘胆酸特异性抗体，由式（I）所示的甘胆酸免疫原免疫动物得到。
本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子，也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
获得多克隆抗体的方法是使用式（I）所示的甘胆酸免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。
单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制作。
一种甘胆酸均相酶免疫检测试剂，包括：上述抗甘胆酸特异性抗体、用于检测抗甘胆酸特异性抗体-甘胆酸复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，其可通过化学合成方法得到。
上述甘胆酸均相酶免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
1）将待测样本与上述抗甘胆酸特异性抗体接触；
2）根据待测样本中甘胆酸与上述抗甘胆酸特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中甘胆酸的含量。
待测样本为各种生理样本，例如血清、血浆、尿液、唾液等。优选的，待测样本为血清或血浆。
下面结合具体的实施例，进一步说明本发明。
实施例一：甘胆酸衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的甘胆酸衍生物化学结构如式（IV）所示：
式(IV)
该甘胆酸衍生物的合成路线如下：
甘胆酸衍生物
具体的合成步骤如下：
化合物3的合成
1）称取10.0g（24.5mmol）化合物1胆酸，将化合物1溶解于100mL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，室温下加入7.04g（36.7mmol）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、4.96g（36.7mmol）羟基苯并三氮唑（HOBT）和10.7mL（61.2mmol）二异丙基乙胺（DIEA），再加入3.07g（24.5mmol）化合物2甘氨酸，搅拌4小时，得到合成溶液；
2）将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，通过减压方法使溶剂蒸发，最后得到9.38g白色固体化合物3，即甘氨胆酸，产率80%。
化合物4的合成
1）称取8.27g（17.2mmol）化合物3溶解于90mL的吡啶中，0℃下加入2.37g（20.7mmol）甲基磺酰氯（MsCl），将此溶液在室温下搅拌1小时，得到合成溶液。
2）将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，通过减压方法使溶剂蒸发，最后得到6.67g白色固体化合物4，产率81%。
化合物5的合成
1）称取10.0g（18.0mmol）化合物4溶解于100mL的吡啶中，室温下加入20mL的乙二醇，将此反应混合液加热至110℃过夜。
2）将上述反应混合液除去溶剂，残留物用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过FCC（DCM/MeOH=30/1）方法纯化得到1.33g白色固体化合物5粗品，产率11%。
化合物7的合成
1）称取100mg（0.191mmol）化合物5和64mg（0.21mmol）碳酸铯（Cs2CO3），共同悬浮于5mL的无水二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴条件下加入41mg（0.21mmol）化合物6（溴乙酸叔丁酯），室温下搅拌反应过夜。
2）将上述反应液用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过FCC（DCM/MeOH=35/1）方法纯化得到15mg黄色固体化合物7，产率12%。
甘胆酸衍生物的合成
1）称取80mg（0.13mmol）化合物7溶解于5mL的二氯甲烷（DCM）中，冰浴条件下加入1mL三氟乙酸（CF3COOH），室温下搅拌反应2小时。
2）将上述反应液除去溶剂后用1N的氢氧化钠（NaOH）调节pH值至9.0，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取。将水相用1N的盐酸（HCl）调节pH值至6.0，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取。
3）使用卤水冲洗有机层，加入Na2SO4干燥，浓缩得到65mg无色固体产物，即式（IV）所示的甘胆酸衍生物，产率89%，纯度>95%。
对上述无色固体纯化产物进行结构鉴定
1、利用Bruker Avance III plus400MHz和VARIAN MERCURYplus300M对上述无色固体化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(400MHz,CD3OD):δ4.61(s,2H),4.27(t,J=5.2Hz,2H),3.95(s,1H),3.90(s,2H),3.79(s,1H),3.71(s,3H),3.60-3.61(m,3H),2.14-2.43(m,4H),1.73-1.92(m,6H),1.55-1.65(m,7H),1.28-1.45(m,7H),1.03(d,J=6.4Hz,3H),0.92(s,3H),0.71(s,3H)。表征为式（IV）所示的甘胆酸衍生物。
2、利用色谱/质谱技术（LCMS）对得到的衍生物进行分析鉴定，采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：Symmetry C18(50×4.6mm,5μm)，柱温为30℃，流速为1.5mL/min，检测波长为214nm，流动相为5-60%乙腈-0.02%NH4OAc。LCMS结果显示：纯度>95%；保留时间3.637min。
综合上述结果，可以确定该无色固体化合物为式（IV）所示的甘胆酸衍生物。
实施例二：BSA-甘胆酸免疫原的合成
BSA-甘胆酸免疫原由牛血清白蛋白BSA与式（IV）所示的甘胆酸衍生物的-(CH2)n-O-CH2-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n=2为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
1)将20mg BSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS）中，上述溶液置于烧杯A中；
2)将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg甘胆酸衍生物，0.35ml二甲基酰胺（dimethylformamide，DMF），0.35ml乙醇，0.7ml10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液。40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS），于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析（4×4L）纯化，得到BSA-甘胆酸免疫原，储存于-20℃。
类似的，n取1～20范围内的其他整数时，用同样的方法可以制备出如式（I）所示的甘胆酸免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。
本发明仅公开了连接基团R为-(CH2)n-O-CH2-COO-，且n=2的甘胆酸衍生物的合成实施例并进行了相关后续实验，由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的甘胆酸衍生物分子结构及所选载体种类有关，因此理论上n取1至20之间的任意整数时，实验结果并无显著差异，使用不同n值的甘胆酸衍生物制备的甘胆酸免疫原均具备强免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有优异性能。
实施例三：抗甘胆酸特异性抗体的制备
将上述制得的BSA-甘胆酸免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的BSA-甘胆酸免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
对上述实验动物兔取血，分离纯化得到抗甘胆酸特异性抗体，经测定，该抗甘胆酸特异性抗体的效价为1:30000。
实施例四：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）溶液的制备：
1）准确称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg（0.05M）Tris、8mg MgCl2（3.3mM）和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH=9.0，本步骤在烧杯C中进行。
2）在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇（Carbitol）。
3）在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethysulfoxide，DMSO)。
1）甘胆酸衍生物的激活
1）在无水状态下称取10mg上述甘胆酸衍生物，溶解于600μLDMF中。
2）使上述溶液温度降到-2～-8℃。
3）加入3μL三丁胺（tributylamine）。
4）加入1.5μL氯甲酸异丁酯（isobutylchloroformate）。
5）-2～-8℃搅拌30分钟。
2）G6PDH与甘胆酸衍生物的连接
1）将上述激活的甘胆酸衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。
2）2-8℃搅拌过夜。
3）纯化产物
通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3)中的溶液，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
实施例五：甘胆酸均相酶免疫检测试剂的制备
甘胆酸均相酶免疫检测试剂，包括：上述抗甘胆酸特异性抗体，用于检测抗甘胆酸特异性抗体-甘胆酸复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，其通过上述化学合成方法得到。
甘胆酸均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是分开放置的，不混合，所以将酶的底物与上述抗甘胆酸特异性抗体混合在一起。也就是说，甘胆酸均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂，具体如下：
1.试剂A的制备：将4.036g（11.25mM）氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g（11.25mM）葡萄糖-6-磷酸G6P置于烧杯D中，用1L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将上述制备的抗甘胆酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:400。
2.试剂B的制备：将上述制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:1500。
上述甘胆酸均相酶免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
1）将待测样本与上述抗甘胆酸特异性抗体接触；
2）根据待测样本中甘胆酸与上述抗甘胆酸特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断待测样本中甘胆酸的含量。
具体的，检测时，将待测样本加到试剂A中，待测样本中的甘胆酸与试剂A中的抗甘胆酸特异性抗体发生特异性结合，生成抗甘胆酸特异性抗体-甘胆酸复合物；再加入试剂B，此时试剂B中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与试剂A中的酶的底物混合、接触，发生酶促反应，构成检测抗甘胆酸特异性抗体-甘胆酸复合物的指示试剂，指示试剂根据待测样本中甘胆酸与上述抗甘胆酸特异性抗体的结合情况判断待测样本中甘胆酸的含量。
由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与待测样本中的甘胆酸竞争性结合抗甘胆酸特异性抗体，所以，待测样本中甘胆酸的量越多，均相酶溶液中游离的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的量越多，酶促反应越快，导致OD340上升。
上述待测样本为生理样本，例如血清、血浆、尿液、唾液等。
作为一种优选的方案，上述待测样本为血清或血浆。
实施例六：甘胆酸均相酶免疫检验
1、获得标准曲线：设置迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数（见表1），操作过程为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图1所示。
表1迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数
通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将甘胆酸标准品溶解于人血清中，至浓度分别为1.20，5.00，30.00μg/ml。检测数据及数据分析见表2。
表2样品测定及精密度和回收率评估
血液样品 低 中 高
样品浓度(μg/ml) 1.20 5.00 30.00
1 1.23 5.25 31.90
2 1.19 5.14 30.45
3 1.25 4.97 29.16
4 1.15 5.23 32.39
5 1.18 5.29 31.07
6 1.27 5.12 30.52
7 1.25 5.05 30.25
8 1.17 5.15 28.98
9 1.20 5.09 31.03
10 1.26 4.94 30.41
平均值(μg/ml) 1.22 5.12 30.62
标准差（SD） 0.0422 0.1154 1.0637
精密度（CV%） 3.46 2.25 3.47
回收率% 101.7 102.4 102.1
检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95%-105%，精密度高，CV均低于4%。
实施例七：药物干扰试验
选取45种常见药物，调整浓度至10.0μg/ml，进行干扰试验测定。常见的45种药物以及测定结果具体参见表3。
表3常见干扰药物
测定结果：上述45种常见药物等价于甘胆酸的浓度均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗甘胆酸的特异性抗体。
实施例八：相关性分析
对包括81例阳性标本和24例阴性标本在内的105例临床标本分别使用雅培的放射免疫法和本发明的均相酶免疫法进行相关性分析，测定的数据参见表4。
表4真实样本测定值
对上述数据作图，参见图2，得到的线性方程为：y=0.995x+0.1105，相关系数R2=0.9993，表明本发明的检测试剂测定的甘胆酸临床标本准确度高。
由于本发明的检测过程是由仪器全自动化完成，所以对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种甘胆酸免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗甘胆酸特异性抗体、用于检测抗甘胆酸特异性抗体-甘胆酸复合物的指示试剂；上述抗甘胆酸特异性抗体由甘胆酸免疫原免疫动物得到，甘胆酸免疫原的结构式如式(I)所示：
式中，R为连接基团-(CH2)n-O-CH2-COO-，n为1至20之间的任意整数，载体为具有免疫原性的蛋白质，载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；上述指示试剂选自酶试剂；
酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
2.根据权利要求1所述的甘胆酸免疫检测试剂，其特征在于，R为-(CH2)2-O-CH2-COO-。
3.根据权利要求1所述的甘胆酸免疫检测试剂，其特征在于，上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与甘胆酸衍生物偶联形成，上述甘胆酸衍生物的结构式如式(II)所示：
上述R为-(CH2)n-O-CH2-COO-，n为1至20之间的整数。
4.根据权利要求3所述的甘胆酸免疫检测试剂，其特征在于，上述R为-(CH2)2-O-CH2-COO-。
5.一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)权利要求3所述的甘胆酸衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定；
(2)甘胆酸免疫原的合成：使甘胆酸衍生物的-(CH2)n-O-CH2-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，n为1至20之间的整数；
(3)用甘胆酸免疫原免疫动物，制备并纯化抗甘胆酸特异性抗体；
(4)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活甘胆酸衍生物，使G6PDH与甘胆酸衍生物连接，纯化连接产物；
(5)甘胆酸均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂A的制备：由抗甘胆酸特异性抗体和均相酶底物混合而成；
试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
6.根据权利要求5所述的一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，蛋白质载体为BSA，n＝2，具体合成步骤如下：
1)将20mg BSA溶解于5ml 0.2M、pH 8.5的PBS中，上述溶液置于烧杯A中；
2)将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg甘胆酸衍生物、0.35ml二甲基酰胺DMF、0.35ml乙醇、0.7ml 10mM pH 5.0的磷酸钾缓冲液、40mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-甘胆酸免疫原，储存于-20℃。
7.根据权利要求5所述的一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)具体过程为：
1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mg MgCl2(3.3mM)和100mgNaCl的溶液中,该溶液pH＝9.0；
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇；
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜；
2)甘胆酸衍生物的激活
a)在无水状态下称取10mg甘胆酸衍生物，溶解于600μL DMF中；
b)使上述溶液温度降到-2～-8℃；
c)加入3μL三丁胺；
d)加入1.5μL氯甲酸异丁酯；
e)-2～-8℃搅拌30分钟；
3)G6PDH与甘胆酸衍生物的连接
a)将上述激活的甘胆酸衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；
b)2-8℃搅拌过夜；
4)纯化产物
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
8.根据权利要求5所述的一种甘胆酸免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤(5)的具体过程如下：
试剂A的制备：将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸G6P用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将制备的抗甘胆酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
9.利用权利要求1至4任意一项所述的甘胆酸免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测样本与抗甘胆酸特异性抗体接触；
2)根据待测样本中甘胆酸与抗甘胆酸特异性抗体的结合情况，
利用指示试剂判断样本中甘胆酸的含量；
所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液；
指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
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