CN104557861A - Hcv蛋白酶抑制剂和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及HCV蛋白酶抑制剂和其用途。所述抑制剂具有式I结构，且具有抑制HCV蛋白酶的作用。

Description

HCV蛋白酶抑制剂和其用途
本申请是申请日为2008年12月19日、申请号为200880127244.9、发明名称为“HCV蛋白酶抑制剂和其用途”的发明专利申请的分案申请。
相关申请案交叉参考
本发明主张2007年12月21日申请的美国临时申请案第61/016,110号、2007年12月23日申请的美国临时申请案第61/016,473号、2008年6月10日申请的美国临时申请案第61/060,371号和2008年9月19日申请的美国临时申请案第61/098,668号的优先权，每一所述案件的全文均以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及可用作HCV蛋白酶的抑制剂的化合物。本发明还提供包含本发明化合物的医药上可接受的组合物以及使用所述组合物治疗各种病症的方法。
背景技术
据估计，全世界超过1.7亿人感染丙型肝炎病毒(HCV)。据估计全球人类血清阳性率为3％，所以HCV是大多数非甲型肝炎、非乙型肝炎病例的重要原因(阿尔伯蒂(Alberti,A.)等人，肝脏病学期刊(J.Hepatology)31.，(增刊1)：17-24，1999)。尽管在一些患者中急性肝炎的症状消退，但至少85％的HCV感染变成慢性，且20％的感染者发生肝硬化。在硬化诊断后四年时存活率小于50％。慢性HCV感染还与肝细胞癌的发生率增加有关。
HCV是正链RNA病毒，其基因组编码具有约3000个氨基酸的多蛋白。将此前体蛋白处理成至少10种病毒结构和非结构蛋白：C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(布拉特(Blight,K.J.)等人，抗病毒疗法(Antiviral Ther.)3，增刊3：71-81，1998)。HCV非结构(NS)蛋白是通过多蛋白的蛋白水解切割而获得，且推测可提供病毒复制的基本催化结构(catalytic machinery)。
NS3是约68Kda的蛋白质，且具有N末端丝氨酸蛋白酶结构域和C末端RNA依赖性ATP酶结构域二者。已显示，NS4A蛋白质作为NS3的丝氨酸蛋白酶活性的辅因子。NS3起蛋白水解酶的作用，其切割位点，释放HCV复制所需要的其它非结构蛋白，且是抗病毒化学疗法的可行的治疗靶标。
未得到HCV的疫苗，且已建立的干扰素治疗疗法仅在15-20％的患者中有效(维兰德(Weiland,O.)，欧洲微生物学会联合会微生物学评论(FEMS Microbiol.Rev.)14:279-88，1994)，且具有明显的副作用((Walker,M.A.)等人，DDT 4:518-29，1999；莫拉德普尔(Moradpour,D.)等人，欧洲胃肠病学与肝脏病学期刊(Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.)11:1199-1202，1999)。尽管当前的标准护理(聚乙二醇化干扰素α与利巴韦林(ribavirin)的组合)更有效且似乎可减轻患有HCV相关硬化的患者的肝细胞癌(洪(Hung,C.H.)等人，病毒性肝炎期刊(J Viral Hepatitis)13(6):409-414，2006)，但还已显示此治疗引起诸如甲状腺功能障碍等副作用(黄(Huang,J.F.)等人，病毒性肝炎期刊(J Viral Hepatitis)13(6):396-401，2006)。
患有HCV感染的患者的预后较差和当前缺乏有效的被认可的治疗突出了对于新颖HCV NS3蛋白酶抑制剂的强烈需要。
发明内容
现已发现，本发明化合物和其医药上可接受的组合物可有效用作HCV蛋白酶的抑制剂。所述化合物具有通式I：
或其医药上可接受的盐，其中R1、R1’、R2a、R3、R4、Rw、Rx、Rx’和Ry如本文所定义。
本发明化合物和其医药上可接受的组合物可用于治疗多种与HCV有关的疾病、病症或病状。所述疾病、病症或病状包括本文所述者。
本发明所提供的化合物还可用于研究生物学和病理学现象中的HCV蛋白酶；研究HCV蛋白酶调介的细胞内信号转导路径；和对新颖HCV蛋白酶抑制剂进行比较评价。
附图说明
图1绘示在测试化合物(I-3)存在下HCV NS3/4A野生型蛋白酶结构域或HCV变体C159S的质谱分析。
图2绘示在测试化合物(I-3)存在下HCV NS3/4A突变体A156S的质谱分析。
图3绘示在测试化合物(I-3)存在下HCV NS3/4A突变体A156T的质谱分析。
图4绘示在测试化合物(I-3)存在下HCV NS3/4A突变体D168A的质谱分析。
图5绘示在测试化合物(I-3)存在下HCV NS3/4A突变体D168V的质谱分析。
图6绘示在测试化合物(I-7)存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图7绘示在测试化合物(I-8)存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图8绘示在测试化合物(I-4)存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图9绘示在测试化合物I-9存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图10绘示在测试化合物I-12存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图11绘示在测试化合物I-3(与其可逆对应物—化合物IR-3进行比较和与无测试化合物进行比较)存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图12绘示在胰蛋白酶消化后于测试化合物I-3存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图13绘示在测试化合物I-73存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图14绘示在测试化合物I-75存在下HCV NS3/4A野生型的质谱分析。
图15和16绘示在各种浓度的两种HCV蛋白酶抑制剂—化合物I-R和化合物I-50存在下在24h、48h和96h时利用复制子分析的荧光素酶活性。化合物I-R是非共价抑制剂，而化合物I-50是不可逆共价抑制剂。尽管两种化合物对蛋白酶的作用机制有差异，但由于分析读出的间接性质复制子分析显示类似结果。
图17绘示NS3蛋白酶的两种不可逆共价抑制剂(化合物I-96和I-102)，如通过自切割所测量，在移除化合物后其对野生型复制子细胞中的NS3蛋白酶活性展示延长的抑制。将化合物与复制子细胞一起培育16小时并随后移除(时间0)。甚至在移除共价NS3抑制剂后长达48小时时，NS3自切割活性被抑制至少50％，而可逆药物显示在移除药物后短至4小时活性实质上完全恢复。
图18绘示另一种NS3蛋白酶共价抑制剂，如通过自切割所测量，在移除化合物后长达24小时其对野生型复制子细胞中的NS3蛋白酶活性展示延长的抑制。不可逆共价抑制剂I-54在移除化合物后长达24小时内展示实质上完全抑制，而可逆药物显示在移除药物后短至4小时活性完全恢复。
图19绘示共价蛋白酶抑制剂I-54，其对经修饰复制子***中的NS3蛋白酶活性展示延长的抑制，在所述经修饰复制子***中NS3蛋白酶含有临床上观察到的突变，其将位置155(R155K)上的氨基酸自精氨酸改变成赖氨酸。此突变导致对蛋白酶抑制剂的临床药物抗性。图19绘示即使具有此突变不可逆共价药物仍能够在移除化合物后至少24小时内抑制突变体蛋白酶的活性。
具体实施方式
1.本发明化合物的概述：
在某些实施例中，本发明提供式I化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1和R1’独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团，或R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2a是-OH或-NHSO2R2；
R2是-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或：
同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团，或：
R3和R1连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含弹头基团；或
R3和由R1和R1’形成的环连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含弹头基团；
Rw是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基：或
Rw与Rx一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环，或：
Rw与Ry一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环；
Rx是-T-Rz，其中：
T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Rz是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
Rx’是氢，或Rx’和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的螺-稠合5-7元环；
Ry是氢，或Rx与Ry一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环；
R4是H、-NHC(O)R5、-NHC(O)OR6、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；
各R5独立地为-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
R6是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；且
R7是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
2.化合物和定义：
本发明化合物包括上文概述的化合物，且由本文所揭示的类、亚类和物质进一步阐释。除非另有说明，否则本文所用的下列定义应适用。对本发明来说，化学元素与元素周期表(CAS版，化学与物理手册(Handbook of Chemistry and Physics)，第75版)一致。此外，有机化学的普遍原理阐述于“有机化学(Organic Chemistry)”(托马斯索雷尔(Thomas Sorrell)，大学科技图书(University Science Books)，索萨利托(Sausalito)：1999)和“马驰高等有机化学(March's Advanced Organic Chemistry)”(第5版，史密斯(Smith,M.B.)和马驰(March,J.)编辑，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，纽约(New York)：2001)中，其全部内容以引用方式并入本文中。
本文所用的术语“脂肪族”或“脂肪族基团”意指完全饱和或含有一或多个不饱和单元的直链(即，无支链)或分支链的经取代或未经取代烃链，或完全饱和或含有一或多个不饱和单元的单环状烃或二环状烃，但其不是芳香族(在本文中其还被称为“碳环”、“环脂族”或“环烷基”)，且通过单一点附接至分子的其它部分。除非另有说明，否则脂肪族基团含有1至6个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1至5个脂肪族碳原子。在其它实施例中，脂肪族基团含有1至4个脂肪族碳原子。在又一些实施例中，脂肪族基团含有1至3个脂肪族碳原子，且在再一些实施例中，脂肪族基团含有1至2个脂肪族碳原子。在一些实施例中，“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一或多个不饱和单元的单环状C3-C6烃，但其不是芳香族，且通过单一点附接至分子的其它部分。适宜的脂肪族基团包括(但不限于)直线型或分支链的经取代或未经取代烷基、烯基、炔基及其混合物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
本文所用的术语“桥接二环基团”是指饱和或部分不饱和的具有至少一个桥键的任何二环状环***(即碳环或杂环)。如IUPAC所定义，“桥键”是连接两个桥头(bridgehead)的无支链原子链或原子或价键，其中“桥头”是环***的键结至三个或更多个骨架原子(不包括氢)的任一骨架原子。在一些实施例中，桥接二环基团具有7-12个环成员和0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子。所述桥接二环基团已为所属领域的技术人员所熟知，且包括下文所陈述的基团，其中各基团在任一可取代的碳或氮原子处附接至分子的其它部分。除非另有说明，否则桥接二环基团任选地经一或多个对于脂肪族基团所陈述的取代基取代。另外或另一选择为，桥接二环基团的任一可取代的氮任选地经取代。实例性桥接二环包括：
术语“低碳数烷基”是指C1-4直链或分支链烷基。实例性低碳数烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
术语“低碳数卤代烷基”是指经一或多个卤素原子取代的C1-4直链或分支链烷基。
术语“杂原子”意指一或多个氧、硫、氮、磷或硅(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任一碱式氮的季铵化形式或；杂环的可取代氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-经取代吡咯烷基中))。
本文所用的术语“不饱和”意指部分具有一或多个不饱和单元。
本文所用的术语“二价C1-8(或C1-6)饱和或不饱和的直链或分支链烃链”是指如本文所定义的直链或分支链的二价亚烷基、亚烯基和亚炔基链。
术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基基团，即，-(CH2)n-，其中n是正整数，优选地自1至6、自1至4、自1至3、自1至2或自2至3。经取代亚烷基链是一或多个亚甲基氢原子被取代基替换的聚亚甲基基团。适宜取代基包括下文对于经取代脂肪族基团所述的取代基。
术语“亚烯基”是指二价烯基。经取代亚烯基链是含有至少一个双键且一或多个氢原子被取代基替换的聚亚甲基基团。适宜取代基包括下文对于经取代脂肪族基团所述的取代基。
本文所用的术语“环丙烯基”是指具有以下结构的二价环丙基：
术语“卤素”意指F、Cl、Br或I。
术语“芳基”单独使用或如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳基氧基烷基”中作为较大部分的一部分使用时，是指具有总共5个至14个环成员的单环状或二环状环***，其中***中的至少一个环是芳香环且其中***中的各环含有3个至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。
术语“芳基”单独使用或如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳基氧基烷基”中作为较大部分的一部分使用时，是指具有总共5个至10个环成员的单环状和二环状环***，其中***中的至少一个环是芳香环且其中***中的各环含有3个至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。在本发明的某些实施例中，“芳基”是指可具有一或多个取代基的芳香环***，其包括(但不限于)苯基、联苯基、萘基、蒽基和诸如此类。本文所用的术语“芳基”的范围还包括芳香环稠合至一或多个非芳香环的基团，例如二氢茚基、邻苯二甲酰亚胺基(phthalimidyl)、萘酰亚胺基(naphthimidyl)、菲啶基或四氢萘基、和诸如此类。
术语“杂芳基”和“杂芳-(heteroar-)”单独使用或作为诸如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”等较大部分的一部分时，是指具有5个至10个环原子、优选地5个、6个或9个环原子；在环阵列中具有6个、10个或14个π电子；且除碳原子外还具有1个至5个杂原子的基团。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，且包括氮或硫的任何氧化形式和碱式氮的任何季铵化形式。杂芳基包括(但不限于)噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。本文所用的术语“杂芳基”和“杂芳-(heteroar-)”还包括杂芳香环稠合至一或多个芳基、环脂族或杂环基环上的基团，其中所述基团或附接点位于所述杂芳香环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、呔嗪基、喹唑啉基、喹喏啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环状或二环状。术语“杂芳基”可与术语“杂芳环”、“杂芳基基团”或“杂芳香族”互换使用，所述术语的任一者均包括任选地经取代的环。术语“杂芳烷基”是指经杂芳基取代的烷基，其中所述烷基和杂芳基部分独立地且任选地经取代。
本文所用的术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环(heterocyclic ring)”可互换使用，且是指稳定的5元至7元单环状或7元至10元二环状杂环部分，其是饱和的或部分不饱和的且除碳原子外还具有一或多个、优选地一至四个如上文所定义的杂原子。当术语“氮”用于指杂环的环原子时，其包括经取代氮。作为实例，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和的环中，所述氮可以是N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或+NR(如在N-经取代吡咯烷基中)。
杂环可在任一产生稳定结构的杂原子或碳原子处附接至其侧基，且任一环原子可任选地经取代。所述饱和或部分不饱和的杂环基团的实例包括(但不限于)四氢呋喃基、四氢苯硫基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮呯基、噁氮呯基、硫氮呯基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团(heterocyclicgroup)”、“杂环部分”和“杂环基团(heterocyclic radical)”在本文中可互换使用，且还包括其中杂环基环稠合至一或多个芳基、杂芳基或环脂族环的基团(例如，二氢吲哚基、3H-吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基)，其中所述基团或附接点位于所述杂环基环上。杂环基可以是单环状或二环状。术语“杂环基烷基”是指经杂环基取代的烷基，其中所述烷基和杂环基部分独立地且任选地经取代。
本文所用的术语“部分不饱和”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和”意欲涵盖具有多个不饱和位点的环，但不意欲包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。
本文所用的短语“天然氨基酸侧链基团”是指天然存在于蛋白质中的20种氨基酸中任一种氨基酸的侧链基团。所述天然氨基酸包括非极性或疏水性氨基酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸。半胱氨酸有时归类为非极性或疏水性的，而其它时候归类为极性的。天然氨基酸还包括极性或亲水性氨基酸，例如酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸(当带电荷时也称为天冬氨酸盐)、谷氨酸(当带电荷时也称为谷氨酸盐)、天冬酰胺和谷氨酰胺。某些极性或亲水性氨基酸具有带电荷的侧链。所述带电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。所属领域的技术人员应认识到对极性或亲水性氨基酸侧链的保护能够使所述氨基酸呈非极性。例如，经由保护羟基经适当保护的酪氨酸羟基能够使所述酪氨酸呈非极性和疏水性。
本文所用的短语“非天然氨基酸侧链基团”是指不包括于上文所述天然存在于蛋白质中的20种氨基酸的列表中的氨基酸的侧链基团。所述氨基酸包括20种天然存在氨基酸中任一者的D-同分异构体。非天然氨基酸还包括高丝氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸和甲状腺素。其它非天然氨基酸侧链已为所属领域的技术人员所熟知且包括非天然脂肪族侧链。其它非天然氨基酸包括经修饰氨基酸，包括经N-烷基化、环化、磷酸化、乙酰化、酰胺化、叠氮化(azidylated)、经标记和诸如此类的氨基酸。在一些实施例中，非天然氨基酸是D-同分异构体。在一些实施例中，非天然氨基酸是L-同分异构体。
如本文所述，本发明化合物可含有“任选经取代”的部分。通常，无论之前有没有术语“任选地”，术语“经取代”意指指定部分的一或多个氢被适宜取代基替换。除非另外指明，否则“任选经取代”的基团可具有位于所述基团的各可取代位置上的适宜取代基，且当任一给定结构中一个以上位置可由一个以上选自特定群组的取代基取代时，每一位置上的取代基可相同或不同。本发明期望的取代基组合优选为可形成稳定的或在化学上可行的化合物者。本文所用的术语“稳定的”是指当经受允许其产生、检测及在某些实施例中其回收、纯化及用于一或多种本文所揭示目的的条件时不发生实质改变的化合物。
“任选经取代”的基团的可取代碳原子上的适宜单价取代基独立地为卤素；-(CH2)0-4R°；-(CH2)0-4OR°；-O(CH2)0-4R°、-O-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4CH(OR°)2；-(CH2)0-4SR°；-(CH2)0-4Ph，其可经R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可经R°取代；-CH＝CHPh，其可经R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可经R°取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(R°)2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)R°；-N(R°)C(S)R°；-(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)C(S)NR°2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°；-N(R°)N(R°)C(O)R°；-N(R°)N(R°)C(O)NR° 2；-N(R°)N(R°)C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)R°；-C(S)R°；-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)SR°；-(CH2)0-4C(O)OSiR°3；-(CH2)0-4OC(O)R°；-OC(O)(CH2)0-4SR-、SC(S)SR°；-(CH2)0-4SC(O)R°；-(CH2)0-4C(O)NR°2；-C(S)NR°2；-C(S)SR°；-SC(S)SR°、-(CH2)0-4OC(O)NR°2；-C(O)N(OR°)R°；-C(O)C(O)R°；-C(O)CH2C(O)R°；-C(NOR°)R°；-(CH2)0-4SSR°；-(CH2)0-4S(O)2R°；-(CH2)0-4S(O)2OR°；-(CH2)0-4OS(O)2R°；-S(O)2NR°2；-(CH2)0-4S(O)R°；-N(R°)S(O)2NR°2；-N(R°)S(O)2R°；-N(OR°)R°；-C(NH)NR°2；-P(O)2R°；-P(O)R°2；-OP(O)R°2；-OP(O)(OR°)2；SiR°3；-(C1-4直链或分支链亚烷基)O-N(R°)2；或-(C1-4直链或分支链亚烷基)C(O)O-N(R°)2，其中各R°可如下文所定义经取代且独立地为氢、C1-6脂肪族基团、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、-CH2-(5-6元杂芳环)、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环，或尽管上文定义，但两个独立出现的R°连同其***的原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，其可如下文所定义经取代。
R°(或两个独立出现的R°连同其***的原子一起形成的环)上的适宜单价取代基独立地为卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤代R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0-2CH(OR●)2；-O(卤代R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1-4直链或分支链亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中各R●未经取代或在之前有“卤代”的情况下仅经一或多个卤素取代，且独立地选自C1-4脂肪族基团、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。R°的饱和碳原子上的适宜二价取代基包括＝O和＝S。
“任选经取代”的基团的饱和碳原子上的适宜二价取代基包括以下：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中各独立出现的R*选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基团、或未经取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。结合至“任选经取代”的基团的邻近可取代碳的适宜二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中各独立出现的R*选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基团、或未经取代的具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。
R*的脂肪族基团上的适宜取代基包括卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中各R●未经取代或在之前有“卤代”的情况下仅经一或多个卤素取代，且独立地为C1-4脂肪族基团、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。
“任选经取代”的基团的可取代氮上的适宜取代基包括 或其中各独立地为氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基团、未经取代的-OPh或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环，或尽管上文定义，但两个独立出现的连同其***的原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环。
的脂肪族基团上的适宜取代基独立地为卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中各R●未经取代或在之前有“卤代”的情况下仅经一或多个卤素取代，且独立地为C1-4脂肪族基团、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳环。
本文所用的术语“医药上可接受的盐”是指在正确医学判断范围内适用于接触人类及低等动物组织而不会产生过度毒性、刺激、过敏反应及诸如此类且与合理效益/风险比相称的盐。医药上可接受的盐已为所属领域的技术人员所熟知。例如，伯格(S.M.Berge)等人在医药科学期刊(J.Pharmaceutical Sciences)，1977，66，1-19(其以引用的方式并入本文中)中详细阐述医药上可接受的盐。本发明化合物的医药上可接受的盐包括衍生自适宜无机及有机酸及碱者。医药上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(例如，乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用所属技术领域中所用的其它方法(例如，离子交换)形成的氨基盐。其它医药上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对-甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐及诸如此类。
衍生自适宜碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐及N+(C1-4烷基)4盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐和诸如此类。如果合适，其它医药上可接受的盐包括无毒性铵、季铵及胺阳离子，其是使用诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳烷基磺酸根及芳基磺酸根等抗衡离子来形成。
除非另有说明，否则本文绘示的结构还意欲包括所述结构的所有同分异构(例如对映异构、非对映异构和几何异构(或构象))形式，例如每一不对称中心的R及S构型、Z及E双键同分异构体以及Z及E构象同分异构体。因此，单一立体化学同分异构体以及本发明化合物的对映异构、非对映异构及几何异构(或构象异构)混合物均涵盖于本发明范围内。除非另有说明，否则本发明化合物的所有互变异构体形式均涵盖于本发明范围内。此外，除非另有说明，否则本文绘示的结构还意欲包括仅在存在一或多个富含同位素原子方面不同的化合物。例如，具有本发明结构(包括由氘或氚替换氢、或由13C-或14C-富集碳替换碳)的化合物涵盖于本发明范围内。所述化合物可用作(例如)分析工具、用作生物分析中的探针或用作本发明的治疗剂。在某些实施例中，所提供化合物的弹头部分R3包含一或多个氘原子。
本文所用的术语“不可逆”或“不可逆抑制剂”是指能够以实质上不可逆的方式共价键结至HCV蛋白酶的抑制剂(即化合物)。即，尽管可逆抑制剂能够结合HCV蛋白酶(但通常不能与HCV蛋白酶形成共价键)，且因此能够自HCV蛋白酶分离，但不可逆抑制剂在形成共价键后将仍然实质上结合至HCV蛋白酶。不可逆抑制剂通常展示时间依赖性，由此抑制程度随抑制剂与酶的接触时间而增加。在某些实施例中，不可逆抑制剂在形成共价键后将仍然实质上结合至HCV蛋白酶，且将在较蛋白质寿命为长的一段时间内保持结合。
鉴定化合物是否作为不可逆抑制剂的方法已为所属领域的技术人员所了解。所述方法包括(但不限于)使用HCV蛋白酶时化合物的抑制分布的酶动力学分析、在抑制剂化合物存在下经修饰蛋白质药物靶标的质谱使用、不连续暴露(也称为“清除”)实验、及使用标记(例如放射标记的抑制剂)来显示酶的共价修饰、以及所属领域的技术人员已知的其它方法。
所属领域的技术人员应认识到某些反应性官能团可用作“弹头”。本文所用的术语“弹头”或“弹头基团”是指存在于本发明化合物上的官能团，其中所述官能团能够共价结合至存在于靶蛋白的结合袋中的氨基酸残基(例如半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸或能够被共价修饰的其它残基)，由此不可逆地抑制所述蛋白质。应了解，如本文所定义及阐述的-L-Y基团为所述弹头基团共价且不可逆地抑制所述蛋白质创造条件。
本文所用的术语“抑制剂”定义为以可测量亲和性结合和/或抑制HCV蛋白酶的化合物。在某些实施例中，抑制剂具有小于约50μM、小于约1μM、小于约500nM、小于约100nM、小于约10nM或小于约1nM的IC50和/或结合常数。
本发明化合物可连结至可检测部分。所属领域的技术人员应认识到，可检测部分可经由适宜取代基附接至所提供化合物。本文所用的术语“适宜取代基”是指能够共价附接至可检测部分的部分。所述部分已为所属领域的技术人员所熟知，且包括含有(例如)羧酸根部分、氨基部分、巯基部分或羟基部分(此处仅举几个例子)的基团。应了解，所述部分可直接附接至所提供化合物或经由连结基团，例如二价饱和或不饱和烃链。在一些实施例中，所述部分可经由点击化学(click chemistry)附接。在一些实施例中，所述部分可经由任选地在铜催化剂存在下叠氮化物与炔烃的1,3-环加成来附接。使用点击化学的方法已为所属领域的技术人员所了解，且包括劳斯特塞伍(Rostovtsev)等人，德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)2002，41，2596-99和孙(Sun)等人，生物结合物化学(Bioconjugate Chem.)，2006，17，52-57所阐述的方法。
本文所用的术语“可检测部分”与术语“标记”可互换使用，且是指能够被检测到的任何部分，例如，一级标记和二级标记。一级标记，例如放射性同位素(例如，氚、32P、33P、35S或14C)、质量-标签和荧光标记是产生报告基团的信号，所述报告基团能够不经进一步修饰而检测到。可检测部分还包括发光和发磷光基团。
本文所用的术语“二级标记”是指需要存在二级中间体以产生可检测信号的部分，例如生物素和各种蛋白质抗原。对于生物素来说，二级中间体可包括抗生蛋白链菌素-酶结合物。对于抗原标记来说，二级中间体可包括抗体-酶结合物。一些荧光基团用作二级标记，这是因为其在非辐射荧光共振能量转移(FRET)过程中将能量转移至另一基团，且第二基团产生检测信号。
本文所用的术语“荧光标记”、“荧光染料”和“荧光团”是指吸收指定激发波长的光能并发射不同波长的光能的部分。荧光标记的实例包括(但不限于)：阿蕾科沙氟(Alexa Fluor)染料(阿蕾科沙氟350、阿蕾科沙氟488、阿蕾科沙氟532、阿蕾科沙氟546、阿蕾科沙氟568、阿蕾科沙氟594、阿蕾科沙氟633、阿蕾科沙氟660和阿蕾科沙氟680)、AMCA、AMCA-S、氟硼荧(BODIPY)染料(氟硼荧FL、氟硼荧R6G、氟硼荧TMR、氟硼荧TR、氟硼荧530/550、氟硼荧558/568、氟硼荧564/570、氟硼荧576/589、氟硼荧581/591、氟硼荧630/650、氟硼荧650/665)、羧基罗丹明(Carboxyrhodamine)6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布黄(CascadeYellow)、香豆素343、酞菁染料(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹酰(Dansyl)、达珀西(Dapoxyl)、二烷基氨基香豆素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-荧光素、DM-NERF、曙红、赤藓红、荧光素、FAM、羟基香豆素、IRD染料(IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、丽丝胺罗丹明B(Lissamine rhodamine B)、海蓝(Marina Blue)、甲氧基香豆素、萘并荧光素(Naphthofluorescein)、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、对甲氨基酚绿(Rhodol Green)、2',4',5',7'-四-溴砜-荧光素、四甲基-罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、得克萨斯红(Texas Red)、得克萨斯红-X。
本文所用的术语“质量-标签”是指能够利用质谱(MS)检测技术借助质量独特地检测到的任何部分。质量-标签的实例包括电泳释放标签(electrophore release tag)，例如N-[3-[4’-[(对-甲氧基四氟苄基)氧基]苯基]-3-甲基甘油酰基]六氢异烟酸、4’-[2,3,5,6-四氟-4-(五氟苯氧基)]甲基苯乙酮、和其衍生物。所述质量-标签的合成及效用阐述于美国专利第4,650,750号、第4,709,016号、第5,360,8191号、第5,516,931号、第5,602,273号、第5,604,104号、第5,610,020号及第5,650,270号中。质量-标签的其它实例包括(但不限于)核苷酸、双脱氧核苷酸、不同长度及碱基组成的寡核苷酸、寡肽、寡糖、及不同长度及单体组成的其它合成聚合物。还可使用诸多种有机分子作为质量-标签，具有合适质量范围(100-2000道尔顿)的中性和带电荷的二者(生物分子或合成化合物)。
本文所用的术语“可测量亲和性”和“可测量地抑制”意指包含本发明化合物或其组合物及HCV蛋白酶的试样与包含HCV蛋白酶但不存在所述化合物或其组合物的等效试样之间HCV蛋白酶活性的可测量的变化。
3.实例性化合物的描述：
在某些实施例中，本发明提供式I化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1和R1’独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团，或R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2a是-OH或-NHSO2R2；
R2是-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或：
同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是-L-Y，其中：
L是共价键或二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换；
Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中：
Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
R3和R1连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含-L-Y；或
R3和由R1和R1’形成的环连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含弹头基团；
Rw是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基：或
Rw与Rx一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环，或：
Rw与Ry一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环；
Rx是-T-Rz，其中：
T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Rz是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
Rx’是氢，或Rx’和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的螺-稠合5-7元环；
Ry是氢，或Rx与Ry一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环；
R4是H、-NHC(O)R5、-NHC(O)OR6、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；
各R5独立地为-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
R6是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；且
R7是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在某些实施例中，L是共价键。
在某些实施例中，L是二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换。
在某些实施例中，L是二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链。在某些实施例中，L是-CH2-。
在某些实施例中，L是共价键、-CH2-、-NH-、-CH2NH-、-NHCH2-、-NHC(O)-、-NHC(O)CH2OC(O)-、-CH2NHC(O)-、-NHSO2-、-NHSO2CH2-、-NHC(O)CH2OC(O)-或-SO2NH-。
在一些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换。
在某些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-替换，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换。
在一些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-C(O)-替换，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换。
如上文所述，在某些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键。所属领域的技术人员应认识到，所述双键可存在于烃链主链内或可“在主链链的外部”且由此形成亚烷基。举例来说，所述具有亚烷基分支链的L基团包括-CH2C(＝CH2)CH2-。因此，在一些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个亚烷基双键。实例性L基团包括-NHC(O)C(＝CH2)CH2-。
在某些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-C(O)-替换。在某些实施例中，L是-C(O)CH＝CH(CH3)-、-C(O)CH＝CHCH2NH(CH3)-、-C(O)CH＝CH(CH3)-、-C(O)CH＝CH-、-CH2C(O)CH＝CH-、-CH2C(O)CH＝CH(CH3)-、-CH2CH2C(O)CH＝CH-、-CH2CH2C(O)CH＝CHCH2-、-CH2CH2C(O)CH＝CHCH2NH(CH3)-、或-CH2CH2C(O)CH＝CH(CH3)-、或-CH(CH3)OC(O)CH＝CH-。
在某些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-OC(O)-替换。
在一些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-替换，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换。在一些实施例中，L是-CH2OC(O)CH＝CHCH2-、-CH2-OC(O)CH＝CH-或-CH(CH＝CH2)OC(O)CH＝CH-。
在某些实施例中，L是-NRC(O)CH＝CH-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)(C＝N2)C(O)-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-NRC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NRC(O)-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NRC(O)-或-CH2NRC(O)亚环丙基-，其中各R独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，L是-NHC(O)CH＝CH-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)(C＝N2)C(O)-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-NHC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NHC(O)-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NHC(O)-或-CH2NHC(O)亚环丙基-。
在一些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个三键。在某些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个三键且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换。在一些实施例中，L具有至少一个三键且L的至少一个亚甲基单元由-N(R)-、-N(R)C(O)-、-C(O)-、-C(O)O-、或-OC(O)-、或-O-替换。
实例性L基团包括-C≡C-、-C≡CCH2N(异丙基)-、-NHC(O)C≡CCH2CH2-、-CH2-C≡C-CH2-、-C≡CCH2O-、-CH2C(O)C≡C-、-C(O)C≡C-或-CH2OC(＝O)C≡C-。
在某些实施例中，L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L的一个亚甲基单元由亚环丙基替换且L的一个或两个其它亚甲基单元独立地由-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换。实例性L基团包括-NHC(O)-亚环丙基-SO2-和-NHC(O)-亚环丙基-。
如上文所概括定义，Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代，各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团或C1-6脂肪族基团，其中Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，Y是氢。
在某些实施例中，Y是任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，Y是任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基。在其它实施例中，Y是任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基。在一些实施例中，Y是C2-6烯基。在其它实施例中，Y是C2-4炔基。
在其它实施例中，Y是经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基。所述Y基团包括-CH2F、-CH2Cl、-CH2CN和-CH2NO2。
在某些实施例中，Y是具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的饱和的3-6元单环，其中Y经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。
在一些实施例中，Y是具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中所述环经1-2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。实例性所述环是环氧化物和环氧丙烷环，其中各环经1-2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。
在其它实施例中，Y是具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和的5-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。所述环包括哌啶和吡咯烷，其中各环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y是或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所述。
在一些实施例中，Y是饱和的3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y是环丙基、环丁基、环戊基或环己基，其中各环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y是其中Re如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y是任选地经卤素、CN或NO2取代的环丙基。
在某些实施例中，Y是具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。
在一些实施例中，Y是部分不饱和的3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。在一些实施例中，Y是环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基或环己烯基，其中各环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y是其中各Re如上文所定义且如本文所述。
在某些实施例中，Y是具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y选自：
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述。
在某些实施例中，Y是具有0-2个氮的6元芳香环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y是苯基、吡啶基或嘧啶基，其中各环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述。
在一些实施例中，Y选自：
其中各Re如上文所定义且如本文所述。
在其它实施例中，Y是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳环，其中所述环经1-3个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述。在一些实施例中，Y是具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5元部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述。实例性所述环是异噁唑基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、***、噻二唑和噁二唑，其中各环经1-3个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述。在某些实施例中，Y选自：
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述。
在某些实施例中，Y是具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述。根据另一方面，Y是具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的9-10元二环状部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述。实例性所述二环状环包括2,3-二氢苯并[d]异噻唑，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述。
如上文所概括定义，各Re基团独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，Re是任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。在其它实施例中，Re是侧氧基、NO2、卤素或CN。
在一些实施例中，Re是-Q-Z，其中Q是共价键且Z是氢(即，Re是氢)。在其它实施例中，Re是-Q-Z，其中Q是二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-NR-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-O-、-C(O)-、-SO-或-SO2-替换。在其它实施例中，Q是具有至少一个双键的二价C2-6直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-NR-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-O-、-C(O)-、-SO-或-SO2-替换。在某些实施例中，Re基团的Z部分是氢。在一些实施例中，-Q-Z是-NHC(O)CH＝CH2或-C(O)CH＝CH2。
在某些实施例中，各Re独立地选自侧氧基、NO2、CN、氟、氯、-NHC(O)CH＝CH2、-C(O)CH＝CH2、-CH2CH＝CH2、-C≡CH、-C(O)OCH2Cl、-C(O)OCH2F、-C(O)OCH2CN、-C(O)CH2Cl、-C(O)CH2F、-C(O)CH2CN或-CH2C(O)CH3。
在某些实施例中，Re是适宜离去基团，即经历亲核置换的基团。“适宜离去基团”是容易被期望引入的化学部分(例如目标半胱氨酸的巯基部分)置换的化学基团。适宜离去基团已为所属领域的技术人员所熟知，例如，参见，“高等有机化学(AdvancedOrganic Chemistry)”，杰瑞马奇(Jerry March)，第5版，第351-357页，约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，N.Y。所述离去基团包括(但不限于)卤素、烷氧基、磺酰基氧基、任选经取代的烷基磺酰基氧基、任选经取代的烯基磺酰基氧基、任选经取代的芳基磺酰基氧基、酰基和重氮部分。适宜离去基团的实例包括氯、碘、溴、氟、乙酰氧基、甲磺酰基氧基(methanesulfonyloxy和mesyloxy)、甲苯磺酰基氧基、三氟甲磺酰基氧基(triflyloxy)、硝基-苯基磺酰基氧基(nitro-phenylsulfonyloxy和nosyloxy)、和溴-苯基磺酰基氧基(bromo-phenylsulfonyloxy和brosyloxy)。
在某些实施例中，-L-Y的以下实施例和组合适用：
(a)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-、-C(O)O-、亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(b)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-替换，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(c)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-C(O)-替换，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(d)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-C(O)-替换；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(e)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个双键且L的至少一个亚甲基单元由-OC(O)-替换；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(f)L是-NRC(O)CH＝CH-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)(C＝N2)-、-NRC(O)(C＝N2)C(O)-、-NRC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NRSO2CH＝CH-、-NRSO2CH＝CHCH2-、-NRC(O)CH＝CHCH2O-、-NRC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NRC(O)-、-CH2NRC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NRC(O)-或-CH2NRC(O)亚环丙基-；其中R是H或任选经取代的C1-6脂肪族基团；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(g)L是-NHC(O)CH＝CH-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)(C＝N2)-、-NHC(O)(C＝N2)C(O)-、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)-、-NHSO2CH＝CH-、-NHSO2CH＝CHCH2-、-NHC(O)CH＝CHCH2O-、-NHC(O)C(＝CH2)CH2-、-CH2NHC(O)-、-CH2NHC(O)CH＝CH-、-CH2CH2NHC(O)-或-CH2NHC(O)亚环丙基-；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(h)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个亚烷基双键且L的至少一个亚甲基单元由-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-替换，且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-O-、-N(R)-或-C(O)-替换；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(i)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L具有至少一个三键且L的一个或两个其它亚甲基单元任选地且独立地由-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-替换，且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(j)L是-C≡C-、-C≡CCH2N(异丙基)-、-NHC(O)C≡CCH2CH2-、-CH2-C≡C-CH2-、-C≡CCH2O-、-CH2C(O)C≡C-、-C(O)C≡C-或-CH2OC(＝O)C≡C-；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(k)L是二价C2-8直链或分支链烃链，其中L的一个亚甲基单元由亚环丙基替换且L的一个或两个其它亚甲基单元独立地由-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-或-C(O)O-替换；且Y是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团；或
(l)L是共价键且Y选自：
(i)经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；
(ii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中所述环经1-2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(v)具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(vi)或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所述；或
(vii)饱和3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(viii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(ix)部分不饱和的3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xi)具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xii)其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xiii)具有0-2个氮的6元芳香环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xv)具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳环，其中所述环经1-3个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xvii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述；
(m)L是-C(O)-且Y选自：
(i)经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；或
(ii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中所述环经1-2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(v)具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(vi)或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所述；或
(vii)饱和3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(viii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(ix)部分不饱和的3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xi)具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xiii)具有0-2个氮的6元芳香环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xv)具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳环，其中所述环经1-3个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xvii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述；
(n)L是-N(R)C(O)-且Y选自：
(i)经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；或
(ii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中所述环经1-2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(v)具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(vi)或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所述；或
(vii)饱和3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(viii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(ix)部分不饱和的3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xi)具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xiii)具有0-2个氮的6元芳香环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xv)具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳环，其中所述环经1-3个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xvii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述；
(o)L是二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链；且Y选自：
(i)经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；
(ii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中所述环经1-2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(v)具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(vi)或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所述；或
(vii)饱和3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(viii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(ix)部分不饱和的3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xi)具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，
其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xiii)具有0-2个氮的6元芳香环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xiv)其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xv)具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳环，其中所述环经1-3个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xvii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述；
(p)L是共价键、-CH2-、-NH-、-C(O)-、-CH2NH-、-NHCH2-、-NHC(O)-、-NHC(O)CH2OC(O)-、-CH2NHC(O)-、-NHSO2-、-NHSO2CH2-、-NHC(O)CH2OC(O)-或-SO2NH-；且Y选自：
(i)经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6烷基；或
(ii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6烯基；或
(iii)任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C2-6炔基；或
(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中所述环经1-2个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(v)具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(vi)或其中各R、Q、Z和Re如上文所定义且如本文所述；或
(vii)饱和3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(viii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(ix)部分不饱和的3-6元碳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(x)其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xi)具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xii)或
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xiii)具有0-2个氮的6元芳香环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xiv)
其中各Re如上文所定义且如本文所述；或
(xv)具有1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5元杂芳环，其中所述环经1-3个Re基团取代，其中各Re基团如上文所定义且如本文所述；或
(xvi)
其中各R和Re如上文所定义且如本文所述；或
(xvii)具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，其中所述环经1-4个Re基团取代，其中Re如上文所定义且如本文所述。
在某些实施例中，式I的Y基团选自下表1中所列示者，其中各波浪线表示附接至分子其它部分的点。
表1.式I的实例性Y基团：
其中各Re独立地为适宜离去基团、NO2、CN或侧氧基。
在某些实施例中，式I的R3基团选自下表2中所列示者，其中各波浪线表示附接至分子其它部分的点。
表2.实例性R 3 基团：
其中各Re独立地为适宜离去基团、NO2、CN或侧氧基。
在某些实施例中，式I的Rx基团是-T-Rz且Rx’是氢。在某些实施例中，式I的T基团是共价键。在某些实施例中，T是C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换。
在某些实施例中，T是C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换，其中T的附接至式I的脯氨酸环的原子是碳、氧或硫。
在一些实施例中，式I的T基团是C1-4二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-或-C(O)-替换。在其它实施例中，T是-O-CH2-。在其它实施例中，T是-O-。在一些实施例中，T是-S-。
在一些实施例中，当Rz是本文所定义的5-10元单环状或二环状杂芳环或4-7元杂环时，T不是价键。
在一些实施例中，T是C2-3二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-或-C(O)-替换。在一些实施例中，T是-CH2C(O)-、-OC(O)-或-NHC(O)-。在某些实施例中，T是-OC(O)-且Rz是具有至少一个氮的8-10元二环状环。
在一些实施例中，T是-O-或-O-(CH2)1-2-且RZ是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基。在一些实施例中，T是-O-或-CH2-且Rz是选自以下的任选经取代的基团：6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基。在一些实施例中，T是-O-CH2-且RZ是苯基。在其它实施例中，T是共价键且Rz是在某些实施例中，T是-OC(O)-且Rz是在一些实施例中，T是共价键或-O-。在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是
在某些实施例中，式I的Rx与Rx’基团一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的螺-稠合5-7元环。在一些实施例中，Rx与Rx’一起形成具有1-2个选自-O-和-S-的杂原子的螺-稠合5-6元环。在其它实施例中，Rx与Rx’一起形成：或
在某些实施例中，式I的R1和R1’基团独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，R1是氢且R1’是C1-4脂肪族基团。在其它实施例中，R1是氢且R1’是正-丙基。
在某些实施例中，式I的R1与R1’基团一起形成任选经取代的3-7元碳环。在一些实施例中，式I的R1与R1’基团一起形成任选经取代的环丙基环。在一些实施例中，式I的R1与R1’基团一起形成经乙基或乙烯基取代的环丙基环。
在一些实施例中，R4是H、-NHC(O)R5、-NHC(O)OR6、或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环。
在某些实施例中，式I的R4基团是-NHC(O)R5。在一些实施例中，式I的R4基团是-NHC(O)OR6。在其它实施例中，式I的R4基团是在某些实施例中，式I的R4基团是氢。
在一些实施例中，当R4是-NHC(O)R5时，R5是C1-6脂肪族基团或选自以下的任选经取代的基团：桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在一些实施例中，当R4是-NHC(O)OR6时，R6是C1-6脂肪族基团或选自以下的任选经取代的基团：桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在一些实施例中，式I的R4基团是氨基酸侧链基团。在一些实施例中，式I的R4基团是非天然氨基酸侧链基团。在一些实施例中，式I的R4基团是脂肪族非天然氨基酸侧链基团。在一些实施例中，式I的R4基团是经一个、两个或三个Ro基团取代的丙氨酸的非天然氨基酸侧链基团，其中各Ro如上文所定义。在一些实施例中，式I的R4基团是天然氨基酸侧链基团。
在某些实施例中，式I的R4基团是丙氨酸的天然氨基酸侧链基团(即，R4是甲基)。在一些实施例中，式I的R4基团是D-丙氨酸的天然氨基酸侧链基团。在一些实施例中，式I的R4基团是L-丙氨酸的天然氨基酸侧链基团。
在其它实施例中，式I的R4基团是缬氨酸的天然氨基酸侧链基团。在一些实施例中，式I的R4基团是D-缬氨酸的天然氨基酸侧链基团。在一些实施例中，式I的R4基团是L-缬氨酸的天然氨基酸侧链基团。
在一些实施例中，式I的R4基团由D-和L-构型的氨基酸侧链基团的混合物组成。所述R4基团在本文中称为“D,L-混合氨基酸侧链基团”。在一些实施例中，D-与L-氨基酸侧链基团的比率选自6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5和1:6中的任一者。因此，在某些实施例中，式I的R4基团是D,L-混合丙氨酸侧链基团。在其它实施例中，式I的R4基团是D,L-混合缬氨酸侧链基团。
尽管不欲受限于任一特定理论，但是我们认为对于式I化合物来说，具有D-构型的氨基酸侧链基团有助于使化合物采取有益于结合HCV蛋白酶的取向。
在某些实施例中，式I的R5和R7基团独立地为选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。在一些实施例中，R5是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的5-10元杂芳基，且R7是任选经取代的C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，R5是且R7是环己基。
在某些实施例中，Rx与Rx’一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的螺-稠合5-7元环。在一些实施例中，Rx与Rx’一起形成具有1-2个选自-O-和-S-的杂原子的螺-稠合5-6元环。在其它实施例中，Rx与Rx’一起形成：或
在某些实施例中，式I的Rw基团是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。在一些实施例中，Rw与Rx一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环。在其它实施例中，Rw与Ry一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环。
在某些实施例中，式I的Rw基团是氢。在其它实施例中，式I的Rw基团是任选经取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，式I的R2a基团是-OH。在其它实施例中，式I的R2a基团是-NHSO2R2，其中R2是如上文所定义且如本文所述。因此，本发明提供式I-a或I-b化合物：
或其医药上可接受的盐，其中R1、R1’、R2、R3、R4、Rw、Rx、Rx’和Ry各自如上文对于式I所定义且如上文及本文类及亚类中所述。
在某些实施例中，式I-b的R2基团是-N(R)2。在其它实施例中，式I-b的R2基团是选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。在某些实施例中，R2是C3-7环烷基或6-10元芳基。在一些实施例中，R2是任选经取代的6-10元芳基。在一些实施例中，R2是苯基。在某些实施例中，R2是环丙基。
在某些实施例中，R2选自C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在某些实施例中，式I的R3基团是弹头基团。在一些实施例中，式I的R3和R1基团连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含弹头基团。在一些实施例中，R3和由R1和R1’形成的环连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含弹头基团。
如上文所概括定义，由式I的R3和R1基团形成的环包含弹头基团。本文所用的短语“包含弹头基团”意指由R3和R1形成的环经弹头基团取代或在环内纳入所述弹头基团。例如，由R3和R1形成的环可经-L-Y弹头基团取代，其中所述基团如本文所述。或者，由R3和R1形成的环在环内纳入弹头基团的合适特征。例如，由R3和R1形成的环可包括一或多个不饱和单元和任选的取代基和/或杂原子，其组合产生本发明的能够共价修饰HCV蛋白酶的部分。在某些实施例中，由R3和R1形成的环任选地在相对于R4所附接的碳的α-、β-、γ-或δ-位经取代。
应了解，当R3和R1连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环时，所述化合物包括R3与由R1和和R1’形成的环连接在一起的化合物。
R3与由R1和R1’形成的环连接在一起的式I的实例性化合物包括式I-c-1、I-c-2、I-c-3、I-c-4、I-c-5-和I-c-6的化合物：
或其医药上可接受的盐，其中R2a、R4、Rw、Rx、Rx’和Ry各自如上文所定义且如本文类及亚类中所述。应了解，尽管式I-c-1、I-c-2、I-c-3、I-c-4、I-c-5和I-c-6绘示由R1和R1’形成的环丙基环，但绘示此基团是出于例示目的，且因此本发明涵盖本文所述的其它R1和R1’基团。
实例性所述化合物包括下文表3中所列示者。
尽管所绘示的式I-c-1、I-c-2、I-c-3、I-c-4、I-c-5和I-c-6的化合物在大环中具有(Z)-双键立体化学，但应了解，在某些实施例中，可提供在大环中具有(E)-双键立体化学的式I-c-1、I-c-2、I-c-3、I-c-4、I-c-5和I-c-6的化合物。在一些实施例中，提供两种立体异构体的混合物。在其它实施例中，可在适宜条件下对式I-c-1、I-c-2、I-c-3、I-c-4、I-c-5和I-c-6的化合物进行处理以使双键饱和。
在某些实施例中，R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环。在一些实施例中，所述化合物具有式I-d：
或其医药上可接受的盐，其中R2a、R3、R4、R°、Rx、Rx’和Ry各自如式I中所定义且如上文及本文类及亚类中所述。
在一些实施例中，R°是选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在一些实施例中，R°是乙基。在其它实施例中，R°是乙烯基。
式I-d的实例性R3基团包括上文及本文所述者以及下表3中所绘示者。
在某些实施例中，R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的饱和或不饱和的16-22元环。在一些实施例中，R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的具有3-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的不饱和18-22元环。在一些实施例中，由R4和Rx形成的环经一或多个Rm基团取代，其中每次出现的Rm独立地为卤素、-OR°；-CN；-SCN；-SR°；-SOR°；-SO2R°；-NO2；-N(R°)2；-NHC(O)R°、或选自由C1-6脂肪族基团和C3-7环烷基组成的群组的任选经取代的基团。在某些实施例中，本发明提供式I-e或I-f化合物：
或其医药上可接受的盐，其中R2a、R3和R°各自如式I中所定义且如上文及本文类及亚类中所述；
p是1至6的整数(包括1和6)；且
每次出现的Rm独立地为卤素、-OR°；-CN；-N(R°)2；或选自由C1-6脂肪族基团和C3-7环烷基组成的群组的任选经取代的基团。
在一些实施例中，p是1。在一些实施例中，p是2。
在某些实施例中，Rm是C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，Rm是甲基。
在一些实施例中，R°是选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在一些实施例中，R°是乙基。在其它实施例中，R°是乙烯基。
式I-e和I-f的实例性R3基团包括本文所述者和下表3中所绘示者。
尽管所绘示的式I-e和I-f的化合物在大环中具有(Z)或(E)双键立体化学，但应了解，在某些实施例中，可提供在大环中具有(E)-双键立体化学的式I-e和I-f的化合物。在某些实施例中，可提供在大环中具有(Z)-双键立体化学的式I-e和I-f的化合物。在一些实施例中，提供两种立体异构体的混合物。在其它实施例中，可在适宜条件下对式I-e和I-f的化合物进行处理以使双键饱和，由此形成式I-g或I-h的化合物：
或其医药上可接受的盐。
在某些实施例中，R4与Rx如上文所述连接在一起，且R3与由R1和R1’形成的环如上文所述连接在一起，以形成新颖的双大环化合物。在某些实施例中，由R4和Rx形成的环如上文对于式I-e和I-f所述经一或多个Rm基团取代。在一些实施例中，由R3与由R1和R1’形成的环形成的大环经-L-Y弹头基团取代以提供式I-j或I-k化合物：
或其医药上可接受的盐；其中各独立地代表单键或双键。制备所述化合物的方法(除本文对于合成纳入弹头的其它大环和化合物所述的方法外)包括由麦考利(McCauley,J.A.)等人，德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)，2008，47，第9104-7页所述者。
在一些实施例中，由R3与由R1和R1’形成的环形成的大环的亚甲基单元由L-Y部分替换以提供式I-m或I-n化合物：
或其医药上可接受的盐；其中各独立地代表单键或双键。
在某些实施例中，本发明提供式II-a或II-b化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1和R1’独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团，或R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2是-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团；
Rx是-T-Rz，其中：
T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Rz是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
Ry是氢或Rx与Ry一起形成任选经取代的C3-7元碳环；
R4是H、-NHC(O)R5、-NHC(O)OR6、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；
各R5独立地为-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；且
R6是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在某些实施例中，本发明提供式II-a或II-b化合物或其医药上可接受的盐，其中R1、R1’、R2、R3、R4、Rx和Ry各自如上文所定义且其中：
R3是-L-Y，其中：
L是共价键或二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换；
Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中：
Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，式II-a和II-b的R1、R1’、R2、R3、R4、Rx和Ry基团如上文对于式I所述且如上文及本文类及亚类中所述。
在一些实施例中，式II-a和II-b的R1与R1’基团一起形成任选经取代的3-7元碳环。在其它实施例中，R1与R1’一起形成任选经取代的环丙基环。
在某些实施例中，式II-b的R2基团是-N(R)2或选自C3-7环烷基或6-10元芳基的任选经取代的基团。在一些实施例中，R2是-N(R)2或选自C3-5环烷基或6-8元芳基的任选经取代的基团。在一些实施例中，R2是-N(R)2且R是甲基。在一些实施例中，R2是环丙基。在其它实施例中，R2是苯基。
在某些实施例中，式II-a和II-b的Rx基团是-T-Rz，T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-替换，且Rz是选自以下的任选经取代的基团：6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基。在一些实施例中，T是-CH2-且Rz是苯基。在其它实施例中，T是共价键且Rz是在一些实施例中，T是共价键或是-O-。在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是
在某些实施例中，式II-a和II-b的R4基团是-NHC(O)OR6，其中R6是选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在一些实施例中，R6是环戊基。在其它实施例中，R6是叔丁基。
在某些实施例中，R4是-NHC(O)R5，其中R5独立地为-N(R)2或选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在一些实施例中，R5是-N(R)2且各R独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，R5是-N(R)2且各R独立地为氢或叔丁基。
在某些实施例中，本发明提供式III-a或III-b化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1和R1’独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团，或R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2是-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团；
Rx是-T-Rz，其中：
T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Rz是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
R4是H、-NHC(O)OR6、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；且
R6是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在某些实施例中，本发明提供式III-a或III-b化合物或其医药上可接受的盐，其中R1、R1’、R2、R3、R4和Rx各自如上文所定义且其中：
R3是-L-Y，其中：
L是共价键或二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换；
Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中：
Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，式III-a和III-b的R1、R1’、R2、R3、R4和R基团各自如上文所述且如上文及本文类及亚类中所述。
在某些实施例中，式III-b的R2基团是-N(R)2或选自C3-7环烷基或6-10元芳基的任选经取代的基团。在一些实施例中，R2是-N(R)2或选自C3-5环烷基或6-8元芳基的任选经取代的基团。在一些实施例中，R2是-N(R)2且R是甲基。在一些实施例中，R2是环丙基。
在某些实施例中，式III-a和III-b的Rx基团是-T-Rz，T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-替换，且Rz是选自以下的任选经取代的基团：6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基。在一些实施例中，T是-CH2-且Rz是苯基。在其它实施例中，T是共价键且Rz是在一些实施例中，T是共价键或是-O-。在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是在某些实施例中，Rz是
在某些实施例中，式III-a和III-b的R4基团是-NHC(O)OR6，其中R6是选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在一些实施例中，R6是环戊基。在其它实施例中，R6是叔丁基。
在某些实施例中，本发明提供式IV-a或IV-b化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2是选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团；
Rx是-T-Rz，其中：
T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Rz是选自以下的任选经取代的基团：6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
R4是H、-NHC(O)OR6、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；且
R6是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在某些实施例中，本发明提供式IV-a或IV-b化合物或其医药上可接受的盐，其中R1、R1’、R2、R3、R4和Rx各自如上文所定义且其中：
L是共价键或二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换；
Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中：
Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，式IV的R1、R1’、R2、R3、R4和Rx基团各自如上文对于式I所述且如上文及本文类及亚类中所述。
在某些实施例中，式IV-a和IV-b的R1与R1’基团一起形成任选经取代的3-7元碳环。在一些实施例中，所述化合物具有式IV-c和IV-d：
或其医药上可接受的盐，其中R2、R3、R4、Rx、Ry和R°各自如上文对于式IV-a和IV-b所述且如上文及本文类及亚类中所述。
在一些实施例中，R°是选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在一些实施例中，R°是乙基。在其它实施例中，R°是乙烯基。
如上文式IV-a和IV-b中所概括定义，R4是-NHC(O)OR6。在一些实施例中，R6是选自C1-6脂肪族基团或6-10元芳基的任选经取代的基团。在其它实施例中，R6是C1-4脂肪族基团。在其它实施例中，R6是叔丁基。
在某些实施例中，本发明提供式V-a和V-b化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1和R1’独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团，或R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2是-N(R)2；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团；
Rx是-T-Rz，其中：
T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Rz是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
R4是H、-NHC(O)OR6、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；且
R6是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在某些实施例中，本发明提供式V-a或V-b化合物或其医药上可接受的盐，其中R1、R1’、R2、R3、R4和Rx各自如上文所定义且其中：：
R3是-L-Y，其中：
L是共价键或二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换；
Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中：
Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，式V-a和V-b的R1、R1’、R2、R3、R4和Rx基团如上文所述且如上文及本文类及亚类中所述。
在某些实施例中，式V的R1与R1’基团一起形成任选经取代的3-7元碳环。在一些实施例中，所述化合物具有式V-c和V-d：
或其医药上可接受的盐，其中R2、R3、R4、R°和Rx各自在式V-a和V-b中定义且在上文及本文类及亚类中阐述。
在一些实施例中，R°是选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在其它实施例中，R°是乙烯基。
如式V-a和V-b中所概括定义，R4是-NHC(O)OR6。在某些实施例中，R6是选自C1-6脂肪族基团的任选经取代的基团。在一些实施例中，R6是环戊基。
如式V-a和V-b中所概括定义，R2是-N(R)2，其中各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环。在某些实施例中，R是任选经取代的C2-4脂肪族基团。在一些实施例中，R是甲基。
在某些实施例中，本发明提供式VI-a或VI-b化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2是选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团；
Rx与Ry一起形成任选经取代的C3-7元碳环；
R4是H、-NHC(O)R5、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；且
R5是-N(R)2。
在某些实施例中，本发明提供式VI-a或VI-b化合物或其医药上可接受的盐，其中R2、R3、R4、Rx和Ry各自在上文予以定义且其中：
R3是-L-Y，其中：
L是共价键或二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换；
Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中：
Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，式VI的R1、R1’、R2、R3、R4、Rx和Ry基团如上文对于式I所述且如上文及本文类及亚类中所述。
如式VI-a和VI-b中所概括定义，R4是-NHC(O)R5且R5是-N(R)2，其中各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
在某些实施例中，各R独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团。在其它实施例中，各R独立地为氢叔丁基。
在某些实施例中，本发明提供式VII-a或VII-b化合物：
或其医药上可接受的盐，其中：
R1和R1’独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团；
R2是选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团；
Rx’和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的螺-稠合5-7元环；
R4是H、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；
R5是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；且
R7是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。
在某些实施例中，本发明提供式VII-a或VII-b化合物或其医药上可接受的盐，其中R1、R1’、R2、R3、R4、Rx和Rx’各自在上文中予以定义且其中：
R3是-L-Y，其中：
L是共价键或二价C1-8饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中L的一个、两个或三个亚甲基单元任选地且独立地由亚环丙基、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-、-C(＝NR)-、-N＝N-或-C(＝N2)-替换；
Y是氢、任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团、或具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-10元单环状或二环状饱和环、部分不饱和环或芳环，且其中所述环经1-4个Re基团取代；且
各Re独立地选自-Q-Z、侧氧基、NO2、卤素、CN、适宜离去基团、或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团，其中：
Q是共价键或二价C1-6饱和或不饱和的直链或分支链烃链，其中Q的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-或-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Z是氢或任选地经侧氧基、卤素、NO2或CN取代的C1-6脂肪族基团。
在某些实施例中，式VII-a和VII-b的R1、R1’、R2、R3、Rx和Rx’基团如上文对于式I所述且如上文及本文类及亚类中所述。
在某些实施例中，式VII-a和VII-b的R5基团是具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的5-10元杂芳环。在一些实施例中，R5是具有1-2个氮的任选经取代的6元杂芳环。在某些实施例中，R5是哌嗪基。
在某些实施例中，式VII-a和VII-b的R7基团是任选经取代的C1-6脂肪族基团。在一些实施例中，R7是分支链C1-5烷基。在其它实施例中，R7是环戊基或环己基。
在某些实施例中，式VII-a和VII-b的Rx与Rx’基团一起形成具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选经取代的螺-稠合5-7元环。在一些实施例中，Rx与Rx’一起形成具有1-2个选自-O-和-S-的杂原子的螺-稠合5-6元环。在其它实施例中，Rx与Rx’一起形成：或
如上文及本文所述，在某些实施例中，式I化合物的R4基团是氢。在某些实施例中，本发明提供式VIII-a或VIII-b化合物：
其中R1、R1’、R2、R3、Rx和Rx’基团各自如上文对于式I所定义且如本文类及亚类中所述。
式I的实例性化合物列示于下表3中。
表3.式I的实例性化合物
在某些实施例中，本发明提供绘示于上文表3中的任一化合物或其医药上可接受的盐。
如上文所概括定义，R3是弹头基团。不欲受限于任一特定理论，我们认为所述R3基团(即弹头基团)尤其适于共价结合至HCV蛋白酶结合结构域中的重要半胱氨酸残基。所属领域的技术人员应了解，HCV蛋白酶及其突变体在结合结构域中具有半胱氨酸残基。在某些实施例中，本发明化合物具有特征在于发明的化合物可靶向HCV蛋白酶的C159半胱氨酸残基的弹头基团。在某些实施例中，本发明化合物具有特征在于发明的化合物靶向HCV蛋白酶的C16半胱氨酸残基的弹头基团。
因此，在一些实施例中，R3的特征在于所述-L-Y部分能够共价结合至半胱氨酸残基，由此不可逆地抑制所述酶。在某些实施例中，所述半胱氨酸残基是HCV蛋白酶或其突变体的Cys159，其中所提供的残基编号是按照通用蛋白质资源(Uniprot)(代码Q91RS4)。
所属领域的技术人员应认识到本文所定义的各种弹头基团适于所述共价键结。所述R3基团包括(但不限于)本文所述和上表3中所绘示者。通过使用下文实例24-27中详细阐述的方案实施质谱实验来测定此现象。此实验的结果绘示于图1至14中，其中显示所提供化合物共价修饰HCV蛋白酶的Cys159。事实上，所述实验显示所提供化合物不共价修饰HCV C159S变体，由此证实Cys159是共价修饰的残基。
根据另一方面，本发明提供包含在Cys159处共价键结至抑制剂的HCV蛋白酶或其突变体的结合物。在一些实施例中，所述抑制剂经由连接体部分共价键结。
在某些实施例中，本发明提供具有式Cys159-连接体-抑制剂部分的结合物。所属领域的技术人员应认识到所述“连接体”基团对应于本文所述的-L-Y弹头基团。因此，在某些实施例中，所述连接体基团如上文对于-L-Y所定义且如本文类及亚类中所述。然而，应了解，所述连接体基团是二价的，且因此由弹头与HCV蛋白酶或其突变体的Cys159反应而产生的对应-L-Y基团也意欲是二价的。
本文所用的术语“抑制剂部分”是指结合HCV蛋白酶的活性位点的主链基团。所述主链基团已为所属领域的技术人员所熟知，且包括阐述于以下专利中者：例如，US 2006258868、US 6642204、US 7091184、US 6642204、US 7091184、US 2006205638、US 7189844、US 2005267151、US 7148347、WO 2007009227、US 2007243166、US20070224167、US 2006287248、US 2006046956、US 7253160、WO 2006122188、US2005143316、US 7135462、US 7132504、US 6878722、US 7041698、US 6869964、US6995174、US 6872805、US 2007099825、US 6867185、US 2007010455、US 2006199773、US 7208600、US 7273885、US 7273851、US 2007072809、US 2006122123和US20050267018。
在某些实施例中，所述抑制剂部分是式A化合物：
其中式A的R1、R1’、R2、R4、Rx、Rx’、R4和Ry基团各自如上文对于式I所定义且如本文类及亚类中所述。因此，在某些实施例中，本发明提供具有下式的结合物：
其中所述结合物的R1、R1’、R2、R4、Rw、Rx、Rx’、R4和Ry基团各自如上文对于式I所定义且如本文类及亚类中所述。
在一些实施例中，R3的特征在于所述-L-Y部分能够共价结合至半胱氨酸残基，由此不可逆地抑制所述酶。在某些实施例中，所述半胱氨酸残基是HCV蛋白酶或其突变体的Cys16，其中所提供的残基编号是按照通用蛋白质资源(Uniprot)(代码Q91RS4)。
根据另一方面，本发明提供包含在Cys16处共价键结至抑制剂的HCV蛋白酶或其突变体的结合物。在一些实施例中，所述抑制剂经由连接体部分共价键结。
在某些实施例中，本发明提供具有式Cys16-连接体-抑制剂部分的结合物。所属领域的技术人员应认识到所述“连接体”基团对应于本文所述的-L-Y弹头基团。因此，在某些实施例中，所述连接体基团如上文对于-L-Y所定义且如本文类及亚类中所述。然而，应了解，所述连接体基团是二价的，且因此由弹头与HCV蛋白酶或其突变体的Cys16反应而产生的对应-L-Y基团也意欲是二价的。
在某些实施例中，所述抑制剂部分是式A-1化合物：
其中式A-1的R1、R1’、R2、R4、Rx、Rx’、R4和Ry基团各自如上文对于式I所定义且如本文类及亚类中所述。因此，在某些实施例中，本发明提供具有下式的结合物：
其中所述结合物的R1、R1’、R2、R4、Rw、Rx、Rx’、R4和Ry基团各自如上文对于式I所定义且如本文类及亚类中所述。
所属领域的技术人员应认识到某些本发明化合物是可逆抑制剂。在某些实施例中，所述化合物可用作分析比较化合物。在一些实施例中，所述可逆化合物可用作HCV蛋白酶或其突变体的抑制剂，且因此可用于治疗本文所述的一或多种病症。在一些实施例中，所提供化合物是所提供不可逆抑制剂的可逆对应物。例如，化合物IR-3(下文)是化合物I-3的可逆参照类似物。
提供本发明化合物的通用方法
在某些实施例中，本发明化合物通常按照下文所列示反应图1来制备：
反应图1
在一方面中，本发明提供按照上文反应图1中所绘示的步骤制备式I化合物的方法，其中各变量如本文所定义及阐述，且各PG是适宜保护基团。在步骤S-1中，利用肽偶合条件使式A的N-经保护(例如Boc)脯氨酸衍生物与式B的α-氨基酯缩合，得到式C的二肽。适宜肽偶合条件已为所属领域的技术人员所熟知，且包括PCT公开案第WO2002094822号(US6825347)中详细阐述者，所述公开案的全文以引用方式并入本文中。除非另有说明，否则所述条件在通篇本申请案中作为适宜肽偶合条件提及。
在步骤S-2中，使用适宜碱使酯基团水解并随后中和得到式D的二肽。适宜碱包括(但不限于)碱金属、碱土金属氢氧化物和其组合。在一些实施例中，所述碱是氢氧化锂。
在步骤S-3中，利用适宜肽偶合条件使式D的二肽与式E的磺酰胺偶合，得到式F的酰基磺酰胺。
在步骤S-4中，自式F的二肽裂解保护基团(例如移除Boc)，得到式G的胺。在某些实施例中，通过使式F化合物与矿物酸或有机酸在卤化烃溶剂中接触来达成Boc基团的裂解。在一些实施例中，在一些实施例中，所述酸是三氟乙酸且所述溶剂是二氯甲烷。
在步骤S-5中，利用适宜肽偶合条件使式G的胺与式H的羧酸偶合，得到式I-0的中间体化合物。
在本文中作为实例阐述的步骤中使式I-0的中间体化合物转化成式I化合物。
如上文所概括定义，式A、C、D和F的PG基团是适宜氨基保护基团。适宜氨基保护基团已为所属领域的技术人员所熟知，且包括详细阐述于以下文献中者：有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)，格林(T.W.Greene)和伍兹(P.G.M.Wuts)，第3版，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，1999，其全文以引用方式并入本文中。经保护的胺已为所属领域的技术人员所熟知，且包括详细阐述于格林(Greene)(1999)中者。适宜经单保护的胺进一步包括(但不限于)芳烷基胺、氨基甲酸酯、烯丙基胺、酰胺和诸如此类。适宜经单保护的氨基部分的实例包括叔丁基氧基羰基氨基(-NHBOC)、乙氧基羰基氨基、甲氧基羰基氨基、三氯乙氧基羰基氨基、烯丙基氧基羰基氨基(-NHAlloc)、苄基侧氧基羰基氨基(-NHCBZ)、烯丙基氨基、苄基氨基(-NHBn)、芴基甲基羰基(-NHFmoc)、甲酰胺基、乙酰胺基、氯乙酰胺基、二氯乙酰胺基、三氯乙酰胺基、苯基乙酰胺基、三氟乙酰胺基、苯甲酰胺基、叔丁基二苯基甲硅烷基和诸如此类。适宜经二保护的胺包括经两个独立地选自上文作为经单保护的胺所述的取代基取代的胺，且进一步包括环状酰亚胺，例如邻苯二甲酰亚胺、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺和诸如此类。
在其它实施例中，本发明化合物通常按照下文所列示反应图2来制备。
反应图2
在一方面中，本发明提供按照上文反应图1中所绘示的步骤制备式I化合物的方法。在步骤S-6中，在酸催化条件下自式C的二肽移除Boc基团得到式J的二肽酯。
在步骤S-7中，利用适宜肽偶合条件使式J的二肽酯与式H的官能化氨基酸缩合，得到式K的三肽酯，其在本文中作为实例阐述的步骤中进一步转化成式L的三肽酯。
在步骤S-8中，使用适宜碱使式L化合物上的酯基团水解并随后中和得到式M的三肽。适宜碱包括(但不限于)碱金属、碱土金属氢氧化物和其组合。在一些实施例中，所述碱是氢氧化锂。
在步骤S-9中，利用适宜肽偶合条件使式M的三肽与式E的磺酰胺偶合，得到式I化合物。
式C、H和K的PG基团是如上所述的适宜氨基保护基团。
4.用途、调配和投予
医药上可接受的组合物
根据另一实施例，本发明提供一种组合物，其包含本发明化合物或其医药上可接受的衍生物以及医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂。本发明组合物中化合物的量应可有效地以可测量的程度抑制生物试样或患者中的HCV蛋白酶或其突变体。在某些实施例中，本发明组合物中化合物的量应可有效地以可测量的程度抑制生物试样或患者中的HCV蛋白酶或其突变体。在某些实施例中，将本发明组合物调配用于投予至需要所述组合物的患者。在一些实施例中，将本发明组合物调配用于经口投予至患者。
本文所用的术语“患者”意指动物，优选为哺乳动物，且最优选为人类。
术语“医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂”是指不损坏一起调配的化合物的药理学活性的非毒性载剂、佐剂或媒剂。可用于本发明组合物中的医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括(但不限于)离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人类血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
“医药上可接受的衍生物”意指本发明化合物的任何无毒性盐、酯、酯盐或其它衍生物，其在投予接受者后能够直接或间接提供本发明化合物或其具有抑制活性的代谢物或残留物。
本文所用的术语“其具有抑制活性的代谢物或残留物”意指其代谢物或残留物也是HCV蛋白酶或其突变体的抑制剂。
本发明组合物可经口、非经肠、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、含服、经***或经由植入型药盒投予。本文所用的术语“非经肠”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，经口、腹膜内或静脉内投予所述组合物。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。所述悬浮液可根据业内已知技术使用适宜的分散或湿润剂和悬浮剂进行调配。所述无菌可注射制剂也可以是存于无毒性非经肠可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如存于1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。此外，通常采用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。
出于此目的，可采用任一温和的不挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸(例如油酸和其甘油酯衍生物)可用于可注射制剂，如同天然的医药上可接受的油类，例如橄榄油或蓖麻油，其尤其呈其聚氧乙烯化形式。所述油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于调配包括乳液和悬浮液在内的医药上可接受的剂型。也可将其它常用的表面活性剂用于调配目的，例如吐温(Tweens)、司盘(Spans)和其它常用于制造医药上可接受的固体、液体或其它剂型的乳化剂或生物利用度增强剂。
本发明的医药上可接受的组合物可以任何经口可接受剂型经口投予，所述剂型包括(但不限于)胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在供经口使用的片剂的情况下，常用载剂包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式经口投予来说，有用稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要经口使用水性悬浮液时，可将活性成份与乳化剂及悬浮剂组合。必要时，还可添加某些甜味剂、矫味剂或着色剂。
或者，本发明的医药上可接受的组合物可以供直肠投予的栓剂形式投予。这些栓剂可通过将药剂与适宜的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，且因此将会在直肠中熔化而释放药物。所述物质包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的医药上可接受的组合物还可局部投予，尤其当治疗目标包括局部施用易于达到的区域或器官(包括眼睛、皮肤或下部肠道的疾病)时。可容易地制备适于每一所述区域或器官的局部调配物。
可以直肠栓剂调配物(参见上文)或适宜的灌肠调配物实现下部肠道的局部施用。还可使用局部经皮贴片。
对于局部施用，可将所提供的医药上可接受的组合物调配于含有悬浮或溶解于一或多种载剂中的活性组份的适宜软膏中。用于本发明化合物的局部投予的载剂包括(但不限于)矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将所提供的医药上可接受的组合物调配于含有悬浮或溶解于一或多种医药上可接受的载剂中的活性组份的适宜洗剂或乳霜中。适宜载剂包括(但不限于)矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬酯醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼睛使用，可将所提供的医药上可接受的组合物调配为存于等渗、pH值经调节的无菌盐水中的微粒化悬浮液，或优选地调配为存于等渗、pH值经调节的无菌盐水中的溶液，含有或不含有防腐剂(例如氯苄烷铵(benzylalkonium chloride))。或者，对于眼睛使用，可将医药上可接受的组合物调配于软膏(例如矿脂)中。
也可通过经鼻气溶胶或吸入来投予本发明的医药上可接受的组合物。根据医药调配领域熟知的技术来制备所述组合物，并且可将其制备成盐水溶液，其采用苯甲醇或其它适宜防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它习用增溶剂或分散剂。
最优选地，将本发明的医药上可接受的组合物调配用于经口投予。所述调配物可与食物一起或不与食物一起投予。在一些实施例中，本发明的医药上可接受的组合物不与食物一起投予。在其它实施例中，本发明的医药上可接受的组合物与食物一起投予。
可与载剂物质组合以产生单一剂型的组合物的本发明化合物的量可视所治疗宿主、特定投予方式而变化。优选地，应对所提供组合物进行调配以使得可向接受所述组合物的患者投予0.01至100mg/kg体重/日的剂量的抑制剂。
还应了解，针对任一特定患者的具体剂量及治疗方案应根据多种因素而定，所述因素包括所采用具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、投予时间、***速率、药物组合、及治疗医师的判断和所治疗特定疾病的严重程度。所述组合物中本发明化合物的量还应视组合物中的特定化合物而定。
化合物和医药上可接受的组合物的用途
本文所述的化合物和组合物通常可用于抑制HCV蛋白酶活性和/或其突变体的活性。因此，所提供化合物可用于治疗非甲型、非乙型肝炎，包括丙型肝炎。
HCV是极其易变的病毒，其在宿主内形成多态变体群。现已在世界范围内确定六种不同的基因型(西蒙兹(Simmonds)等人，肝脏病学(Hepatology)，第42卷，第4期，2005)。将所述基因型进一步分成更密切相关的遗传学上不同的亚型。称为共有序列的比较序列部分列示于下表3a中。HCV基因型和亚型在世界各个地区的分布有所不同，且某些基因型在某些地区占优势。基因型1-3在全世界广泛分布。亚型1a在北美和南美、欧洲和澳大利亚较普遍。亚型1b在北美和欧洲较常见，而且在亚洲一些地区也有发现。基因型2存在于大多数发达国家中，但相比于基因型1其较不常见(http://www.hcvadvocate.org/hepatitis/factsheets_pdf/genotype_FS.pdf)。其它基因型在除美国之外的患者群体中较普遍，且因此是重要的靶标。
值得注意的是，位于基因型1b中氨基酸位置159处的半胱氨酸在迄今测序的所有HCV NS3基因型和亚型中较保守，尽管在其它基因型和亚型中氨基酸位置可能不同。使用不可逆抑制剂靶向此半胱氨酸残基应能够研发出可有效对抗多种HCV基因型的药剂。
如本文所述，本发明提供一或多种HCV蛋白酶基因型及其变体的不可逆抑制剂。包含称为R3的弹头基团的所述化合物包括本文所述的具有以下各式的化合物：式I、I-a、I-b、I-c-1、I-c-2、I-c-3、I-c-4、I-c-5、I-c-6、I-d、I-e、I-f、I-g、I-h、Il-a、II-b、III-a、III-b、IV-a、IV-b、IV-c、IV-d、V-a、V-b、V-c、V-d、VI-a、VI-b、VII-a、VII-b、VIII-a和VIII-b。在一些实施例中，R3的特征在于-L-Y部分能够共价结合至半胱氨酸残基，由此不可逆地抑制所述酶。不欲受限于任一特定理论，我们认为所述R3基团(即弹头基团)尤其适于共价结合至一或多种HCV蛋白酶基因型或其变体的结合结构域中的重要半胱氨酸残基。在一些实施例中，由本发明化合物抑制的一或多种基因型包括1a、1b、2a和3a。在某些实施例中，一或多种所述变体包括A156T、A156S、D168V、D168A和R155K。
所属领域的技术人员应了解，HCV蛋白酶基因型和其变体在结合结构域附近具有一或多个半胱氨酸残基。不欲受限于任一特定理论，我们认为弹头基团接近目标半胱氨酸有助于通过弹头基团共价修饰所述半胱氨酸。在一些实施例中，目标半胱氨酸残基是HCV蛋白酶亚型1b或其变体的Cys159，其中所提供的残基编号是按照通用蛋白质资源(Uniprot)(代码Q91RS4)。适于被本发明不可逆抑制剂共价修饰的其它HCV蛋白酶基因型和亚型的半胱氨酸残基包括概述于下表3a中者，其中粗体且加以下划线的“C”是指在与HCV蛋白酶亚型1b的Cys159等效的位置上保守的半胱氨酸残基。
表3a.
a所属领域的技术人员应了解，每一种病毒都有突变倾向且经历多态现象，且本文所述的任一基因型共有序列均为给定基因型或亚型的代表。所述代表性共有序列可在http://hcv.lanl.gov/content/sequence/NEWALIGN/align.html上获得。
出现抗药性是靶向疗法的重要挑战。例如，已报导研发中的HCV蛋白酶抑制剂的抗药性。所述化合物包括BILN 2061和VX-950，其分别由德国勃林格殷格翰制药公司(Boehringer Ingelheim)和维特制药公司(Vertex Pharmaceuticals)研发。BILN 2061和VX-950的结构绘示于下文。
事实上，维特制药公司最近发表的标题为“丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶的活体外抗性研究(In Vitro Resistance Studies of Hepatitis C Virus Serine Protease)”的文章正视了使用VX-950和BILN 2061所观察到的突变体抗性问题。参见林(Lin)等人，生物化学期刊(The Journal of Biological Chemistry)，第279卷，第17期，4月23日发行，第17508-17514页，2004。所述文章得出的结论是“涉及HCV酶小分子抑制剂的将来丙型肝炎疗法可能如同当前HIV治疗的情况需要多药物组合(future hepatitis C therapyinvolving small molecule inhibitors of HCV enzymes might require multidrug combination,as in the case of the current HIV treatments)”。参见第17513页最后一段。
对特定抗病毒药物的抗性是限制疗法对抗许多反转录病毒或RNA病毒的功效的重要因素。所述病毒的易错性质使得发生突变，而对当前可得的药物或经历临床测试的药物产生抗性。抗性问题是用于治疗HCV患者的新颖HCV特异性抑制剂的药物研发中面对的重要障碍。
最近的使用两种HCV NS3·4A蛋白酶抑制剂VX-950和BILN 2061的活体外抗性研究发现，针对任一抑制剂选择的抗性突变导致对抑制剂本身的感受性显著降低。然而，针对BILN 2061的主要抗性突变对VX-950完全感受，且针对VX-950的重要抗性突变保留对BILN 2061的敏感性(林(Lin)等人，生物化学期刊(Jour.Biol.Chem.)，279(17):17508-14，2004)。
已令人惊奇地发现，所提供化合物抑制至少5种HCV蛋白酶突变体，包括A156T、A156S、D168V、和D168A以及R155K。相比于仅各自抑制两种突变体的其它已知HCV蛋白酶抑制剂(例如，VX-950和BILN 2061)，其具有优势。事实上，先前技术中阐述的药物没有一种药物显示是所有已知HCV蛋白酶突变体的有效抑制剂。例如，且如下文表4a和4b中所列示，其中BILN 2061和VX-950数据如林(Lin)等人以及HCV文献中其它地方所报告，且按照下文实例中所述的方法获得化合物I-3的数据。不欲受限于任一特定理论，我们认为本发明化合物可以是HCV蛋白酶的药物抗性形式的有效抑制剂。尽管表4b显示化合物I-3对抗四种提及HCV变体(A156T、A156S、D168V和D168A)的活性，但接下来的实例将阐述可有效对抗所述变体以及第五种变体(R155K)的其它本发明所提供化合物。
表4a.比较性K i 值(nM) a
BILN 2061 VX-950
WT 19 100
A156T >1200 9900
A156S 112 2900
D168V >1200 43
D168A >1200 150
a野生型数据是自基于细胞的分析获得，且突变体数据是自生物化学分析获得。参见林(Lin)等人和本文所述的方案。
表4b.比较性IC 50 值(nM) a
BILN 2061 VX-950 化合物I-3
WT 4 402 20
A156T -- -- 18
A156S 7 4650 1
D168V 5090 163 77
D168A 1860 193 45
a野生型数据是自基于细胞的分析获得，且突变体数据是自生物化学分析获得。参见林(Lin)等人和本文所述的方案。
不欲受限于任一特定理论，我们认为与其中式I的R3部分代之以非弹头基团，例如直链烷基(例如，未经取代烷基)、分支链烷基、环烷基或烯基的对应式I化合物相比，式I化合物在抑制HCV蛋白酶或其突变体方面更有效。例如，与其中式I的R3部分代之以非弹头部分，例如甲基、乙基、丙基、丁基(例如，叔丁基)、未经取代的直链或分支链烯基(例如C1-8烯基)、环己基或环戊基的对应式I化合物相比，式I化合物可能在抑制HCV蛋白酶或其突变体方面更有效。
与其中式I的R3部分代之以非弹头部分，例如甲基、乙基、丙基、丁基(例如，叔丁基)、未经取代的直链或分支链烯基(例如C1-8烯基)、环己基或环戊基的对应式I化合物相比，上文所揭示的式I化合物可能在对抗HCV蛋白酶或突变体(例如A156T、A156S、D168V、D168A或其它突变体，例如本文所揭示者)的IC50方面更强效。与其中式I的R3部分代之以非弹头部分的对应式I化合物相比式I化合物的所述比较效能可通过标准时间依赖性分析方法(例如下文实例部分中详细阐述者)来测定。在某些实施例中，与其中式I的R3部分代之以非弹头部分，例如甲基、乙基、丙基、丁基(例如，叔丁基)、未经取代的直链或分支链烯基(例如C1-8烯基)、环己基或环戊基的对应式I化合物相比，式I化合物以可测量的程度更强效。在一些实施例中，与其中式I的R3部分代之以非弹头部分，例如甲基、乙基、丙基、丁基(例如，叔丁基)、未经取代的直链或分支链烯基(例如C1-8烯基)、环己基或环戊基的对应式I化合物相比，式I化合物以可测量的程度更强效，其中所述效能在约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约8小时、约12小时、约16小时、约24小时或约48小时后观察到。在一些实施例中，与其中式I的R3部分代之以非弹头部分，例如甲基、乙基、丙基、丁基(例如，叔丁基)、未经取代的直链或分支链烯基(例如C1-8烯基)、环己基或环戊基的对应式I化合物相比，式I化合物更强效约1.5倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约25倍、约50倍、约100倍或甚至约1000倍中的任一者。
本文所用的术语“临床抗药性”是指由于药物靶标的突变造成药物靶标对药物治疗的感受性损失。
本文所用的术语“抗性”是指编码靶蛋白的野生型核酸序列和/或靶蛋白序列的改变，所述改变降低或彻底破坏抑制剂对靶蛋白的抑制效果。
受本文所述化合物和组合物抑制且本文所述方法对其有用的蛋白酶的实例包括NS3、NS3·4A或其突变体。
在本发明中用作NS3、NS3·4A或其突变体的抑制剂的化合物的活性可在活体外、活体内或在细胞系中进行分析。活体外分析包括测定对丝氨酸蛋白酶活性和/或随后功能结果、或激活NS3、NS3·4A或其突变体的ATP酶活性的抑制的分析。替代活体外分析测定抑制剂结合NS3或NS3·4A的能力。抑制剂结合可通过在结合之前对抑制剂进行放射性标记、分离抑制剂/NS3或抑制剂/NS3·4A复合物并测定所结合放射性标记的量来测量。或者，抑制剂结合可通过实施竞争实验来测定，其中将新颖抑制剂与结合已知放射性配体的NS3或NS3·4A一起培育。用于分析在本发明中用作NS3或NS3·4A或其突变体的抑制剂的化合物的详细条件在下文实例中陈述。
丝氨酸蛋白酶是切割蛋白质中肽键的蛋白水解酶大家族。丝氨酸蛋白酶家族包括消化酶糜蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶、以及与血液凝固有关的蛋白酶。丝氨酸蛋白酶具有包含丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的特征性“催化三联体(catalytic triad)”，联合起激活丝氨酸以与酶底物形成共价键由此使肽键水解的作用。除上文所述外，丝氨酸蛋白酶还参与包括免疫和炎症在内的多种机能。
本文所用的术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指逆转、减轻、延迟本文所述疾病或病症或其一或多种症状的发作或抑制其进展。在一些实施例中，可在一或多种症状发生之后实施治疗。在其它实施例中，可在无症状时实施治疗。例如，可在症状发作之前对易感个体实施治疗(例如，根据症状史和/或根据遗传或其它感受性因素)。还可在症状消除后继续治疗以(例如)预防或延迟其复发。
根据本发明方法，可以有效治疗或减轻癌症、自身免疫病症、神经变性或神经学病症、精神***症、骨相关病症、肝病或心脏病症的严重程度的任一量利用任一投予途径来投予所述化合物和组合物。所需确切量可视个体物种、年龄及总体状况、感染严重程度、特定药剂、其投予模式和诸如此类随个体而有所变化。本发明化合物优选调配成便于投予和均匀给药的剂量单位形式。本文所用的表达“剂量单位形式”是指适于拟治疗患者的药剂的物理离散单位。然而，应了解，本发明化合物和组合物的总日用量应由主治医师在合理的医学判断范围内确定。任一特定患者或生物体的特定有效剂量水平可视多种因素而定，包括所治疗病症和所述病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的投予时间、投予途径和***速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；及医疗技术中熟知的类似因素。本文所用的术语“患者”意指动物，优选为哺乳动物，且最优选是人类。
本发明的医药上可接受的组合物可以下列方式投予至人类和其它动物：经口、经直肠、非经肠、脑池内、***内、腹膜内、局部(以粉剂、软膏或滴剂形式)、含服(以经口或鼻喷雾形式)或诸如此类。在某些实施例中，本发明化合物可以约0.01mg/kg至约50mg/kg且优选约1mg/kg至约25mg/kg个体体重/天的剂量水平每天一或多次经口或非经肠投予，以获得期望的治疗效果。
在一些实施例中，每天向有需要的患者投予一次所提供组合物。不欲受限于任一特定理论，我们认为延长HCV NS3蛋白酶不可逆抑制剂的作用持续时间对于向有需要的患者每天投予一次以治疗与HCV NS3蛋白酶有关的病症尤其有利。在某些实施例中，每天向有需要的患者投予至少一次所提供组合物。在其它实施例中，每天向有需要的患者投予两次、三次或四次所提供组合物。
例如，当投予至患者时，与其中式I的R3部分代之以非弹头部分，例如直链烷基(例如，未经取代烷基)、分支链烷基、环烷基或烯基的对应式I化合物相比，式I化合物通常提供延长的作用持续时间。例如，当投予至患者时，与其中式I的R3部分代之以非弹头部分，例如甲基、乙基、丙基、丁基(例如，叔丁基)、未经取代的直链或分支链烯基(例如C1-8烯基)、环己基或环戊基的对应式I化合物相比，式I化合物能够提供延长的作用持续时间。
用于经口投予的液体剂型包括(但不限于)医药上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物以外，所述液体剂型还可含有所属技术中常用的惰性稀释剂(例如水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯、和其混合物。除惰性稀释剂以外，所述口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和加香剂。
可根据已知技术使用适宜分散剂或润湿剂及悬浮剂来调配可注射制剂，例如，无菌可注射水性或油性悬浮液。所述无菌可注射制剂还可以是存于无毒性非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如存于1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer's solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，通常采用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可采用任一温和的不挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。此外，在可注射制剂中可使用诸如油酸等脂肪酸。
所述可注射调配物可(例如)通过经由细菌截留过滤器过滤或通过纳入灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂呈可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。
为了延长本发明化合物的效果，通常期望自皮下或肌内注射来减缓所述化合物的吸收。此可通过使用具有较差水溶性的结晶或非晶形物质的液体悬浮液来达成。于是，化合物的吸收速率取决于其溶解速率，此溶解速率又取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，可通过将化合物溶解或悬浮于油性媒剂中来达成非经肠投予化合物形式的延迟吸收。可通过在生物可降解聚合物(例如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成化合物的微囊基质来制备可注射的储积形式。根据化合物与聚合物的比率及所用特定聚合物的性质，可控制化合物的释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储积可注射调配物也可通过将化合物俘获于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
用于直肠或***投予的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明化合物与适宜无刺激性赋形剂或载剂(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)进行混合来制备，所述赋形剂或载剂在环境温度下为固体但在体温下为液体，且因此其可在直肠或***腔内熔化并释放所述活性化合物。
用于经口投予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在所述固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性、医药上可接受的赋形剂或载剂(例如，柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或扩充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和***胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土(kaolin)和膨润土；和i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，和其混合物。如果是胶囊、片剂和丸剂，所述剂型还可包含缓冲剂。
在使用诸如乳糖(lactose或milk sugar)和高分子量聚乙二醇等赋形剂的软质和硬质填充明胶胶囊中，还可使用类似类型的固体组合物作为填充剂。固体剂型的片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒可以用包膜和包壳制备，例如肠溶包膜和医药调配技术中熟知的其它包膜。其可任选地含有遮光剂，且也可以是任选地以延迟方式仅(或优先)在肠道的某一部分释放活性成份的组合物。可使用的包埋组份的实例包括聚合物质和蜡。在使用诸如乳糖(lactose或milk sugar)和高分子量聚乙二醇等赋形剂的软质和硬质填充明胶胶囊中，还可使用类似类型的固体组合物作为填充剂。
活性化合物还可以是具有一或多种上述赋形剂的微囊形式。可使用诸如肠溶包膜、释放控制包膜及医药调配技术中熟知的其它包膜等包膜和包壳来制备片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂及微粒的固体剂型。在所述固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂(例如，蔗糖、乳糖或淀粉)混合。所述剂型除惰性稀释剂以外还可如同通常实践一般包含其它物质，例如压片润滑剂及其它压片助剂(例如硬脂酸镁及微晶纤维素)。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可包含缓冲剂。其可任选地含有遮光剂，且也可以是任选地以延迟方式仅(或优先)在肠道的某一部分释放活性成份的组合物。可使用的包埋组份的实例包括聚合物质和蜡。
用于局部或经皮投予本发明化合物的剂型包括软膏、膏糊、乳霜、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾、吸入剂或贴片。如果需要，可在无菌条件下将活性组份与医药上可接受的载剂及任一所需防腐剂或缓冲剂混合。眼用调配物、滴耳剂和滴眼剂也涵盖于本发明范围内。此外，本发明涵盖使用经皮贴片，其具有提供化合物至身体的受控递送的额外优点。可通过将所述化合物溶解或分散于合适介质中来制备所述剂型。还可使用吸收增强剂来增加所述化合物经过皮肤的通量。所述速率可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
根据一个实施例，本发明涉及抑制生物试样中的丝氨酸蛋白酶活性的方法，其包含使所述生物试样与本发明化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。
根据另一实施例，本发明涉及抑制生物试样中的HCV蛋白酶或其突变体的活性的方法，其包含使所述生物试样与本发明化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。在某些实施例中，本发明涉及不可逆地抑制生物试样中的HCV蛋白酶或其突变体的活性的方法，其包含使所述生物试样与本发明化合物或包含所述化合物的组合物接触的步骤。
本文所用的术语“生物试样”包括(但不限于)细胞培养物或其提取物；自哺乳动物获得的活组织检查物质或其提取物；和血液、唾液、尿、粪便、***、眼泪或其它体液或其提取物。
抑制生物试样中的HCV蛋白酶或其突变体的活性可用于所属领域的技术人员已知的各种目的。所述目的的实例包括(但不限于)输血、器官移植、生物试样储存和生物分析。
本发明的另一实施例涉及抑制患者中的HCV蛋白酶或其突变体的活性的方法，其包含向所述患者投予本发明化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。
根据另一实施例，本发明涉及抑制患者中的HCV蛋白酶或其突变体的活性的方法，其包含向所述患者投予本发明化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。根据某些实施例，本发明涉及不可逆地抑制患者中的HCV蛋白酶或其突变体的活性的方法，其包含向所述患者投予本发明化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。在其它实施例中，本发明提供治疗有需要的患者的由HCV蛋白酶或其突变体介导的病症的方法，其包含向所述患者投予本发明化合物或其医药上可接受的组合物的步骤。所述病症在本文中予以详细阐述。
视拟治疗的特定病状或疾病而定，通常投予以治疗所述病状的其它治疗剂也可与本发明化合物和组合物组合投予。认为本文所用的通常投予以治疗特定疾病或病状的其它治疗剂“适于所治疗疾病或病状”。
在某些实施例中，所提供化合物或其组合物与HCV蛋白酶或其变体的另一抑制剂组合投予。在一些实施例中，所提供化合物或其组合物与另一抗病毒剂组合投予。所述抗病毒剂包括(但不限于)免疫调节剂，例如α-、β-和γ-干扰素、聚乙二醇化衍生干扰素-α化合物和胸腺素；其它抗病毒剂，例如利巴韦林、金刚烷胺(amantadine)和替比夫定(telbivudine)；其它丙型肝炎蛋白酶抑制剂(NS2-NS3抑制剂和NS3-NS4A抑制剂，例如BILN 2061和VX-950)；HCV生命周期中的其它靶标的抑制剂，包括解旋酶和聚合酶抑制剂；内部核糖体进入抑制剂；广谱病毒抑制剂，例如IMPDH抑制剂(例如，霉酚酸和其衍生物)；或任一上文的组合。
在某些实施例中，可投予两种或更多种抗病毒剂的组合。在某些实施例中，可投予三种或更多种抗病毒剂的组合。在一些实施例中，抗病毒剂选自利巴韦林或干扰素。在其它实施例中，抗病毒剂是α-干扰素。
还可与本发明抑制剂组合的药剂的其它实例包括(但不限于)：阿兹海默氏症(Alzheimer's Disease)治疗药物，例如和HIV治疗药物，例如利托那韦(ritonavir)；帕金森氏症(Parkinson's Disease)治疗药物，例如L-DOPA/卡比多巴(carbidopa)、恩他卡朋(entacapone)、罗吡尼洛(ropinrole)、普拉克索(pramipexole)、溴隐亭(bromocriptine)、培高利特(pergolide)、苯海索(trihexephendyl)和金刚烷胺；治疗多发性硬化(MS)的药剂，例如β干扰素(例如，干扰素β-1a粉针剂和和米托蒽醌(mitoxantrone)；哮喘治疗药物，例如沙丁胺醇(albuterol)和治疗精神***症的药剂，例如再普乐(zyprexa)、维思通(risperdal)、思瑞康(seroquel)和氟哌啶醇(haloperidol)；消炎剂，例如皮质类固醇、TNF阻断剂、IL-1RA、硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；免疫调节和免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素(rapamycin)、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、干扰素、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和柳氮磺胺吡啶；神经营养因子，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂、MAO抑制剂、干扰素、抗惊厥药、离子通道阻断剂、利鲁唑(riluzole)和抗帕金森氏症药；治疗心血管疾病的药剂，例如β-阻断剂、ACE抑制剂、利尿药、硝酸盐、钙通道阻断剂和抑制素；治疗肝病的药剂，例如皮质类固醇、考来烯胺(cholestyramine)、干扰素和抗病毒剂；治疗血液病症的药剂，例如皮质类固醇、抗白血病药和生长因子；延长或改善药物代谢动力学的药剂，例如细胞色素P450抑制剂(即，代谢分解抑制剂)和CYP3A4抑制剂(例如，酮康唑(ketokenozole)和利托那韦)；以及治疗免疫缺陷病症的药剂，例如γ-球蛋白。
在某些实施例中，本发明化合物或其医药上可接受的组合物与单克隆抗体或siRNA治疗组合投予。
所述其它药剂可作为多剂量方案的一部分与含有本发明化合物的组合物分开投予。或者，所述药剂可以是单一剂型的一部分，与本发明化合物一起混合于单一组合物中。如果作为多剂量方案的一部分投予，则两种活性药剂可同时、依序或彼此在一段时间内(通常彼此在5小时内)呈送。
本文所用的术语“组合(combination、combined)”和相关术语是指同时或依序投予本发明的治疗剂。例如，本发明化合物可与另一治疗剂在单独单位剂型中或共同存于单一单位剂型中同时或依序投予。因此，本发明提供一种单一单位剂型，其包含式I化合物、其它治疗剂和医药上可接受的载剂、佐剂或媒剂。
可与载剂物质组合以产生单一剂型的本发明化合物与其它治疗剂(在包含如上文所述其它治疗剂的组合物中)二者的量可视所治疗的主体及特定投予模式而定。优选地，应对本发明组合物进行调配以使得可投予0.01至100mg/kg体重/日的剂量的本发明化合物。
在包含其它治疗剂的组合物中，所述其它治疗剂与本发明化合物可协同作用。因此，所述组合物中其它治疗剂的量可小于仅使用所述治疗剂的单一疗法所需要的量。在所述组合物中可投予0.01至100mg/kg体重/日的剂量的其它治疗剂。
存在于本发明组合物中的其它治疗剂的量不超过在包含所述治疗剂作为唯一活性剂的组合物中通常投予的量。优选地，在本文所揭示组合物中其它治疗剂的量将是包含所述药剂作为唯一治疗活性剂的组合物中通常存在量的约50％至100％。
范例
如下文实例中所绘示，在某些实例性实施例中，按照以下通用程序来制备化合物。应了解，尽管所述通用方法绘示某些本发明化合物的合成，但以下通用方法和所属领域的技术人员已知的其它方法可应用于所有本文所述化合物以及所述化合物中每一化合物的亚类和物质。
下文实例中所用的化合物编号对应于上文表3中所列示的化合物编号。
制备R 3 含有仲酰胺基团的化合物的通用方法A
反应图3
如上文反应图3中所绘示，利用适宜肽偶合条件使Boc-脯氨酸衍生物N与α-氨基酸衍生物O缩合，得到二肽酯P。使用氢氧化锂水溶液使酯P水解随后酸化得到酸Q。使Q与磺酰胺R缩合得到酰基磺酰胺S。在酸催化下自S移除Boc得到中间体T。利用适宜肽偶合条件使T与Boc/Fmoc保护的氨基酸U缩合得到中间体V。使用哌啶自V选择性移除Fmoc保护基团得到胺W，使用酰氯使其酰化，得到化合物I-3、I-4、I-7、I-8和I-11(和本文其它实例中提供的其它化合物)。尽管此方法概述所述化合物的合成，但所属领域的技术人员应认识到此方法可用于合成其它式I化合物。
制备R 3 含有叔酰胺基团的化合物的通用方法B
反应图4
如上文反应图4中所绘示，利用适宜肽偶合条件使来自通用方法A的中间体T与N-Boc-O-TBS-高丝氨酸X缩合，得到三肽Y。在氟化物催化下使Y去甲硅烷基化，得到醇Z，使用戴斯-马丁过碘烷(Dess-Martin periodinane)将其氧化，得到醛AA，使用三乙酰氧基硼氢化物和甲胺使AA还原胺化，得到甲胺BB。使BB酰化，得到化合物I-9和I-12(和本文其它实例中提供的其它化合物)。尽管此方法概述所述化合物的合成，但所属领域的技术人员应认识到此方法可用于合成其它式I化合物。
制备R 3 含有环氧化物的化合物的通用方法C
反应图5
如上文反应图5中所绘示，使通用方法B的醛中间体AA与二甲基亚甲基硫氧反应，得到环氧化物I-6。尽管此方法概述所述化合物的合成，但所属领域的技术人员应认识到此方法可用于合成其它式I化合物。
制备R 3 含有2-烯酰胺的化合物的通用方法D
反应图6
如上文反应图6中所绘示，使用盐酸移除通用方法A的中间体P的Boc基团，得到胺CC。利用适宜肽偶合条件使中间体CC与N-Boc-3-(Fmoc)氨基-L-丙氨酸缩合，得到三肽中间体DD。使用哌啶自DD选择性移除Fmoc保护基团得到胺EE。使用酰氯酰化EE得到酰胺FF-1或FF-2。使用氢氧化锂使FF-1或FF-2水解，随后酸化，得到酸GG-1或GG-2。利用适宜肽偶合条件使酸GG-1或GG-2与苯磺酰胺偶合，得到I-2和I-5。尽管此方法概述所述化合物的合成，但所属领域的技术人员应认识到此方法可用于合成其它式I化合物。应了解，可颠倒所述酰化和磺酰胺偶合步骤以在附加R2基团后附加R3基团。
尽管在上文反应图中绘示特定保护基团，例如Boc和TBS，但所属领域的技术人员应认识到其它胺和羟基保护基团也适用于制备本发明化合物。因此，本发明涵盖各种胺羟基保护基团。适宜保护基团已为所属领域的技术人员所熟知，且包括详细阐述于以下文献中者：有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)，格林(T.W.Greene)和伍兹(P.G.M.Wuts)，第3版，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)，1999，其全文以引用方式并入本文中。
实例1
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(2-丙烯酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-3)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物。
中间体1
1-[[[(2S,4R)-1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-2-吡咯烷基]羰基]氨基]-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸乙基酯：边搅拌边向(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙基酯甲苯磺酸(2.29g,7.0mmol)和N-Boc(2S,4R)-(2-苯基-7-甲氧基喹啉-4-侧氧基)脯氨酸(3.4g,7.3mmol)存于100ml DCM中的溶液中添加HATU(3.44g,9.05mmol)和随后DIEA(3.81ml,21.9mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。起始材料完全耗尽后，将反应混合物用盐水洗涤两次并经MgSO4干燥。移除溶剂后，在硅胶(己烷:EtOAc＝2:1)上对粗产物实施色谱处理。获得3.45g标题化合物：Rf 0.3(EtOAc:己烷＝2:1)；MS m/z：602.36(M+H+)。
中间体2
1-[[[(2S,4R)-1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-2-吡咯烷基]羰基]氨基]-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸：向中间体1产物(1.70g,2.83mmol)存于140ml THF/H2O/MeOH(9:5:1.5)中的溶液中添加氢氧化锂单水合物(0.95g,22.6mmol)。在室温下搅拌24小时后，用1.0N HCl中和反应混合物。在真空中蒸发有机溶剂，并使用1.0N HCl将剩余水相酸化至pH～3，并用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机层，并经无水硫酸镁干燥。移除溶剂后，获得1.6g标题化合物：Rf 0.2(EtOAc:MeOH＝10:1)；MS m/z：574.36(M+H+)。
中间体3
N-(1,1-二甲基乙氧基)羰基)-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：向中间体2产物(1.24g,2.16mmol)存于20ml DMF中的溶液中添加HATU(0.98g,2.58mmol)和DIEA(1.43ml,8.24mmol)，将混合物搅拌1小时，随后添加苯磺酰胺(1.30g,8.24mmol)、DMAP(1.0g,8.24mmol)和DBU(1.29g,8.4mmol)存于15ml DMF中的溶液。再持续搅拌4小时。将反应混合物用EtOAc稀释并使用水性NaOAc缓冲液(pH～5,2x10ml)、NaHCO3溶液和盐水洗涤。经MgSO4干燥并移除溶剂后，通过添加一份DCM使纯净产物沉淀。浓缩滤液，并在硅胶上使用己烷/EtOAc(1:1-1:2)对残留物实施色谱处理。总共获得0.76g标题化合物：Rf 0.3(EtOAc:己烷＝3:1)，MS m/z：713.45(M+H+)，735.36(M+Na+)。
中间体4
(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：向中间体3产物存于30ml DCM中的溶液中逐滴添加15ml TFA。将混合物在室温下搅拌2小时。移除溶剂后，倾倒入一份20-ml的DCM，随后蒸发至干燥。所述添加DCM随后蒸发的过程重复四次。添加甲苯(20ml)且随后通过蒸发至干燥来移除。此周期重复两次得到残留物，其固化成标题化合物的TFA盐形式的0.9g白色粉末。使用NaHCO3中和少量TFA盐试样，获得标题化合物：Rf 0.4(DCM:MeOH＝10:1)；MS m/z：613.65(M+H+)。
中间体5
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：在室温下边搅拌边向中间体4产物(0.15g,0.178mmol)和N-Boc-3-(Fmoc)氨基-L-丙氨酸(0.107g,0.25mmol)存于3.0ml DMF中的溶液中添加HATU(85.1mg,0.224mmol)和NMM(90.5mg,0.895mmol)。TLC分析表明偶合反应在1小时后完成。倾倒入一份20-ml的EtOAc，并使用缓冲液(pH～4,AcONa/AcOH)、NaHCO3和盐水洗涤混合物，并经MgSO4干燥。移除溶剂后，在硅胶(洗脱液：EtOAc/己烷)上对粗油状产物实施色谱处理。总共获得0.12g标题化合物：Rf 0.4(EtOAc:己烷＝1:1)；MS m/z：1021.56(M+H+)。
中间体6
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：将110mg中间体5产物(0.108mmol)存于含有12％哌啶的1ml DMF中的溶液在室温下搅拌1.5小时，并随后在高真空下蒸发至干燥。使用己烷/醚(4:1)研磨残留物，获得70mg标题化合物：Rf 0.25(EtOAc:MeOH＝10:1)；MS m/z：798.9(M+H+)。
化合物(I-3)
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(2-丙烯酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：在0℃下将丙烯酰氯(11uL,0.132mmol)逐滴添加至69mg中间体6产物存于含有3当量三乙胺的3ml DCM中的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1.5hr，并随后用10ml DCM稀释。所得溶液用盐水洗涤两次并经硫酸镁干燥。移除溶剂获得粗产物，通过在硅胶上首先使用己烷/EtOAc(1:3～1:5)且随后使用DCM-甲醇(50:1～25:1)洗脱实施色谱处理而予以纯化。总共获得36mg标题化合物：Rf 0.25(DCM:MeOH＝25:1)；MS m/z：892.55(M+H+)。
使用中间体6产物以类似方式来制备以下化合物：
2-氯亚磺酰基苯甲酰氯提供N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-(苯并异噻唑啉-3-酮-2-基)-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-10)：Rf 0.3(EtOAc:己烷＝5:1)；MS m/z：933.55(M+H+)，955.55(M+Na+)。
1-氰基环丙基羰酰氯提供N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(1-氰基-环丙基羧基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-11)：0.15(EtOAc:己烷＝5:1)；MS m/z：892.55(M+H+)。
丙酰氯提供N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(丙酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(IR-3)：Rf 0.35(EtOAc:己烷＝5:1)；MS m/z：855.45(M+H+)，877.36(M+Na+)。
氯乙酰氯提供N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(氯乙酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-7)：Rf 0.3(EtOAc:己烷＝3:1)；MS m/z：875.45(M+H+)。
R-氯丙酰氯提供N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[R-(氯丙酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-13)：Rf 0.5(EtOAc/己烷＝2/1)，M/Z 889.55(M+H+)。
(S)-2-氯丙酰氯提供(S)-3-((S)-2-氯丙酰胺基)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-21)：M/Z 889.45(M+H+)。
(R)-2-溴丙酰氯提供(S)-3-(2-溴丙酰胺基)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-22)：M/Z 934.70(M+H+)。
2-氯-2-苯基乙酰氯提供(S)-3-(2-氯-2-苯基乙酰胺基)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-23)：M/Z 952.3(M+H+)。
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-35)是遵循实例1中所述的程序来制备，只是在中间体3步骤中使用环丙基磺酰胺替换苯磺酰胺。M/Z 817.30(M+H+)。
(1R,2S)-1-((2S,4R)-1-((S)-3-丙烯酰胺基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺基)-2-乙烯基环丙烷甲酸(I-41)是遵循实例1中所述的程序通过在最后一步中使用酯代替磺酰胺随后使酯LiOH水解成羧酸来制备。M/Z 714.30(M+H+)。
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(4-乙炔基苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-61)是遵循实例1中所述的程序通过在中间体3合成中使用4-乙炔基苯磺酰胺来制备：Rf 0.58(EtOAc/MeOH 10:1)；MS m/z：877.3(M+H+)。
实例2
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-(氯乙酰基)氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-4)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体7
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：在室温下边搅拌边向中间体4产物(0.15g,0.178mmol)和(2S)-2-Boc-氨基]-4-Fmoc-氨基丁酸(0.107g,0.25mmol)存于3.0ml DMF中的溶液中添加HATU(85.1mg,0.224mmol)和NMM(90.5mg,0.895mmol)。1小时后，TLC分析显示反应完成。倾倒入一份20-ml的EtOAc，并使用缓冲液(pH～4,AcONa/AcOH)、NaHCO3溶液和盐水洗涤混合物，并经MgSO4干燥。移除溶剂后，在硅胶(洗脱液：EtOAc/己烷)上对粗产物实施色谱处理，得到0.12g标题化合物：Rf 0.35(EtOAc:己烷＝2:1)；MS m/z：1035.45(M+H+)。
中间体8
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-氨基丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：将110mg中间体7产物的溶液溶解于含有12％哌啶的1ml DMF的溶液中。将混合物在室温下搅拌1.5小时，并随后在高真空下蒸发至干燥。使用己烷/醚(4:1)研磨残留物，获得70mg标题化合物：Rf 0.55(DCM/MeOH＝25:1)；MS m/z：813.66(M+H+)。
化合物(I-4)
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-(氯乙酰基)氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：在0℃下边搅拌边向中间体8产物(60mg,0.074mmol)存于存在三乙胺(70μl,0.5mmol)的3ml二氯甲烷中的溶液中逐滴添加氯乙酰氯(15μL，0.18mmol，3.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌1.5hr。将反应混合物用10ml DCM稀释，用盐水洗涤两次并经硫酸镁干燥。移除溶剂获得粗产物，通过在硅胶(洗脱液：己烷/EtOAc(1:3-1:5)和DCM/MeOH(50:1-25:1))上实施色谱处理而予以纯化。27mg标题化合物：Rf 0.45(DCM/MeOH＝50:1)，MS m/z：889.55(M+H+)。
以类似方式使中间体8产物与丙烯酰氯缩合提供(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-(2-丙烯酰基)氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-8)：Rf 0.65(EtOAc:MeOH＝10:1)；MS m/z：867.55(M+H+)，889.45(M+Na+)。
外消旋-2-氯丙酰氯提供(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-(R,S-氯丙酰基)氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-1)：Rf 0.6(EtOAc/MeOH＝10/1)，M/Z 903.64(M+H+)；925.55(M+Na+)。
2-溴丙酰氯提供I-20：M/Z 949.36(M+H+)。
实例3
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-(2-丙烯酰基)甲基氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-12)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体9
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-O-[(1,1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-L-高丝氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：边搅拌边向中间体4产物(0.20g,0.326mmol)和N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-O-[(1,1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]-L-高丝氨酸(0.152g,0.457mmol)存于10ml DMF中的溶液中添加HATU(0.155g,0.408mmol)且随后逐滴添加NMM(0.175ml,1.63mmol)。将所述混合物在室温下搅拌1小时。反应溶液用饱和NaHCO3中和，使用EtOAc萃取。将有机相用盐水洗涤三次，经无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发得到残留物，通过使用EtOAc/己烷＝1:2实施快速色谱处理予以纯化，得到0.21g标题化合物：Rf 0.30(EtOAc/己烷＝1:1)；MS m/z：928.64(M+H+)，950.55(M+Na+)。
中间体10
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-L-高丝氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：将中间体9产物(189mg,0.2mmol)存于TBAF(0.4ml存于THF中的1.0M TBAF)和4ml THF中的溶液在室温下搅拌3小时。在真空中蒸发反应溶液以移除THF。将残留物溶解于EtOAc中。将所述溶液用水和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发得到残留物，实施快速色谱处理(EtOAc/己烷＝5:1)予以纯化，得到150mg标题化合物：Rf 0.30(EtOAc/己烷＝5:1)；MS m/z：814.36(M+H+)，836.27(M+Na+)。
中间体11
(2S)-N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-4-侧氧基丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：在冰-水浴中向中间体10产物(100mg,0.123mmol)存于8ml DCM中的溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(62.8mg,0.148mmol)。将混合物在0℃下搅拌1小时并随后在室温下搅拌30分钟。反应混合物用***处理，并蒸发。将残留物直接引入至色谱柱上以使用EtOAc/己烷＝2:1实施纯化，得到66.7mg标题化合物：Rf 0.30(EtOAc/己烷＝2:1)；MS m/z：812.45(M+H+)。
中间体12
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-甲基氨基丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺：边搅拌边向甲胺(87.6μl,1.01mmol)存于混合溶剂(6ml MeOH/3ml CHCl3)中的溶液中添加中间体11产物(82.3mg,0.101mmol)，随后添加四甲基铵三乙酰氧基硼氢化物(66.4mg,0.253mmol)。将所述混合物在室温下搅拌1小时。蒸发所得溶液以移除溶剂并用EtOAc(3x 20ml)萃取。合并萃取物，用盐水洗涤两次，经无水硫酸镁干燥。移除溶剂后，通过使用EtOAc/己烷＝5:1实施快速色谱处理来纯化残留物，得到59mg标题化合物：Rf 0.20(EtOAc/己烷＝5:1)；MS m/z：827.55(M+H+)，849.45(M+Na+)。
化合物I-12
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-(2-丙烯酰基)甲基氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-12)：在0℃下，向中间体12产物(67.8mg,0.082mmol)和三乙胺(46μl,0.328mmol)存于4ml二氯甲烷中的溶液中添加丙烯酰氯(7.4μl,0.090mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将溶液用水洗涤两次并经硫酸镁干燥，并蒸发。通过使用EtOAc/己烷＝5:1实施快速色谱处理来纯化残留物，得到15mg标题化合物：Rf 0.65(EtOAc/MeOH＝10:1)；MS m/z：881.55(M+H+)，903.55(M+Na+)。
以类似方式使中间体12产物与氯乙酰氯缩合得到：(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-4-(氯乙酰基)甲基氨基-丁酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-9)：Rf 0.35(EtOAc/己烷＝5:1)；MS m/z：903.55(M+H+)。
实例4
(2S)-2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-环氧乙烷丙酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-6)：在室温下于氮气中将中间体11产物(26.8mg,0.033mmol)存于DMSO中的溶液一次性添加至三甲基碘化亚砜(Me3SOI,21.8mg,0.099mmol)与KOt-Bu(11.1mg,0.099mmol)的无水混合物中。将所得澄清溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水处理且用EtOAc萃取。将有机萃取物用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发。在TLC板上使用EtOAc/己烷＝2:1对粗产物进行纯化，得到4.5mg标题化合物：Rf 0.36(EtOAc/己烷＝2:1)；MS m/z：808.45(M+H+-H2O)。
实例5
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(4-二甲基氨基-2-丁烯酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-5)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体13
1-[[[(2S,4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-2-吡咯烷基]羰基]氨基]-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸乙基酯二盐酸盐：将5.22g中间体1产物(8.68mmol)溶解于190ml存于二噁烷中的4N HCl中。将混合物在室温下搅拌2.0hr。浓缩反应混合物以获得半固体状产物(5.0g)，通过添加己烷进行固化，得到4.3g标题化合物。
中间体14
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸乙基酯：向中间体13产物(0.1145g,0.2mmol)和(2S)-2-Boc-氨基]-4-Fmoc-氨基丁酸(0.119g,0.28mmol)存于1.47ml DMF中的溶液中添加HATU(0.095g,0.25mmol)。逐滴添加NMM(0.1086ml,0.68mmol)，并在室温下持续搅拌1小时。将反应混合物用30ml EtOAc稀释，并用5％NaHCO3和盐水洗涤，并经MgSO4干燥。移除溶剂后，通过快速色谱(己烷:EtOAc＝2:1)对粗产物进行纯化，获得0.143g标题化合物：Rf 0.30(EtOAc:己烷＝1:1)。MS m/z：910.55(M+H+)。
中间体15
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸乙酯：边搅拌边向中间体14产物(0.429g,0.47mmol)存于4.5ml DMF中的溶液中添加0.5ml哌啶。在室温下持续搅拌30分钟。将反应混合物倾倒至30ml水中，用EtOAc(3x 30ml)萃取，并经MgSO4干燥。蒸发溶剂后，通过快速色谱(EtOAc:MeOH＝10:1)对残留物进行纯化，得到0.15g标题化合物：Rf 0.20(EtOAc:MeOH＝10:1)；MS m/z：688.45(M+H+)，710.45(M+Na+)。
中间体16
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-(4-二甲基氨基-2-丁烯酰基)氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸乙酯：向中间体15产物(100mg,0.145mmol)和4-二甲基氨基2-丁烯酸(24.1mg,0.145mmol)存于5ml DCM中的溶液中添加HATU(68.6mg,0.18mmol)且随后添加DIEA(75.8μl,0.436mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水洗涤两次并经MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过使用EtOAc:MeOH＝1:1实施快速色谱处理对混合物进行纯化，得到0.10g标题化合物：Rf 0.25(EtOAc:MeOH＝10:1)MS m/z：799.45(M+H+)。
使用巴豆酰氯以类似方式制备N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-(2-丁烯酰基)氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸乙酯：Rf 0.30(EtOAc:己烷＝3:1)。MS m/z：756.45(M+H+)。
中间体17
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-(4-二甲基氨基-2-丁烯酰基)氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸：向中间体16产物(100mg,0.125mmol)存于10ml THF/H2O/MeOH(9:5:1.5)中的溶液中添加LiOH·H2O(42mg,1.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌24小时，并用乙酸中和。在真空中蒸发有机溶剂，并用EtOAc萃取剩余水相。用盐水洗涤有机层，经MgSO4干燥。移除溶剂后获得77.1mg标题化合物：MS m/z：771.45(M+H+)，793.45(M+Na+)。
自N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-(2-丁烯酰基)氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸乙酯开始以类似方式制备N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-(2-丁烯酰基)氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸：m/z：728.2(M+H+)，750.2(M+Na+)。
化合物I-5
N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(4-二甲基氨基-2-丁烯酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-5)：将中间体17产物(77.1mg,0.10mmol)、HATU(47.5mg,0.125mmol)、DIPEA(69.5μl,0.4m mol)存于2ml无水DMF中的溶液搅拌1小时和15分钟。随后，向上文反应溶液中添加苯磺酰胺(62.9mg,0.4mmol)、DMAP(56.2mg,0.413mmol)和DBU(61.6μl,0.413mmol)存于2ml无水DMF中的溶液。将反应物在室温下搅拌过夜。将所得反应混合物用EtOAc(45ml)稀释，并相继用水性乙酸钠缓冲液(pH～4,2x15ml)、5％碳酸氢钠水溶液(15ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并蒸发。在制备型TLC板(EtOAc:MeOH＝1:1)上对粗残留物进行纯化，得到15mg标题化合物：Rf 0.40(EtOAc:MeOH＝1:1)；MS m/z：910.55(M+H+)。
以类似方式自N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-(2-丁烯酰基)氨基-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷甲酸制备N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(2-丁烯酰基)氨基]-L-丙氨酰基-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧基]-L-脯氨酰基-1-氨基-2-乙烯基-N-(苯基磺酰基)-(1R,2S)-环丙烷甲酰胺(I-2)：Rf 0.35(EtOAc:己烷＝5:1)；MS m/z：867.55(M+H+)。
实例6
使Boc-脯氨酸甲基酯与羰基二咪唑(CDI)缩合以形成中间体咪唑氨基甲酸酯，随后使其暴露于4-氟异二氢吲哚。用氢氧化锂使甲基酯水解，并使用HATU使所得游离羧酸根偶合至2-乙烯基-1-氨基环丙烷甲酸乙基酯。使用三氟乙酸(TFA)移除所得二肽上的Boc保护基团，并使用经保护的烯丙基-鸟氨酸来酰化所得胺。利用钌催化的闭环复分解(RCM)形成大环并使用氢氧化锂(LiOH)使C末端酯水解。使用HATU使此游离酸偶合至环丙烷磺酰胺，使用N-甲基吗啉移除鸟氨酸侧链上的Fmoc保护基团并使用丙烯酰氯酰化所述游离胺以产生最终产物化合物I-18。上文所提及的经保护的烯丙基-鸟氨酸可通过以下来达成：使用儿茶酚-硼烷选择性还原经适当保护的谷氨酸、将所得醇氧化成醛，经由还原胺化引入烯丙基胺，使用Fmoc-氯化物保护侧链胺，并最后使用氢氧化锂使酯水解得到所需要的中间体。
使用前述反应图中所述的程序可制备以下化合物：
化合物I-19
(1aR,3aS,5R,9S,16aS,Z)-4-氟异二氢吲哚-2-甲酸11-丙烯酰基-9-(叔丁氧基羰基氨基)-1a-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-3,8-二侧氧基-1,1a,2,3,3a,4,5,6,8,9,10,11,12,13,14,16a-十六氢环丙烷[n]吡咯并[2,1-c][1,4,8]三氮杂环十五烯-5-基酯
化合物I-16
4-氟异二氢吲哚-2-甲酸(1aR,3aS,5R,9S,16aS,Z)-9-(叔丁氧基羰基氨基)-1a-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-11-(N-甲基丙烯酰胺基)-3,8-二侧氧基-1,1a,2,3,3a,4,5,6,8,9,10,11,12,13,14,16a-十六氢环丙烷[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂环十五烯-5-基酯
实例7
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基丙烯酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-52)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物。
中间体7-1
(2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯：遵循对于中间体3所述的程序通过使用环丙基磺酰胺代替苯磺酰胺自中间体2(实例1)制备中间体7-1。Rf 0.3(EtOAc:己烷＝3:1)，MS m/z：677.2(M+H+)。
中间体7-2
(2S,4R)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺：将中间体7-1产物(0.8g,1.18mmol)溶解于5ml存于二噁烷中的4N HCl中，并将反应物在室温下搅拌1小时。移除溶剂后，倾倒一份20-ml的DCM，随后蒸发至干燥。所述添加DCM随后蒸发的过程重复三次，得到HCl盐形式的化合物6。MS m/z：577.2(M+H+)。
中间体7-3
(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(2-硝基苯基磺酰胺基)丙酸：在室温下向(S)-3-氨基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(2.04g,10mmol)、TEA(4.5ml,30mmol)存于50ml CH2Cl2中的溶液中添加硝基苯磺酰氯(2.9g,13.0mmol)。将混合物在室温下搅拌10小时。在真空中移除溶剂，随后添加100ml EtOAc。用1N HCl(至pH 3)、水和盐水洗涤有机层。有机层经Na2SO4干燥，过滤并移除溶剂，获得粗中间体7-3(4.0g)。
中间体7-4
(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(N-甲基-2-硝基苯基磺酰胺基)丙酸甲酯：将粗中间体7-3(2.0g)、K2CO3(1.5g，4当量)溶解于10ml DMF中。在室温下向反应物中添加MeI(0.8ml，4当量)。将所得混合物搅拌20小时。在真空中移除大部分DMF，并添加100ml EtOAc，并用水和盐水洗涤混合物。经Na2SO4干燥有机层。移除溶剂后，将粗产物在短硅胶柱(洗脱液：EtOAc/己烷)上实施处理，产生1.62g中间体7-4。MS m/z：439.9(M+Na+)。
中间体7-5
(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(N-甲基-2-硝基苯基磺酰胺基)丙酸：向中间体7-4(1.6g,3.8mmol)存于10mL THF/MeOH(1:1)中的溶液中添加1N LiOH水溶液(5.8mL,5.8mmol)。在室温下搅拌10小时后，用1.0N HCl中和反应混合物。在真空中蒸发有机溶剂，并使用1.0N HCl将剩余水相酸化至pH～3，并用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机层，并经无水硫酸钠干燥。移除溶剂后，获得1.5g中间体7-5。MS m/z：402.0(M-1，负电模式)。
中间体7-6
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基-2-硝基苯基磺酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯：在室温下边搅拌边向中间体7-2(0.27g,0.44mmol)和中间体7-5(0.24g,0.58mmol)存于5.0mL无水乙腈中的溶液中添加HATU(0.22g,0.58mmol)和DIEA(0.23mL,1.3mmol)。TLC分析和LC-MS表明1小时后偶合反应完成。倾倒入一份20-ml的EtOAc，并使用缓冲液(pH～4,AcONa/AcOH)、NaHCO3和盐水洗涤混合物。经Na2SO4干燥有机层。移除溶剂后，在硅胶(洗脱液：EtOAc/己烷)上对粗产物实施色谱处理。总共获得0.35g中间体7-6：Rf 0.4(EtOAc:己烷＝1:1)；MS m/z：962.2(M+H+)。
中间体7-7
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-3-(甲基氨基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯：向中间体7-6(0.35g,0.36mmol)存于5mL DMF中的溶液中添加苯基硫醇(80mg,0.72mmol)和K2CO3(0.20g,1.0mmol)。将所得混合物在室温下搅拌10小时。添加30mL EtOAc，并用水和盐水和水洗涤混合物。经Na2SO4干燥有机层。移除溶剂后，在硅胶(洗脱液：EtOAc/己烷)上对粗产物实施色谱处理，产生0.2g中间体7-7。MS m/z：777.2(M+H+)。
化合物(I-52)
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基丙烯酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-52)：在0℃下，将丙烯酰氯(18uL,0.207mmol)逐滴添加至108mg中间体7-7产物存于含有3当量三乙胺的3mL DCM中的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1.5hr，并随后用10ml DCM稀释。所得溶液用盐水洗涤两次并经硫酸镁干燥。移除溶剂获得粗产物，通过在硅胶上首先使用己烷/EtOAc(1:3～1:5)且随后使用DCM-甲醇(50:1～25:1)洗脱实施色谱处理而予以纯化。总共获得100mg标题化合物：Rf 0.25(DCM:MeOH＝25:1)；MS m/z：831.3(M+H+)。
(S)-N-乙基-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-78)：以类似方式通过在中间体7-4的步骤中使用碘乙烷来制备化合物I-78。MS m/z：845.3(M+H+)。
(S)-N-2-丙烯基-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-79)：通过在中间体7-4的步骤中使用烯丙基溴来制备化合物I-79。MS m/z：857.3(M+H+)。
(S)-3-(2-侧氧基吡咯-3-烯基)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-80)：通过利用钌催化的闭环复分解自化合物I-79制备化合物I-80。MS m/z：829.3(M+H+)。
(S)-N-甲基-4-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-82)：通过在中间体7-3的步骤中使用(2S)-2-boc-氨基-4-氨基丁酸代替(S)-3-氨基-2-boc-氨基丙酸来制备化合物I-82。Rf 0.35(EtOAc/MeOH 10:1)；MSm/z：845.30(M+H+)。
实例8
(S)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基丙烯酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-28)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物。
中间体8-1
(S)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(甲基氨基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯：按照实例7中对于中间体7-7所述的程序使用来自实例1的中间体4代替中间体7-2来制备中间体8-1。MS m/z：813.3(M+H+)。
化合物I-28
(S)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基丙烯酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-28)：在0℃下，将丙烯酰氯(1.2当量)逐滴添加至100mg中间体8-1产物存于含有3当量三乙胺的3mL DCM中的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1.5hr，并随后用10ml DCM稀释。所得溶液用盐水洗涤两次并经硫酸镁干燥。移除溶剂获得粗产物，通过在硅胶上首先使用己烷/EtOAc(1:3～1:5)且随后使用DCM-甲醇(50:1～25:1)洗脱实施色谱处理而予以纯化。总共获得80mg标题化合物：Rf 0.25(DCM:MeOH＝25:1)；MS m/z：867.2(M+H+)。
以类似方式使用中间体8-1产物来制备以下化合物：
氯乙酰氯提供(S)-3-(2-氯-N-甲基乙酰胺基)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-29)：MS m/z：890.30(M+H+)；
(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰氯提供(S)-3-((E)-4-(二甲基氨基)-N-甲基丁-2-烯酰胺基)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-30)：M/Z 924.3(M+H+)；
甲基丙烯酰氯提供(S)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基甲基丙烯酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-32)：MS m/z：881.3(M+H+)；
2-氯-2-苯基乙酰氯提供(2S)-3-(2-氯-N-甲基-2-苯基乙酰胺基)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-33)：MS m/z：965.20(M+H+)；
丁-2-炔酰氯提供(S)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基丁-2-炔酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-51)：MS m/z：879.30(M+H+)；
2-(三氟甲基)丙烯酰氯提供(S)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基-2-(三氟甲基)丙烯酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-53)：MS m/z：935.30(M+H+)。
实例9
(2S,4R)-1-(2-丙烯酰胺基乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-27)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物。
中间体9-1
(2S,4R)-1-(2-叔丁氧基羰基氨基乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺：在室温下边搅拌边向来自实例1的中间体4产物(0.10g,0.15mmol)和N-Boc-甘氨酸(0.035g,0.20mmol)存于3.0mL乙腈中的溶液中添加HATU(85.1mg,0.22mmol)和DIEA(0.09mL,0.5mmol)。将反应混合物搅拌2h。LC-MS和TLC分析表明偶合反应完成。倾倒入20-mL EtOAc，并使用缓冲液(pH～4,AcONa/AcOH)、NaHCO3和盐水洗涤混合物，并经Na2SO4干燥。移除溶剂后，在硅胶(洗脱液：EtOAc/己烷)上对粗产物实施色谱处理。总共获得0.11g标题化合物：Rf 0.2(EtOAc:己烷＝2:1)；MS m/z：770.3(M+H+)。
中间体9-2
(2S,4R)-1-(2-氨基乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺：将中间体9-1产物(0.11g,0.13mmol)溶解于2mL存于二噁烷中的4N HCl中，并将反应物在室温下搅拌1小时。移除溶剂后，倾倒入一份3-mL的DCM，随后蒸发至干燥。所述添加DCM随后蒸发的过程重复三次，得到HCl盐形式的标题化合物中间体9-2(0.10g)。MS m/z：670.2(M+H+)。
化合物I-27
(2S,4R)-1-(2-丙烯酰胺基乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-27)：通过使用HATU遵循对于中间体9-1所述的偶合反应使中间体9-2与丙烯酸偶合来制备标题化合物。总共获得0.10g标题化合物，87％：Rf 0.5(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：724.3(M+H+)。
遵循实例9中所述的程序以类似方式来制备以下化合物：
化合物I-34
(2S,4R)-1-((S)-2-丙烯酰胺基丙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-34)：Rf 0.4(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：738.20(M+H+)。
化合物I-43
(2S,4R)-1-(2-丁-2-炔酰胺基乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-43)：Rf 0.4(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：736.2(M+H+)。
化合物I-44
(2S,4R)-1-(2-甲基丙烯酰胺基乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-44)：Rf0.45(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：738.3(M+H+)。
化合物I-45
(2S,4R)-1-(2-((S,R)-2-氯-2-苯基乙酰胺基)乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-45)：Rf0.55(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：822.3(M+H+)。
化合物I-46
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基丙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(1-46)：Rf0.4(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：738.2(M+H+)。
化合物I-47
(2S,4R)-1-(2-(E)-丁-2-烯酰胺基乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-47)：Rf0.45(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：738.3(M+H+)。
化合物I-24
4-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-羰基)哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(I-24)：Rf 0.20(存于DCM中的10％MeOH)；MS m/z：839.3(M+H+)。
化合物I-25
1-(2-氯乙酰基)-4-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-羰基)哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(I-25)：Rf 0.50(存于EtOAc中的10％MeOH)；MS m/z：915.3(M+H+)。
化合物I-26
1-丙烯酰基-4-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-羰基)哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(I-26)：Rf 0.40(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：893.4(M+H+)。
化合物I-59
(S)-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(4-氟-3-硝基苯基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-59)：Rf 0.40(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：923.3(M+H+)。
化合物I-63
(2S,4R)-1-(2-氟-4-硝基苯甲酰胺基乙酰基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-63)：Rf 0.61(EtOAc/MeOH 10:1)；MS m/z：837.3(M+H+)。
化合物IR-27
通过与乙烯基磺酰氯反应可制备以下结构：(2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-1-(2-丙酰胺基乙酰基)吡咯烷-2-甲酰胺(IR-27)：MS m/z：726.30(M+H+)。
实例10
化合物I-39
(2S,4R)-1-(2-丙烯酰胺基乙酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-39)：按照实例9中所述的步骤和中间体通过在第一步中使用中间体7-2代替中间体4来制备标题化合物。
MS m/z：687.8(M+H+)。
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-3-甲基-1-侧氧基丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-R)：按照实例9中所述的步骤和中间体通过在第一步中使用中间体7-2代替中间体4且使用Boc-L-缬氨酸代替Boc-甘氨酸来制备标题化合物。
MS m/z：776.3(M+H+)。
遵循实例10中所述的程序以类似方式来制备以下化合物：
化合物I-37
(2S,4R)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-1-(2-(N-甲基丙烯酰胺基)乙酰基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-37)：MS m/z：702.0(M+H+)。
化合物I-38
2-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-2-侧氧基乙基氨基甲酸叔丁酯(I-38)：MSm/z：733.9(M+H+)。
化合物I-48
(2S,4R)-1-(2-丁-2-炔酰胺基乙酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-48)：Rf 0.4(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：700.20(M+H+)。
化合物I-49
(2S,4R)-1-丙烯酰基-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-49)：MS m/z：631.0(M+H+)。
化合物I-54
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基丙酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-54)：Rf 0.66(存于DCM中的10％MeOH)；MS m/z：702.30(M+H+)。
化合物I-56
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基-3-甲基丁酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-56)：Rf 0.61(存于DCM中的10％MeOH)；MS m/z：730.30(M+H+)。
化合物I-57
(2S,4R)-1-(2-(E)-丁-2-烯酰胺基乙酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-57)：Rf 0.6(存于DCM中的10％MeOH)；MS m/z：702.2(M+H+)。
化合物I-60
(2S,4R)-1-((S)-2-丙烯酰胺基-3-甲基丁酰基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-60)：Rf 0.45(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：766.3(M+H+)。
化合物I-65
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基-3,3-二甲基丁酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-65)：MS m/z：744.30(M+H+)。
化合物I-66
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基-苯基乙酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-66)：MSm/z：764.30(M+H+)。
化合物I-67
(2S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-5-((2R,3S)-2-甲基-4-侧氧基环氧丙烷-3-基氨基)-1,5-二侧氧基戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-67)：MS m/z：889.2(M+H+)。
化合物I-69
(2S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-5-((3S)-2-侧氧基环氧丙烷-3-基氨基)-1,5-二侧氧基戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-69)：MS m/z：875.3(M+H+)。
化合物I-70
(2S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-5-(2-侧氧基氮杂环丁基)-1,5-二侧氧基戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-70)：MS m/z：859.2(M+H+)。
实例11
化合物I-31
(2S,4R)-1-((S)-3-丙烯酰胺基-2-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-侧氧基六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)丙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-31)按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体11-1
(2S,4R)-1-((S)-3-丙烯酰胺基-2-氨基丙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺：向实例1产物(I-3)(30mg,0.04mmol)存于3mL DCM中的溶液中逐滴添加0.5mL TFA。将混合物在室温下搅拌2小时。移除溶剂后，倾倒入一份5-mL的DCM，随后蒸发至干燥。所述添加DCM随后蒸发的过程重复四次。添加甲苯(4mL)并随后通过蒸发至干燥而移除，获得标题化合物：MS m/z：753.2(M+H+)。
化合物I-31
(2S,4R)-1-((S)-3-丙烯酰胺基-2-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-侧氧基六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)丙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺(I-31)：通过按照实例9中对于中间体9-1所述的步骤使中间体11-1与生物素化的羧酸偶合来制备标题化合物。MS m/z：1092.4(M+H+)。
使用中间体11-1产物以类似方式来制备以下化合物：
化合物I-42
N1-((S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(苯基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基)-N1,N5-二甲基-N5-(丙-2-炔基)戊二酰胺(I-42)：Rf 0.45(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：918.3(M+H+)。
自化合物I-35(实例1)开始遵循上文所述的TFA-boc移除程序且使用甲酸氯环戊基酯来酰化所得胺，提供化合物I-55：
化合物I-55
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸环戊基酯(I-55)：Rf 0.59(存于EtOAc中的10％MeOH)；MS m/z：829.30(M+H+)。
自化合物I-52(实例7)开始遵循上文所述的TFA-boc移除程序且使用甲酸氯环戊基酯来酰化所得胺，提供化合物I-72：
化合物I-72
(S)-N-甲基-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸环戊基酯(I-72)：Rf 0.40(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：843.3(M+H+)。
自化合物I-52(实例7)开始遵循上文所述的TFA-boc移除程序且使用吡嗪-2-甲酸和HATU来酰化所得胺，提供化合物I-58：
化合物I-58
(S)-N-3-(N-甲基)丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基-2-丙基吡嗪甲酰胺(I-58)：Rf 0.35(存于DCM中的5％MeOH)；MS m/z：837.3(M+H+)。
自化合物I-52(实例7)开始遵循上文所述的TFA-boc移除程序且使用甲酸氯炔丙基酯来酰化所得胺，提供化合物I-81：
化合物I-81
(S)-N-甲基-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸丙-2-炔基酯(I-81)：MS m/z：813.3(M+H+)。
自化合物I-82(实例7)开始遵循上文所述的TFA-boc移除程序且使用甲酸氯环戊基酯来酰化所得胺，提供化合物I-85：
化合物I-85
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-4-(N-甲基丙烯酰胺基)-1-侧氧基丁-2-基氨基甲酸环戊基酯(I-85)：MS m/z：857.5(M+1)。
实例12
化合物I-50
(E)-丁-2-烯酸((2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-4-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-4-侧氧基丁-2-基)酯(I-50)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体12-1
(2S,3R)-3-((E)-丁-2-烯酰基氧基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸：在室温下向Boc-L-苏氨酸(0.44g 2.0mmol)存于10.0ml DCM中的溶液中添加巴豆基氯(0.32g,3.0mmol)，随后添加催化量的DMAP和TEA(1.0ml,6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10小时。添加NaHCO3水溶液(10mL)以终止反应。2小时后，缓慢添加1N HCl水溶液使PH～3。收集DCM层并用DCM(2X 10mL)萃取水性层。有机层经Na2SO4干燥，过滤，并移除溶剂以提供粗产物。
化合物I-50
(E)-丁-2-烯酸((2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-4-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-4-侧氧基丁-2-基)酯(I-50)：遵循实例1中对于中间体5所述的偶合反应使用HATU使来自实例7的中间体7-2与中间体12-1偶合来制备标题化合物。以约40％的产率总共获得58mg标题化合物。Rf 0.5(EtOAc)；MS m/z：846.0(M+H+)。
以类似方式自中间体7-2(实例7)制备化合物I-64：
化合物I-64
(2S,3R)-3-丙烯酰氧基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-64)：MS m/z：832.2(M+H+)。
实例13
化合物I-68
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯：(I-68)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体13-1
(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-7-甲基-5-侧氧基辛-6-烯酸：在-78℃下，向N-Boc-焦谷氨酸(0.23g 1.0mmol)存于10.0ml无水THF中的溶液中缓慢添加2-甲基丙-1-烯基)溴化镁(0.5M，存于THF中，5mL，2.5mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌1h。添加1N HCl(2.5ml)水溶液并将混合物缓慢升温至室温。使用1N HCl将pH调节至约等于3。随后在真空中移除THF并使用DCM(3X 20mL)萃取剩余水性物质。有机层经Na2SO4干燥，过滤，并移除溶剂以提供粗产物。
化合物I-68
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-68)：遵循实例1中对于中间体5所述的偶合反应使用HATU通过使实例7的中间体7-2与中间体13-1偶合来制备标题化合物。总共获得70mg标题化合物，65％：Rf 0.5(EtOAc)；MS m/z：844.2(M+H+)。
实例14
化合物I-73
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-73)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体14-1
(2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-1-(3,3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-甲酸：在室温下，向反式4-羟基L-BOC-脯氨酸(5g,21.6mmol)存于DMSO(60mL)中的溶液中一次性添加叔丁醇钾(7.3g,65mmol)。将混合物在室温下搅拌30min，使用冰-水浴(约17℃)冷却并分两份添加7-溴-1-氯异喹啉(5.24g,21.6mol)。使反应物升温至室温，搅拌1h(LC-MS显示反应完成，如果以较大规模实施则可能需要延长反应时间)。将反应混合物倾倒至400mL含有45mmol HCl的冰水中。反应混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，并经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，得到中间体14-1(约8g)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.32(t,1H,J＝0.8Hz),8.06(d,1H,J＝5.2Hz),7.92(dd,2H,J＝8.0,1.6Hz),7.46(d,1H,J＝6.0Hz),5.67(br s,1H),4.40(t,1H,J＝8.0Hz),3.77(m,1H),3.65(br d,1H,J＝12Hz),3.33(s,3H,OMe),2.65(m,1H),2.35(m,1H),1.36(s,9H)。LC/Ms：m/z435(M-1,ES-)。
中间体14-2
(1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酸叔丁酯：向500mg(1R,2S)-1-BOC-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸(2.2mmol)存于4mL DMA(N,N-二甲基乙酰胺)中的正在搅拌溶液中添加370mg羰基二咪唑(CDI,2.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1hr，随后添加280mg环丙基磺酰胺(2.3mmol)、1mL二异丙基乙胺和350uLDBU。将所得混合物在60℃下搅拌过夜。移除溶剂，并使用100mL EtOAc实施一般处理，用10mL 1.0N HCl水溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥。浓缩后，通过快速柱色谱对残留物进行纯化，得到580mg白色固体。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ9.7(br s,1H),5.61(m,1H),5.33(br dd,2H,J＝9.6,1.2Hz),5.18(dd,J＝9.6,1.2Hz),2.92(m,1H)2.14(q,1H,J＝8.0Hz),1.91dd,1H,J＝8.4,2.4Hz),1.55(br s,2H),1.47(s,9H),1.40(m,2H),1.30(m,2H),0.95-1.15(m,2H)。LC/MS：m/z 329.1，(M-1,ES-)。
中间体14-3
(1R,2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-乙烯基环丙烷甲酰胺：向存于2mL无水二氯甲烷中的580mg上文所述的中间体14-2中添加9mL存于二噁烷中的4.0M HCl。将混合物在室温下搅拌30min，随后在减压下浓缩，并在真空中干燥，得到约532mg中间体14-3的盐。
中间体14-4
(2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯：遵循实例1中对于中间体5所述的偶合反应使用HATU通过使中间体14-1与中间体14-3偶合来制备标题化合物。总共产生435mg中间体14-4(约67％)。LC/MS：m/z 649.6(ES+)，m/z＝647.6(ES-)。
化合物I-73
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-73)是遵循实例1中对于合成化合物I-3所述的程序自中间体14-4制备。通过快速柱色谱使用EtOAc作为洗脱液对化合物进行纯化，得到93mg标题化合物。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.30(s,1H),8.01(d,1,J＝5.6Hz),7.80(dd,1H,J＝8.8,2.0Hz),7.75(d,1H,J＝8.8Hz),7.33(d,1H,J＝5.6Hz),6.24(br d,2H,J＝8.0Hz),5.92(br s,1H),5.70-5.80(m,1H),5.65(dd,1H,J＝8.8,3.2Hz),5.34(d,1H,J＝18.4Hz),5.13(d,1H,J＝12.0Hz),4.55-4.63(m,1H),4.35(m,1H),3.58(dd,1H,J＝13.2,5.2Hz),3.47(m,1H),3.35(m,1H),2.97(m,1H,2.60(dd,1H,J＝13.2,6.8Hz),2.36(m,1H),2.30(q,1H,J＝8.4Hz),1.89(dd,1H,J＝7.6,5.2Hz),1.43(dd,1H,J＝4.8,8.4Hz),1.10-1.30(m,13H)。LC/MS：m/z 787.2(ES-)。
以类似方式使用中间体14-4产物遵循实例9中所述的程序来制备以下化合物：
化合物I-74
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基丙酰基)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-甲酰胺：MS m/z：674.0(M+H+)。
遵循实例13中所述的程序使用中间体14-4和中间体13-1产物来制备以下化合物：
化合物I-75
(S)-1-((2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯：1HNMR(CD3OD,400MHz)δ9.38(s,1H),8.31(d,1H,J＝0.8Hz),8.03(d,1,J＝6.0Hz),7.80-7.75(m,2H),7.33(d,1H,J＝6.0Hz),6.20(t,1H,J＝1.2Hz),5.92(br s,1H),5.70-5.80(m,1H),5.34(dd,1H,J＝17.2,1.6Hz),5.13(d,1H,J＝11.6Hz),4.63(m,1H),4.47(d,1H,J＝11.6Hz),4.33(t,1H,J＝6.8Hz),4.08-4.18(m,2H),2.96(m,1H),2.52-2.60(m,2H),2.24-2.35(m,2H),2.12(s,3H,Me),2.00(m,1H),1.90(s+m,4H,Me+1H),1.80(m,1H),1.40-1.43(m,1H),1.25(m,1H),1.17(s,9H),1.05-1.15(m,2H)。LC/MS：m/z 814.2(ES-)。
遵循实例7中所述的程序使用中间体14-4和中间体7-5产物来制备以下化合物：
化合物I-84
(S)-1-((2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-(N-甲基丙烯酰胺基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-84)：LC/MS：m/z：801.1，803.2(ES-)。
在中间体14-1的合成中自1-氯异喹啉而非7-溴-1-氯异喹啉开始且遵循实例14中的偶合步骤来制备化合物I-97：
化合物I-97
{l-(丙烯酰基氨基-甲基)-2-[2-(l-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-基]-2-侧氧基-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(I-97)LC-MS：m/z＝711.2(ES+)，709.2(ES-)。
在中间体14-1的合成中自1-氯异喹啉而非7-溴-1-氯异喹啉开始且遵循实例7中的偶合步骤来制备化合物I-98：
化合物I-98
{1-[(丙烯酰基-甲基-氨基)-甲基]-2-[2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-基]-2-侧氧基-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(I-98)LC-MS：m/z＝723.2(ES-)。
在中间体14-1的合成中自1-氯异喹啉而非7-溴-1-氯异喹啉开始且遵循实例13中的偶合步骤来制备化合物I-86：
化合物I-86
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯(I-86)：LC/MS：m/z：736.3(ES-)。
遵循实例13中所述的程序通过使中间体14-4与以与中间体13-1类似的方式制备的合适酸偶合可制备以下化合物：
化合物I-90
遵循实例13中所述的程序通过使中间体14-4与以与中间体13-1类似的方式制备的合适酸偶合来制备以下化合物：
化合物I-91
{1-[4-(7-溴-异喹啉-1-基氧基)-2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-吡咯烷-1-羰基]-5-甲基-4-侧氧基-庚-5-烯基}-氨基甲酸叔丁酯(I-91)，LC-MS：m/z838.0(ES+,M+Na)，814.2(ES-)。
在中间体14-1的合成步骤中自1-氯-6-甲氧基异喹啉开始且遵循上文所述的程序可制备以下化合物：
化合物I-93
化合物I-94
在中间体14-1的合成步骤中自1-氯-6-甲氧基异喹啉开始且遵循上文所述的程序来制备以下化合物：
化合物I-92
{1-(丙烯酰基氨基-甲基)-2-[2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(6-甲氧基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-基]-2-侧氧基-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(I-92)，LC-MS：m/z＝741.2(ES+)。
化合物I-95
{1-[2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(6-甲氧基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-羰基]-5-甲基-4-侧氧基-庚-5-烯基}-氨基甲酸叔丁酯(I-95)，LC-MS：m/z＝768.2(ES+)
化合物I-96
{1-[2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(6-甲氧基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-羰基]-6-甲基-4-侧氧基-庚-5-烯基}-氨基甲酸叔丁酯(I-96)，LC-MS：m/z＝768.2(ES+)。
化合物I-99
{1-[(丙烯酰基-烯丙基-氨基)-甲基]-2-[2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(6-甲氧基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-基]-2-侧氧基-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(I-99)，LC-MS：m/z＝779.3(ES-)
化合物I-100
{2-[2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(6-甲氧基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-基]-1-甲基-2-侧氧基-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(I-100)，LC-MS：m/z＝626.2(ES+)，624.2(ES-)。
化合物IR-100
(2S,4R)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(6-甲氧基异喹啉-1-基氧基)-1-((R)-2-丙酰胺基丙酰基)吡咯烷-2-甲酰胺(IR-100)，LC-MS：m/z＝628.2(ES+)，626.2(ES-)。
化合物I-101
{1-[2-(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基氨甲酰基)-4-(6-甲氧基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-1-羰基]-2-甲基-丙基}-氨基甲酸叔丁酯(I-101)，LC-MS：m/z＝654.2(ES+)，652.2(ES-)。
I-105
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基-4-甲基戊酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(6-甲氧基异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺，MS m/z：668.2(M+H+)。
I-106
(2S,4R)-1-((R)-2-丙烯酰胺基-3-苯基丙酰基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(6-甲氧基异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-2-甲酰胺，MS m/z：702.2(M+H+)。
I-129
MS：m/e＝754.2(M+1)
以类似方式，自I-92开始随后脱去-Boc并实施如I-31的偶合反应来制备生物素化的化合物。
I-103
1-{3-丙烯酰基氨基-2-[5-(2-侧氧基-六氢-噻吩并[3,4-d]咪唑-6-基)-戊酰基氨基]-丙酰基}-4-(6-甲氧基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-2-甲酸(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基-环丙基)-酰胺I-103，LC-MS：m/z＝867.3(ES+)，865.2(ES-)。
I-104
I-104，LC-MS：m/z＝1183.4(ES+)，1181.4(ES-)。
遵循实例14中所述的程序自(2S,4R)-1-(叔丁氧基羰基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)-2H-四唑-2-基)吡咯烷-2-甲酸开始来制备以下化合物：
I-108
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)-2H-四唑-2-基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯，MS m/z：742.1(M+H+)。
遵循实例14中所述的程序自(2S,4R)-1-(叔丁氧基羰基)-4-(3-(噻吩-2-基)喹喏啉-2-基氧基)吡咯烷-2-甲酸开始来制备以下化合物：
I-109
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(3-(噻吩-2-基)喹喏啉-2-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯，MS m/z：794.2(M+H+)。
遵循实例14和实例13中所述的程序自(2S,4R)-1-(叔丁氧基羰基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)-2H-四唑-2-基)吡咯烷-2-甲酸开始来制备以下化合物：
I-107
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)-2H-四唑-2-基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯，MS m/z：769.1(M+H+)。
遵循实例14和实例13中所述的程序自(2S,4R)-1-(叔丁氧基羰基)-4-(3-(噻吩-2-基)喹喏啉-2-基氧基)吡咯烷-2-甲酸开始来制备以下化合物：
I-110
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(3-(噻吩-2-基)喹喏啉-2-基氧基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯，MS m/z：821.2(M+H+)。
I-114
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2R)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙基环丙基氨甲酰基)-4-(6-甲氧基异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯。以类似方式，遵循实例14中用于化合物I-96的程序自饱和中间体14-2开始可制备标题化合物。可经由对中间体14-2实施钯催化的氢化反应来制备饱和中间体14-2。
实例15
化合物I-76
(S)-3-(丙烯酰胺基甲基)-4-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-乙烯基异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-1-基)-4-侧氧基丁酸叔丁酯(I-76)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体15-1
(2S,4R)-1-(叔丁氧基羰基)-4-(7-乙烯基异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-2-甲酸：通过在铃木(Suzuki)反应条件下使用乙烯基硼酸处理中间体14-1来制备中间体15-1。
化合物I-76
(S)-3-(丙烯酰胺基甲基)-4-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-乙烯基异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-1-基)-4-侧氧基丁酸叔丁酯(I-76)：按照实例14中所述的程序自中间体15-1制备标题化合物。LC/MS：m/z 762.2(M-1,ES-)。
以类似方式遵循实例15使用2-噻吩硼酸代替乙烯基硼酸来制备以下化合物：
化合物I-87
(S)-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-(噻吩-2-基)异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-1-基)-7-甲基-1,5-二侧氧基辛-6-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯。LC/MS：m/z 818.2(ES-)。
化合物I-88
(S)-3-丙烯酰胺基-1-((2S,4R)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨甲酰基)-4-(7-(噻吩-2-基)异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-1-基)-1-侧氧基丙-2-基氨基甲酸环戊基酯。LC/MS：m/z 805.2(ES+)。
实例16
化合物I-77
(1R,2S)-N-1-环丙基磺酰基甲酰胺基-2-乙烯基环丙基(2R,4S,7S,14E)-7-丙烯酰胺基甲基-2H-16,18-亚乙烯基-2,5-亚甲基(methano)-11H-吡啶并[2,3-k][1,10,3,6]二氧杂二氮杂环十九烯-4-基甲酰胺(I-77)：按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体16-1
(S)-2-氨基-3-(2-硝基苯基磺酰胺基)丙酸甲酯盐酸盐：在室温下向存于30mLMeOH中的1.2g中间体7-3(实例7，3.08mmol)中鼓泡氯化氢气体，直至其在MeOH中饱和。将所得混合物搅拌过夜，并在减压下浓缩至干燥，以定量产率得到中间体16-1的Me-酯HCl盐。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.13(m,1H),7.89(m,1H),7.76(m,2H),4.23(t,1H,J＝4.4Hz),3.85(s,3H,OMe),3.56(t,2H,J＝5.6Hz)。
中间体16-2
(S)-2-(4-戊烯基氧基羰基氨基)-3-(2-硝基苯基磺酰胺基)丙酸甲酯：向介于20mL饱和NaHCO3水溶液与20mL THF之间的中间体16-1(上文所获得)的悬浮液中添加6.4mL 0.5M氯碳酸戊-4-烯基酯甲苯溶液。将所得混合物在室温下搅拌3hr，随后酸化至pH约等于3，用EtOAc(40mL x 2)萃取。经无水硫酸钠干燥合并的有机层。浓缩后，在硅胶上对残留物实施快速柱色谱处理，得到890mg淡黄色油状物。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.13(m,1H),7.89(m,1H),7.76(m,2H),5.81(m,1H),5.76(t,1H,J＝6.4Hz),5.49(br d,1H),5.05(dq,1H,J＝2.0,16.8Hz),5.00(dq,1H,J＝1.5,10.4Hz),4.43(br q,1H),4.07(t,2H,J＝7.2Hz),3.80(s,3H),3.55(t,2H,J＝4.8Hz),2.13(q,2H,J＝7.2Hz),1.72(m,2H)。
中间体16-3
(S)-2-(4-戊烯基氧基羰基氨基)-3-(2-硝基苯基磺酰胺基)丙酸：向890mg中间体16-2存于混合溶剂(THF/MeOH 10mL/10mL)中的混合物中添加900mg氢氧化锂单水合物和10mL水。将反应混合物在室温下搅拌2hr，随后酸化至pH约等于5。反应混合物用EtOAc(60mL x 2)萃取，经无水硫酸钠干燥。浓缩后获得860mg略微黄色的固体。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.13(m,1H),7.88(m,1H),7.76(m,2H),5.93(br s,1H),5.81(m,1H),5.67(br d,1H,J＝6.0Hz),5.05(dq,1H,J＝2.0,18.4Hz),5.00(dq,1H,J＝1.6,10.0Hz),4.43(br q,1H),4.11(m,2H),3.58(t,2H,J＝5.2Hz),2.11(q,2H,J＝7.2Hz),1.75(m,2H)。
中间体16-4
(2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐：将实例15的中间体15-1(约15mmol)溶解于甲醇和20mL存于二噁烷中的4.0M HCl中，持续搅拌过夜(LC-MS显示约70％转化)。再添加20mL存于二噁烷中的4.0M HCl，并再持续反应18hr。浓缩反应混合物；过滤后获得4.0g灰白色固体(约70％)。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.51(s,1H),8.03(d,1H,J＝5.6Hz),7.86(dd,1H,J＝8.0,1.6Hz),7.80(d,1H,J＝8.0Hz),7.41(d,1H,J＝6.0Hz),5.96(t,1H,J＝4.4Hz),4.86(dd,1H,J＝8.4,10.4Hz),3.88(s,3H),3.86(dd,1H,J＝13.2,4.8Hz),3.78(d,1H,J＝13.2Hz),2.91(qt,1H,J＝8.0,1.2Hz),2.64(dq,1H,J＝4.8,14.8Hz)。LC/MS：m/z 351.0，353.0(ES+)
中间体16-5
(2S,4R)-4-(7-溴异喹啉-1-基氧基)-1-((S)-3-(2-硝基苯基磺酰胺基)-2-((戊-4-烯基氧基)羰基氨基)丙酰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯：向812mg中间体16-4(2.1mmol)和860mg中间体16-3(2.14mmol)存于30mL乙腈中的混合物中添加2mL N,N-二异丙基乙胺，随后添加1.0g HATU(2.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2hr，随后实施一般处理程序，并通过快速柱色谱使用洗脱液(庚烷/EtOAc v/v 1:2)对产物进行纯化，得到1.18g中间体16-5(77％)。LC/MS：m/z 733.9，735.0(ES+)；732.0，734.0(ES-)
中间体16-6
(2S,4R)-1-((S)-3-(2-硝基苯基磺酰胺基)-2-((戊-4-烯基氧基)羰基氨基)丙酰基)-4-(7-乙烯基异喹啉-1-基氧基)吡咯烷-2-甲酸甲酯：将1.10g中间体16-5(1.5mmol)的甲苯溶液用氮气流吹扫30min，随后添加660μL乙烯基三丁基锡(2.25mmol)和200mg四(三苯基膦)钯。将所得混合物在100℃下加热48hr，随后冷却至室温。通过硅藻土短柱过滤反应混合物，并用50mL EtOAc洗涤。浓缩合并的有机层，并在硅胶上使用洗脱液(庚烷/EtOAc v/v 1:2至1:3)对残留物实施快速柱色谱处理，得到约520mg期望产物。LC/MS：m/z 682.2(ES+)；680.0(ES-)。
中间体16-7
(2R,4S,7S,14E)-7-(2-硝基苯磺酰基)氨基甲基-2H-16,18-亚乙烯基-2,5-亚甲基-11H-吡啶并[2,3-k][1,10,3,6]二氧杂二氮杂环十九烯-4-基羧酸甲酯：将350mg中间体16-6存于75mL无水二氯乙烷中的溶液用氮气流吹扫30min，随后添加75mg格拉布催化剂(Grubbs catalyst)。将所得混合物在55℃下加热过夜，并再添加50mg格拉布试剂(Grubbs reagent)。再持续反应24hr，随后冷却。在减压下浓缩反应混合物，并在硅胶上使用洗脱液(庚烷/EtOAc v/v 1:1至1:3)对残留物实施快速柱色谱处理，得到310mg褐色固体。
中间体16-8
(2R,4S,7S,14E)-7-(2-硝基苯磺酰基)氨基甲基-2H-16,18-亚乙烯基-2,5-亚甲基-11H-吡啶并[2,3-k][1,10,3,6]二氧杂二氮杂环十九烯-4-基羧酸：遵循对于中间体16-3所述的程序自中间体16-7制备中间体16-8。LC/MS：m/z 640.2(ES+)；638.0(ES-)。
中间体16-9
(1R,2S)-N-1-环丙基磺酰基甲酰胺基-2-乙烯基环丙基(2R,4S,7S,14E)-7-(2-硝基苯磺酰基)氨基甲基-2H-16,18-亚乙烯基-2,5-亚甲基-11H-吡啶并[2,3-k][1,10,3,6]二氧杂二氮杂环十九烯-4-基甲酰胺：遵循对于中间体16-5所述的程序通过使中间体16-8与中间体14-3偶合来制备中间体16-9。(产量＝123mg)LC/MS：m/z 852.1(ES+)；850.2(ES-)。
化合物I-77
(1R,2S)-N-1-环丙基磺酰基甲酰胺基-2-乙烯基环丙基(2R,4S,7S,14E)-7-丙烯酰胺基甲基-2H-16,18-亚乙烯基-2,5-亚甲基-11H-吡啶并[2,3-k][1,10,3,6]二氧杂二氮杂环十九烯-4-基甲酰胺(I-77)：向12mg中间体16-9存于1mL DMF中的溶液中添加40uL苯硫酚和50mg碳酸钾。将混合物在室温下搅拌过夜，随后用10mL EtOAc稀释。过滤出沉淀，浓缩滤液并在真空中干燥。
向残留物中添加3mL乙腈、20mg丙烯酸和300uL N,N-二异丙基乙胺，随后添加100mg HATU。将反应混合物在室温下搅拌2hr，随后实施一般处理且最后通过在硅胶(洗脱液-存于EtOAc中的5％甲醇)上实施快速柱色谱处理进行纯化，得到9.5mg化合物I-77。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ9.14(s,1H),8.44(s,1H),7.87(d,2H,J＝6.0Hz),7.72(d,1H,J＝8.4Hz),7.55(dd,1H,J＝8.8,1.2Hz),7.27(d,1h,6.0Hz),6.56(d,1H,J＝15.6Hz),6.44(m,1H),6.29(d,1H,J＝10.8Hz),6.26(d,1H,J＝4.4Hz),5.65-5.75(m,3H),5.28(dd,1H,J＝1.2,16.8Hz),5.09(dd,1H,J＝2.0,10.4Hz),4.80(m,1H),4.40-4.48(m,2H),4.00(m,2H)3.50-3.70(m,2H),2.95-3.01(m,1H),2.19-2.35(m,4H),1.80-1.90(m,2H),1.20-1.50(m,5H),1.10(m,2H)。LC/MS：m/z 721.2(ES+)；719.2(ES-)。
以类似方式结合实例7的程序来制备以下化合物：
(1R,2S)-N-1-环丙基磺酰基甲酰胺基-2-乙烯基环丙基(2R,4S,7S,14E)-7-(N-甲基丙烯酰胺基甲基-2H-16,18-亚乙烯基-2,5-亚甲基-11H-吡啶并[2,3-k][1,10,3,6]二氧杂二氮杂环十九烯-4-基甲酰胺(I-83)：LC/MS：m/z 735.2(ES+)。
以类似方式可制备以下化合物：
实例17
(I-102)，按照下文所述的步骤和中间体来制备标题化合物：
中间体17-1
4-(7-乙烯基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐。通过将存于HCl饱和甲醇中的中间体15-1搅拌过夜来制备中间体17-1。LC-MS：m/z＝299.2(ES+)。
中间体17-2
5-侧氧基-吡咯烷-1,2-二甲酸2-苄基酯1-戊-4-烯基酯(中间体17-2)。在0℃下，向5.5g 5-侧氧基-吡咯烷-2-甲酸苄基酯(25mmol)、4mL三乙胺、3.3g N,N-二甲基氨基吡啶(27mmol)存于40mL二氯甲烷中的正在搅拌溶液中添加4.1g氯甲酸4-戊烯基-1-基酯(27.6mmol)。随后使反应混合物升温至室温，并搅拌整个周末。浓缩后，将所得残留物溶解于120mL***中，用30mL 1.0N HCl水溶液、随后盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发有机溶剂，并通过在硅胶上使用庚烷/EtOAc(v/v 1/1)实施快速色谱处理对残留物进行纯化，得到7.3g无色油状中间体17-2(88％)。LC-MS：m/z＝331.2(ES+)。
中间体17-3
5-侧氧基-吡咯烷-1,2-二甲酸1-戊-4-烯基酯(中间体17-3)。在氮气中，向240mg乙酸钯(1.1mmol)存于20mL脱气二氯甲烷中的正在搅拌溶液中添加460uL三乙胺(3.3mmol)和5.33mL三乙基硅烷(33mmol)。在室温下搅拌15min后，添加存于25mL脱气二氯甲烷中的7.3g中间体17-2。将所得溶液在室温下搅拌过夜。使反应混合物通过硅藻土垫，并浓缩滤液，且通过使用DCM/MeOH(v/v 9/1)作为洗脱液实施快速柱色谱处理进行纯化，得到4.55g无色油状物(85％)。LC-MS：m/z＝240.1(ES-)。
中间体17-4
2-(5-甲基-3-侧氧基-己-4-烯基)-琥珀酸4-戊-4-烯基酯(中间体17-4)。在氮气中，向1.0g中间体17-3(4.0mmol)存于30mL无水THF中的-78℃的正在搅拌溶液中添加24mL 0.5M 2-甲基-1-丙烯基溴化镁THF溶液。将反应混合物在-78℃下搅拌1hr，随后添加12mL 1.0N HCl水溶液。升温至室温后，将反应混合物用50mL EtOAc萃取，用盐水洗涤，并经硫酸钠干燥。浓缩有机层，获得1.02g中间体17-4，其可不经进一步纯化直接使用(86％产率)。LC-MS：m/z＝298.1(ES+)，296.2(ES-)。
中间体17-5
1-(7-甲基-5-侧氧基-2-戊-4-烯基氧基羰基氨基-辛-6-烯酰基)-4-(7-乙烯基-异喹啉-1-基氧基)-吡咯烷-2-甲酸甲酯。以与实例15中所述类似的方式经由中间体17-1与中间体17-4的偶合反应来制备中间体17-5。LC-MS：m/z＝578.2(ES+)。
中间体17-6
如对于中间体16-7所述经由烯烃复分解来制备中间体17-6。LC-MS：572.2(M+Na+,ES+)。
中间体17-7
中间体17-7。向420mg中间体17-6(0.76mmol)存于6mL t-BuOH和3mL THF中的正在搅拌混合物中添加8mL 1.0N LiOH溶液。在室温下搅拌1hr后，使用1.0NHCl溶液将所述溶液酸化至pH＝5。将反应混合物用60mL二氯甲烷萃取，用盐水洗涤并经无水MgSO4干燥。过滤并浓缩后，所得混合物可直接用于下一步骤中。(330mg粘性固体，980％)。LC-MS：m/z＝534.2(ES-)。
I-102
(I-102)。遵循对于中间体16-5所述的程序通过使中间体17-7与中间体14-3偶合来制备标题化合物，得到223mg(53％)粉白色固体。LC/MS：m/z 748.3(ES+)；746.2(ES-)。
实例18
单链HCV蛋白酶(wt)肽的表达和纯化
将单链蛋白水解结构域(NS4A21-32-GSGS-NS33-631)克隆至pET-14b(诺瓦金(Novagen)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))中并转化至DH10B细胞(英杰生命技术公司(Invitrogen))中。将所得质粒转移至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(诺瓦金(Novagen))中以如先前(1,2)所述实施蛋白质表达和纯化。简单来说，使培养物在37℃下于含有100μg/ml氨苄西林(ampicillin)的LB培养基中生长，直至600nm下的光密度(OD600)达到1.0，并通过添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至1mM来诱导。在18℃下再培育20h后，通过在6,000xg下离心10min来收获细菌，并再悬浮于裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液含有50mM Na3PO4(pH 8.0)、300mM NaCl、5mM2-巯基乙醇、10％甘油、0.5％聚乙二醇苯基醚CA630(Igepal CA630)和蛋白酶抑制剂混合液，所述混合液由1mM苯基甲基磺酰氟、0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胃酶抑素A和2mM苯甲脒组成。通过冰冻与解冻、随后超声波处理来裂解细胞。通过在12,000x g下离心30min来移除细胞碎片。经由通过0.45-μm过滤器(康宁(Corning))进一步净化上清液，并随后加载至装载有NiSO4(安玛西亚医药生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech))的HiTrap螯合柱中。使用咪唑溶液以100-至-500mM线性梯度来洗脱结合的蛋白质。使所选流份通过Ni2+柱色谱，并在10％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。通过在12％SDS-PAGE凝胶中实施电泳分辨出纯化蛋白并随后转移至硝酸纤维素膜上。通过蛋白质印迹分析使用抗NS3单克隆抗体来分析所述蛋白质。通过使用化学发光试剂盒(罗氏(Roche))使用结合辣根过氧化物酶的山羊抗-小鼠抗体(皮尔斯(Pierce))作为二级抗体来观测蛋白质。将所述蛋白质等分并储存于-80℃下。
实例19
HCV蛋白酶A156S、A156T、D168A、D168V药物抗性突变体和C159S变体的克隆和表达
通过PCR产生NS4A/NS3的突变体DNA片段并克隆至pET表达载体中。转化至BL21感受态细胞中之后，使用IPTG诱导表达2小时。利用亲和柱随后尺寸排阻色谱来纯化带有His标签的融合蛋白。
实例20
分析缓冲液：2％CHAPS、50mM Tris pH 7.5、50％甘油、2uM M-2235(巴赫姆(Bachem))底物。在50ul反应中，添加49ul分析缓冲液、1ul(1U)HCV丝氨酸蛋白酶(巴恩泽(Bioenza))。在室温下培育20分钟。在350/460nm(激发/发射)下在荧光微板读数器上读数所述板或以1分钟间隔实施监测以获得动力学曲线。
所述酶耐受1％DMSO和2％甲醇。在测试化合物的实验中，使用20％甲醇(10％DMSO和20％甲醇)将存于纯DMSO中的化合物稀释10倍。将此化合物溶液添加至反应中(不超过最终反应体积的10％)。有机溶剂的最终浓度是：1％DMSO和2％甲醇。
实例21
其它分析方案
方法A：
对化合物实施分析以使用HCV RNA复制子评价化合物的活体外抗病毒活性和细胞毒性。此分析使用细胞系ET(luc-ubi-neo/ET)，其是含有HCV RNA复制子的人类Huh7肝细胞瘤细胞系，所述复制子带有稳定的荧光素酶(Luc)报告基因和三种细胞培养适应性突变。通过病毒特异性塔曼(TaqMan)RT-PCR直接测量HCV RNA水平：
正向引物：ACGCAGAAAGCGTCTAGCCAT (SEQ ID NO:63)
反向引物：TACTCACCGGTTCCGCAGA (SEQ ID NO:64)
探针：[6-FAM]-CCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-[TAMRA]
(SEQ ID NO:65)
使ET细胞系在杜贝克氏改良必需培养基(Dulbecco’s modified essential media)(DMEM)、10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(penicillin)-链霉素(streptomycin)(pen-strep)、1％谷氨酰胺、250μg/ml G418中于37℃的5％CO2培育箱中生长。所有细胞培养试剂均自培养基科技(Mediatech)(马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(VA))获得。使细胞胰蛋白酶化(1％胰蛋白酶:EDTA)并以5x 103个细胞/孔铺板于专用于细胞数量(细胞毒性)或抗病毒活性评估的白色96-孔分析板(科斯塔(Costar))中。分别以六种3-倍浓度添加药物，并在DMEM、5％FBS、1％pen-strep、1％谷氨酰胺中实施分析。人类干扰素α-2b(PBL生物实验室(PBL Biolabs)，新布伦兹维克(New Brunswick)，新泽西州(NJ))包括于每一实验中作为阳性对照化合物。在添加药物后72hr处理细胞，此时细胞仍处于亚汇合状态。通过按照制造商说明书使用Steady-Glo荧光素酶分析***(普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))分析复制子衍生的荧光素酶活性来测量抗病毒活性。使用CytoTox-1试剂(普洛麦格(Promega))来测定每一孔中细胞的数量。通过计算可应用的EC50(抑制50％病毒复制的有效浓度)、EC90(抑制90％病毒复制的有效浓度)、IC50(使细胞生存力降低50％的浓度)和SI50(选择性指数：EC50/IC50)值来获得化合物性质。所选化合物的IC50值列示于下表5中。
方法B：利用FRET方法实施HCV蛋白酶分析
利用基于定量荧光共振能量转移(FRET)的方法来识别HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂。所述分析使用自HCV NS5A/5B切割位点获得的合成FRET肽，使用HCV蛋白酶通过监测复合物的切割活性来评价化合物对所述蛋白酶的活性。包括NS5A-5B连接点(NH2-EDVVCCSMSYK-COOH)的合成肽在N-和C-末端分别用4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)和5’-(2’-氨乙基氨基萘-1-磺酸(Edans)进行标记(英杰生命技术公司，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))。利用荧光测量来估计测试化合物的IC50值。两种荧光团形成猝灭对并在完整肽内展示FRET。FRET肽被HCV NS3/4A蛋白酶复合物(100ng/mL)切割后，荧光恢复且可在激发/发射＝340/490nm下持续进行监测。
实例22
野生型和突变NS3/4A 1b酶的HCV蛋白酶FRET分析(IC50)
所述方案是来自HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂的活体外抗性研究(In Vitro ResistanceStudies of HCV Serine Protease Inhibitors)，2004，JBC，第279卷，第17期，第17508-17514页的改进的基于FRET的分析(v_02)。针对HCV NS3/4A 1b蛋白酶的A156S、A156T、D168A和D168V突变体对化合物的内在效能进行评估，如下：
在50mM HEPES(pH 7.8)、100mM NaCl、5mM DTT和20％甘油中制备来自巴恩泽(Bioenza)(芒廷维尤(Mountain View)，加利福尼亚州(CA))的NS3/4A蛋白酶的10X原液和来自阿纳拜客(Anaspec)(圣何塞(San Jose)，加利福尼亚州(CA))的1.13X5-FAM/QXLTM520FRET肽底物。将5μL各酶在康宁(Corning)(#3573)384-孔黑色未经处理的微量滴定板(康宁(Corning)，纽约州(NY))中在25℃下与0.5μL体积的50％DMSO以及在50％DMSO中制备的经系列稀释的化合物一起预培育30min。添加45μL FRET底物以开始蛋白酶反应，并在λex487/λem514下借助夸德(Quad)4单色仪(monochromoter)在来自百泰克(BioTek)(威努斯基(Winooski)，佛蒙特州(VT))的斯诺吉(Synergy)4平板读数器中监测120分钟。每次分析结束时，针对线性反应动力学和拟合统计学(R2，绝对平方和)检查各孔的进展曲线。自相对荧光单位对时间(分钟)的曲线图的斜率确定各反应的初始速度(0分钟至30+分钟)，且随后针对抑制剂浓度绘制曲线图以在来自格拉夫派得软件(GraphPad Software)(圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(CA))的格拉夫派得普锐斯(GraphPad Prism)中自log[抑制剂]对应答(可变斜率模型)估计IC50。
表5显示所选本发明化合物在FRET分析中的活性。化合物编号对应于表3中的化合物编号。具有标明为“A”的活性的化合物的IC50值≤10nM；具有标明为“B”的活性的化合物的IC50值>10nM且≤100nM；具有标明为“C”的活性的化合物的IC50值>100nM且≤1000nM；具有标明为“D”的活性的化合物的IC50值>1000nM且<10,000nM；且具有标明为“E”的活性的化合物的IC50值≥10,000nM。
表5。实例性化合物的酶数据
1数据采集自实例21中所述的分析。
实例23
WT和突变NS3/4A 1b酶的HCV蛋白酶FRET分析(IC50_APP)。
使用以下方案来产生如下表6中所绘示的“表观”IC50(IC50-APP)值。不欲受限于任一特定理论，我们认为与IC50值形成对照的IC50-APP可提供时间依赖性抑制的更有用的指示，且因此更能代表结合亲和性。所述方案是改进的基于FRET的分析(v_03)，其研发用以针对HCV NS3/4A 1b蛋白酶的野生型和C159S、A156S、A156T、D168A、D168V、R155K突变体对化合物的效能、等级序列和抗性分布进行评价，如下：在50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM DTT、2％CHAPS和20％甘油中制备来自巴恩泽(Bioenza)(芒廷维尤(Mountain View)，加利福尼亚州(CA))的NS3/4A蛋白酶的10X原液和来自阿纳拜客(Anaspec)(圣何塞(San Jose)，加利福尼亚州(CA))的1.13X5-FAM/QXLTM520FRET肽底物。在点样0.5μL体积的50％DMSO以及在50％DMSO中制备的经系列稀释的化合物后，将5μL各酶添加至康宁(Corning)(#3573)384-孔黑色微量滴定板(康宁(Corning)，纽约州(NY))中。添加酶后，添加45μL FRET底物，紧接开始蛋白酶反应，并在λex485/λem520下在来自百泰克(BioTek)(威努斯基(Winooski)，佛蒙特州(VT))的斯诺吉(Synergy)4平板读数器中监测60-90分钟。每次分析结束时，针对线性反应动力学和拟合统计学(R2，95％置信区间，绝对平方和)检查各孔的进展曲线。自相对荧光单位对时间(分钟)的曲线图的斜率确定各反应的初始速度(0分钟至15+分钟)，且随后针对抑制剂浓度(以不含抑制剂且不含酶的对照的百分比)绘制曲线图以在来自格拉夫派得软件(GraphPad Software)(圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(CA))的格拉夫派得普锐斯(GraphPad Prism)中自log[抑制剂]对应答(可变斜率模型)估计表观IC50。
表6显示所选本发明化合物在FRET分析中的活性。化合物编号对应于表3中的化合物编号。具有标明为“A”的活性的化合物的IC50值≤10nM；具有标明为“B”的活性的化合物的IC50值>10nM且≤100nM；具有标明为“C”的活性的化合物的IC50值>100nM且≤1000nM；具有标明为“D”的活性的化合物的IC50值>1000nM且<10,000nM；且具有标明为“E”的活性的化合物的IC50值≥10,000nM。
表6。实例性化合物的酶数据
1表示IC90值(nM)。
2表示EC50值(nM)。数据采集自实例34中所述的分析。
3表示EC90值(nM)。数据采集自实例34中所述的分析。
4数据采集自实例21中所述的分析。
实例24
在测试化合物存在下实施HCV野生型或HCV变体C159S的质谱分析。将100pmol HCV野生型(巴恩泽(Bioenza)，加利福尼亚州(CA))与化合物在(I-3)对蛋白质10倍过量下一起培育1hr和3hr。用10ul 0.1％TFA稀释1ul试样分液(总体积为4.24ul)，随后使用芥子酸作为解吸附基质(10mg/ml，于0.1％TFA:乙腈50:50中)利用micro C4ZipTipping处理使其直接至基质辅助激光解吸附电离(MALDI)靶上。在岛津生物技术阿希马(Shimadzu Biotech Axima)TOF2(岛津仪器(Shimadzu Instruments))基质辅助激光解吸附/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪上实施分析。对100pmol HCV蛋白酶的HCV C159S突变体在(I-3)对蛋白质10倍过量下实施相同程序达3hr。
完整HCV蛋白在MH+24465下出现，而对应芥子酸(基质)加合物在高约200Da下出现。以化学计量纳入(I-3)化合物(MW为852Da)，在高约850-860Da下产生新的质谱峰(MH+为25320-25329)。(图1)此与纳入单个(I-3)分子一致。如图1中所绘示，在10x化合物浓度下甚至在1hr后发生明显反应，且在10x浓度下在3hr后接近完全转化。所述酶的C159S变体形式未显示任何修饰迹象，此证实所述化合物修饰Cys 159。
如图11中所绘示，使用HCV野生型将化合物I-3与其可逆对应物—化合物IR-3进行比较且与无测试化合物进行比较。
实例25
如图2、3、4和5中所绘示，在测试化合物(I-3)存在下实施HCV野生型或HCV突变体的质谱分析。将HCV突变体(A156S)、(A156T)、(D168A)和(D168V)在(I-3)对蛋白质10X倍过量下培育1hr和3hr。用10ul 0.1％TFA稀释1ul试样分液，随后使用芥子酸作为解吸附基质(10mg/ml，于0.1％TFA:乙腈50:50中)利用micro C4ZipTipping处理使其直接至基质辅助激光解吸附电离(MALDI)靶上。
HCV(A156S)：在图2中可以看出，与无化合物时的蛋白质相比，与(I-3)一起培育的蛋白质明显发生反应而产生Mw为25,340的新物质，其加重约855Da，与化合物(I-3)的质量853Da良好吻合。1小时时的反应与3小时时的反应之间转化方面的变化非常小。
HCV(A156T)：如图3中所绘示，对于HCV(A156T)突变体，甚至在1小时反应时间时观察到接近完全反应。约25,350下的新物质与24,498下的未反应突变体之间的质量差异为852Da，再次良好吻合。
HCV(D168A)：如图4中所绘示，对于HCV(D168A)突变体，甚至在1小时反应时间后接近完全转化。在此情况下，25,278下的新物质与24,430下的未反应物之间的质量差异是848Da，再次与I-3的质量良好吻合。
HCV(D168V)：如图5中所绘示，对于HCV(D168V)突变体，在3小时反应时间后完全转化。再次，新物质(25,305)与未反应突变体(24,450)之间的质量差异与化合物I-3的质量一致。
如图6、7、8、9和10中所绘示，在测试化合物I-7、I-8、I-4、I-9和I-12存在下实施HCV野生型的质谱分析，且观察到各个别化合物对HCV共价修饰所预期的合适质谱位移。
实例26
在测试化合物I-73和I-75存在下使用以下方案实施HCV野生型(基因型1b)的质谱分析：将HCV NS3/4A野生型(wt)在测试化合物对蛋白质10X倍过量下培育1hr。用10ul 0.1％TFA稀释2ul试样分液，随后使用芥子酸作为解吸附基质(10mg/ml，于0.1％TFA:乙腈50:50中)利用micro C4ZipTipping处理使其直接至基质辅助激光解吸附电离(MALDI)靶上。测量完整蛋白质量时，仪器设置为线性模式，使用24,500的脉冲萃取设置且使用去铁肌红蛋白作为标准物来校准仪器。
如图13中所绘示，反应1小时后几乎完全转化成新质量。25256Da的第一质量峰显示质量增加789Da，此与I-73的质量(790Da)一致。类似地，对于化合物I-73，观察到D168A突变体的共价修饰。
如图14中所绘示，反应1小时后转化成MH+25282下的新峰，其加重815Da且与I-75的质量(817Da)一致。当实施1hr和更长时间时，也观察到化合物I-75使D168A突变体发生实质转化。
以类似方式测试化合物I-50，且在1小时反应时间后观察到可测量的HCV NS3/4Awt的共价修饰。
实例27
在测试化合物I-96存在下使用以下方案实施HCV NS3/4A基因型1a、1b、2a和3a的质谱分析：将HCV NS3/4A在测试化合物对蛋白质10X倍过量下培育3hr。用10ul 0.1％TFA稀释2ul试样分液，随后使用芥子酸作为解吸附基质(10mg/ml，于0.1％TFA:乙腈50:50中)利用micro C4ZipTipping处理使其直接至基质辅助激光解吸附电离(MALDI)靶上。测量完整蛋白质量时，仪器设置为线性模式，使用24,500的脉冲萃取设置且使用去铁肌红蛋白作为标准物来校准仪器。反应3小时后，观察到各HCVNS3/4A基因型的可测量的共价修饰。
以类似方式使用HCV NS3/4A wt(基因型1b)测试化合物I-27，且在3小时反应时间后观察到HCV NS3/4A wt的几乎完全共价修饰。
实例28
利用胰蛋白酶消化策略实施野生型HCV蛋白酶的Cys159的修饰
在胰蛋白酶消化之前，将HCV与测试化合物I-3一起培育3hr。化合物培育后，使用碘乙酰胺作为烷基化剂。胰蛋白酶消化时，用10ul 0.1％TFA稀释2ul分液(0.06ug/ul)，随后使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质(5mg/ml，于0.1％TFA:乙腈50:50中)利用micro C18Zip Tipping处理使其直接至基质辅助激光解吸附电离(MALDI)靶上。
胰蛋白酶消化时，仪器设置为反射模式，且使用1800的脉冲萃取设置。使用激光Biolabs Pep Mix标准物(1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20)实施校准。CID/PSD分析时，使用光标设置离子门时序以选择肽，且在高约20％的激光功率下发生碎裂且使用He作为CID的碰撞气体。使用用于曲线场反射的P14R碎片校准实施片段校准。
在胰蛋白酶肽AAVCTR上出现修饰。经修饰肽的质量与肽(MH+620.32)+I-3(852.31)＝1472.63的质量吻合。在各种消化中未观察到其它经修饰肽。化合物在853.20处的CID分析显示在252处有标识片段。参见图12。
实例29
细胞培养
Huh-luc/neo-ET、Huh7-Lunet自ReBLikon股份有限公司(海德堡(Heidelberg)，德国(Germany))获得。使细胞在补加有2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、100U青霉素/ml、100μg链霉素/mL和10％胎牛血清的杜贝克氏改良鹰氏培养基(Dulbeccomodified Eagle medium)(DMEM；英杰生命技术公司)中生长。添加G418(遗传霉素(Geneticin)；英杰生命技术公司)，最终浓度为400ug//mL。使Huh7-Lunet在不存在G418下生长。
实例30
突变体构建体
通过使用快速变化II定点诱变试剂盒(QuickChange II Site-Directed MutagenesisKit)(斯塔基因(Stratagene)，拉霍亚(La Jolla)，加利福尼亚州(CA))按照制造商说明书且使用下表7中所述的引物对pFK-I389-luc-ubi-neo-NS3-3’ET质粒(ReBLikon股份有限公司(海德堡(Heidelberg)，德国(Germany)))实施定点诱变来产生含有临床相关突变的构建体。
表7：用于建立突变体复制子细胞系的引物序列。
实例31
活体外转录
通过使用洛曼(Lohmann V)等人，病毒学期刊(J.Virol)，77:3007-3019，2003阐述的方案来制备HCV正链的活体外转录物。正链HCV RNA转录时，用AseI随后Sca1消化质粒DNA(pFK I341PI-Luc/NS3-3’/ET，自ReBLikon股份有限公司(海德堡(Heidelberg)，德国(Germany))获得)。限制酶切消化后，用苯酚和氯仿萃取DNA，用乙醇沉淀，且溶解于不含RNA酶的水中。活体外转录反应物含有80mM HEPES(pH7.5)、12mM MgCl2、2mM精脒、40mM二硫苏糖醇、3.125mM浓度的各三磷酸核苷、1U RNA酶抑制剂(RNasin)。使用5ug限制酶切质粒DNA和80U T7RNA聚合酶(普洛麦格(Promega))。在37℃下2h后，再添加40U T7聚合酶，并将反应物再培育2h。通过每ug质粒DNA添加1U不含RNA酶的DNA酶(普洛麦格(Promega))、随后在37℃下培育30min来终止转录。在用酸性苯酚和氯仿萃取后，用异丙醇使RNA沉淀并溶解于不含RNA酶的水中。通过测量260nm下的光密度(OD260)来测定浓度，且通过变性琼脂糖凝胶电泳来检查RNA的完整性。
实例32
HCV全长基因组的转染和稳定细胞系的选择
将7x104个Huh7-Lunet细胞过夜接种于12孔板中，第二天使用美若斯Tx(MirusTx)(麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))试剂盒转染1ug RNA/孔。按照制造商说明书实施转染，且转染后24小时，对细胞实施荧光素酶分析或实施G418(400ug/ml)选择以建立稳定的细胞系。
实例33
蛋白酶自切割的抑制
将Huh-7-Luc-Neo-ET细胞以1x 105个细胞/孔的密度铺板于12孔板中的复制子分析培养基(Replicon Assay Medium)(RPMI补加有5％FBS、1X非必需氨基酸和pen/strep)中。8小时后，移除培养基并用1ml含有测试化合物(每一化合物5个孔)和0.02％DMSO的培养基替换，并将细胞返回到培育箱中，保持过夜。16小时后，用PBS洗涤每一化合物的1个孔和1个未经处理的孔，随后裂解并刮擦至30ul细胞提取缓冲液(碧欧泉(Biosource)，卡马里奥(Camarillo)，加利福尼亚州(CA))加完全蛋白酶抑制剂(Complete Protease Inhibitor)(罗氏(Roche)，印第安纳波利斯(Indianapolis)，印第安纳州(IN))中。其余孔用PBS冲洗2X，随后填充复制子培养基并返回到培育箱中。每小时通过移除旧的培养基并替换成新鲜培养基来洗涤一次细胞，并裂解，且在第一次收集后4、12、24和48小时收集。
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Page)(4-20％)分离细胞裂解物，并转移至Immobilon-P聚偏二氟乙烯转印膜(Immobilon-P PVDF membrane)(密理博公司(Millipore Corporation)，马萨诸塞州(MA))上，并点渍多克隆抗NS3抗体(巴恩泽(Bioenza)，加利福尼亚州(CA))。将点渍扫描于里考公司(Licor)的奥德赛红外扫描仪(Odyssey infrared scanner)上，并使用与扫描仪一起提供的里考公司软件分别定量FL带和切割产物。切割产物以各试样中总NS3的百分比来计算，且随后规范化成DMSO对照，由此DMSO对照反映100％活性。
结果与讨论
当蛋白酶活性受到抑制时，自切割被彻底破坏且唯一可检测到的蛋白质物质是全酶。将复制子细胞持续暴露于NS3抑制剂化合物16小时后，在处理试样中不能检测到自切割产物，但在未经处理的对照复制子细胞中可容易地检测到自切割产物。通过将复制子细胞暴露于蛋白酶抑制剂16小时，此时移除化合物，并将复制子细胞再重复洗涤数小时来证实延长的作用持续时间。共价不可逆NS3抑制剂展示持续抑制NS3内部自切割活性长达48小时，而当使用可逆化合物时蛋白酶自切割活性迅速恢复(图17和图18)。
具体来说，图15和16绘示在各种浓度的两种HCV蛋白酶抑制剂—化合物I-R和化合物I-50存在下在24h、48h和96h时利用复制子分析的荧光素酶活性。化合物I-R是非共价抑制剂，而化合物I-50是不可逆共价抑制剂。尽管两种化合物对蛋白酶的作用机制有差异，但由于分析读出的间接性质复制子分析显示类似结果。
图17绘示NS3蛋白酶的两种不可逆共价抑制剂(化合物I-96和I-102)如通过自切割所测量在移除化合物后对野生型复制子细胞中的NS3蛋白酶活性展示延长的抑制。将化合物与复制子细胞一起培育16小时并随后移除(时间0)。甚至在移除共价不可逆NS3抑制剂后长达48小时时，NS3自切割活性被抑制至少50％，而可逆药物VX-950显示在移除药物后短至4小时活性实质上完全恢复。
图18绘示另一种NS3蛋白酶共价抑制剂—化合物I-54如通过自切割所测量在移除化合物后长达24小时对野生型复制子细胞中的NS3蛋白酶活性展示延长的抑制。不可逆共价抑制剂化合物I-54在移除化合物后长达24小时内展示实质上完全抑制，而可逆药物VX-950显示在移除药物后短至4小时活性完全恢复。
图19绘示共价蛋白酶抑制剂—化合物I-54对经修饰复制子***中的NS3蛋白酶活性展示延长的抑制，在所述经修饰复制子***中NS3蛋白酶含有临床上观察到的突变，其将位置155(R155K)上的氨基酸自精氨酸改变成赖氨酸。此突变导致对蛋白酶抑制剂的临床药物抗性。图19绘示即使具有此突变不可逆共价药物仍能够在移除化合物后至少24小时内抑制突变体蛋白酶的活性。
实例34
荧光素酶分析
对化合物实施分析以利用复制子衍生的荧光素酶活性来评价化合物的抗病毒活性和细胞毒性。此分析使用细胞系ET(luc-ubi-neo/ET)，其是含有HCV RNA复制子的人类Huh7肝细胞瘤细胞系，所述复制子带有稳定的荧光素酶(Luc)报告基因和细胞培养适应性突变。使ET细胞系在补加有2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、100U青霉素/ml、100μg链霉素/mL和10％胎牛血清的杜贝克氏改良必需培养基(DMEM)中在37℃的5％CO2培育箱中生长。添加G418(遗传霉素(Geneticin)；英杰生命技术公司)，最终浓度为400ug//mL。
所有细胞培养试剂均自英杰生命技术公司(Invitrogen)(卡尔斯巴德(Carlsbad))获得。使细胞胰蛋白酶化(1％胰蛋白酶:EDTA)并以5x 103个细胞/孔铺板于专用于细胞数量(细胞毒性)或抗病毒活性评估的白色96-孔分析板(科斯塔(Costar))中。分别以六种3-倍浓度添加测试化合物，并在DMEM、5％FBS、1％pen-strep、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸中实施分析。人类干扰素α-2b(PBL生物实验室(PBL Biolabs)，新布伦兹维克(New Brunswick)，新泽西州(NJ))包括于每一实验中作为阳性对照化合物。在添加测试化合物后72hr处理细胞，此时细胞仍处于亚汇合状态。通过按照制造商说明书使用Steady-Glo荧光素酶分析***(普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))分析复制子衍生的荧光素酶活性来测量抗病毒活性。通过细胞滴定蓝色分析(Cell Titer Blue Assay)(普洛麦格(Promega))来测定各孔中细胞的数量。通过计算可应用的EC50(抑制50％病毒复制的有效浓度)、EC90(抑制90％病毒复制的有效浓度)、IC50(使细胞生存力降低50％的浓度)和SI50(选择性指数：EC50/IC50)值来获得化合物性质。
尽管已对许多本发明实施例进行了描述，但明显可以看出，可对我们的基本实例加以修改以提供可利用本发明化合物和方法的其它实施例。因此，应了解，本发明的范围由随附权利要求书而非由实例所代表的具体实施例来定义。

Claims (1)

1.一种式I化合物，
或其医药上可接受的盐，其中：
R1和R1’独立地为氢或任选经取代的C1-6脂肪族基团，或R1与R1’一起形成任选经取代的3-7元碳环；
R2a是-OH或-NHSO2R2；
R2是-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C3-7环烷基、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
各R独立地为氢、任选经取代的C1-6脂肪族基团，或：
同一氮原子上的两个R连同所述氮一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环；
R3是弹头基团(warhead group)，或：
R3和R1连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含弹头基团；或
R3和由R1和R1’形成的环连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的12-18元环，其中由此形成的所述环包含弹头基团；
Rw是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基：或
Rw与Rx一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环，或：
Rw与Ry一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环；
Rx是-T-Rz，其中：
T是共价键或C1-6二价烃链，其中T的一个或两个亚甲基单元任选地且独立地由-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-或-SO2N(R)-替换；且
Rz是氢或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元单环状或二环状芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元单环状或二环状杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
Rx’是氢，或Rx’和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的螺-稠合5-7元环；
Ry是氢，或Rx与Ry一起形成任选经取代的具有0-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的C3-7元环；
R4是H、-NHC(O)R5、-NHC(O)OR6、天然或非天然氨基酸侧链基团；或R4和Rx连同其***的原子一起形成任选经取代的饱和或不饱和的具有2-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的16-22元环；
各R5独立地为-N(R)2或选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；
R6是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基；且
R7是选自以下的任选经取代的基团：C1-6脂肪族基团、桥接二环基团、6-10元芳基、具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-10元杂芳基、或具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环基。2 -->
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