CN105385612A - 产朊假丝酵母菌、其组合物和应用 - Google Patents
产朊假丝酵母菌、其组合物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株新的产朊假丝酵母菌，含该菌的益生菌剂组合物以及产朊假丝酵母菌和其益生菌剂组合物在棉粕发酵和含氨氮废液处理中的应用。本发明还提供制备发酵饲料益生菌剂组合物的方法。本发明还提供了通过紫外线诱变育种筛选获得高氨氮同化率和高棉酚降解率酵母菌突变株的方法。本发明提供的产朊假丝酵母菌氨氮同化率高，降解棉酚能力强，发酵菌体生物量和蛋白质含量高。采用该菌株处理含氨氮废液可以有效降低氨氮含量，并可形成饲用菌体蛋白；采用含该菌株的益生菌剂及其组合物发酵棉粕，可显著降低棉粕中有毒物棉酚的含量，提高粗蛋白含量和水溶性蛋白含量，并可部分替代豆粕用于饲养动物。
Description
发明所属领域：
本发明属于生物饲料及生物环保领域，具体地说，本发明涉及产朊假丝酵母菌、含该菌的发酵菌剂组合物，及该酵母菌和其组合物在饲料发酵和废液处理中的应用。
背景技术：
产朊假丝酵母(Candidautilis)是经美国FDA认证为可作为食品添加剂的安全生物(GRAS)，在我国可作为安全的食品或活性饲料添加剂使用。产朊假丝酵母可生产谷胱甘肽(卫功元，等.过程工程学报，2005,5(3)：327-331)、酵母抽提物等风味物质(叶茂,等.食品工业科技，2014,25(33)：223-225)等物质，广泛用于食品和制药业。产朊假丝酵母富含蛋白质和B族维生素，还被用作牲畜、家禽类饲料蛋白。
酵母菌转化非蛋白氮(如尿素或铵盐)的能力是体现酵母菌生物转化能力的重要指标，不同菌株转化非蛋白氮的能力不同。产朊假丝酵母具有较强的转化无机氮为有机氮的能力，可以利用尿素和铵态氮作为氮源，还能够以各种废弃物为原料生产食用蛋白质，如麸皮、糖蜜、马铃薯淀粉废水(Ge1inasetal.，BioresourTechnology，2007，98(5)：1138—1143)、乳酸等多种有机酸(高卫卫,等.生物技术，2008年18(5)：58-60)等，在发酵饲料及废水处理等领域均具有广泛的应用前景。何东东等(食品科学，2009,30(21)：210-213)通过对产朊假丝酵母菌的紫外诱变，筛选获得蛋白质含量为33％的诱变菌株。陈佳,等(饲料工业，2013，34(5)：53-55)试验以产朊假丝酵母为出发菌株，味精废水、玉米粉和麸皮为底物，固态发酵生产饲料酵母，结果表明：味精废水作为廉价的非蛋白氮原料，可用于产朊假丝酵母固态发酵的生产中，具有很好的经济效益和开发潜力。
棉粕是我国仅次于大豆粕的第二大植物蛋白资源,但由于棉粕中含主要有毒物质棉酚会对动物生长发育和繁殖等产生严重的不良影响,也间接影响到人类健康,极大地限制了棉籽饼粕在饲料工业上的大规模应用。棉酚脱毒方法主要有物理脱毒法、化学钝化法、溶剂浸出法和生物脱毒法等。近几年利用微生物发酵棉粕以降低其中游离棉酚含量的脱毒方法越来越受到重视，主要是由于微生物发酵法在降低游离棉酚含量的同时还可以提高棉籽饼粕的营养价值，如改善蛋白质品质和消化率等(夏新成等.复合发酵棉籽粕营养价值及活性产物分析研究，中国粮油学报,2012,25(2)：96-100)；聂存喜等.棉籽粕源发酵蛋白质饲料的代谢产物研究，动物营养学报,2012，24(8):1602-1609)。
目前报道的以棉粕为主要发酵底物，可降解棉酚的微生物主要包括酵母菌、霉菌和细菌等。不同的研究者报道的微生物对棉粕中棉酚的去除率差异很大，最高的可达90％以上(吴小月等.利用微生物降解棉仁饼粕中游离棉酚的研究，中国农业科学，1989,22(2)：82-86；林海晶等.诱变选育棉籽粕高效脱毒菌株，浙江大学学报(农业与生命科学版),2011,37(3):252-258)，低的仅为50％左右(刘建成等.高效降解棉粕中游离棉酚菌种的筛选，饲料工业,2012，33(1)：29-31；马珍等.粪肠球菌发酵生棉粕的工艺条件优化，食品与发酵工业，2013,39(5):94-98)。这主要与发酵前棉粕原料是否经过高温灭菌处理和采用的发酵菌种及其组合不同有关。高温灭菌本身可使游离棉酚与蛋白质和氨基酸等结合而形成结合棉酚，使游离棉酚含量显著下降。不同微生物菌种脱毒的效果有明显差异(杨霞，翁晓燕，郭建林等.棉酚降解菌株的分离、筛选及鉴定，棉花学报，2010，(6)：539-546)。孙中超等(微生物学通报,2011,38(8):1166-1171)报道了1株高效降解棉酚的毕赤酵母菌株(Pichiaguilliermondii)，不进行湿热处理条件下,经接种发酵后脱毒率达到58％。程福亮等(饲料广角，2012,14:22-23)利用产朊假丝酵母对经高温高压处理后的棉粕进行固体发酵脱毒，结果显示棉粕在发酵前后，棉酚去除率在85.7％左右。乔晓艳等(中国油脂，2013,38(5)：30-33)利用热带假丝酵母JD－9和干酪乳杆菌MX－48发酵棉粕，达到改善棉粕饲用品质的目的。结果表明:发酵后棉粕中游离棉酚含量从发酵前520mg/kg降低至270mg/kg，脱毒率达到48.1％；周慧林等(武汉轻工大学，2014，,33(1):14-16)通过比较不同酵母茵在以醋酸棉酚为唯一碳源的固体培养基上的生长状况，筛选出一株在醋酸棉酚培养基中生长较好的产朊假丝酵母1087。以产朊假丝酵母1087为接种剂，以棉粕和红薯渣等为主要原料的固体发酵试验，结果表明，发酵后的样品粗蛋白含量提高了37.4％，棉酚含量下降了55.6％。
地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌均为我国农业部于2013年公布的“饲料添加剂品种目录”中可在饲料中添加的微生物。地衣芽孢杆菌以其耐高温、耐酸碱、抗逆性强、易贮存等特点被广泛作为益生菌或致病菌竞争性抑制剂应用于畜禽养殖业中。该菌在生长过程中，可分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多种有助于消化吸收的酶类，在降低和消除抗营养因子上也发挥了重要作用(张菊,等.中国饲料，2012年，17：9-11)。植物乳杆菌等乳酸菌作为人和动物体内的正常菌群具有调节肠道、促进消化等功能，被认为是生产益生菌剂的理想菌种，常应用于牛奶等食品以及饲料的发酵菌剂(金桩等.粮食与饲料工业，2010(3)：37－40)。这两种细菌均有被报道与其他微生物混合用于发酵棉粕，但其发酵效果不尽相同。徐晶等(中国油脂，2012年，37(7)：16-19)研究了微生物固态生料发酵对棉籽粕中游离棉酚和蛋白质含量变化的影响，结果表明，单菌棉籽粕固态发酵实验中地衣芽孢杆菌Bl2脱毒效果最佳，脱毒率为42.7％，水溶性蛋白含量8.2％，混菌组合发酵中，地衣芽孢杆菌Bl2+产朊假丝酵母Cu1为最佳组合，其脱毒率为50.03％，水溶性蛋白含量为9.11％，混菌发酵效果优于单菌发酵。张庆华等(饲料工业,2007,28(18)：37-38)报道了3菌株协同固态发酵对棉粕脱毒效果及其生物活性的影响，结果表明,3菌株混合培养可显著降低棉粕底物中游离棉酚含量,其最佳工艺条件为:热带假丝酵母:拟内孢霉:植物乳杆菌配比为3:2:1；棉粕:玉米粉:麸皮比为6:2:2时,棉粕的去除率为85.30％。而杨宇等(湖北农业科学，2013，52(15)：3596-3597)报道利用筛选出的黑曲霉、酵母、植物乳杆菌和芽孢杆菌的混合益生菌群在成熟的发酵条件下发酵湖北棉粕和菜粕，结果表明，湖北棉粕经过发酵处理后，原料里的游离棉酚含量反而升高了129.15％。不同菌种组合发酵处理棉籽粕，其脱毒效果也会产生很大的差异(叶明强等，中国饲料，2009,15:8-14)。
中国专利CN201010218533公开了一种用于难降解废水处理的复合高效微生物制剂；中国专利CN200310107801公开了一种微生物氨氮调节剂；中国专利CN201210329933本发明公开了一种提高棉粕蛋白含量并可脱毒的生物发酵法；中国专利CN201110102144公开了用复合菌种发酵分解棉粕中棉酚的方法；中国专利CN201310440055公开了一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法；中国专利CN201410248620公开了用复合菌加复合酶发酵棉粕降解棉酚的方法；中国专利CN200810044216公开了一种混合发酵处理酒糟等饲料原料的方法；中国专利CN201110161862公开了一种反刍动物微生态添加剂及其制备工艺。
目前，国内在开发非常规蛋白饲料如发酵棉粕的工艺中往往添加部分硫酸铵或尿素等非蛋白氮，期望通过酵母菌发酵将其转化为动物可利用的菌体蛋白，增加发酵饲料的蛋白质含量，同时，通过微生物发酵作用降低棉籽粕中有毒物质棉酚的含量。这就要求发酵棉粕生产上应用的酵母菌株应同时具备较强的非蛋白氮转化能力和较强的降解棉酚的能力。目前已报道的产朊假丝酵母菌株存在的不足之处是功能比较单一。曹玉飞等(武汉轻工大学学报，2015:34(2)：1-5)报道了从假丝酵母和酿酒酵母等4个属共56株耐高温酵母菌中筛选获得1株氨氮同化率达81.1％的产朊假丝酵母(C.utilis)SG607，但该菌株存在的不足是对棉酚的降解能力不强，对氨氮的同化率处于低水平。目前尚未见到同时具备对氨氮同化能力和棉酚降解能力均很高的野生型产朊假丝酵母或其突变株的报道。
单一酵母菌株用于发酵棉粕等蛋白饲料时所产生的水溶性蛋白含量有限，对提升饲料的营养价值不利。组合菌种混合发酵存在的问题是菌种的匹配不恰当、混合菌种中单一菌种的功能性不强或混合比例不当，往往导致发酵棉粕效果不佳或存在安全性问题。
发明技术内容：
本发明的一个目的是提供一种新的产朊假丝酵母菌株，该菌株对氨氮的同化率高，对棉酚的降解效果好，使用该菌株能够处理含氨氮的有机废液生产饲料酵母菌体蛋白，能够发酵棉粕脱毒并高效利用非蛋白氮生产高蛋白饲料。
本发明的另一个目的是提供一种含有产朊假丝酵母的益生菌剂组合物。
本发明的再一个目的是提供产朊假丝酵母在发酵含氨态氮等非蛋白氮的棉粕中的应用。
本发明的再一个目的是提供制备含产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌的益生菌剂组合物的方法。
本发明的再一个目的是提供含有产朊假丝酵母的益生菌剂组合物在棉粕发酵中的应用。
本发明公开了一株新的产朊假丝酵母菌，由经土壤分离产朊假丝酵母(C.utilis)SG607诱变产生，其特征在于,该菌株为产朊假丝酵母SG60765(CandidautilisSG60765),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:2015718。保藏日期是2015年12月3日。中国典型培养物保藏中心位于湖北省武汉市武昌区武汉大学校内，电话：027-68752319，EMAIL：cctccwhu.edu.cn.在本发明公开后，第三方研究者可依法从保藏机构获取菌种再现本发明的技术内容。
产朊假丝酵母SG60765株从湖北土壤分离并经紫外线诱变筛选获得。该菌株有如下特征：
产朊假丝酵母SG60765株形态特征是：在YPD固体培养基上生长1～2d，菌落为乳白色，奶酪状，表面光滑、较湿润，在YPD液体培养基中37℃下培养12～14h，细胞呈球形，卵形或椭圆型，大小为(2.2～5.0)μm×(2.5～5.5)μm。
产朊假丝酵母SG60765株生化特征是：可发酵利用蔗糖，半乳糖，海藻糖，麦芽糖，木糖，乳糖，纤维二糖、棉子糖。
产朊假丝酵母SG60765株同化氨氮能力特征是：37℃下，在含160mg/L的氨氮的培养基中，SG60765对氨氮的同化率达94.2％，分别是酿酒酵母CCTCCAY92003和产朊假丝酵母1807的2.6倍和1.6倍。表明酵母菌SG60765对氨氮的同化能力好。
产朊假丝酵母SG60765株降解棉酚能力特征是：37℃下，在含60.84mg·Kg-1棉酚的棉粕中，SG60765对棉酚的降解率达93.4％，分别比酿酒酵母CCTCCAY92003和产朊假丝酵母1807降解率高54.8％和23.7％，表明酵母菌SG60765对棉酚的降解能力好。
对产朊假丝酵母SG60765株进行26SrDNA的PCR扩增与测序实验，分析显示：菌株SG60765与CandidautilisIFO10707的26SrDNA的同源性达到了99％，确定菌株SG60765为一种产朊假丝酵母。
本发明还公开了一种含产朊假丝酵母SG60765株的益生菌剂组合物，该益生菌剂组合物主要成份是产朊假丝酵母SG60765株及胞外产物。
优先地，本发明还公开了一种含产朊假丝酵母SG60765株益生菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份(按活菌数比计)：
产朊假丝酵母60％
地衣芽孢杆菌20％
植物乳杆菌20％
其中产朊假丝酵母为CCTCCNO:2015718，地衣芽胞杆菌为ACCC19372,植物乳杆菌为CICC20765。
地衣芽胞杆菌为ACCC19372和植物乳杆菌为CICC20765均为常用普通微生物菌种，分别登载于中国农业微生物菌种保藏管理中心和中国工业微生物菌种保藏管理中心的菌种目录中，处于公开状态，科学工作者可向这两家菌种保藏中心索取。
本发明公开的益生菌剂组合物为液态或固态。优先的，本发明公开的益生菌剂组合物为固态。
本发明还公开了制备固态SG60765益生菌剂及其组合物的方法，该方法包括如下步骤：包括如下步骤：
(1)菌种活化：接种产朊假丝酵母SG60765株于灭菌液体培养基中，28～37℃摇床培养18-24小时，液体培养基组成是葡萄糖3％，酵母膏1％，蛋白胨1％，余量是双蒸水；
(2)固体培养：将活化培养的酵母菌液按10％质量比混合接种固体培养基后装盒，保持室温30℃左右，品温35℃左右，培养2天发酵，固体培养基的配制是将麸皮96％、红糖4％，用水润料至含水率40％，蒸煮冷散后；
(3)低温干燥：对发酵后的固体样品在45℃进行低温干燥处理，样品含水率低于12％后，进行包装得到SG60765益生菌剂；
(4)将制备好的SG6076益生菌剂按重量比计，加入地衣芽孢杆菌20％和植物乳杆菌剂20％后包装，得到含SG60765益生菌的组合菌剂，其中地衣芽胞杆菌为ACCC19372,植物乳杆菌为CICC20765。
本发明还公开了产朊假丝酵母SG60765株在发酵棉粕中的应用。
本发明也公开了产朊假丝酵母SG60765株在含氨氮废液处理中的应用。
本发明的优点：
1、本发明提供的产朊假丝酵母SG60765株是一株新通过诱变育种获得的突变菌株，该菌株具有很高氨氮同化能力,比工业上常用的1807菌株氨氮的同化力高1.6倍；比其出发菌株SG607氨氮的同化力高12.1％。
2、产朊假丝酵母SG60765株具有很强的降解棉酚的能力，比工业上常用的1807菌株棉酚降解率高36.1％；比其出发菌株SG607棉酚降解率高13.2％。
3、产朊假丝酵母SG60765株具有很高的生物量，液体培养条件下，比产朊假丝酵母ACCC20060菌株的生物量高1.4倍。
4、产朊假丝酵母SG60765株用于含氨氮的棉粕进行生料发酵时，该菌株对氨氮的同化率和对棉酚的降解率均达到90％以上，表现出了优良的综合性能，克服了目前市场上酵母菌株功能较单一的缺点，在生产上具有明显的优势。
5、含朊假丝酵母SG60765株的组合菌剂用于发酵棉粕时，发酵棉粕的水溶蛋白含量比用单一菌剂发酵时有明显提高。即产朊假丝酵母SG60765株具有较强的氨氮同化率、棉酚降解率和较高的生物量的能力，其组合菌剂不仅较强的氨氮同化率和棉酚降解能力，还具有较强的提高发酵棉粕水溶性蛋白的能力。
附图说明
图1.产朊假丝酵母SG60765株26SrDNAD1/D2区序列***发育树
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1产朊假丝酵母高氨氮同化率、高棉酚降解率突变株SG60765的选育及鉴定
1.1产朊假丝酵母高氨氮同化率突变株SG6076的选育
以产朊假丝酵母SG607为出发菌株，将紫外照射后的SG607菌悬液经过适当稀释后涂布到YPD固体培养基上，待其菌落比较明显时，从中挑出饱满、大而圆的菌落接种到YPD固体培养基上，待其长出单菌落后，转接到装有7mLYPD液体培养基的25mL培养瓶中，在37℃170rpm条件下摇床培养5h，将培养好的各酵母菌液定量移入96孔板中，用酶标仪在波长620nm处，测定其OD值。从中挑出OD值较大的20株菌株，编号为1号-20号菌株，进行进一步复筛，每个菌株3个重复。共获得5株氨氮同化率比出发菌株有显著提高的突变株，其中编号为6号的突变株的氨氮同化率最高达93.2％，比出发菌株的氨氮同化率提高了12.1％，将该突变株命名为SG6076(见表1)。
表15株突变菌株的氨氮同化能力的测定结果
1.2产朊假丝酵母高棉酚降解率突变株SG60765的选育
为了获得同时具备高氨氮同化率和高棉酚降解率的优良酵母菌株，本发明根据微生物基因突变相互独立的原理，对获得的高氨氮同化率突变株SG6076进行第二次紫外线诱变并采用高通量筛选方法，从中筛选出对棉酚具有高降解率的突变株。具体方法为：以SG6076为出发菌株，将紫外照射后的SG6076菌液经过适当的稀释，然后涂布在醋酸棉酚固体培养基上，避光培养24h后，挑出饱满、大而圆的菌落，经活化后，接种于盛有10mL含1000mg·L-1醋酸棉酚的培养基中，在37℃、170rpm条件下摇床培养5h，取200μL的菌液到无菌的96孔板中，在波长620nm处，用酶标仪测定OD620值。通过OD620值大小进行初筛，共获得4株比出发菌株OD值明显增大的突变株(表2)。将这4株突变株和出发菌株活化后，以10％的接种量进行接种，发酵条件为水分42％、温度37℃、时间36h，进行固体棉粕发酵，通过测定其对棉酚的降解率进行复筛。由表3可以看出，65号突变株的棉酚降解率最高达为93.6％，比出发菌株提高了11.5％。将65号突变株命名为编号为SG60765。
表24株突变株对棉酚降解能力比较
本发明人将通过两次紫外诱变选育的一株新的产朊假丝酵母SG60765株(CandidautilisSG60765)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:2015718。保藏日期是2015年12月3日。中国典型培养物保藏中心位于湖北省武汉市武昌区武汉大学校内，电话：027-68752319，EMAIL：cctccwhu.edu.cn.
1.3产朊假丝酵母SG60765株的鉴定
通过形态特征观察、生理生化测定及26SrDNAD1/D2区域基因序列分析结果对SG60765进行鉴定。在鉴定中，本实验选择安琪耐高温酿酒酵母TRADY、产朊假丝酵母CICC1807作为对照菌株。酿酒酵母CCTCCAY92003为常用普通微生物菌种，登载于中国典型培养物保藏中心目录；产朊假丝酵母CICC1807来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，已上目录,公开状态，科学工作者可索取。
1.3.1产朊假丝酵母SG60765株形态特征观察
在YPD固体培养基上生长1d-2d，菌落为饱满圆形，中心略突出，乳白色，奶酪状，表面光滑，湿润，粘连，易挑取。在YPD液体培养基培养12h-14h，细胞呈椭圆形，略圆，部分细胞首尾相接在一起，呈典型的假丝状，大小为(2.5-3.5)μm×(6.5-8.5)μm。
1.3.2通过26SrDNAD1/D2区域序列分析进行***发育地位鉴定
以酵母菌株的基因组DNA为模板做PCR扩增反应，扩增酵母菌株26SrDNAD1/D2区域，扩增引物采用通用引物NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和NS4(5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3')。
PCR反应体系(25μL)：10×PCR缓冲液(含20mmol/L的Mg2+)2.5μL，引物NS1/NS4(10μmol/L)各1μL，模板DNA(约50ng/mL)1.8/2.8μL，dNTP(10mmol/Leach)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，双蒸水18/17μL。
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸5min。所得PCR产物送上海生工生物工程纯化并测序，测序引物用上述NL1、NL4。
通过分子测序后，发现菌株SG60765与CandidautilisIFO10707的26SrDNA的同源性达到了99％，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株间差异不超过1％的标准，确定菌株SG60765为一种产朊假丝酵母。图1是根据26SrDNAD1/D2区域序列所做的***发育树。
1.3.3产朊假丝酵母SG60765株的生理生化实验测定结果
SG60765菌株对糖的利用结果见表3。SG60765菌株对蔗糖等6种糖均能利用。
表3产朊假丝酵母SG60765不同碳源的发酵试验结果
实施例2.产朊假丝酵母SG60765对氨氮的同化能力及处理高氨氮含量废液的效果分析
2.1不同酵母菌株氨氮同化率的比较结果
将SG60765等7株酵母菌种子液以5％的接种量分别转接到3个独立的装有100mL酵母菌发酵培养基的250mL三角瓶中，在37℃170rpm条件下摇床发酵24h，测定发酵液上清氨氮含量，比较不同酵母菌株对氨氮的同化率，结果如表4所示，突变株SG6076比其出发菌株SG607的氨氮同化率提高了13.1％，突变株SG6076与SG60765之间对氨氮同化率无明显差异。
热带假丝酵母CICC1254为购于中国工业微生物菌种保藏管理中心菌种库的一株用于发酵生产饲料酵母的菌株。产朊假丝酵母ACCC20060为购于中国农业微生物菌种保藏管理中心菌种的一株用于发酵生产饲料酵母的菌株。酿酒酵母CCTCCAY92003为常用普通微生物菌种，登载于中国典型培养物保藏中心目录，处于公开状态，科学工作者可向中国典型培养物保藏中心索取。
表4不同酵母菌株氨氮同化率的比较
2.2不同酵母菌株处理高氨氮含量废液的效果分析
选取以上3株高氨氮同化率的产朊假丝酵母SG60765、SG607和ACCC20060进行高氨氮含量废液的发酵放大实验，此次发酵采用3L三角瓶中装1L高氨氮含量的培养液。按10％体积比接种量分别接种各酵母菌液于含氨氮240.0mg·L-1的废液中，37℃170rpm条件下摇床培养24h后，于4000rpm、5min离心，收集菌体，105℃烘干、称重，并测定菌体粗蛋白含量。由表5可以看出，SG60765在扩大培养条件下对氨氮同化率有了进一步的提高，达到96.6％，分别比SG607和ACCC20060菌株的氨氮同化率高10.2％和15.9％。与SG607和ACCC20060相比，SG60765的生物量和粗蛋白含量均较高，分别达到3.83g·L-1和51.0％。相同发酵条件下，SG60765酵母菌体的生物量是ACCC20060菌株生物量的1.4倍。
表5不同酵母菌株处理高氨氮含量废液的效果比较
实施例3.SG60765菌株发酵降解棉粕中棉酚及同化氨氮的能力分析
将酿酒酵母CCTCCAY92003、热带假丝酵母CICC1254；产朊假丝酵母CICC1807、ACCC20060、SG607、SG6076、SG60765共7株酵母分别活化后，按接种量10％分别接种添加1％硫酸铵的棉粕进行固态生料发酵试验比较，发酵条件为：发酵料起始水分42％、发酵温度37℃、发酵时间36h。用凯氏定氮法和液相色谱法分别测定发酵前后棉粕中的氨氮和棉酚含量，并计算各菌株的氨氮同化率和棉酚降解率。实验测定棉粕原料的棉酚含量为60.84mg·Kg-1。由表6可以看出，产朊假丝酵母SG60765对棉酚的降解率最高达93.4％，分别比酿酒酵母CCTCCAY92003和产朊假丝酵母1807降解率高54.8％和23.7％，比其出发菌株SG6076高10.0％，而SG60765突变株对氨氮的同化率与SG6076相似，表明该突变株在获得了高棉酚降解能力的同时仍保留了其高氨氮同化能力的性状。同一产朊假丝酵母不同菌株之间如CICC1807和ACCC20060对棉酚的降解能力也存在显著差异。
表6不同酵母菌株对氨氮同化率和棉酚降解率的比较
实施例4SG60765菌株与地衣芽孢杆菌及植物乳杆菌按不同比例混合发酵棉粕
效果比较
将地衣芽孢杆菌ACCC19372、产朊假丝酵母SG60765和植物乳杆菌为CICC20765活化后，分别以活菌数比例为3：1：0、2：1:0、1：1:0、1：2:0、1：3:0和1：3:1进行混合接种发酵，棉粕发酵条件为水分42％、温度37℃、时间36h。由表7可以看出，随着混合菌种中酵母菌的接种量不断增大，棉酚降解率不断升高，当地衣芽孢杆菌ACCC19372和产朊假丝酵母SG60765接种比例为1:3时，棉酚降解率达到最高，为91.3％。表明产朊假丝酵母SG6076对棉酚的降解作用大于地衣芽孢杆菌。当组合菌剂中添加植物乳杆菌即ACCC19372：SG60765:CICC20765为1:3:1时，发酵棉粕的棉酚降解率达91.5％，而发酵料的pH值由6.0降至5.0，表明含有植物乳杆菌的组合菌剂未明显降低棉酚的降解率，但可显著增加发酵棉粕的酸度，这有利于增加饲料的适口性和储存时间。
表7SG60765与地衣芽孢杆菌不同混合比例对棉酚降解率的影响
实施例5SG60765益生菌剂及其组合物的制备方法
5.1菌种活化：接种产朊假丝酵母SG60765株于灭菌液体培养基(葡萄糖3％，酵母膏1％，蛋白胨1％)中，28～37℃摇床培养18-24小时；
5.2固体培养：固体培养的配料是：麸皮96％，红糖4％，用水润料至含水率40％，蒸煮冷散后，将5.1活化培养2种酵母菌液按10％接种量体积比混合接种后装盒，保持室温30℃左右。品温35℃左右，培养2天发酵完毕；
5.3低温干燥：对发酵后的固体样品在45℃进行低温干燥处理，样品含水率低于12％后，进行包装得到SG60765益生菌剂；
5.4将制备好的SG60765益生菌剂分别按一定比例添加地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌剂后包装，即得到含SG60765益生菌的组合菌剂；
5.5酵母菌制剂组合物测定结果：采用稀释平板测定实验室制备的益生菌剂组合物中产朊假丝酵母菌活菌数达到15亿/g左右。产朊假丝酵母SG60765：ACCC19372：CICC20765活菌数比例是6：2：2。
实施例6SG60765单株发酵菌剂及其组合物在发酵棉粕中的应用
6.1SG60765单株发酵菌剂及其组合物用于棉粕发酵试验结果
将SG60765单一发酵菌剂及其组合物分别以2％的接种量接种于水分为40％的100Kg的固体棉粕中，生料发酵40h后，于烘箱60℃烘干后粉碎。由表8中数据可知，采用单一菌剂和组合菌剂发酵棉粕后粗蛋白含量分别增加了7.25％和7.61％，棉酚降解率分别为90.16％和90.21％，水溶性蛋白分别为9.89％和12.45％。采用组合菌剂发酵的棉粕比单一菌剂发酵的棉粕的水溶性蛋白含量提高了25.88％，表明组合菌剂在增加棉粕的水溶性蛋白方面具有明显优势。发酵后的棉粕均具有很浓的酵母香味，可增加饲料的适口性。
表8单一菌剂和组合菌剂发酵棉粕的效果比较
6.2发酵棉粕饲养肉鸡试验结果及分析
为了测试用组合菌剂发酵的棉粕的饲养效果，选择100只出壳健康科宝500肉仔鸡公雏，随机分为5组，每组4个重复，每个重复5只。五组分别饲喂豆粕、50％棉粕替代豆粕、100％棉粕替代豆粕、50％发酵棉粕替代豆粕、100％发酵棉粕替代豆粕。鸡舍温度第1周控制在35℃，以后每周降低3℃，至试验结束。各组试验鸡自由采食和饮水。每日上午7:00加料和水，试验期为21天。试验过程中无鸡只死亡。试验结果见表9。由表9可见,棉粕发酵与否对平均日增重和料肉比有极显著影响(p≤0.001),豆粕的替换量(50％与100％)极显著影响采食量。用发酵棉粕替代豆粕的50％对0～21日龄肉鸡的生产性能无显著影响。表明采用组合菌剂发酵的棉粕具有较好的替代豆粕的功能。
表9两因素(棉粕与发酵棉粕)两水平(替代豆粕50％与100％)试验肉鸡0～21日龄生产性能比较
Claims (8)
1.一株产朊假丝酵母，由经土壤分离产朊假丝酵母(C．utilis)SG607诱变产生，其特征在于,该菌株为产朊假丝酵母SG60765（CandidautilisSG60765）,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015718。
2.一种含权利要求1中所述的产朊假丝酵母SG60765株的微生物益生菌剂，其特征在于其活性成分为产朊假丝酵母SG60765株菌体及其代谢产物。
3.一种含权利要求1中所述菌株的益生菌剂组合物。
4.根据权利要求3中所述的益生菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份(活菌数比)：
产朊假丝酵母60%
地衣芽孢杆菌20%
植物乳杆菌20%
其中产朊假丝酵母为CCTCCNO:2015718，地衣芽胞杆菌为ACCC19372,植物乳杆菌为CICC20765。
5.根据权利要求3中所述的益生菌剂组合物，其特征在于所述的益生菌剂组合物为固态菌剂。
6.制备权利要求4中所述的益生菌剂组合物的方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化：接种产朊假丝酵母SG60765株于灭菌液体培养基中，28～37℃摇床培养18-24小时，液体培养基组成是葡萄糖3%，酵母膏1%，蛋白胨1%，余量是双蒸水；
（2）固体培养：将活化培养的酵母菌液按10%质量比混合接种固体培养基后装盒，保持室温30℃左右，品温35℃左右，培养2天发酵，固体培养基的配制是将麸皮96％、红糖4％，用水润料至含水率40%，蒸煮冷散后；
（3）低温干燥：对发酵后的固体样品在45℃进行低温干燥处理，样品含水率低于12%后，进行包装得到SG60765益生菌剂；
（4）将制备好的SG6076益生菌剂按重量比计，加入地衣芽孢杆菌20%和植物乳杆菌剂20%后包装，得到含SG60765益生菌的组合菌剂，其中地衣芽胞杆菌为ACCC19372,植物乳杆菌为CICC20765。
7.权利要求1中所述的产朊假丝酵母SG60765在发酵棉粕中的应用。
8.权利要求1中所述的产朊假丝酵母SG60765在含氨氮废液处理中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Application publication date: 20160309 Assignee: HEILONGJIANG WINOVAZYME BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: WUHAN POLYTECHNIC University Contract record no.: X2023980050893 Denomination of invention: Candida albicans, their compositions, and applications Granted publication date: 20180928 License type: Common License Record date: 20231212 |