CN104547027B - 一种丹参叶三七叶提取物的制备方法及其应用 - Google Patents
一种丹参叶三七叶提取物的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种丹参叶三七叶提取物的制备方法及其应用。本发明采用三七叶与丹参叶作为原料，经碱水提取、醇沉、浓缩和干燥制成丹参叶三七叶提取物。丹参叶三七叶提取物具有调节血脂、改善微循环、抗缺氧等作用，可用于保健品、功能茶、食品的生产，也可用于药品的生产，用于心血管疾病的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明屈于中药领域，具体涉及一种丹参叶三七叶提取物的制备方法及其应用。
背景技术
丹参又名赤参，紫丹参，红根等。为双子叶植物唇形科，药用的主要部位是根茎。主产于安徽、河南、陕西等地。功效：活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神。丹参的主要成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类。其中丹酚酸类成分包括丹参素、丹酚酸B等，主要作用于心血管***，能够扩张心脑血管，增加心脏供血，改善微循环。
丹参叶为丹参植物的干燥叶。经研究表明，丹参叶与丹参所含成分存在一定差异。丹参叶不含有丹参酮类脂溶性成分，含有以迷迭香酸为主的多种丹酚酸类成分，总酚酸含量与丹参大体相当。文献报道迷迭香酸具有改善微循环、抑制血小板聚集，抗血栓形成等功效。因此，丹参叶与丹参在主要成分的功效方面基本一致。但丹参叶在价格上明显低于丹参的根茎。
三七又名田七，为五加科人参屈植物，具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，药用的主要部位是根茎。
三七叶为三七的干燥叶，具有止血、消肿、止痛的功效。三七叶中含有多种皂苷类成分，主要含有人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3，总皂苷含量与三七药材大体相当。文献报道人参皂苷Rb3具有保护心肌功能、抑制血管平滑肌细胞增生、抑制血小板活化聚集，防止血栓的形成的功效。因此，三七叶与三七在主要成分的功效方面基本一致。但三七叶在价格上明显低于三七的根茎。
发明内容
本发明采用丹参叶，三七叶作为原料，经碱水提取，醇沉、浓缩制成丹参叶三七叶提取物。
本发明提供一种丹参叶三七叶提取物，其制备方法包括以下步骤：
(1)取丹参叶、三七叶，加入碱性溶液提取，分离提取液，浓缩得到碱提液；
(2)药渣加水提取，分离提取液，浓缩得到水提液；
(3)将所述步骤(1)的碱提液和所述步骤(2)的水提液合并，浓缩后加入乙醇，静置；
(4)分离上清液，回收乙醇，浓缩，即得丹参叶三七叶提取物。
本发明的制备方法，其中丹参叶，三七叶两者可以分别提取，得到各自的提取物，也可以共同提取，优选共同提取，得到一种混合的提取物。
根据本发明实施方式之一，丹参叶和三七叶的重量百分比为丹参叶20-98％，三七叶2％-80％。
根据本发明另一实施方式，所述步骤(1)的碱性溶液优先选自：碳酸氢钠，碳酸钠，氢氧化钠，氢氧化钾的水溶液，pH值为7-10。
优选的，所述步骤(1)的碱性溶液为碳酸氢钠溶液，pH值为8-9。
根据本发明再一实施方式，所述步骤(1)加入的碱性溶液体积为药材重量的6-20倍。所述步骤(2)加入的水的体积为药材重量的6-20倍。
优选的，所述步骤(1)加入的碱性溶液体积为药材重量的10-12倍。所述步骤(2)加入的水的体积为药材重量的8-10倍。
根据本发明实施方式之一，所述步骤(1)和步骤(2)的提取方法为加热回流提取、连续逆流提取或超高压提取等。
优选的，所述步骤(1)和步骤(2)的提取方法为加热提取，提取时间为1-3小时，提取次数为1-3次。
根据本发明实施方式之一，所述步骤(3)合并提取液，浓缩至糖度为30-60Brix，优选45-55Brix，最优选为48-52Brix。
根据本发明实施方式之一，所述步骤(3)加入乙醇的量应使整个溶液的乙醇含量达到50-90％(V/V)，加入乙醇后静置12-36小时。
加入乙醇是为了将不溶解于乙醇的成分从提取液中分离出去，加入乙醇的量应使整个溶液的含乙醇量达到50-90％(V/V)，优选65-70％，最优选为69％。加入乙醇后静置12-36小时，优选室温放置24小时，待沉淀析出后，分离沉淀，得到上清液。
根据本发明实施方式之一，所述步骤(4)浓缩至糖度为50-90Brix，优选82-88Brix，最优选为84.5-86Brix。
浓缩的同时回收乙醇，可以降低成本，保护环境。
根据本发明所述的丹参叶三七叶提取物在制备调节血脂、耐缺氧、改善微循环以及增强体质的保健品、功能茶、食品以及药品等中的应用。
本发明的丹参叶三七叶提取物可以用于健康保健产品、功能茶和食品以及药品的生产，可制成滴丸、片剂、胶囊或其他任意一种适宜的形式，用于调节血脂、耐缺氧、改善微循环以及增强体质，也可用于心血管疾病的预防和治疗。
附图说明
图1：丹参叶三七叶提取物中的酚酸成分色谱图；色谱条件：Agilent SB-C18色谱柱；梯度洗脱：流动相：A相为0.02％磷酸水溶液；B相为80％乙腈0.02％的磷酸水溶液；检测波长280nm。
图2：丹参叶三七叶提取物中的皂苷成分色谱图，色谱条件：Agilent SB-C18色谱柱；梯度洗脱：A相为0.01％冰醋酸水溶液，B相为0.01％冰醋酸乙腈溶液；检测波长203nm。
具体实施方式
以下通过试验例的实验数据来说明本发明的有益效果：
试验例1丹参叶三七叶提取物与复方丹参提取物有效成分比较
采用实施例1的方法制备得到丹参叶三七叶提取物，经测定，丹参叶三七叶提取物中各成分含量见表1，HPLC色谱图见图1和图2。
表1丹参叶三七叶提取物各成分含量
检测结果表明，本发明的丹参叶三七叶提取物中含有多种丹酚酸类和皂苷类成分，丹酚酸主要包括迷迭香酸和丹参素，文献报道迷迭香酸具有改善微循环、抑制血小板聚集，抗血栓形成等功效，丹参素具有扩张心脑血管，增加心脏供血，改善微循环及降血脂等功效。皂苷类成分主要包括人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd。人参皂苷Rb2具有抗心肌缺血、增加心脏供血，改善微循环的作用，可用于治疗急性心梗。人参皂苷Rd能够阻止动脉硬化的发生，用于动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心血管***疾病的治疗。
试验例2丹参叶三七叶提取物的抗缺氧药理作用
1.受试药物
丹参叶三七叶提取物浸膏(5.32g生药/g浸膏)，为棕褐色浸膏，由天津天士力现代中药资源有限公司提供。
药物保存与配制：受试浸膏置于4℃冰箱避光保存，临用前用40℃温水浸泡后搅匀，采用无菌蒸馏水搅拌配制成相应浓度药液供给药。
2.阳性药
复方丹参片，0.25克/片，广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：D9A038。
药物保存与配制：阳性药常温保存，临用前用0.5％CMC-Na研磨混悬，配制成相应浓度药液供给药。
3.动物
ICR小鼠，清洁级，雄性，体重18-22g，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004。
4.剂量设置及依据
三七药材临床常用量为9g(根据体表面积折算，小鼠和大鼠剂量分别约为1.37g/kg和0.95g/kg)，丹参药材临床常用量为15g(根据体表面积折算，小鼠和大鼠剂量分别约为2.23g/kg和1.58g/kg)，受试样品每g约相当于药材5～6g，则小鼠的药材临床剂量折算成浸膏剂量范围约为：200～400mg/kg。为此，本试验中小鼠试验高、中、低剂量组分别设为600、300和150mg/kg，中剂量约与临床折算剂量相当，高剂量和低剂量分别高于和低于临床折算剂量。
参考文献，阳性药复方丹参片小鼠灌胃剂量设为400mg/kg。
5.抗缺氧作用
5.1动物分组
取雄性小鼠测定体重，随机分组，每组10只：(1)空白对照组；(2)复方丹参片400mg/kg组；(3)丹参叶三七叶提取物600mg/kg；(4)丹参叶三七叶提取物300mg/kg；(5)丹参叶三七叶提取物150mg/kg。
5.2试验方法
上述动物分组后，药物稀释成不同浓度，各组分别给予相应药物，给药体积均为0.1ml/10g，空白对照组给予等体积的生理盐水。动物预防给药7天。试验前1天动物禁食过夜。给药第7天，取125ml广口玻璃瓶，每瓶内加入50g医用钠石灰，瓶口涂抹凡士林保证密封。末次给药1h后，将动物迅速分别放入玻璃瓶中，每瓶1只，密封瓶口，秒表计时，观察记录各只动物的死亡时间。
5.3结果判断
参照《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》要求，受试样品组与空白对照组相比，存活时间延长，并具有统计学意义，则判断该实验结果阳性。
6.数据处理与统计分析
用SPSS16.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差
表示，先做ANOVA分析，然后进行非配对t检验，以P＜0.05为差别有显著性意义。
7.结果
由表2可见，与空白对照组相比，丹参叶三七叶提取物组均可不同程度的延长小鼠常压缺氧存活时间，具有一定的抗缺氧作用。其中丹参叶三七叶提取物高、中剂量均达到统计学显著差异(P＜0.05，P＜0.01)。
表.1三种中药提取物对小鼠常压缺氧存活时间的影响
*P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组相比。
试验例3丹参叶三七叶提取物的降脂药理作用
1.受试药物
丹参叶三七叶提取物浸膏(5.32g生药/g浸膏)为棕褐色浸膏，由天津天士力现代中药资源有限公司提供。
药物保存与配制：受试浸膏置于4℃冰箱避光保存，临用前用40℃温水浸泡后搅匀，采用无菌蒸馏水搅拌配制成相应浓度药液供给药。
2.阳性药
血脂康胶囊，0.3g/粒，批号：20130211，北京北大维信生物科技有限公司。
药物保存与配制：阳性药常温保存，临用前用0.5％CMC-Na研磨混悬，配制成相应浓度药液供给药。
3.动物
SD大鼠，SPF级，雄性，体重150-180g，购自浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK(浙)2008-0033。
4.剂量设置及依据
三七药材临床常用量为9g(根据体表面积折算，小鼠和大鼠剂量分别约为1.37g/kg和0.95g/kg)，丹参药材临床常用量为15g(根据体表面积折算，小鼠和大鼠剂量分别约为2.23g/kg和1.58g/kg)，受试样品每g约相当于药材5～6g，则大鼠的药材临床剂量折算成浸膏剂量范围约为：200～400mg/kg。为此，本试验中大鼠试验高、低剂量组分别设为400和200mg/kg，高剂量和低剂量分别高于和低于临床折算剂量。
参考文献，阳性药血脂康胶囊剂量大鼠灌胃剂量设为300mg/kg。
5.降血脂作用
5.1动物分组
取雄性大鼠测定体重，随机分组，每组10只：(1)空白对照组；(2)模型组；(3)血脂康胶囊300mg/kg组；(4)丹参叶三七叶提取物400mg/kg；(5)丹参叶三七叶提取物200mg/kg。
5.2试验方法
大鼠喂饲基础饲料观察10天，采血测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)水平。开始高脂饲料喂养10天，采血测定TC、TG、HDL水平，根据TC水平进行随机分组。受试样品灌胃给药，每天1次，给药体积均为10ml/kg。同时继续给予高脂饲料，每周测定体重，连续给药6周，末次给药后，禁食16h，同法采血测定TC、TG、HDL水平。
5.3结果判定
参照《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》要求，结果判定标准如下：
(1)辅助降血脂功能结果判定：在血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇三项指标检测中血清总胆固醇和甘油三酯二项指标阳性，可判定该受试样品辅助降血脂功能动物实验结果阳性。
(2)辅助降低甘油三酯结果判定：①甘油三酯二个剂量组结果阳性；②甘油三酯一个剂量组结果阳性，同时高密度脂蛋白胆固醇结果阳性，可判定该受试样品辅助降低甘油三酯动物实验结果阳性。
(3)辅助降低血清总胆固醇结果判定：①血清总胆固醇二个剂量组结果阳性；②血清总胆固醇一个剂量组结果阳性，同时高密度脂蛋白胆固醇结果阳性，可判定该受试样品辅助降低血清总胆固醇动物实验结果阳性。
6.数据处理与统计分析
用SPSS16.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差
表示，先做ANOVA分析，然后进行非配对t检验，以P＜0.05为差别有显著性意义。
7.结果
试验期间，高脂饲料模型组动物的体重与同期普通饲料组基本相当，受试样品各组给药对高脂饲料模型动物体重未见明显影响(表3)。
与空白对照组相比，高脂饲料模型大鼠造模10天血清TC水平即有显著升高(P＜0.01)，给药6周后维持较高的血清TC水平(P＜0.01)。与模型组相比，丹参叶三七叶提取物组对血清TC水平具有不同程度的改善作用(P＜0.01，P＜0.05)(表4)。
与空白对照组相比，高脂饲料模型大鼠试验期间血清TG水平仅有部分升高趋势，未见明显变化。与模型组相比，丹参叶三七叶提取物对血清TG水平也未见明显影响(表5)。
与空白对照组相比，高脂饲料模型大鼠造模10天血清HDL水平即有显著升高(P＜0.05)，给药6周后维持较高的血清HDL水平(P＜0.01)。与模型组相比，丹参叶三七叶提取物对血清HDL水平具有不同程度的改善作用(P＜0.01，P＜0.05)(表6)。
综上可见，本实验中所建立模型血清TC和HDL显著升高，而TG水平无明显变化，表明该模型为高胆固醇血症模型，可用于辅助降低血清总胆固醇活性评价。依据前述结果判断标准(以P＜0.05为阳性标准)，则丹参叶三七叶提取物的辅助降低血清总胆固醇结果判定均为阳性(表7)。
表4丹参叶三七叶提取物对大鼠高脂饲料模型血清胆固醇(TC)水平的影响
*P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组相比；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，与模型组相比。
表5丹参叶三七叶提取物对大鼠高脂饲料模型血清甘油三酯(TG)水平的影响
*P＜0.05，与空白对照组相比。
表6丹参叶三七叶提取物对大鼠高脂饲料模型血清高密度脂蛋白(HDL)水平的影响
-：，阴性；+：阳性。
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
取丹参叶450克、三七叶88克，加12BV的碳酸氢钠溶液(pH值为8.5)，加热回流2小时，提取液过滤，备用。药渣加入8BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
实施例2
取丹参叶200克、三七叶800克，加12BV的碳酸氢钠溶液(pH值为8.5)，加热回流2小时，提取液过滤，备用。药渣加入8BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置12h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
实施例3
取丹参叶980克、三七叶20克，加12BV的碳酸氢钠溶液(pH值为8.5)，加热回流2小时，提取液过滤，备用。药渣加入8BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置36h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
实施例4
取丹参叶450克、三七叶88克，加20BV的碳酸氢钠溶液(pH值为8.5)，加热回流2小时，提取液过滤，备用。药渣加入6BV量水提取3次，每次加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
实施例5
取丹参叶450克、三七叶88克，加6BV的碳酸氢钠溶液(pH值为8.5)提取3次，每次加热回流2小时，提取液过滤，备用。药渣加入20BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置过夜静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
实施例6
取丹参叶450克、三七叶88克，加12BV的氢氧化钠溶液(pH值为10.0)，加热回流3小时，提取液过滤，备用。药渣加入10BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度48-52Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置过夜静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
实施例7
取丹参叶450克、三七叶88克，加12BV的碳酸钠溶液(pH值为7.0)，连续逆流提取2小时，提取液过滤，备用。药渣加入10BV量水，连续逆流提取3小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置过夜静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
实施例8
取丹参叶450克、三七叶88克，加12BV的碳酸氢钠溶液(pH值为8.5)，加热回流2小时，提取液过滤，备用。药渣加入8BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度30-32Brix Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为50％，静置过夜静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度90Brix，即得。
实施例9
取丹参叶450克、三七叶88克，加12BV的碳酸氢钠溶液(pH值为8.5)，加热回流2小时，提取液过滤，备用。药渣加入8BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度58-60Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为80％，静置过夜静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度50Brix，即得。
实施例10
取丹参叶450克、三七叶88克，加12BV的氢氧化钾溶液(pH值为9.0)，超高压提取2次，每次2小时，提取液过滤，备用。药渣加入8BV量水，超高压提取2次，每次1小时，提取液过滤，备用。合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液放凉(10-30℃)，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置过夜静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得。
Claims (2)
1.一种丹参叶三七叶提取物，其特征在于，其制备方法，包括以下步骤：
取丹参叶450克、三七叶88克，加12BV的pH值为8.5的碳酸氢钠溶液，加热回流2小时，提取液过滤，备用，药渣加入8BV量水，加热回流1小时，提取液过滤，备用，合并上述提取液，浓缩至糖度49-51Brix，浓缩液10-30℃条件下放凉，按计算量加入乙醇至含醇量为69％，静置24h，分离上清液，70℃减压浓缩，回收乙醇，减压浓缩至糖度84.5-86Brix，即得丹参叶三七叶提取物。
2.根据权利要求1所述的提取物在制备调节血脂、耐缺氧的保健品、功能茶、食品以及药品等中的应用。
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